Guía Practica 2 [SOLUCIONES Y ESPECTROFOTOMETRIA]

BIOQUÍMICA CLÍNICA I Dra. Rosa Elisa Cruz T. Página 1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

BIOQUÍMICA CLINICA I

GUÍA PARA PRÁCTICA DE LABORATORIO No2

1. TEMA: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y LECTURA ESPECTROFOTOMÉTRICA

2. OBJETIVOS:

2.1. OBJETIVOS GENERALES - Preparar correctamente soluciones para la ejecución de prácticas de laboratorio.

- Aplicar la Espectrofotometría como una técnica cualitativa y cuantitativa de análisis.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Realizar los cálculos teóricos mediante la aplicación de fórmulas y/ó factores de conversión, para

en la práctica preparar soluciones a partir de solutos sólidos o líquidos aplicando normas de

bioseguridad, utilizando correctamente materiales y equipos en el laboratorio.

- Analizar conceptos relacionados con la espectrofotometría, para entender su importancia

como técnica de análisis bioquímico.

- Realizar la lectura de la Absorbancia de una banco de diluciones de orina en el

espectrofotómetro y correlacionar los resultados con la concentración expresada en porcentaje y la

transmitancia de cada muestra analizada.

3. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS - 1 gradilla

- 6 tubos de ensayo pequeños limpios y secos.

- 1 pipetas graduadas de 5 y 10 mL

- 1 pera de succión

- 2 vasos de precipitación de 50 y 100 mL

- 1 balón aforado de 250 ml

- 1 varilla de agitación

- 1 probeta de 100 ml

- 1 espátula

- Parafilm

- Temporizador

- Espectrofotómetro,

- Balanza analítica.

- Acido Acético 100%, Cloruro de sodio, Amoniaco 25%(d=0,91g/dL)

TRAER CADA GRUPO:

- Orina (una muestra recogida en un recipiente estéril, las ¾ partes del chorro medio de la

micción).

- Etiqueta (adhesivo multipek) (para etiquetar la solución preprada)

- 1 Envase de plástico limpio y seco 250mL (para envasar correctamente la solución preparada)

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4. FUNDAMENTO TEÓRICO

ANÁLISIS BIOQUÍMICO

A) INTRODUCCIÓN

Un análisis bioquímico o clínico es la exploración complementaria de líquidos y/ó especímenes

biológicos que permiten: interpretación de resultados, diagnóstico médico, valoración del pronóstico,

valoración del tratamiento, investigación, ensayos clínicos, conocimiento de patologías, análisis del

metabolismo.

El resultado de un análisis se interpreta frente a valores de referencia establecidos para cada población y

requiere de una interpretación médica.

Por un lado está la prueba diagnóstica realizada y su resultado, y por el otro, la interpretación que el

médico, respetando cada campo profesional.

Lo más importante es que al realizar un análisis, siempre se deben tener en cuenta ciertas características

propias de una prueba diagnóstica. Algunos de estos aspectos clave son:

1. Exactitud: Grado de concordancia entre el resultado y un valor de referencia certificado. En

ausencia de exactitud se tiene error sistemático.

2. Precisión: Grado de concordancia entre los datos obtenidos de una serie. Refleja el efecto de los

errores aleatorios producidos durante el proceso analítico.

3. Sensibilidad: Capacidad para discriminar entre pequeñas diferencias de concentración del analito. Se

evalúa mediante la sensibilidad de calibración, que es la pendiente de la curva de calibración a la

concentración de interés.

4. Límite de detección: Concentración correspondiente a una señal de magnitud igual al blanco más tres

veces la desviación estándar del blanco.

5. Selectividad: Cuantifica el grado de ausencia de interferencias debidas a otras especies contenidas en

la matriz.

6. Seguridad: Amplitud de condiciones experimentales en las que puede realizarse un análisis.

Las pruebas de laboratorio constituyen un factor fundamental en el diagnóstico, evaluación,

tratamiento y pronóstico de la mayoría de las afecciones humanas.

