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MONOGRAFA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNTICOS EN ELCRECIMIENTO DE E. col i Y S. cerevisiaeY LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR

FSFORO EN Pseudomo nas sp Y Baci l lus sp, DE USO INDUSTRIAL

SANDRA JOHANA HERNNDEZ JIMNEZ

Cd. 1.088.288.470

ESTEFANIA LUCERO DOMNGUEZ TORO

Cd. 1.088.293.270

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGIA

TECNOLOGIA QUMICA

PEREIRA, RISARALDA

2014

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MONOGRAFA SOBRE LA INFLUENCIA DE CAMPOS MAGNTICOS EN ELCRECIMIENTO DE E. col i Y S. cerevisiaeY LA CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR

FSFORO EN Pseudomo nas sp Y Baci l lus sp, DE USO INDUSTRIAL

SANDRA JOHANA HERNNDEZ JIMNEZ

Cd. 1.088.288.470

ESTEFANIA LUCERO DOMNGUEZ TORO

Cd. 1.088.293.270

Proyecto de Grado Modalidad Monografa presentado como requisito finalpara optar al ttulo de Tecnloga Qumica

Director de Trabajo de Grado

Luis Gonzaga Gutirrez

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA

FACULTAD DE TECNOLOGIATECNOLOGIA QUMICA

PEREIRA, RISARALDA

2014

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Nota de aceptacin

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Presidente del Jurado

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AGRADECIMIENTOS.

A nuestros padres y hermanos por su apoyo incondicional, al brindarnoscomprensin, recursos, tiempo, paciencia y amor. Por estar en los momentos ms

difciles de nuestra vida estudiantil y animarnos con sus palabras de aliento.A nuestro Director Luis Gonzaga Gutirrez por tan valiosa ayuda en la bsquedade alcanzar la meta. Por ofrecernos su tiempo y asesora en el momento quenecesitbamos con paciencia. Por darnos la oportunidad de trabajar con l yadquirir nuevos conocimientos. Al profesor Fernando Areiza por su contribucin ala monografa.

A todos nuestros amigos, por permitirnos pasar momentos felices a su lado,aprender y recordar con cario nuestro paso por la Universidad Tecnolgica dePereira.

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GLOSARIO.

- Absorvancia:Medida de la intensidad de luz que absorbe la muestra a unalongitud de onda establecida.

- Antgeno: Sustancias como protenas y polisacrido que desencadenan laformacin de anticuerpos.

- ATP: El trifosfato de adenosina es una fuente energtica necesaria paratodas las formas de trabajo biolgico.

- Campo magntico: Cargas con movimiento, paralelo a una corriente

producida por otras cargas y que experimenta una fuerza perpendicular asu propia velocidad.

- Carga microbiana: Nmero de microorganismos viables presentes en unelemento determinado.

- Clula fotoelctrica:nodo y ctado que convierte la energa luminosa enenerga elctrica.

- Colonia bacteriana: Agrupacin de microorganismos originados de unanica clula y que se incrementan durante un intervalo de tiempo

determinado.

- Diploide: Clula somtica que posee dos copias de cada cromosoma.

- Densidad de Flujo magntico: Medida de la concentracin de lneas deflujo en una seccin puntual del circuito electromagntico. Tambin sedefine comoel flujo magntico por unidad de rea y su unidad es el tesla.

- Espectrofotmetro: Instrumento utilizado para cuantificar microorganismosy sustancias qumicas al medir la longitud de onda.

- Espora Bacteriana: Estructura en la que el microbio forma una capsulaque protege al material gentico de las condiciones adversas, como altatemperatura y escases de nutrientes.

