TCNICAS MODERNAS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS PATGENOS

TCNICAS MODERNAS EN MICROBIOLOGA DE ALIMENTOSLina Mara Lpez de vila, MSc.Docente Escuela de Microbiologa Universidad de Antioquia

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METODOLOGAS MODERNASMtodos rpidosCualquier mtodo para la deteccin, recuento, caracterizacin y subtipificacin de microorganismos mediante el cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los mtodos convencionales.RapidezExactitudBajo costoFacilidad de usoAceptabilidad

Medios cromognicos y fluorognicos

Mtodos de cultivo modificados

Basados en bioqumica

Medios de cultivo cromognicos o fluorognicosEnumeracin de coliformes fecales y E. coliEnumeracin de microorganismos patgenos: Salmonella, L. monocytogenes, S. aureus

Sustrato: carbohidrato, aminocido, fosfatoCromgeno o fluorogno: derivados de indolil o sustratos 4-metilumbeliferil

Cromgeno / fluorognoNombre comercialColor /fluorescencia5-Bromo-4-cloro-3-indoxilXAzul turquesa a verde menta5-bromo-3-indoxilLapisAzul5-bromo-6-cloro-indoxilMagentaMorado a magenta6-cloro-3-indoxilSalmonRosa a salmnN-metilindoxilGreenVerde2-NitrofenilONPAmarillo4-metilumbeliferilMUAzul (UV 365 nm)ELFELFBajo luz UV verde (377 nm)SustratoMicroorganismoCromognicoFluorognico-D-glucuronidoE. colisiSi-D-galacto-piranosidoEnterobacterias, coliformesSiNo-D-glucopiranosidoKlebsiella spp, enterobacter spp.SiNoN-acetil--D-glucosamidaCandida albicansSiSiMyo-inositol-1-fosfatoB. cereus, Listeria sp.SiSiFosfatoS. aureusSiSiE. Coli /ColiformesE. Coli O157:H7Salmonella spp.S. aureusL. monocytogenesGrupo Bacillus cereusChromocultBCM E. coli O157:H7Rambach agarCHROMagar S. aureusBBL CHROMagar ListeriaBCMRAPIDE. coli 2Flourocult E. coli O157:H7 AgarSM ID mediumS. aureus ID AgarRapidL. monoR&F Bacillus anthracis agarCHROMagar E. coliO157:H7 ID-MediumCHROMagar SMSAgar ALOAEMX-AgarRainbow agar O157BBL CHROMagar SalmonellaLIMONO-Ident-AgarTBX agarColi ID mediumE. coli O157:H7No fermentacin de sorbitolNo posee -D-glucuronidasaS. aureusReduccin de teluritoProteolisis albmina L. monocytogenesDeteccin de fosfolipasa CNo fermentacin de xilosaSalmonella spp.Deteccin de Caprilato esterasa y -glucosidasa

Mtodos de cultivo modificados

Nmero mas probableSimplateTecnologa de deteccin binaria, mltiples enzimas.Requiere menos microorganismos para generar cambios de color.Mtodos de cultivo modificados

TempoMtodos bioqumicosImpedanciaResistencia al paso de una corriente alterna a travs de un material conductor.El metabolismo microbiano cambia este parmetro elctrico.El tiempo de deteccin es inversamente proporcional al numero de bacterias en la muestra.

Recuento de viablesPruebas de esterilidadDeteccin y cuantificacin de indicadoresScreening de patgenosMonitoreo ambientalScreening de compuestos antimicrobianosBioluminiscenciaATP indicador de viabilidad celular

InmunoensayosPermiten la deteccin de: Clulas intactas, toxinas, productos metablicos.No permiten la diferenciacin de clulas vivas y muertas.Condiciones de stress generan expresiones aberrantes de antgenos.

Anticuerpos policlonalesAnticuerpos monoclonales

Resultados presuntivosSeparacin inmunomagntica

Partculas magnticas cubiertas con AcLa suspensin del alimento se mezcla con las partculas magnticas 30-60 minEl complejo magntico es puesto en un separador magntico.El complejo magntico es lavado varias veces con un buffer para eliminar contaminantesLas clulas son eluidas para posteriores anlisis.

