2014-2 p9. Estudio Cinético de Alfa-Amilasa

8/19/2019 2014-2 p9. Estudio Cinético de Alfa-Amilasa

1/9

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: ___________________________________________ Código: _________________

Alumno: ___________________________________________ Código: _________________

Práctica 9: ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA – AMILASA:

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNAREACCIÓN ENZIMÁTICA.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO

Estudio cinético del enzima α-amilasa.

Introducción a la enzimología.

La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas

por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales

transcurren las reacciones enzimáticas. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede

medir:

1 Por la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo.

2 Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo.

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato [S],

del enzima [E], el pH y la temperatura (T°C) sobre la velocidad de la reacción catalizada por el

enzima α-amilasa salival, sobre los enlaces α-1,4 del almidón.

OBJETIVOS:

•

Reconocer y diferenciar los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas porenzimas.

• Ilustrar el mecanismo por el cual ciertos factores afectan la velocidad de las reaccionesenzimáticas.

• Utilizar aquellos factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas para comprendercómo se regula el trabajo de las enzimas en los organismos biológicos.

• Discutir los efectos de las variaciones bruscas de factores como temperatura y pH en el

funcionamiento adecuado de los organismos.


2/9

Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón por unidad de tiempo, mediante el

seguimiento de la reacción de coloreada que produce el mismo, así como sus productos de

hidrólisis, con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).

Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe

tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de

hidrólisis) con el reactivo de Lugol.

Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la

cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y T°C,

fundamentalmente.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridadEl estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de pro tección personal

Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:

• Bata de laboratorio

• Guantes de nitrilo

• Gafas de seguridad

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su

intercambio con los demás compañeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos químicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer losresiduos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello elestudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los

cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones nocontroladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de lapráctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien leindicará la forma correcta de hacerlo.


3/9

3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO

CONSULTAS PREVIAS.

1 ¿Cuáles son las características estructurales del almidón?

2 ¿Qué tipo de enzima es la α-amilasa salival?

3 ¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón?

4 Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en laconcentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.

5 ¿Qué tipo de reacción se debe dar entre el lugol y el almidón y de qué forma a través de éstareacción se puede determinar la presencia o ausencia de almidón?

6 ¿Cuál es el producto o productos de la reacción de degradación del almidón por el enzima?

4. METODOLOGIA

4.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.ITEM Cantidad

Gradilla 1

Tubos de ensayo pequeño 15

Pipeta pasteur 5

Vasos de precipitados de 250 mL 2

Vaso de precipitados de 25mL 1

Erlenmeyer de 50mL 1

Probeta 25 mL 1

Pipetas graduadas de 2mL, 5mL y 10mL 1 de c/u

Pipeta graduada de 1mL 2

Propipeta 1

Termómetro 1

Pinza para tubos de ensayo 1

Cronómetro 1

Frasco lavador 1

Varilla de vidrio 1

Placa de aglutinación 2

Estufa 9 para todo el salón

Erlenmeyer de 25mL con tapa 2 para todo el salón

Vaso de precipitados de 250mL 1 para todo el salón


4/9

4.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.Reactivos Cantidad

Lugol (en frasco ámbar con tapa gotero) 25mL

Almidón al 0,5% 30mL

Soluciones tampón de pH 4 2 mLSoluciones tampón de pH 7 2 mL

Agua destilada 50mL

Hielo

4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE MUESTRA DE AMILASA:

Obtenga aproximadamente 1mL de amilasa salival de su boca en una probeta y

complete hasta 20mL con agua destilada.

Esta solución es el EXTRACTO ENZIMÁTICO.

Método 1: Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacciónenzimática.

Procedimiento.

1. Rotule 4 tubos de ensayo y agregue 2mL de almidón al 0,5%

2. Encuentre la cantidad de lugol necesaria para detectar la solución de almidón

proveída en esta práctica. Para ello tome 3 gotas de uno de los tubos preparados

en el punto 1 y adicione 1 gota de lugol. Repita el procedimiento aumentando a 2

y 3 gotas de lugol. Escoja la menor cantidad que de una coloración fuerte.

3. Lléve los tubos preparados en el paso 1 a 37°C en baño maría y mantenga la

temperatura constante.

4. Agregue en el siguiente orden 2.9mL, 2.8mL, 2.7mL y 2.6mL de agua destilada alos tubos de ensayo.

5. Luego en el mismo orden, adicione: 0.1mL, 0.2mL, 0.3mL y 0.4mL del extracto

enzimático. En este momento empieza la reacción.


5/9

6. En placas para ELISA, tome 3 gotas de cada reacción y agrégueles 1 gota delugol (o la cantidad que usted determino apropiada). Repita este procedimientocada 2 minutos durante los primeros 20 minutos de reacción. Para los 40 minutos

restantes tome muestras cada 10 minutos. Consulte con su instructor y ajuste los

tiempos según la velocidad de su amilasa salival (resultados varían según

grupo).

7. Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la

Tabla 5.1.

Método 2: Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una reacciónenzimática.

Procedimiento.

1. En dos tubos de ensayo agregue 2.5mL de almidón al 0.5%, rotúlelos y agregue

1mL de buffer pH 7.0 a uno y 1mL de buffer pH 4.0 al otro.

