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Paz-Lago, Dalila; Hernndez, Marta

Purificacin y caracterizacin parcial de la enzima xilanasa a partir del preparadocomercial Novoban 240

Cultivos Tropicales, vol. 21, nm. 2, abril-junio, 2000, pp. 27-31Instituto Nacional de Ciencias Agrcolas (INCA)

La Habana, Cuba

Cmo citar? Nmero completo Ms informacin del artculo Pgina de la revista

Cultivos TropicalesISSN (Versin impresa): 0258-5936revista@inca.edu.cuInstituto Nacional de Ciencias Agrcolas (INCA)Cuba

www.redalyc.orgProyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

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Cultivos Tropicales 21(2):27-31, 2000

Key words: hydrolases, xylanases, pathogenesis,enzymes, purification

Palabras clave: hidrolasas, xilanasas, patognesis,enzimas, purificacin

INTRODUCCINEl xilano es el principal carbohidrato encontrado en

la fraccin hemicelulsica de los tejidos vegetales y cons-tituye la tercera parte de todo el carbn orgnico renova-ble sobre la tierra.

La xilanasa (E.C.3.2.1.8; 1,4 xilano xilanohidrolasa), componente mayoritario de un complejo sis-tema enzimtico, acta en la naturaleza depolimerizandolas molculas de xilano en unidades de pentosasmonomricas, que son usadas por bacterias y hongoscomo fuente principal de carbono (1).

Las xilanasas unidas a las glicsido-hidrolasas (res-ponsables de la ruptura enzimtica de la celulosa de laplanta) cointeractan en la acumulacin ilimitada debiomasa vegetal, son un elemento fundamental de intersbiotecnolgico (2) y juegan en su conjunto un papel cen-tral durante la hidrlisis de la pared celular de la planta (3).

El desarrollo de nuevas tcnicas analticas y la dis-ponibilidad comercial de nuevos sustratos no solo hanllevado a la purificacin y caracterizacin de un amplionmero de enzimas xilanasas sino que, adems, lasmetodologas ms actuales han resultado en la selec-cin de las enzimas xilanolticas ms adecuadas para suaplicacin industrial (4). Para estudiar los efectos de es-tas enzimas en la pared de las plantas y evaluar su posi-ble papel en la patognesis, son necesarias preparacio-nes de enzima pura, las que constituyen una potenteherramienta para la elucidacin de la estructura de la pareddel vegetal (5).

Novoban 240 es un preparado enzimtico comercialproducido por la Novo Industri A/S, que se utiliza en laindustria de elaboracin de vinos para eliminar los resi-duos contaminantes que afectan su filtrabilidad y clarifi-cacin. Se persigue como objetivo en el presente trabajoestablecer una metodologa rpida de purificacin parcialde endoxilanasas a partir de este preparado, la cual pue-de ser empleada para la obtencin de xilo-oligosacridoscon actividad inductora de mecanismos de defensa enlas plantas.

PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN PARCIALDE LA ENZIMA XILANASA A PARTIR DEL PREPARADOCOMERCIAL NOVOBAN 240Dalila Paz-Lago y Marta HernndezABSTRACT. Novoban 240 is a commercial enzymaticpreparation from Novo Industri A/S with amylase activitywhich is obtained by submerged fermentation of Bacillusamilolichuefaciens and is used in wine industry. Moreover, itpossesses endoxylanase activity, a closely related enzyme withthe hypersensitive response of plant tissues upon pathogenicattack. A methodology for the partial purification of this enzymeusing ion exchange chromatography on DEAE cellulose andSP Sephadex C-25 is established. The discrete enhance ofreducing power during the enzymatic hydrolysis is an indicatorconfirming the presence of an endoxylanase in Novoban 240,which might be used to obtain xylo-oligosaccarides withinducing activity of plant defense. The molecular weightestimated for this enzyme by polyacrylamide gelelectrophoresis is below 14 kDa.