Durante todo el procesamiento de la muestra, pueden ocurrir situaciones que se escapan al control,

muchas veces por factores externos y otras por circunstancias propias del procedimiento, las cuales deben

ser detectadas, registradas y resueltas: este es el caso de las no conformidades del sistema.

En otras ocasiones los profesionales del laboratorio clínico y las instituciones en las que trabajan, se ven

inmersos en incidentes de trabajo que no tienen que ver con situaciones internas del laboratorio, sino

por condiciones legales, éticas, morales o de comunicación con agentes externos, los cuales deben ser

correctamente solucionados en procura de preservar la imagen del laboratorio o de la Institución.

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PROGRAMACIÓN DEL TRABAJO EN EL LABORATORIO CLÍNICO

Los análisis clínicos comprenden tres fases perfectamente diferenciadas:

1. FASE PRE ANALÍTICA:

Conjunto de actividades realizadas desde el momento en que se recibe la petición analítica hasta

que se inicia la fase analítica, sus etapas son:

Formulación Pedido o Solicitud de Examen.

Recepción del Pedido de Examen

Preparación del paciente

Obtención del espécimen

Identificación y trazabilidad de la muestra

Manipulación, conservación y envío de muestra

Aceptación o rechazo de la muestra.

Revisión del Método (Fundamento, Composición, Técnica, Valoración)

Preparación de materiales, reactivos y equipos.

La calidad, la estabilidad, la cadena de frío y la caducidad de los reactivos son aspectos claves por

donde se empieza a garantizar un buen resultado en la etapa analítica.

Equipos: la calibración, verificación y mantenimiento de los equipos son fundamentales, y son fuente

de no conformidades, especialmente porque se manejan con un erróneo criterio de contención de

costos.

2. FASE ANALÍTICA:

Conjunto de actividades directamente relacionadas con la ejecución analítica, sus etapas son:

Recurso humano: La primera y por lo tanto la más importante es la competencia del personal

con base en su educación formación, habilidades y experiencia.

El control de calidad interno: en algunos casos no realizado, en otros realizado a intervalos

no definidos y en otros aunque realizados no registrados o analizados. Los costos de los controles

no son negociables.

Aplicación del Método y Obtención de datos de la Prueba

3. FASE POSTANALÍTICA:

Conjunto de actividades realizadas con posterioridad a la ejecución analítica, sus etapas son:

Esta es la etapa definitiva, en la cual el profesional del laboratorio se compromete con un

resultado que va a tener importantes implicaciones en el paciente, bien sea positiva o negativa,

mediante la aplicación de fórmulas, factores etc.

Verificación de los resultados e Interpretación: cada resultado está reflejando la situación de un

paciente, y en ese sentido su análisis es individual. La calidad del resultado la garantiza el tecnólogo

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médico y no la máquina. En ocasiones la no conformidad se presenta por confiar ciegamente en la

máquina.

Elaboración Informe de Resultados o Exámenes realizados

Diagnóstico final (Personal responsable, únicamente el o la médico).

B) TÉRMINOS RELACIONADO CON EL ANÁLISIS:

Espécimen: Material biológico para el análisis sangre, orina, heces, saliva, esputo, liquido cefalorraquídeo,

líquido pleural, líquido amniótico, líquido ascítico, etc.

Muestra: Parte representativa de la materia o espécimen objeto del análisis.

Analíto: Especie química o sustancia que se analiza.

Solución estándar o disolución estándar: Disolución que contiene una concentración conocida de un

analíto o sustancia específica, llamada patrón primario, empleado para valorar las concentraciones de

otras soluciones.

Blanco de reactivo: Es la solución en la cual están todos los componentes menos el que desencadena la

reacción coloreada o analito generalmente se utiliza agua destilada o el reactivo de trabajo.

Método: Conjunto de operaciones y técnicas aplicadas al análisis de una muestra.

Técnica: Medio de obtener información sobre el analito.

Análisis: Estudio de una muestra para determinar sus composición o naturaleza química.

