Universidad de Guanajuato

División de ciencias naturales

y exactas

Laboratorio de QUÍMICA ORGANICA

Practica No.5

Cromatografía en columna: separación

de pigmentos de cloroplastos

Escalera Pérez Juan Alfonso

Q.F.B

Laboratorio De Química OrgánicaCromatografía en columna: separación de pigmentos de cloroplastos

Practica No. 5

Cromatografía en columna: separación de pigmentos de cloroplastos

Objetivo

Aprender la técnica de cromatografía en columna mediante la separación de los

componentes (coloridos visibles) de una mezcla. Además aplicar la técnica de

cromatografía en capa fina para monitorear la separación en una columna

cromatográfica.

Introducción

La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para la

separación, a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se

encuentren en estado sólido o líquido.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el  absorbente, se

coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para

controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se

impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos

interesa separar la depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase

móvil podrá ir atravesando el sistema.

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la

columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que

son por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras

en salir de la columna. En cambio, las sustancias más polares, quedan retenidas por más

tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la

finalidad de incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos.

El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con

el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada

compuesto en una condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el

absorbente usado, el disolvente, la presión, el diámetro que tenga la columna utilizada,

etc.

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El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de

sílice. A veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la

mezcla a cromatografiar, se utilizan la alúmina  o el florisil (silicato magnésico). La

cromatografía en columna puede realizarse por gravedad o a media presión. Cuando

se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la columna a un compresor o a una

línea de aire comprimido.

La medida de las partículas de gel de sílice para realizar las cromatografías a media

presión debe ser más pequeñas que en el caso de la cromatografía por gravedad. Si en la

cromatografía por gravedad utilizásemos un gel de sílice con un tamaño de partículas

más pequeñas, no se produciría elución, pues se impediría el flujo del disolvente. Pero

en cambio, si aplicamos presión, entonces debido a la fuerza si se produciría la elución

por el disolvente.

A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se produce una

separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media presión, produce mejores

resultados que la cromatografía por gravedad, y además, al ser más rápida, es la más

utilizada.

Cuando vamos a realizar una cromatografía en columna, lo primero que debemos hacer

es elegir un disolvente adaptado para nuestro caso, para así optimizar la separación de

los componentes de la mezcla. Dicha operación se produce a través de cromatografía

analítica en capa fina. La variante más influyente en la eficacia de la separación de la

cromatografía a media presión usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así

como la cantidad de gel utilizado.

Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina de la

muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de los

componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar a un Rf

cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un eluyente menos

polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en placa.

A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente. Para esto,

la cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad adecuada para

poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez recogido, se aumentará

poco a poco la polaridad para poder ir separando los componentes más polares. Si

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cuando se empieza la cromatografía se usa un disolvente excesivamente polar, los

componentes de la mezcla eluirán conjuntamente, lo que llevaría a que la separación no

tenga lugar. Una de las mezclas de disolventes más utilizadas es hexano/acetato de

etilo.

Fotosíntesis

La fotosíntesis es la conversión de materia inorgánica en materia orgánica gracias a la

energía que aporta la luz. En este proceso la energía luminosa se transforma enenergía

química estable, siendo el adenosín trifosfato (ATP) la primera molécula en la que

queda almacenada esa energía química.

Los orgánulos citoplasmáticos encargados de la realización de la fotosíntesis son

los cloroplastos, unas estructuras polimorfas y de color verde (esta coloración es debida

a la presencia del pigmento clorofila) propias de las células vegetales. En el interior de

estos orgánulos se halla una cámara que contiene un medio interno llamado estroma,

que alberga diversos componentes, entre los que cabe destacar enzimas encargadas de la

transformación del dióxido de carbono en materia orgánica y unos sáculos aplastados

denominados tilacoides o lamelas, cuya membrana contiene pigmentos fotosintéticos.

En términos medios, una célula foliar tiene entre cincuenta y sesenta cloroplastos en su

interior.

La fotosíntesis se realiza en dos etapas: una serie de reacciones que dependen de la luz y

son independientes de la temperatura, y otra serie que dependen de la temperatura y son

independientes de la luz.

La velocidad de la primera etapa, llamada reacción lumínica, aumenta con la intensidad

luminosa (dentro de ciertos límites), pero no con la temperatura. En la segunda etapa,

llamada reacción en la oscuridad, la velocidad aumenta con la temperatura (dentro de

ciertos límites), pero no con la intensidad luminosa.

