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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
Centro Nacional
de Alimentación
Detección de alérgenos en alimentos.
Actuaciones del Centro Nacional de
Alimentación
Servicio de Biotecnología
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Presentación Guía de gestión de alérgenos en la industria alimentaria, 28 de noviembre de 2013
Los alérgenos alimentarios son proteínas o glicoproteínas presentes de forma natural en los alimentos, tanto de origen vegetal como animal
ALÉRGENOS ALIMENTARIOS
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
ALIMENTOS ALERGÉNICOS
Cualquier alimento puede ser potencialmente alergénico
Alimentos Alergénicos
Frutas 33%
Frutos secos 26%
Marisco; 22%
Huevo; 16%;
Leche ; 14%
Pescado ; 10%
Frutas
Frutos secos
Marisco
Huevo
Leche
Pescado
0tros
0tros, 10%
Alimentos Alergénicos
Frutas 33%
Frutos secos 26%
Marisco; 22%
Huevo; 16%;
Leche ; 14%
Pescado ; 10%
Frutas
Frutos secos
Marisco
Huevo
Leche
Pescado
0tros
“TOP 8” 90 %
Leche Huevo Soja Trigo Cacahuete Nueces Pescado Mariscos
Incidencia en España
0tros, 10%
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Cereales que contienen gluten (trigo, centeno, cebada, avena, espelta, kamut o sus variedades híbridas) y productos derivados
Crustáceos y productos a base de crustáceos Huevos y productos a base de huevo Pescado y productos a base de pesqueros Cacahuetes y productos a base de cacahuetes Soja y productos a base de soja Leche y productos lácteos (incluida la lactosa) Frutos de cáscara, es decir: almendra (Amygdalus communis L.), avellanas (Corylus
avellana), nueces (Juglans regia), anacardos (Anacardium occidentale), pacanas (Carya illinoensis), nueces de brasil (Bertholletia excelsa),alfóncigos ( Pistacia vera), nueces de macadamia o nueces de Australia (Macadamia ternifolia) y productos derivados
Apio y productos derivados Mostaza y productos derivados Granos de sésamo y productos derivados Dióxido de azufre y sulfitos] > 10 mg/kg ó 10 mg/L expresado como SO2 Altramuces y productos a base de altramuces Moluscos y productos a base de moluscos
REGLAMENTO (UE) Nº 1169/2011 (Anexo II)
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A) Métodos inmunológicos Detección de las proteínas alergénicas mediante anticuerpos específicos
B) Métodos basados en biología molecular Detección de secuencias diana de ADN mediante PCR
C) Métodos cromatográficos Utilizados en investigación
ANÁLISIS DE ALÉRGENOS EN ALIMENTOS
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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Métodos basados en la detección de una o más proteínas o fragmentos proteicos (alérgeno), mediante la unión especifica antígeno-anticuerpo
A) MÉTODOS INMUNOLÓGICOS
a) Enzimoinmunoensayo ELISA ELISA sandwich ELISA competitivo ELISA directo
b) Métodos rápidos (tiras inmunocromatográficas o reactivas)
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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
TEPNEL BIOKITS
SISTEMAS ELISA
AgraQuant® Métodos directos : DETECTAN LAS PROTEÍNAS
ALERGÉNICAS
Cuantitativos
Rápidos No requieren equipos demasiado complejos (lector de placas)
ALTA SENSIBILIDAD: La mayoría de los ELISA declaran una sensibilidad
suficiente para detectar concentraciones relativamente pequeñas de alérgenos (adecuados para proteger al consumidor)
(Límite de detección : entre 0,5 mg/kg (ppm) a 5 mg/kg (ppm))
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SISTEMAS DE FLUJO LATERAL (LFD) o TIRAS REACTIVAS
•Sistemas cualitativos (puede ser
utilizados como semicuantitativos con precaución)
•Utilidad para muestreo ambiental, verificación zonas de limpieza, screening, … •Disponibles para muchos alérgenos •Rápidos •Sencillos •Sensibilidad declarada (1 mg/kg - 5 mg/kg (ppm))
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
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Limitaciones analíticas en el control de alérgenos:
A) Extracción de proteínas alergénicas
B) Diferencias en los distintos sistemas ELISA
C) No disponibilidad de MR certificados
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A) Dificultad de la extracción de proteínas alergénicas en los alimentos
a) Influencia del procesado en las propiedades de las proteínas alergénicas
b) Complejidad de la matriz que contiene el alérgeno Polifenoles y taninos Grasas pH (ácido) c) Distribución en el alimento
La facilidad y/o dificultad de la extracción depende:
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Desarrollo de adecuados procedimientos de extracción
Kits comerciales suministran sus propios tampones de extracción
Procesos rápidos y fáciles de realizar •Composición desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)
•Similares para todos los alérgenos
Necesidad de aditivos (compuestos) especiales:
gelatina de pescado
leche en polvo
sustancias reductoras (β-mercaptoetanol)
urea 6 mol/litro
agentes surfactantes (1 % Tween 20® 0,4 % Triton X-100®,
4 % SDS)
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RETO
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ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ (CNA)
Efecto de la matriz en alimentos ricos en taninos y polifenoles
• Cacao, chocolate y derivados • Café y te • Frutas ricas en taninos: • Uvas, plátano, manzana, pera… • Frutos secos con piel: castaña…..