C) MÉTODOS DE ANÁLISIS

1. MÉTODOS CLÁSICOS:

1.1 MÉTODOS CUALITATIVOS: Métodos que permiten valorar calidad, considerada una

propiedad existente que pueda ser analizada como tal, comparada con otra similar, afín o de la misma

especie, así se tiene las características organolépticas como textura, olor, color, aspecto. En el análisis

de muestras y/ó líquidos biológicos no se aplica el sabor. El reporte puede ser: positivo,

negativo, reactivo, no reactivo, presente, ausente…..etc.

1.2 MÉTODOS CUANTITATIVOS: Métodos que permiten valorar cantidad, examinar los

datos de manera científica, específicamente en forma numérica, determinar la concentración de

analítos de interés diagnóstico. El reporte es en concentraciones (densidades).

2. MÉTODOS QUÍMICOS

2.1 MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS: Determinan la cantidad de una sustancia por el peso.

2.2 MÉTODOS VOLUMÉTRICOS: Sinónimo de valoración o titulación son:

2.2.1 POR LAS REACCIONES:

Método Volumétrico de Neutralización (Acido – Base): Se utilizan reactivos valorantes para

determinar la concentración de un analito o sustancia en la muestra, mediante reacciones

acido–base.

Método Volumétrico de Precipitación: Determinación de iones o sustancias en la muestra

con reactivos valorantes que sean capaces de formar precipitados.

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Método Volumétrico de Oxido-reducción: Mediantes reactivos valorantes de oxidación se

determina la concentración de un analito o sustancia reductoras por pérdida y ganancia de

electrones y viceversa.

Método Volumétrico de Formación de complejos: Mediantes reactivos valorantes de se

determina la concentración de un analito o sustancia por formación de complejo.

2.2.2 POR EL VOLUMEN TOTAL EMPLEADO

Macrométodo: más de 2 ml de volumen total en el análisis.

Semimicrométodo: de 1 a 2 ml de volumen total en el análisis.

Micrométodo: de 0.1 a 1 ml de volumen total en el análisis.

Ultramicrométodo: menos de 0.1 ml de volumen total en el análisis

2.3 MÉTODO COLORIMÉTRICO: Miden la concentración de un compuesto, a partir de la

diferencia de la intensidad de color desarrollada en el análisis.

2.4 MÉTODO ENZIMÁTICO: Miden la concentración de un compuesto, a partir de la

utilización de enzimas y coenzimas que catalizan las reacciones químicas.

3. MÉTODOS FÍSICOQUÍMICOS O MÉTODOS INSTRUMENTALES

3.1 MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS: Basados en la interacción de la radiación

electromagnética u otras partículas con un analito o sustancia para identificarlo o determinar su

concentración. Emplean técnicas que se dividen en técnicas espectroscópicas y en técnicas no

espectroscópicas

3.2 MÉTODOS ELECTROANALÍTICOS: Estudian un analito mediante la medida del

potencial (voltios) y/o la corriente eléctrica (Amperios) en una celda electroquímica, que

contiene el analito. Estos métodos se pueden dividir en varias categorías dependiendo de qué

aspectos de la célula son controlados y cuales se miden:

3.2.1 Potenciometría: Miden la diferencia de potenciales en el electrodo.

3.2.2 Coulombimetría: Mide la corriente de las celdas con el tiempo

3.2.3 Voltamperometría: Mide la corriente de las celdas mientras se altera activamente el

potencial.

3.3 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Métodos de separación para la caracterización de

mezclas complejas, utilizan técnicas basadas en el principio de retención selectiva, para separar los

distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos

componentes.

3.3.1 Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre

un papel. Las principales técnicas son: Cromatografía en papel, Cromatografía en capa fina

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3.3.2 Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.

Según el fluido empleado como fase móvil se distinguen: Cromatografía de

líquidos, Cromatografía de gases, Cromatografía de fluidos supercríticos.

ESPECTROFOTOMETRIA

A) INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA

Espectrofotometría es una técnica de análisis óptico usada en las investigaciones químicas y biológicas para:

- Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto utilizando las fórmulas

ya mencionadas.

- Determinar estructuras moleculares.