Fase primaria o lumínica

La fase lumínica de la fotosíntesis es una etapa en la que se producen reacciones

químicas con la ayuda de la luz solar y la clorofila.

La clorofila capta la luz solar, y provoca el rompimiento de la molécula de agua,

separando el hidrógeno del oxígeno ; es decir, el enlace químico que mantiene unidos al

hidrógeno y al oxígeno de la molécula de agua, se rompe por efecto de la luz.

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El proceso genera oxígeno gaseoso que se libera al ambiente, y la energía no utilizada es

almacenada en moléculas especiales llamadas ATP. En consecuencia, cada vez que la

luz esté presente, se desencadenará en la planta el proceso descrito.

Fase secundaria u oscura

La fase oscura de la fotosíntesis es una etapa en la que no se necesita la luz, aunque

también se realiza en su presencia. Ocurre en los cloroplastos y depende directamente

de los productos obtenidos en la fase lumínica.

En esta fase, el hidrógeno formado en la fase anterior se suma al dióxido de carbono

gaseoso presente en el aire, dando como resultado la producción de compuestos

orgánicos, principalmente carbohidratos; es decir, compuestos cuyas moléculas

contienen carbono, hidrógeno y oxígeno.

Dicho proceso se desencadena gracias a una energía almacenada en moléculas de ATP

que da como resultado el carbohidrato llamado glucosa, un tipo de compuesto similar al

azúcar, y moléculas de agua como desecho.

Después de la formación de glucosa, ocurre una secuencia de otras reacciones químicas

que dan lugar a la formación de almidón y varios carbohidratos más.

A partir de estos productos, la planta elabora lípidos y proteínas necesarios para la

formación del tejido vegetal, lo que produce el crecimiento.

Cada uno de estos procesos no requiere de la participación de luz ni de la clorofila, y

por ende se realiza durante el día y la noche.

El resultado final, y el más trascendental, es que la planta guarda en su interior la

energía que proviene del Sol.  Esta condición es la razón de la existencia del mundo

vegetal porque constituye la base energética de los demás seres vivientes.

Carotenos

 Son pigmentos orgánicos con función antioxidante del grupo de los isoprenoide que

pueden ser encontrados de forma natural en organismos fotosintéticos como las plantas,

algas, algunos tipos de bacterias y hongos. Son conocidos más de 700 compuestos

pertenecientes a este grupo, los cuales se dividen en dos tipos básicos: los carotenos,

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que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados. Los carotenoides se

caracterizan por su color intenso (como el rojo, anaranjado y amarillo).

Todos los organismos que dependen del sol para obtener energía, sean bacterias o

plantas, contienen carotenoides.

Su efecto antioxidante hace que estos compuestos tengan un papel esencial para

proteger a los organismos de daños durante la fotosíntesis. Una de las funciones

principales de los carotenoides tiene que ver claramente con absorbancia de la luz en el

proceso de la fotosíntesis.

Clorofila

La función de las clorofilas es la absorción de energía luminosa en la variante de la

fotosíntesis que llamamos fotosíntesis oxigénica, la que es característica de los

organismos antes enumerados.

El principal papel de las clorofilas en la fotosíntesis es la absorción de fotones de luz

con la consiguiente excitación de un electrón. Ese electrón excitado cede su energía,

volviendo al estado normal, a algún pigmento auxiliar (a veces otras clorofilas), donde

se repite el fenómeno. Al final el electrón excitado facilita la reducción de una

molécula, quedando así completada la conversión de una pequeña cantidad de energía

luminosa en energía química, una de las funciones esenciales de la fotosíntesis.

Procedimiento

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Parte a.- Extracción de pigmentos

Pese 0.5 g de hojas de espinacas frescas (no use tallos o venas gruesas). Corte las hojas en

pequeños trozos y colóquelas en un mortero junto con 1.0 ml de acetona fría. Muélalas con el

pistilo, adicione mas acetona si se requiere (0.5 a 1.0 ml) hasta obtener una “papilla” espesa.

Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga, enjuague el mortero y pistilo con 1.0 ml de acetona

fría y transfiera los lavados al tubo. Tape el tubo y agite vigorosamente, ventile y deje reposar.