InmunoensayosSistemas de flujo lateral - inmunocromatografaEnsayo tipo sandwich en una membrana porosa (nitrocelulosa)Anticuerpo de capturaAnticuerpo de deteccin

Singlepath

DuPont Lateral Flow System

RapidChek SELECT

Ensayo inmunoabsorbente asociado a enzima (ELISA)Peroxidasa Perxido de hidrogeno(Fenilendiamina)Fosfatasa alcalina P-nitrofenilfosfato-Galactosidasa O-nitrofenil-B-D-galactopiransido

IndirectaSandwichInhibicin competitiva

LOCATE Biopharm

3M Tecra

RIDASCREEN Campylobacter

Mtodos basados en bacterifagosEspecificidad de los bacterifagosIMS con protenas recombinantes

AplicacinVentajasProblemasDeteccin directa de patgenosNo requiere cultivoPuede detectar clulas muertas.Inhibicin por componentes del alimento.Sensible a contaminaciones en el laboratorioConfirmacin a partir de pre-enriquecimiento Rpido y sensiblePosible automatizacinNo se afecta por la microbiota acompaanteCaracterizacin de patgenos Identifica cepas virulentas y no virulentasCaracterizacin mltipleOtras aplicaciones Identificacin de organismos genticamente modificadosMTODOS MOLECULARESAspectos importantesPreparacin de la muestra

Componentes del alimentos pueden afectar la sensibilidad del mtodo.

Calcio, grasas, glicogeno, compuestos fenlicos, enzimas.

Falla en la lisis celularCaptura y degradacin de cidos nucleicosInhibicin de la polimerasa

Eliminacin de inhibidores

FiltracinAdecuada extraccin de ADNSeparacin inmuno magntica (IMS)Pre-enriquecimiento de la muestra

2. Blanco molecular

Presente en la clula en alto numero de copias.Suficientemente heterlogo.

Genes RNA ribosomal (rRNA)Genes de virulencia Genes codificantes de toxinasGenes involucrados en el metabolismo celularAspectos importantes

3. Tipo de metodologasBasadas en PCRAmplificacin isotrmicaBasadas en hibridacinElectroforesis en campo pulsadoRibotypingMicroarreglos

Aspectos importantesMetodologas basadas en PCR

PCR tradicionalAmplificacin de una secuencia blanco y visualizacin por electroforesis en gel de agarosa.

Cuantificacin de punto finalPosibilidad de contaminacin

PCR mltiplePCR anidadaMetodologas basadas en PCRPCR en tiempo real

Fragmento amplificadoSistema de deteccinCuantificacin absoluta vs.Cuantificacin relativaMetodologas basadas en PCR

Agentes fluorescentes

No especficosNo reconocen secuencias especificasUnion al ADN - Intercalantes - Unin al surco menorLa fluorescencia aumenta con la cantidad de producto amplificado

Dmeros de primersCurva de melting (Tm)

Curva de meltingEvaluacin rango de temperaturas (60-90C)La fluorescencia disminuye gradualmente hasta que desaparece totalmente

Agentes fluorescentes

EspecficosSondas especificas marcadas con fluoroforos

TaqmanMolecular beaconsScorpionsSondas TaqMan Sondas de hidrlisisActividad exonucleasa 5de Taq polimerasaReportero Quencher

TaqMan = PacMan

Molecular beaconsSondas de hibridacin en horquillaBucle: 18-30 pb complementario a la secuencia blancoTallo: 5-7 nt complementarios entre si5fluoroforo3qencher

Primers ScorpionsPrimer unido covalentemente a una sonda

EquiposPCR en tiempo real

Sistemas comercialesKitFormatoBacteriasCasa comercialBAXConvencionalSalmonella, E. coli 0157:H7, L. monocytogenes, CampylobacterQualiconLightCycler FoodproofTiempo realListeria, Salmonella, E. coliRocheMericonTiempo realL. monocytogenes, Campylobacter, SalmonellaQIAGENTaqManTiempo realCampylobacter, E. coli, L. monocytogenesApplied BioSystemsIQ-CheckBioRadR.A.P.I.D LTTiempo realL. monocytogenes, Salmonella, E. coliIdahotechRAPD (DNA polimrfico amplificado aleatoriamente)Primers arbitrarios (10 pb) de baja astringenciaPatrn de bandeo nico para cada cepa

AFLP (Polimorfismos en longitud de los fragmentos amplificados)Metodologas basadas en PCRGenotipificacin

Metodologas basadas en hibridacinFISH (Fluorescent in situ hybridization)

Identificacin de rRNA con sondas marcadas con fluorocromosDeteccin por epifluorescenciaLimite de deteccin 104 UFC/ml

RibotypingReconocimiento de genes ribosomalesProcariotas: 5S, 16S y 23S rRNARFLPs de genes rRNA

Purificacin y digestin de DNA genmicoElectroforesis en gel de agarosaSouthern blot

Micro arreglosColeccin de molculas biolgicas sobre soporte solido.

BIOSENSORESDispositivos analticos que combinan sistemas de reconocimiento biolgico con sealizacin fsica o electroqumica.

Alta sensibilidad, selectividad y reproducibilidadFcil manejo, bajo costo Corto tiempo de anlisisResultados en tiempo realFcil automatizacin

CLASIFICACIN