- Identificar unidades estructurales específicas ya que estas tienen distintos tipos de absorbancia

(grupos funcionales o isomerías).

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente

transparente absorbe radiación de longitudes de ondas que no pertenecen al espectro visible; el agua

absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones depende de la estructura de las moléculas (grupos funcionales) o grupos

químicos llamados CROMÓGENOS que tienen la capacidad de absorber radiación UV – VISIBLE así:

dobles enlaces, triples enlaces, anillos aromáticos y otros.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir

ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide

sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La absorción y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración y de la distancia recorrida.

ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

Es el conjunto de las ondas electromagnéticas, que emite (espectro de emisión) o absorbe (espectro de

absorción) una sustancia. Dicha radiación sirve para identificar la sustancia de manera análoga a una huella

dactilar. Los espectros se pueden observar mediante espectroscopios que, además de permitir observar el

espectro, permiten realizar medidas sobre éste, como la longitud de onda, la frecuencia y la intensidad de la

radiación.

El espectro electromagnético se extiende desde la radiación de menor longitud de onda, como los rayos

gamma y los rayos X, pasando por la luz ultravioleta, la luz visible y los rayos infrarrojos, hasta las ondas

electromagnéticas de mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. Se cree que el límite para la

longitud de onda más pequeña posible es la longitud de Planck mientras que el límite máximo sería el tamaño

del Universo.

Dependiendo del fenómeno estudiado, la radiación electromagnética se puede considerar no como una

serie de ondas sino como un chorro o flujo de partículas, llamadas fotones. Esta dualidad onda-corpúsculo

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hace que cada fotón tenga una energía directamente proporcional a la frecuencia de la onda asociada, dada

por la relación de Planck:

Donde E es la energía del fotón, h es la constante de Planck y ν es la frecuencia de la onda.

Valor de la constante de Planck:

Así mismo, considerando la radiación electromagnética como onda, la longitud de onda λ y la frecuencia de

oscilación ν están relacionadas por una constante, la velocidad de la luz en el medio (c en el vacío):

c = λ.v

RADIACIONES ELECTROMAGNÉTICAS

Banda Longitud de onda Frecuencia Energía

Rayos gamma < 10 pm > 30,0 EHz > 20·10−15 J

Rayos X < 10 nm > 30,0 PHz > 20·10−18 J

Ultravioleta extremo < 200 nm > 1,5 PHz > 993·10−21 J

Ultravioleta cercano < 380 nm > 789 THz > 523·10−21 J

Luz Visible < 780 nm > 384 THz > 255·10−21 J

Infrarrojo cercano < 2,5 µm > 120 THz > 79·10−21 J

Infrarrojo medio < 50 µm > 6,00 THz > 4·10−21 J

Infrarrojo lejano/submilimétrico < 1 mm > 300 GHz > 200·10−24 J

Microondas < 30 cm > 1 GHz > 2·10−24 J

Ultra Alta Frecuencia - Radio < 1 m > 300 MHz > 19.8·10−26 J

Muy Alta Frecuencia - Radio < 10 m > 30 MHz > 19.8·10−28 J

Onda Corta - Radio < 180 m > 1,7 MHz > 11.22·10−28 J

Onda media - Radio

Onda Media - Radio

< 650 m > 650 kHz > 42.9·10−29 J

Onda Larga - Radio < 10 km > 30 kHz > 19.8·10−30 J

Muy Baja Frecuencia - Radio > 10 km < 30 kHz < 19.8·10−30 J

A MENOR LONGITUD DE ONDA, MAYOR FRECUENCIA, MÁS ENERGÉTICA SERÁ LA RADIACIÓN

Y POR LO TANTO MÁS PELIGROSA.

A MAYOR LONGITUD DE ONDA, MENOR FRECUENCIA, MENOS ENERGÉTICA SERÁ LA

RADIACIÓN Y POR LO TANTO MENOS PELIGROSA.