2. Incúbelos a 37°C en baño maría y mantenga la temperatura constante.

3. Agregue 0.5mL del extracto enzimático a cada erlenmeyer. Aquí comienza la

reacción.

4. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de lugol

(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción. Repitaeste procedimiento en intervalos de 2 o 5 minutos durante 30 minutos.


Tabla 5.2.

Método 3: Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática

Procedimiento.

1. Tome 4 tubos de ensayo, rotúlelos y agregue en el siguiente orden 0.5mL,

1.0mL, 1.5mL y 2.0mL de almidón al 0,5%. Llévelos a 37°C en baño maría y

mantenga la temperatura constante.

2. Luego agrégueles a cada tubo, en el orden correspondiente: 2.0mL, 1.5mL,

1.0mL y 0.5mL de agua destilada.


6/9

3. Agregue a cada tubo 0.5mL del extracto enzimático. Aquí comienza la reacción.


(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción. Repita

este procedimiento en intervalos de 10 minutos durante 60 minutos.


Tabla 5.3.

Método 4: Estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Procedimiento.

1. Rotule 3 tubos de ensayo, para realizar los experimentos a 4°C, temperatura

ambiente y 50°C.

2. Agregue a todos los tubos 2mL de almidón al 0,5%.

3. Al primer tubo llévelo a 4°C en hielo, el segundo a temperatura ambiente y el

tercero a 50°C en baño maría.

4. Agregue a todos los tubos 0.5mL del extracto enzimático.


(o la cantidad apropiada), esto para cada reacción. Repita este procedimiento en

intervalos de 2 minutos durante 10 minutos.


Tabla 5.4.


7/9

5. RESULTADOS Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS.

Método 1: Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática

Tabla 5.1 Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática

1. Con los datos obtenidos construya una tabla tomando como concentración del

enzima el volumen de la solución de extracto enzimático utilizado en cada tubo.2. Con estos datos construya un gráfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad

de reacción (1/t) en el eje abscisas. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de

reacción el inverso del tiempo?

3. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación

mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los

enlaces del almidón. Plantee las conclusiones que se pueden obtener de los

resultados del experimento.

4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo.

Método 2: Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una reacción enzimática

Tabla 5.2 Resultados del efecto del tiempo y el pH sobre la actividad enzimática

Tiempo de reacción(Minutos)

Observación

pH 7.0 pH 4.00

3

5

810

15

20

25

30


Observación

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 40

10

20

30

40

50

60


8/9

Anote si la reacción en cada tubo es positiva o negativa y anote el tiempo en que seagota el almidón. Llene con sus resultados la tabla 4.2.

1. ¿Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la

realización de este ensayo?

2. Si hubo diferencia en los tiempos de reacción, ¿cómo explicaría esta diferencia?

Método 3: Estudio del efecto de la [S] sobre la velocidad de la reacción enzimática

Tabla 5.3. Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática

1. Con los datos obtenidos construya una tabla, tomando como valor de [S] el del

mismo volumen de sustrato medido en cada tubo.

2. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción

(volumen/tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de

abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro

experimento). ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción

es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?3. Analice el gráfico y plantee las conclusiones a las que puede llegar en este caso.

4. Describa las dificultades presentadas en este ensayo.

Método 4: Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática

Tabla 5.4 Resultados del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

1. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la Tabla 4.4.

2. Plantee las conclusiones que obtuvo en este ensayo.


ObservaciónTubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

0

10

20

30

40

50

60

Tiempo de reacción(minutos)

Observación

4°C Temperatura ambiente 50°C

0

24

6

8

10


9/9

Preguntas

1. Consulte con los demás grupos de trabajo, las velocidades de actividad de cada

amilasa salival y compare la suya con la de ellos, identificando la amilasa

aparentemente más rápida y la más lenta, y dando una posible explicación para

la variabilidad (si la hay).

2. Ofrezca una explicación a la variación de la actividad de la enzima a diferentes

pHs y diferentes temperaturas.

3. Ofrezca una explicación de por qué no podemos digerir a otro polisacárido de

glucosas como la celulosa. Para esto, mire los tipos de enlace que ocurren en el

almidón y los de la celulosa.

4. Consulte sobre el gen de la amilasa salival en humanos comparado con el deotros primates, y de una explicación de por qué la capacidad de degradar

almidón en la saliva pudo haber sido un factor importante en el desarrollo de las

civilizaciones humanas.

http://www.unav.es/acienciacierta/salud/amilasa.html,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2377015/, y

http://blogs.scientificamerican.com/guest-blog/2012/07/23/human-ancestors-

were-nearly-all-vegetarians/).
https://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.unav.es%2facienciacierta%2fsalud%2familasa.htmlhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.unav.es%2facienciacierta%2fsalud%2familasa.htmlhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2fpmc%2farticles%2fPMC2377015%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2fpmc%2farticles%2fPMC2377015%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2fpmc%2farticles%2fPMC2377015%2fhttps://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.unav.es%2facienciacierta%2fsalud%2familasa.html

2014-2 p9. Estudio Cinético de Alfa-Amilasa

Documents

Transcript of 2014-2 p9. Estudio Cinético de Alfa-Amilasa