RESUMEN. Novoban 240 es un preparado enzimtico comer-cial de la Novo Industri con actividad amilasa, que se obtienepor fermentacin sumergida de Bacillus amilolichuefaciens yes utilizado en la industria de elaboracin de vinos. Este pre-parado de uso industrial posee actividad xilanasa, enzima es-trechamente relacionada con la respuesta hipersensible de lostejidos vegetales frente al ataque de microorganismospatgenos. En el presente trabajo se establece una metodolo-ga de purificacin parcial de esta enzima a travs del empleode las cromatografas de intercambio inico sobre DEAE celu-losa y SP Sephadex C-25. El incremento discreto del poderreductor en el medio de reaccin durante la hidrlisisenzimtica, es un indicador que confirma la presencia de unaendoxilanasa en Novoban 240, la que podra ser utilizada parala obtencin de xilo-oligosacridos con actividad inductora dedefensa en plantas. El peso molecular estimado de la enzimapor electroforesis en gel de poliacrilamida est por debajo delos 14 kDa.

Dalila Paz-Lago, Investigador Agregado del Departamento de Fisiologay Bioqumica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrcolas, GavetaPostal 1; Marta Hernndez, Profesor Auxiliar del Departamento deQumica, Facultad de Agronoma, Universidad Agraria de La Habana(UNAH), Apartado Postal 18-19, San Jos de las Lajas, La Habana,Cuba.

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MATERIALES Y METODOSLos geles, las resinas y los sustratos utilizados son

calidad reactivo suministrados por los siguientes proveedo-res: Dietilaminoetil celulosa (SIGMA), SP-Sephadex C-25(PHARMACIA); sustratos: xilano de madera de abedul(SIGMA), laminarina de laminaria digitata (SIGMA); pa-trones: D-xilano, (SIGMA), D-glucosa (SIGMA), albmi-na de suero bovino fraccin V (BDH). Se emple ademsmembrana Spectra/Por mwco: 5000. El resto de losreactivos utilizados son sales de alta pureza para la pre-paracin de las soluciones tampn y otros.Preparacin del extracto. Un volumen equivalente a100 mL de Novoban 240 se dializ contra cinco cambiosde 3 L de solucin tampn de Na

2PO

4 10 mM pH 6.0,

durante 24 horas. El dializado se centrifug 20 minutos a10 000 g para precipitar el material insoluble y se deter-min la actividad de las enzimas xilanasa y 1,3glucanasa al sobrenadante, as como la concentracinde protenas.Procedimientos analticosDeterminacin colorimtrica de actividad enzimticaActividad xilanasa. 0.1 mL de solucin de enzima fue adi-cionado a una mezcla de reaccin que contena 0.2 mL desolucin tampn Na

2PO

4 200 mM pH 6.0 y 0.2 mL de

xilano 0.5 %. La mezcla se incub a 37C durante 10minutos (6). La actividad xilanasa se expres como mol dexilosa producido durante una hora por mililitro de enzima.Actividad 1,3 glucanasa. Laminarina reducida disueltaen solucin tampn de NaCOOH

3 100 mM pH 5.2, se

adicion a 0.1 mL de solucin de enzima. La mezcla seincub a 40C, durante 30 minutos (7). Se calcul la can-tidad de carbohidratos reductores (8) y la actividad 1,3glucanasa se expres como mol de glucosa producidodurante una hora por mililitro de enzima.

Para ambas determinaciones se realizaron curvasusando xilosa y glucosa como patrones respectivamente.Protenas. El contenido proteico se determin por el m-todo de MicroLowry (9), usando albmina de suero bovi-no como estndar.Procedimiento de purificacinCromatografa de intercambio inico en DEAE celulosa.Las cromatografas se realizaron en una columna de vi-drio C Pharmacia Fine Chemicals (26 x 300) mm, utili-zando DEAE celulosa como soporte cromatogrfico yequilibrada con solucin tampn de Na

2PO

4 10 mM

pH 6.0. Se aplicaron 3 mL del preparado comercial pre-viamente dializado y se colectaron fracciones de 4 mL auna velocidad de flujo de 20 mL.h-1. La columna fue eluidacon el mismo tampn y se conect en la fraccin 50 ungradiente lineal de fuerza inica de (0.1-2.0) M de NaClen el tampn Na

2PO

4.