- Fimbrias: Grupo de filamentos filiformes cortos que rodean algunasbacterias gram negativas.
http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.saludmed.com/CsEjerci/Imagenes/ATP-1e.gif&imgrefurl=http://www.saludmed.com/CsEjerci/FisioEje/F-Energ.html&usg=__JGKj4AtAnvy8axLu3romcx0GLCg=&h=384&w=587&sz=28&hl=es&start=15&tbnid=lKGWABMtzq7eIM:&tbnh=88&tbnw=135&prev=/images%3Fq%3DENERGIA%2BATP%252BACTIVIDAD%2BFISICA%26hl%3Deshttp://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.saludmed.com/CsEjerci/Imagenes/ATP-1e.gif&imgrefurl=http://www.saludmed.com/CsEjerci/FisioEje/F-Energ.html&usg=__JGKj4AtAnvy8axLu3romcx0GLCg=&h=384&w=587&sz=28&hl=es&start=15&tbnid=lKGWABMtzq7eIM:&tbnh=88&tbnw=135&prev=/images%3Fq%3DENERGIA%2BATP%252BACTIVIDAD%2BFISICA%26hl%3Des

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- Flagelos peritricos: Apndices similares a pelos sobresalientes de lapared celular. Permiten al microbio moverse y rodean toda la superficiebacteriana.

- Flujo magntico: Nmero total de lneas de fuerza que atraviesa unasuperficie. La unidad del flujo magntico es el voltio segundo (Vs) o weber(Wb).

- Haploide: Clula cuya dotacin gentica consta de solo un par decromosomas en su ncleo.

- Manitol:Azcar derivado de la manosa o fructuosa.

- Medio EMB: Medio Eosina azul de metileno, selectivo para el aislamientode enterobacteriasy otras bacterias gram negativas.

- Meiosis: Es un proceso en que se origina cuatro gametos con la mitad delos cromosomas de la clula inicial.

- Metabolitos secundarios: Mezcla de compuestos qumicos que tienedistribucin taxonmica restringida y se forman al terminar el crecimiento.

- Mitosis: Reproduccin en la que se forman dos clulas idnticas a laoriginal.

- Paramagnetismo:Caracterstica de algunos materiales para magnetizarse

al ser sometidos a la accin de un campo magntico, por lo que se imantaen el mismo sentido del campo.

- Pilis:Estructura con forma de pelos, anclados a la membrana de algunasbacterias. Involucradas en la conjugacin bacteriana.

- Plasmlisis: Fenmeno en el que la clula pierde agua, aumentando laviscosidad intracelular y disminuye el volumen, por lo que la membranacitoplasmtica se retrae.

- Presin osmtica: Tipo de presin celular en la que se evita que pase

solvente a travs de una membrana semipermeable, al ejercer una presinmayor que la del diluyente puro.

- Radicales libres: Molcula o tomo que tiene uno o ms electronesdesapareados y pueden existir en dicha forma. Son molculas reactivasque producen la oxidacin de las clulas y cambios en el ADN.

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- Transmitancia: Cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en unadeterminada longitud de onda.

- Telsa: Unidad para expresar la densidad del flujo magntico (B). 1 Telsa (T)

= 104 Gauss

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RESUMEN.

La estimulacin magntica de microorganismos ha sido de inters investigativo

debido a sus aplicaciones industriales e impacto positivo en el medio ambiente.Por ello, se ha visto como una alternativa viable para cambiar el crecimientomicrobiano y la capacidad de solubilizar fsforo.

Adems, el crecimiento celular es el parmetro ms importante en el estudiomicrobiolgico, ya que es utilizado como base para medir la eficiencia en otraspropiedades de los microorganismos, tales como el metabolismo y la produccinde sustancias de inters cientfico y tecnolgico. Por tal motivo, se describe larespuesta al campo magntico de Escherichia coli, el microorganismo msestudiado por habitar en ambientes cotidianos para el ser humano, y

Saccharomyces cerevisiae con aplicaciones en la industria alimenticia.Por otra parte, los microorganismos solubilizadores de fosfatos son de granimportancia para la industria agrcola. Gracias a ellos las plantas pueden asimilarel fsforo que no logran procesar por s mismas, ayudando as a su crecimiento.En este trabajo se profundiza en Pseudomonas sp y Bacillus sp por ser buenossolubilizadores de fsforo y por su capacidad para degradar los sustratos

De ah, que sea importante recopilar la informacin cientfica disponible, donde sedescriben los mecanismos por los cuales las microbios se reproducen y/osolubilizan fsforo, y la respuesta de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae,Pseudomonas sp y Bacillus sp, a campos magnticos con densidades variables ysu aplicacin industrial.