Adicione al tubo 2.0 ml de hexano y tápelo, agite la mezcla exhaustivamente y ventile. Adicione

2.0 ml de agua, agite y ventile. Centrifugue la mezcla para romper la emulsión, lo cual se

observa cuando aparece una capa verde turbia a la mitad de la mezcla. Si no se cuenta con una

centrifuga agite vigorosamente hasta lograrlo. Transfiera a un tubo limpio la fase orgánica que

contiene los pigmentos. Seque con sulfato de sodio anhidro y extraiga la fase orgánica. Marque

este tubo con una E (extracto) para no confundirlo con los otros tubos que se utilizarán

posteriormente. Tape el tubo con el extracto y colóquelo en un lugar seguro hasta que tenga lista

su columna para correr la cromatografía.

Parte b,. Cromatografía en columna

Preparación previa

Antes de correr la columna, prepare el siguiente material y líquidos. Prepare 5 tubos de ensaye y

numérelos. Prepare dos pipetas Pasteur, calibre una para medir 0.25 ml. Prepare cuatro

recipientes separados, en uno coloque 10.0 ml de hexano, en el siguiente 6 ml de la solución

hexano 70% - acetona 30% (v/v); en otro 6 ml de acetona y en el cuarto 6 ml de la mezcla

acetona 80% - metanol 20%. Márquelos claramente.

Prepare la columna para cromatografía empacándola con alúmina. Coloque un tapón no muy

apretado de algodón en la base de una pipeta Pasteur. Adicione 1.25 g de alúmina,

aproximadamente, a la pipeta hasta llenar ¾ partes de la altura de la pipeta, como se muestra en

la figura siguiente:

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Algodón

Alúmina

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Cuide que la alúmina quede bien empacada, sin aire. Vaya dando golpes con el canto de la

mano a la pipeta para lograr esto hasta asegurarse que el nivel de la alúmina no desciende más.

Si la columna no está bien empacada se facturará.

Sostenga la columna con unas pinzas a una altura adecuada para poder colocar los tubos y

colectar las fracciones. Coloque debajo de la columna el tubo numero 1.

Corriendo la columna cromatográfica.

Usando una pipeta Pasteur adicione 3.0 ml de hexano a la columna. La columna debe estar

completamente humedecida por el disolvente. Drene el exceso de hexano hasta el nivel que el

hexano alcance el tope de la alúmina. Una vez que se haya adicionado el hexano a la alúmina,

no debe permitirse que la columna se seque, si es necesario adicione mas hexano.

Nota: Es esencial que el nivel del líquido no baje del tope de la alúmina en ningún momento.

Si la alúmina se seca se puede fragmentar y taparse.

Cuando el nivel del hexano alcanza el tope de la alúmina, adicione aproximadamente 0.25 ml

del extracto E a la columna. Deje el remanente en el tubo de ensaye para el procedimiento de

cromatografía en capa fina. (Tape el tubo y colóquelo en un lugar seguro). Continúe colectando

el eluente en el tubo numero 1. A medida que la solución del pigmento penetra en la columna,

adicione hexano y drene hasta que el líquido alcance el nivel de la parte superior de la alúmina.

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Adicione más hexano hasta que la banda amarilla se separe de la banda verde, continúe

adicionado hexano hasta que la banda amarilla pase a través de la columna. Si la banda amarilla

no se separa de la banda verde, cambie al siguiente solvente más polar (hexano 70% - acetona

30%). Al hacer el cambio de disolventes, no adicione el nuevo disolvente hasta que el anterior

haya penetrado en la alúmina. Cuando se haya encontrado el disolvente adecuado, adiciónelo

hasta que la banda amarilla pase a través de la columna. Antes de que la banda amarilla alcance

el fondo de la columna coloque debajo de la columna el tubo número 2. Cuando el eluente

llegue a perder el color cambie de tubo (el volumen total del material amarillo debe ser menor

de 2 ml), coloque el tubo número 3 debajo de la columna.

Esquema de separación de dos componentes por cromatografía en columna.

Adicione varios ml del disolvente más polar cuando el nivel del último disolvente esta casi al

tope de la alúmina. Si la banda verde se mueve a través de la columna, continúe adicionado este

disolvente hasta que la banda verde sea eluída completamente de la columna. Si la banda verde

no se mueve o si una banda amarilla difusa empieza a moverse, cambie al siguiente solvente

más polar. Cambie de disolvente según sea necesario. Colecte la banda verde en el tubo 4.