Cromatografa de intercambio inico en SP-Sephadex C-50.La fraccin I proveniente de la cromatografa en DEAE-celulosa (3 mL de X-I) se aplic en una columna de vidrio

C Pharmacia Fine Chemicals (30 x 600) mm, con faseestacionaria SP-Sephadex C-25 pre-equilibrada con tam-pn Na

2PO

4 10 mM pH 6.0. La columna se eluy con el

mismo tampn y se aplic en la fraccin 15 un gradientelineal de fuerza inica de (0.1-1.0) M de NaCl en la solu-cin tampn. Se colectaron fracciones de 2 mL a unavelocidad de flujo de 10 mL.h-1.Concentracin y dilisis de las fracciones. Las diferentesfracciones cromatogrficas seleccionadas en los perfilesse unieron y concentraron utilizando polietilenglicol 8 000y se dializaron 24 horas contra el tampn correspondien-te o agua destilada segn el procedimiento posterior arealizar.Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y mercaptoetanol. se realizaron las electroforesisen gel de poliacrilamida con SDS y mercaptoetanol(10). Se prepararon geles al 12.5 % y se aplicaron 20 gde las muestras. La corrida electrofortica tuvo una dura-cin de una hora y se utiliz un amperaje constante de30 mA. Se aplicaron como protenas patrones un KitPharmacia de pesos moleculares de 14-94 kD.Hidrlisis de D-xilano con xilanasa parcialmente purifi-cada. 0.1 g de D-xilano de madera de abedul, disueltoen 10 mL de tampn Na

2PO

4 10 mM pH 6.0, se incuba-

ron a 37C con 1 mL de solucin de enzima X-I1 (fraccio-

nes 53-56), en presencia de algunas gotas de toluenopara retardar el crecimiento bacteriano. Al cabo de las24, 48 y 72 horas, se detuvo la reaccin por calenta-miento a 100C de las muestras durante 15 minutos.Se centrifug a 5 000 g para eliminar posible remanentede sustrato y se conserv el sobrenadante en refrigera-cin para su posterior uso.Estudio de la dinmica de hidrlisis. Se realiz determi-nando la concentracin de carbohidratos totales por elmtodo de Fenol-Sulfrico (11), azcares reductores (8)y pentosas utilizando HCl-orcinol (12).

Para la determinacin de carbohidratos totales ypentosas, se realizaron curvas de calibracin empleandoxilosa como patrn.Eficiencia de la hidrlisis enzimtica. La eficiencia (% dehidrlisis) de la enzima X-I

1 sobre el sustrato se midi

incubando 0.1 g de xilano a diferentes concentracionesde enzima. El medio de reaccin contena buffer Na

2PO

410 mM pH 6.0, para un volumen final de 10 mL. La mez-cla se incub durante 72 horas y la reaccin se detuvopor calentamiento durante 15 minutos a 100C. Poste-riormente se centrifug a 5 000 g para eliminar el mate-rial remanente. Se evalu la aparicin de carbohidratosreductores (8).

El porcentaje de hidrlisis se calcul segn la ex-presin siguiente:

% de hidrlisis= Rm/T-RsRm = g de carbohidratos reductores producidos por la accin de la enzima en el medio de reaccin.T = g de carbohidratos totales del sustrato.Rs = g de carbohidratos reductores del sustrato.

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-0 .1

0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

0 .6

0 .7

0 .8

0 50 100 150 200

Prote nasA c t. x ilanas a

Buf f e r f os f a to 10 mM, pH 6 .0 NaCl (0 .1 -2 ) M, f rac c in 50

X - I

N o de frac c iones

A bs (nm ) 2.0 NaCl (M)

0.1

Figura 2. Cromatografa de intercambio inico so-bre SP Sephadex C-25 de la fraccin X-Ide DEAE celulosa

La Figura 3 representa el patrn electrofortico delas diferentes muestras aplicadas en gel de poliacrilamidaal 12.5 %. Se aprecia la diversidad de protenas presen-tes en Novoban 240, lo que se corresponde con un pre-parado de uso industrial. Se aplicaron las fracciones X-I de DEAE celulosa y X-I 1 (fracciones de la 53-56) deSP Sephadex C-25. La xilanasa purificada posee unamasa molecular por debajo de los 14 kDa y se obtienecon un buen grado de pureza.

Figura 3. Electroforesis en gel de poliacrilamida conSDS y mercaptoetanol

Los resultados que hasta el momento se poseen encuanto a la purificacin de la enzima xilanasa a partir delpreparado comercial de amilasas, se resumen en la Ta-bla II. An cuando los rendimientos en protenas son ba-jos, el valor de actividad especfica que manifiesta la pro-tena es considerable.