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CONTENIDO

GLOSARIO. ............................................................................................................. 5

RESUMEN. .............................................................................................................. 8

INTRODUCCIN ................................................................................................... 14

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 15

JUSTIFICACIN .................................................................................................... 16

OBJETIVOS ........................................................................................................... 18

METODOLOGA .................................................................................................... 19

CAPITULO 1.......................................................................................................... 20

MARCO CONCEPTUAL ........................................................................................ 20

1.1 CAMPOS MAGNTICOS. ........................................................................ 20

1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO. ................................................................ 24

1.2.1 Nutrientes. .......................................................................................... 24

1.2.2 Actividad del Agua. ............................................................................. 25

1.2.3 Temperatura. ...................................................................................... 25

1.2.4 pH. ...................................................................................................... 26

1.2.5 Oxgeno. ............................................................................................. 27

1.3 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR. ................................................... 29

1.3.1 Fase de Latencia. ............................................................................... 30

1.3.2 Fase de Crecimiento Logartmico o Exponencial. .............................. 30

1.3.3 Fase Estacionaria. .............................................................................. 30

1.3.4 Fase de Declinacin o Muerte Celular. ............................................. 31

1.4 TIPOS DE REPRODUCCIN EN MICROORGANISMOS. ...................... 31

1.4.1 REPRODUCCIN ASEXUAL. ........................................................... 32

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1.4.1.1 Biparticin (divisin binaria). .................................................................. 32

1.4.1.2 Gemacin. ............................................................................................. 33

1.4.1.3 Mitosis. .................................................................................................. 33

1.5 ALGUNOS MTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR ENMICROORGANISMOS. ...................................................................................... 35

1.5.1 Recuento en placa. ............................................................................ 35

1.5.2 Filtracin. ............................................................................................ 37

1.5.3 Nmero ms probable (NMP). ........................................................... 37

1.5.4 Espectrofotometra y escala de Mcfarlan. .......................................... 39

1.5.5 DETERMINACIN DE LA SOLUBILIZACIN DE FOSFATOS EN ELLABORATORIO. ............................................................................................. 43

1.5.5.1 Preparacin del inculo. ........................................................................ 43

1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIN DE FSFORO. ................................ 44

1.6.1 En medio slido: ................................................................................. 44

1.6.2 En medio lquido................................................................................. 44

1.7 SOLUBILIZACIN DE FSFORO. .......................................................... 45

1.7.1 Ciclo del Fsforo. ............................................................................... 45

1.7.2 Capacidad de solubilizar fsforo de los microorganismos. ................. 46

1.8 Resistencia a los Antibiticos. .................................................................. 47

2 CAPITULO 2 ................................................................................................... 48

ESTIMULACIN MAGNTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO. ....................... 48

2.1 Escherichia coli. ........................................................................................ 48

2.2 Saccharomyces cerevisiae. ...................................................................... 54

3 CAPTULO 3. .................................................................................................. 59

ESTIMULACIN MAGNTICA Y CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FSFORO. ... 59

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3.1 Pseudomonas sp. ..................................................................................... 59

3.2 Bacillus sp. ................................................................................................ 64

3.2.1 GENERADOR DE CAMPO MAGNTICO UTILIZADO PARAESTIMULAR Bacillus substitute...................................................................... 67

3.3 APLICACIONES INDUSTRIALES DE ESTIMULAR MAGNETICAMENTEMICROORGANISMOS. ...................................................................................... 69

DISCUSIN GENERAL ......................................................................................... 70

CONCLUSIONES: ................................................................................................. 74

BIBLIOGRAFA ...................................................................................................... 75

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NDICE DE TABLAS.