ESPECTRO VISIBLE

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Por encima de la frecuencia de las radiaciones infrarrojas se encuentra lo que comúnmente es llamado

luz, un tipo especial de radiación electromagnética que tiene una longitud de onda en el intervalo de 0,4 a 0,8

micrómetros. La unidad usual para expresar las longitudes de onda es el Angstrom o los nm. Los intervalos

van desde los 8.000 Å (rojo) hasta los 4.000 Å (violeta), donde la onda más corta es la del color violeta.

B) LEY DE LAMBERT - BEER

La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en

la unidad de tiempo (potencia).

La transmitancia óptica que se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de onda especificada,

que pasa a través de una muestra.

Su expresión matemática es:

Donde Io es la intensidad del rayo incidente e I es la intensidad de la luz que viene de la muestra.

La transmitancia de una muestra está normalmente dada porcentualmente, definida como:

Color Longitud de onda

violeta 380–450 nm

azul 450–495 nm

verde 495–570 nm

amarillo 570–590 nm

naranja 590–620 nm

rojo 620–750 nm

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La transmitancia se relaciona con la absorbancia (o absorbencia) A como

A=2-log10T%

Donde T% es el porcentaje de transmitancia y T es transmitancia en "tanto por uno".

Entonces: A= log 1/T

Lo que es igual a: A= -log T

ó: T= antilog (- A)

La cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución y de la distancia

recorrida por la luz. La ecuación simplificada de la Ley de Beer – Lambert.

A= a.b.C

A= Absorbancia

a= Factor de calibración, relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.

b= Espesor recorrido por la radiación.

C= Concentración.

C

Concentración en: a

Absorbilidad como:

Símbolo

g/l absorbilidad a mol/l absorbilidad molar am

g/100 ml a 1 por ciento 1 cm A 1 cm 1%

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la a bsorbancia de una sustancia se puede

averiguar su concentración así:

1. Por comparación con una solución conocida: Dos soluciones, una problema (P) y una estándar (S),

establecer la siguiente relación matemática entre ellas.

Para el estándar As = a.b.Cs

Para el problema Ap = a.b.Cp

Dividiendo las ecuaciones:

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Como se trata de la misma sustancia a y b son los mismos:

As = Absorbancia del estándar

Ap = Absorbancia problema o muestra

Cs = Concentración estándar

Cp = Concentración problema o muestra

2. A través de una curva de calibración: La curva de calibración es la representación gráfica en un eje de

coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan

varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado,

que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación

de las A de las soluciones problema en la curva de calibración. Ejemplo:

Absorbancia de la muestra:

Absorbancia de la muestra:

0,333 Absorbancia del blanco de reactivos: 0,011 Absorbancia del blanco de muestra: 0,24 Absorbancia corregida de la muestra: 0,082

CON LA ECUACIÓN DE LA RECTA SE DETERMINA LA CONCENTRACIÓN:

C=0.076x0.082+0.1693

C=11,023µg/mL

Ó por Interpolación de la recta.

De la misma manera que se obtiene la gráfica de A vs. T, se pueden interpretar los resultados de T vs. C y A

vs. T.

A MAYOR ABSORBANCIA MAYOR CONCENTRACIÓN Y MENOR

TRASMITANCIA.

A MENOR ABSORBANCIA MENOR CONCENTRACIÓN Y MAYOR

TRASMITANCIA.

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Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las

cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración.

Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer,

convirtiéndose la recta en una curva.

La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración

falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en

los límites de la linealidad.

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C) ESPECTROFOTOMETRO Y SUS COMPONENTES

Es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que

contiene una cantidad desconocida de soluto o analito, y una que contiene una cantidad conocida de la

misma sustancia o analito que consta de:

1. Fuente de luz o energía radiante.

2. Selector de longitud de onda (rendija, lente, prisma).

3. Cubeta o Célula de flujo para la muestra.

4. Detector de energía radiante.

5. Registro o Dispositivo de lectura de la señal generada por el detector.

Fuente de luz: Es la fuente de energía radiante, consta de una lámpara de tungsteno, halógeno, molibdeno,

hidrógeno para emitir luz poli cromática (formada por varias radiaciones de diferentes longitudes de

onda).