La dinmica de liberacin de azcares solubles du-rante la digestin enzimtica de la fraccin X-I se midi alas 24, 48 y 72 horas (Figura 4). Se observa que la enzi-ma es capaz de provocar la hidrlisis del xilano, lo que semanifiesta por un incremento del poder reductor(Abs

520 nm) en el medio de reaccin. Dicho incremento

en el medio es indicativo de que el preparado tiene activi-dad xilanasa.

RESULTADOS Y DISCUSINLa Tabla I muestra las actividades enzimticas de

inters presentes en Novoban 240.

Tabla I: Actividades enzimticas presentes en elpreparado industrial Novoban 240

Protena total Actividad xilanasa Actividad 1,3 glucanasa (mg) (mol xilosa.h-1.mL-1) (mol glucosa.h-1.mL-1)

2.54 80.4 1.81

La Figura 1 muestra el perfil resultante de lacromatografa de intercambio inico sobre DEAE-celulo-sa del extracto de Novoban 240 dializado. Una fraccinproteica con actividad xilanasa y 1,3 glucanasa eluyecon la solucin tampn Na

2PO

4 10 mM pH 6.0, compor-

tamiento que seala la ausencia de interaccin de estasenzimas con la fase estacionaria. El resto de las prote-nas presentes revelan su carcter cido, al quedar reteni-das en el soporte las que solo eluyen una vez conectadoel gradiente lineal de fuerza inica (0.1-2) M de NaCl, amolaridades entre 0.15-0.3 M. Estas protenas no se lo-gran separar totalmente y constituyen la mayor parte dela protena aplicada en la columna, correspondiente a laactividad -amilasa (datos no mostrados).

Figura 1. Cromatografa de intercambio inico so-bre DEAE celulosa del Novoban 240

El perfil resultante de la aplicacin de X-I sobre SP-Sephadex C-25 se muestra en la Figura 2. Luego de co-nectado el gradiente de fuerza inica (0.1-1) M NaCl, enla fraccin 15 eluye primeramente una fraccin proteicacon actividad 1,3 glucanasa. Posteriormente, amolaridades superiores eluye una fraccin mayoritaria enla que las protenas no se logran separar, pero s susactividades enzimticas (actividad xilanasa). Este resul-tado pudiera ser representativo de la presencia deisoformas de esta enzima, las que solo se lograron sepa-rar en electroforesis de poliacrilamida.

-0 .05

0

0 .05

0 .1

0 .15

0 .2

0 .25

0 .3

0 .35

0 50 100 150 200

Pro te naA c t. 1,3 g luc anas a A c t. x ilanas a

X- I 1

Buf f er f os f a to 10 mM, pH 6.0NaCl (0 .1-1) M, f rac c in 15

No de frac c iones

A bs (nm ) 1.0 NaCl (M)

0.1

9467

43

30

20.114.4

a: patronesb: Novoban 240c: Fraccin X-Id: Fraccin X-I 1e: xilanasa (SIGMA)

30

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150

Concentracin de protenas (g)

% d

e hi

drl

isis

Carbohidratos reductores

0.1 mL de xilano10 mL buffer fosfatotiempo de incubacin 72 horas

Figura 4. Dinmica de la hidrlisis enzimtica

A medida que transcurre el tiempo de hidrlisisenzimtica, se observa un aumento en la concentracinde carbohidratos totales, efecto en parte provocado por laaparicin en el medio de azcares reductores, aunqueestos ltimos en concentraciones ms bajas. El incre-mento discreto del poder reductor en el medio de reac-cin, sin que se produzcan cambios bruscos durante elcurso de la hidrlisis, pudiera tomarse como indicativo deque el preparado enzimtico posee actividad endoxilanasay que al medio de reaccin se estn liberando xilo-oligosacridos. El contenido de pentosas es alto y repre-senta aproximadamente la concentracin de carbohidratostotales, lo cual es seal de la pureza del sustrato utilizado.

La eficiencia del proceso de hidrlisis de X-I con elxilano se representa en la Figura 5. Se aprecia la depen-dencia directamente proporcional entre el por ciento dehidrlisis y la concentracin de protena empleada.