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TABLA 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos.. .............................. 28

TABLA 2. Propagacin celular ..................................................................................................................... 34

TABLA 3. NMP para calcular carga microbiana. ....................................................................................... 38

TABLA 4. Modelo de ensayo para calcular NMP. ..................................................................................... 39

TABLA 5. Nmero equivalente de microorganismos en la serie de tubos. ........................................... 41

TABLA 6. Proporcin de reactivos para preparar la escala de McFarland. .......................................... 41

TABLA 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos ............................................... 42

TABLA 8. Resumen de parmetros utilizados para estimular magnticamente E. coli...................... 51

TABLA 9. Resumen de parmetros utilizados para estimular magnticamente S. cerevisiae........... 57

TABLA 10. Resumen de parmetros utilizados para estimular magnticamente Pseudomonas sp.62

TABLA 11.Resumen de parmetros utilizados para estimular magnticamente Bacillus sp............ 68TABLA 12. E.colisometida a 2 mT. ............................................................................................................. 71

TABLA 13. Crecimiento de S. cerevisiaey efecto de las variables. ....................................................... 72

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NDICE DE FIGURAS.

Pg.

FIGURA 1. Parmetros bobina de Helmholtz. ........................................................................................... 20

FIGURA 2. Estimulacin magntica usando un Solenoide. ..................................................................... 21

FIGURA 3. Imn superconductor para estimular magnticamente S. cerevisiae. .............................. 22

FIGURA 4. Bobina para la exposicin de cultivos de clulas. ................................................................. 23

FIGURA 5. Bobina para la exposicin de cultivos de clulas en erlenmeyers. .................................... 23

FIGURA 6. Forma de las clulas bacterianas. ........................................................................................... 29

FIGURA 7. Curva de crecimiento microbiano. ........................................................................................... 31

FIGURA 8. Reproduccin asexual por biparticin. .................................................................................... 32

FIGURA 9. Levadura en proceso de gemacin. ........................................................................................ 33

FIGURA 10. Divisin celular por mitosis. .................................................................................................... 34

FIGURA 11. Diluciones sucesivas. .............................................................................................................. 36

FIGURA 12. Colonias rojas de coliformes en medio Tipo-Endo que contiene lactosa........................ 37

FIGURA 13. Fundamento de espectrofotometra en crecimiento celular. ............................................. 40

FIGURA 14. Turbidez de mcfarland comparado con una solucin microbiana y un tubo inocuo...... 41

FIGURA 15. Vista de Escherichia colien microscopio de fuerza atmica. ........................................... 48

FIGURA 16. Reproduccin de clulas haploide y diploide de la levadura S. cerevisiae..................... 55

FIGURA 17. Pseudomona spcon flagelos. ................................................................................................ 60FIGURA 18. Vase el halo de fsforo solubilizado alrededor de la colonia de Pseudomonasen agar

pikovskaya. ............................................................................................................................................. 60

FIGURA 19. Bacillus sp. ................................................................................................................................ 64

FIGURA 20. Influencia del campo magntico alterno, en el fondo congelacin y su accincombinada en el crecimiento de Bacillus cereus: A.Es el control; B. Alternando mf; C. Accinde Bacillus cereusen fro; D. Accin del campo magntico en fro.............................................. 66

FIGURA 21. Generador de campo magntico. .......................................................................................... 67

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INTRODUCCIN

El campo magntico es una propiedad fsica que influye en los seres vivos, por loque, es de inters cientfico y tecnolgico estudiar cmo acta enmicroorganismos y su aprovechamiento en la industria alimentaria, agro ytratamiento de aguas, entre otros.

Investigaciones fijan su atencin en un parmetro importante de microbiologa, elcrecimiento, ya que las bacterias despus de ser expuestas a campos magnticoscontrolados manifiestan cambios en la reproduccin celular afectando elfuncionamiento del organismo expuesto, como sucede con Escherichia coli ySaccharomyces cerevisiae. Adems, la capacidad de solubilizar fsforo debacterias que ayudan a las plantas en la asimilacin del elemento tambin secambia, pues experimentos realizados revelan variaciones en Pseudomonas sp yBacillus sp. despus de la magneto -estimulacin.

El presente trabajo discute la informacin cientfica recopilada sobre el crecimientode Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, y la capacidad de solubilizarfosfatos de Pseudomonas sp y Bacillus sp despus de ser sometidos a camposmagnticos.