Selector: Permite seleccionar la longitud de onda (λ ) requerida para analizar una determinada sustancia

en la muestra. Está formado por un sistema monocromador que obtiene luz monocromática (de una sola

longitud de onda ( λ )) a partir de la policromática emitida por la fuente de luz.

Cubeta o Célula de Flujo: Es el recipiente donde se coloca la muestra a analizar. Normalmente tienen un

grosor estandarizado de 1 cm, a simple vista parecen un tubo de ensayo, presentan diversas formas redondas,

cuadradas y rectangulares. Pueden ser de plástico, vidrio y cuando se trabaja a inferiores a los 300 nm son de

cuarzo. Antes de cada lectura deben limpiarse y el volumen de muestra debe ser exactamente de 5 ml o hasta

la marca que viene señalada en la cubeta.

Detector: Está formado por células fotovoltaicas o foto tubos, que recogen la luz resultante de

atravesar la cubeta y la transforman en energía eléctrica.

Registro: Suele ser un galvanómetro que registra la señal eléctrica generada por el detector y la indica en

forma de lectura como Absorbancia o D.O. (densidad óptica), % de transmitancia o incluso directamente en

concentración.

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5. DISEÑO EXPERINMENTAL

A) PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

1. Realice los cálculos y prepare las siguientes soluciones:

2. Solución de ácido acético al 5%, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución transfiera a

un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado.

3. Solución de cloruro de sodio 0,15 M, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución

transfiera a un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado.

4. Solución de Amoniaco 0.21 M, 250 mL, utilice agua destilada. Preparada la solución transfiera a

un recipiente de plástico limpio y estéril debidamente etiquetado. Datos: Densidad del amoniaco al

25% es 0.91 g/mL

5. Banco de Diluciones de Orina.

Recoger una muestra de orina ¾ partes del chorro medio de la micción en un recipiente limpio

y estéril.

En tubos debidamente rotulados, utilizando la orina y agua destilada prepare un banco de 4

diluciones de orina a razón geométrica de ½. Volumen total de cada dilución 2mL.

TUBOS DILUCION Blanco Agua destilada

A ORINA SIN DILUIR (ESTÁNDAR) B 1/2 C 1/4 D 1/8

Registre el color de cada tubo con su tonalidad.

B) REVISIÓN DEL EPECTROFOTOMÉTRO

1. Identifique las funciones que realiza el espectrofotómetro a través del panel principal.

2. Verifique las diferentes partes que constituyen el equipo.

3. Compruebe como se realiza el manejo del equipo, cuidado y mantenimiento.

C) MEDICIÓN DE LA ABSORBANCIA DEL BANCO DE DILUCIONES DE ORINA

Con el Banco de Diluciones de la Orina preparado en el apartado anterior proceda a realizar la lectura

de la Absorbancia (A) en el espectrofotómetro a 505 nm de longitud de onda, con sistema

monocromático.

1. Lavado del sistema de flujo o succión del equipo con agua destilada.

2. Lectura de Absorbancia del BLANCO DEL REACTIVO

3. Lectura de Absorbancia del ESTANDAR

4. Lectura de Absorbancia de LAS MUESTRAS DE CONCENTRACIÓN CONOCIDA

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5. La docente entregará un tubo de dilución de orina como muestra desconocida, para que también se

realice la lectura de absorbancia de la MUESTRA DE CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA.

6. CÁLCULOS

Exprese los cálculos realizados.

Solución de ácido acético al 5%, 250 mL.

Solución de cloruro de sodio 0,15 M, 250 mL

Solución de Amoniaco 0,21 M, 250 mL. Densidad del amoniaco 0.91 g/mL

Banco de Diluciones de Orina

Con los valores de las diluciones de la orina calcule la concentración en porcentaje de

volumen (%V/V) de cada tubo.

Calcule la concentración en porcentaje de volumen (%V/V) de la muestra

desconocida o problema, con los valores de la Absorbancia calcule la Transmitancia.

7. RESULTADOS

En la siguiente tabla registre resultados a partir de los cálculos anteriores.