Figura 5. Eficiencia de la hidrlisis enzimtica

Las investigaciones destacan que pocas xilanasasde origen bacteriano han sido caracterizadas y algunosinformes muestran al gnero Bacillus como un sistemaapropiado para la produccin de estas enzimas. El pre-parado comercial Novoban 240 de Novo Nordisk A/S esun producto fundamentalmente de enzima -amilasa. Noobstante, a la baja proporcin de xilanasa en relacincon la protena fundamental, este producto comercial pue-de ser usado como fuente para la purificacin de estaenzima, si observamos el valor representativo de activi-dad especfica obtenido durante el proceso de purifica-cin. Teniendo en cuenta que la investigacin ms actua-lizada presupone la manipulacin artificial del sistema dedefensa natural de los vegetales mediante los elicitores,como una alternativa ecolgica de lucha contra las enfer-medades, contar con una fuente barata y rpida para lapurificacin de una endoxilanasa, es disponer a su vezde xilo-oligosacridos para ser usados como inductoresde mecanismos de defensas en muchas especies vege-tales.

REFERENCIAS1. Prade, R. A. Xylanase biology to biotechnology.

Biotechnology Genetic Engenering Rev. 1996, vol. 13, p.101-131.

2. Suizenbacher, G., et al. The Streptomyces lividans family12 endoglucanase: construction of the catalytic creexpression and X-ray structure at 1.75 A resolution.Biochemistry, 1997, vol. 36, no. 1, p. 16032-16039.

3. Fontes, C. M., et al. Identification of tandemly repeatedtype VI cellulose-binding domains in an endoglucanasefrom the aerobic soil bacterium Cellvibrio mixtus. Appl:Microbiology. Biotechnology, 1998, vol. 49, no. 5, p. 552-559.

4. Sunna, A. y Antranikian, G. Xylanolitics enzymes from fungiand bacteria. Crit. Rev. Biotechnology, 1997, vol. 17, no.1, p. 39-67.

5. Mozzetti, C., et al. Variation in enzyme activities in leavesand cell suspensions as markers of incompatibility indifferent Phytophthora-peper interactions. Physiologycaland Molecular Plant Pathology, 1995, vol. 46, p. 95-107.

6. Hernndez, M. Oligosacridos de pared celular de caacon actividad necrosante en plantas. [Tesis de Maestraen Qumica Agrcola]. Instituto Superior de CienciasAgropecuarias de La Habana, 1996.

7. Paz-Lago, D. y Gutirrez, A. Resultados preliminares depurificacin de la enzima 1,3 glucanasa a partir delpreparado comercial Glucanex. Cultivos Tropicales,1995, vol. 16, no. 3, p. 36-39.

Tabla II. Resumen del proceso de purificacin de una xilanasa a partir de Novoban 240

Pasos Protena Actividad Actividad Rendimiento Recobrado Purificacin (mg) enzimtica especfica (%) de actividad (veces)

(mol.h-1.mL-1) (mol.h-1.mL-1) (%)

Dilisis 2.54 80.4 31.6 100 100 1DEAE celulosa 0.27 55.5 205.6 10.6 69 6.5SP Sephadex C-25 0.012 5.84 486.7 0.47 7.26 15.4

01234567

0 20 40 60 80

Tiempo de incubacin (horas)

mg.

mL

d

e az

car

es

Carbohidratos reductoresPentosasCarbohidratos totales -1

31

8. Nelson, N. J. A photometric adaptation of the Somogyimethod for the determination of glucose. J.Biol.Chem.,1944, vol. 153, p. 375-380.

9. Sun, S. MicroLowry in methods in Plant Molecular Biologyand Agricultural Biotechnology. Asian VegetableResearch and Development Center Council ofAgriculture, 1994, p. 9-11.

10. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head of bacteriophage T

4. Nature,

1970, vol. 227, p. 680-685.

11. Dubois, N., et al. Colorimetric method for determinationof sugar and related substances. And. Chem., 1956, vol.28, p. 350-356.

12. Chaplin, M. F. y Kennedy, J. K. Carbohydrate analyses apractical aproach. Oxford : IRL PRESS. 1987, vol. 3, no.4, p. 10-12.

Recibido: 16 de septiembre de 1999Aceptado: 22 de octubre de 1999