Cuando observe poco o ningún color verde en el eluente, coloque el tubo número 5 bajo la

columna y detenga el procedimiento. Las fracciones obtenidas las usará en la parte C.

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Parte c.- Cromatografía de capa fina. (ccf)

Usando un baño de agua tibia (40-60oC), evapore el disolvente del tubo que contiene la banda

amarilla (tubo 2), del tubo que contiene la banda verde (tubo 4), y del tubo conteniendo la

solución del pigmento original (tubo E). Tan pronto como el disolvente se ha evaporado de cada

uno de los tubos, retírelos del baño de agua. No permita que ninguno de los tubos permanezca

en el baño de agua después de que el disolvente se haya evaporado. Tápelos y colóquelos en un

lugar seguro.

Prepare su placa para CCF, tenga cuidado de no doblarlas para que el adsorbente no se fracture.

Trate de sostenerla solo por las orillas, la superficie no debe tocarse. Aplique la muestra

utilizando un capilar de vidrio.

Prepare el disolvente revelador, en este caso es una mezcla de hexano 70% - acetona 30% y un

vaso de precipitados de un tamaño adecuado en donde quepa la placa sin doblarse. En el vaso

coloque un trozo de papel filtro que cubra parte de las paredes, deje un espacio sin cubrir aprox.

3 cm. Coloque la placa en el interior del vaso de precipitados evitando que esta toque el papel

filtro en algún punto pues el disolvente se difundiría sobre la superficie del adsorbente en ese

punto.

Con una pipeta Pasteur adicione dos gotas del disolvente revelador (hexano 70% - acetona 30%)

a cada uno de los tres tubos de ensaye que contienen los pigmentos. Agite los tubos de tal

manera que logre disolver lo más que se pueda los pigmentos. Aplique las tres muestras (banda

amarilla, banda verde y extracto) sobre la placa de CCF. Para la banda verde (tubo 4) toque una

vez con el capilar la placa de CCF, el punto de aplicación de la muestra no debe ser mayor de 2

mm de diámetro y debe ser color verde oscuro. Para la banda amarilla (tubo 2), debe repetir la

aplicación de la muestra de 5 a 10 veces hasta que el punto de aplicación tenga un color

amarillo definido. Deje evaporar el disolvente entre aplicaciones sucesivas. Aplique la muestra

exactamente en la misma posición cada vez. Guarde las muestras liquidas en caso de que

necesite repetir la CCF.

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Revelado de la placa de CCF

Coloque la placa de CCF en el vaso de precipitados preparada con el papel filtro y el disolvente,

asegurándose de que el volumen de disolvente en la cámara de revelado quede debajo del nivel

en donde se aplicó la muestra. Detenga la cromatografía cuando el disolvente este a 1 cm de la

orilla superior de la placa, marque la posición hasta donde llega el solvente con un lápiz. Tan

pronto como la placa seque dibuje un círculo en los puntos a donde se movió la muestra y anote

los colores. Es necesario que marque el corrimiento de la muestra en cuanto seque el plato

pues algunos pigmentos cambian de color cuando son expuestos al aire.

Parte A.-

Parte B.-

Antes de comenzar a correr la cromatografía preparar:

Marcar 5 tubos

Calibrar una pipeta Pasteur a 0.25 ml

En cuatro tubos:

a) 10 ml de hexano 90%/Acetona 10%

b) 6ml de hexano 70%/Acetona 30%

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Moler en un mortero la

espinaca con acetona

Lavar

Con acetona

Agitar

vigorosamente

Adicionar 2ml

de hexano y 2

ml de agua

destilada

Ventilar

Y dejar

reposar

CentrifugarDecantar el

extracto

Secar con Na2SO4 y

guardar

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c) 6ml de acetona

d) 6ml de Acetona 80%/Metanol 20%

Parte C.-

70

Cálculos y resultados.-

Parte B.

En la parte b se obtuvo 6 bases, con 4 diferentes tonos de verde y otros 2 tonos de

amarillo. Se cambió la alumina por silica gel.