TUBOS DILUCION CONCENTRACIÓN % ABSORBANCIA TRANSMITANCIA

A Orina sin diluir

Estándar

B 1/2 C 1/4 D 1/8 X Muestra

Problema

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de A Vs. C. Una los puntos de la

curva, obtenga la ecuación de la recta, determine la concentración de la muestra

problema a través de la ecuación. Establezca conclusiones.

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de T Vs. C. Una los puntos de la

curva. Establezca conclusiones.

Grafique en papel milimetrado la variación de la Lectura de A Vs. T. Una los puntos de la

curva. Establezca conclusiones.

NOTA: Cada gráfica debe tener el título, nombres de los ejes, escala adecuada, interpretación

8. CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipos de vinagre existen y cuáles son sus usos en medicina?

2. ¿De qué manera se prepara el suero fisiológico usado en el laboratorio clínico?

3. ¿Qué es el amoniaco, cuáles son los efectos nocivos y benéficos para la salud?

4. ¿Qué son soluciones proponga 5 ejemplos de soluciones del organismo humano?

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5. ¿Qué es la espectrofotometría y qué importancia tiene en Bioquímica?

6. ¿Cuál es la relación entre Absorbancia, Transmitancia y Concentración?

7. ¿Qué es longitud de onda, frecuencia, energía?

8. ¿Cuál es el cuidado y mantenimiento que se debe dar al espectrofotómetro?

9. ¿Qué diferencias hay entre solución estándar o patrón, muestra, y blanco de reactivo?

10. Coteje la columna de la izquierda con la respuesta correcta de la columna de la derecha

(a) Transmitancia ( ) Relación entre la Intensidad final de la radiación y la Intensidad inicial

(b) Absorbancia ( ) Grupos funcionales químicos que tienen la capacidad

de absorber la radiación UV- Visible del espectro

ejemplo: dobles, triples enlaces, anillos aromáticos y otros.

(c) Cromógeno ( ) Ciencia que estudia los fenómenos de absorción y de

dispersión de la luz.

(d) Espectrofotometría ( ) Técnica de laboratorio cualitativa que permite

identificar la sustancia de una muestra y cuantitativa

porque permite conocer la concentración exacta de la

muestra utilización radiaciones electromagnéticas.

(e) Espectro -electromagnetico

( ) Cuando los átomos pierden energía radiante y emiten una radiación electromagnética

(f) Espectro de emisión ( ) Conjunto de radiaciones espectro electromagnéticas,

caracterizadas por su energía, longitud de onda y

frecuencia

(g) Espectroscopia ( ) Cantidad de la Intensidad de la radiación que es

captada por los átomos que constituyen una muestra

11. Visite Hospitales, Centros de Salud, Consultorios Médicos y/ o Laboratorios Clínicos: anexar al

presente informe una Solicitud de Examen e Informe de laboratorio Clínico (Buscar referencias

en formatos estándares del Ministerio de Salud).

RESUELVA LOS SIGUIENTES EJERCICIOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA (realice los

cálculos necesarios).

12. En la determinación del colesterol total en el suero del paciente se obtiene una absorbancia de 0,840.

Un patrón de colesterol total de 200 mg/dl leído en el espectrofotómetro da una absorbancia de

0,435. ¿Cuál es la concentración de colesterol total en la muestra?

13. Cuando una muestra presenta un valor de Absorbancia X. ¿Cuál es la transmitancia y el porcentaje de

Transmitancia?

Absorbancia Transmitancia % Transmitancia

0,445

0,555

0,632

14. ¿Cuál es la concentración de hemoglobina total de una muestra de suero de una paciente mujer que

leída en el espectrofotómetro obtuvo una Absorbancia de 0.248? Por otra parte un estándar de

Guía Practica 2 [SOLUCIONES Y ESPECTROFOTOMETRIA]

BIOQUÍMICA CLÍNICA I Dra. Rosa Elisa Cruz T. Página 16

hemoglobina total tiene una concentración de 12g/dL en el mismo instrumento dio una Absorbancia

de 0.321.