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
“La influencia de los polifenoles en la detección de gluten en alimentos infantiles hidrolizados a base de fruta. Efectos de la matriz en la extracción de las proteínas del gluten”
OBJETIVO: Comprobar el efecto inhibidor de los polifenoles presentes en alimentos con alto contenido en fruta en la extracción de gluten PROCEDIMIENTO: Comprobación del rendimiento de extracción de diferentes tipos de soluciones en alimentos infantiles ricos en fruta (papillas infantiles de frutas): 1.- Solución coktail con etanol al 80 % 2.- Solución de guanidina/-mercaptoetanol/Isopropanol (prep. Lab.) 3.- Solución coktail con gelatina de pescado 4.- Solución coktail con leche desnatada
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RESULTADOS:
1.- Solución cocktail con etanol al 80 % -- 2.- Solución de guanidina / -mercaptoetanol / Isopropanol--3.- Solución 1 con gelatina de pescado-- 4.- Solución 1 con leche desnatada
Muestras adicionadas con 40 mg/kg de gluten
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Detectan diferentes proteínas (diferente sistemas antígeno-anticuerpo) Utilizan diferentes calibrantes Diferentes formas de expresión de resultados
B) Diferencia de resultados entre distintos sistemas ELISA
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ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DE
LOS DISTINTOS SISTEMAS
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ESPECIFICACIONES DE LOS KITS DE DETECCIÓN DE PROTEÍNAS DE HUEVO
SISTEMA ELISA ESPECIFICIDAD FORMAS DE
MEDIDA CALIBRANTE
RANGO DE CUANTIFICACION
mg/kg (ppm)
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
LC mg/kg (ppm)
A Anticuerpo policlonal Ovomucoide (Gald1)
Proteína blanca de huevo (EWP)
NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo)
0,5 – 10 0,5
B - Huevo entero en polvo
Proteína total de huevo
2,5 - 25 2,5
C Anticuerpos Ovomucoide (Gald1)
Huevo entero en polvo
- 1- 10 1
D Ovoalbúmina y ovomucoide (Gald 1 y Gald 2)
Huevo entero en polvo
NIST SRM8445 (Huevo seco entero en polvo)
0,5- 13,5 0,5
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0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Galleta Pasta Bollo Helado Vino
3 mg/kg 6 mg/kg 3 mg/kg 1,5 mg/kg 1,5 mg/kg
1
2
3
4
5
Valor esperado en mg/kg de huevo entero en polvo
1 2 3 4
Resultado expresado en mg/kg de huevo entero en polvo
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
b-L
acto
glo
bu
lin
a
BioKts ELISA Systems R- Biopharm Otros
Resultados diferentes ELISAS
FAPAS Proficiency Test 2780 -A
Determinación de β-lactoglobulina en Fórmula infantil a base de soja (valor teórico 88 mg/kg de β-lactoglobulina)
Valor asignado: • Biokits 37,5 mg/kg • ELISA Systems 25,5 mg/kg • r-Biopharm 79,0 mg/kg
0
5
10
15
20
25
30
35
Cac
ahu
ete
(mg
/kg
)
BioKits Romer Labs R-Biopharm Neogen
Resultados diferentes ELISAS
FAPAS Proficiency Test 2776C
FAPAS 2776- C
FAPAS 2780-A
Muestra cacahuete en chocolate (valor teórico 10 mg/kg)
Valor asignado: •Biokits 11,8 mg/kg • Romer Labs 8,7 mg/kg • r-Biopharm 24,2 mg/kg • Neogen 15,0 mg/kg
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Recuperación con muestras fortificadas con 5 mg/kg de avellana
Preparación de muestras fortificadas, mediante mezcla de variedades de avellana
COMPARACION DE LA EXACTITUD ??????
Elisa Systems R-Biopharm Neogen Romer Labs
C) No disponibilidad de materiales de referencia
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a) Materiales de referencia disponibles
b) Sobrantes de ensayos de intercomparación
c) Utilización de reactivos químicos (cuando el alérgeno exista como
reactivo, ej. caseína, β-lactoglobulina, etc…)
c) Utilización del alimento alergénico
Posibles soluciones:
Muestras cargadas
Como utilizarlos
Spiked: muestra preparada por adición
de una determinada cantidad de alergeno
Incurred: muestra adicionada y sometida
a distintos tratamientos de procesado
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Detección mediante PCR de secuencias de ADN : especificas del alimento alergénico secuencias de ADN que codifican la proteína alergénica Desarrollo de kits comerciales (límite de sensibilidad declarado menos de 2,5 mg/kg (ppm) de alimento alergénico)
B) MÉTODOS BIOLOGÍA MOLECULAR – Reacción de la Polimerasa en Cadena - PCR
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VENTAJAS
Gran sensibilidad Gran especificidad Fácil de usar Mayor estabilidad
Cumple con el Reglamento (UE) 1169/2011 Útil si no existe ELISA Verificar resultados cuestionables (ej: proteínas hidrolizadas) Bueno como método confirmativo
INCONVENIENTES
No detectan la proteína alergénica No relación constante entre presencia de ADN y proteína Cualitativo o semicuantitativo (ADN y no proteína
no válido para gluten , valor)
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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACION
Alcance actual de acreditación del CNA bajo la Norma UNE-EN ISO/IEC 17025, en el campo de alérgenos
Gluten, en 2009 Cacahuete, en 2010 Proteínas lácteas, en 2010 -lactoglobulina Caseína Proteínas de huevo, en 2012
Ampliación de alcance de acreditación (auditoria de ENAC, noviembre 2013)
Detección de avellana
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Centro Nacional
de Alimentación
Muchas Gracias
Directora del CNA Mª Teresa López Esteban [email protected] Servicio de Biotecnología Mª Isabel Prieto Santos [email protected]