Parte C.-

En el extracto se vieron los siguientes componentes por coloración y su acomodo adecuado

con respecto al RF

Carotenos (la mancha amarilla) Feofitina a (gris) Feofitina b (gris muy claro) Clorofila a (azul-verde) Clorofila b (verde) Xantofilas (posiblemente tres manchas amarillas)

Tabla de reactivos

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En la columna agregar hexano

hasta el tope

Agregar 0.25 ml del extracto y

seguir agregando hexano

Recibir la banda amarilla en un

tubo

Cambiar de tubo para recibir el solvente

Recibir la banda verde en otro tubo

Dejar el solvente sobrante en el tubo de solvente

Evaporar disolvente en los tubos con pigmento

A la muestra seca agregar unas gotas del disolvente revelador

Correr la cromatografía con una placa

comercial

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COMPUESTO p. fusión °C

p. ebullición °C

Solubilidad en agua

Toxicidad

Sílica gelO2Si

- - Insoluble .

MetanolCH3OH

-98 65 Miscible

HexanoC6H14

-95 69 0.0013g/ml

AcetonaCH3COCH3

-94 56.5 Miscible .

AlúminaAl2O3

2050 2980 0.001g/L

Conclusión

Realizamos con éxito esta práctica. Obteniendo los resultados esperados

Dado al buen desempeño en esta práctica logramos obtener una cantidad de 7 colores en

la columna cromatográfica.

Separación de los Pigmentos Clorofila y Carotenoides de Hojas

de Espinacas

1. La cromatografía en columna al igual que la cromatografía en capa delgada son técnicas de separación sólido–liquido. ¿Cuales son los dos sólidos adsorbentes mas comúnmente usados y cuales son sus fórmulas generales?

Silica gel y alumina

2. ¿Qué significa que una sustancia tenga:

a) rf < 0.5 ? Corre una distancia menor que la mitad del disolvente,

tienen polaridad diferente

b) rf = 0.5 ? Corre una distancia igual a la mitad del disolvente,

tienen polaridad intermedia

c) rf > 0.5 ? Corre una distancia igual a la mitad del disolvente,

tienen polaridad intermedia

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3. ¿Que tipo de sustancia se enlaza mas fuertemente a la alúmina (o a la sílica gel)?

a) polarb) no polarc) adsorbented) eluente

4. En la técnica de cromatografía en columna el término eluente se refiere a:

a) los componentes de una mezcla que son separadosb) el adsorbentec) el absorbente d) el disolventee) una solución diluida

5. En que orden se colocan los componentes de una columna cromatográfica?

a) Algodón, adsorbente, eluenteb) Eluente, algodón, adsorbentec) Algodón, eluente, adsorbented) Adsorbente, algodón, eluente

6. En este experimento, el adsorbente es:

Silica gel

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7. En este experimento la banda verde es eluída con un solvente de baja polaridad mientras que la banda amarilla es eluída con un solvente de alta polaridad

a) verdaderob) falsoc) la separación se basa en sus pesos moleculares y no es su polaridad

8. A medida que los componentes de una mezcla son separados después de haber pasado a través de la columna las diferentes fracciones son colectadas en series de a) viales de reacciónb) tubos de ensaye marcadosc) placas de cromatografía de capa finad) matraces de filtración

9. ¿Porqué las clorofilas son menos móviles en la columna cromatográfica y porqué tienen valores menores que los carotenos?

Por ser polar

10. Como variarían los valores Rf de los pigmentos si se aumentara la concentración relativa de acetona en el solvente de revelado.

La clorofila tendría un Rf mayor al de los carotenos

11. Una mezcla que contiene tres compuestos orgánicos A, B y C, será separada por columna cromatográfica. Un análisis preliminar por cromatografía de capa fina dió los siguientes resultados:

A B C

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Metanol ciclohexano tolueno

a) Explique el comportamiento de cada solvente en la columna cromatográfica. ¿Cúal solvente o solventes escogería para desarrolar la columna cromatográfica y llevar a cabo la separación de A, B y C?

Metanol y tolueno, para que corrieran diferentes distancias cada uno y no

quedaran juntos.

b) ¿Cúal solvente o solventes escogería para correr la columna cromatográfica si solamente se desea A y los dos restantes serán descartados?

Ciclohexano

Bibliografía

Jan Koolman. Bioquímica: texto y atlas (tercera edición). Edit. Médica Panamericana.(Pág. 128-133)

Rodés García Rosa. Manual de prácticas de fotosíntesis. Edit. Las prensas de ciencias.(Pág. 27)

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