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Debido al creciente inters de la sociedad por utilizar los recursos naturales de

manera ms responsable, se han buscado mtodos amigables con el ambienteque permitan adquirir eficiencia en procesos industriales a menor costo conintervalos de tiempo cortos. Buscar una forma de acelerar los procesos decrecimiento celular bacteriano y aumentar la capacidad de solubilizar fsforo, esuna opcin viable a travs de la estimulacin magntica de los microorganismosya que permite obtener resultados en tiempos menores a los esperados. Por otraparte, la magneto-estimulacin en ciertas dosis tambin tiene efecto bactericida.Por lo que su utilizacin puede disminuir la contaminacin microbiana enalimentos, y con esto reducir la transmisin de enfermedades producidas porbacterias patgenas (Al-Zeyara et al. 2010). De manera que esta tcnica tiene

aplicaciones en la industria en general.

En un medio en el que se deben ofrecer ms alimentos y productos con cada vezmenos recursos y tierra adecuada para esta actividad, condicionada adems a lasseveras limitaciones que le impone el cambio climtico, es urgente y oportuna labsqueda de prcticas tecnolgicas alternativas, que se vislumbren como eficacesy sustentables, capaces de dar salidas a las tpicas de la revolucin verde, incluidala fertilizacin por sntesis qumica (Patio, 2010). El fsforo despus delnitrgeno, es el nutriente inorgnico ms requerido por plantas y microorganismosy adems, en el suelo es el factor limitante del desarrollo vegetal a pesar de ser

abundante tanto en formas inorgnicas como orgnicas.

En Colombia, estimular magnticamente microorganismos es una tarea que pocose ha investigado. Debido a que la respuesta de las bacterias al campoelectromagntico es muy variable y depende directamente del tiempo e intensidaddel campo magntico suministrado, es importante recopilar la informacindisponible, que permita tener una idea general sobre lo que es la estimulacinmagntica de microorganismos, que produce en el individuo y como ha sidoimplementado en la industria.

Por tal razn, se desea discutir cmo un campo magntico controlado afecta lacapacidad de crecimiento de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, ysolubilizacin de fsforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp. Para tal efecto estamonografa se encaminar a estudiar la influencia de campos magnticos sobrediferentes especies de bacterias para analizar su crecimiento y solubilizacin defsforo.

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JUSTIFICACIN

Debido a que es difcil encontrar tratamientos industriales que resulten benficos

para los recursos naturales porque la mayora contaminan los ecosistemas, hacrecido el inters por investigaciones que conduzcan al desarrollo de prcticasambientalmente amigables, capaces de evitar el crecimiento de bacteriaspatgenas, incrementar la proliferacin de microorganismos de inters cientfico yeconmico, y aumentar la solubilizacin de fsforo (Zhang et al. 2002). Por talmotivo, Zapata et al. (2002) plantean que se deben desarrollar mecanismosposibilitadores del incremento en la reproduccin celular de organismos de usoindustrial, mediante estimulacin magntica, permitiendo disminuir el tiempo defermentacin, aumentar rendimiento y reducir costos en la produccin dealimentos, enzimas y frmacos, entre otros.

Con ese fin, Ayed et al.(2007) han venido trabajando en la magneto-estimulacinpara cultivar con eficiencia microorganismos utilizando grupos de imanes,obtenindose como resultado que el campo magntico ha cambiado la tasa decrecimiento y ayuda a optimizar la elaboracin de productos que son capaces defabricar (Zapata et al. 2005). Entre los microbios cultivados con este tipo deestimulacin se encuentra, E. coli ampliamente analizado por su resistencia aagentes antimicrobianos y fcil duplicacin (Johnson, 2011; Romero, 2007). Porotro lado, S. cerevisiae tambin ha sido sometida a campos magnticos, ya que,es conocida en la elaboracin de alimentos; pero adems es de inters

investigativo por su fcil manipulacin y reproduccin rpida (Blackburn, 2006).

Por otro lado, el fsforo es uno de los elementos (macronutrientes) que las plantasdemandan en cantidades relativamente grandes. Su importancia radica en formarparte de los fosfatos portadores de energa (ATP-ADP), fosfolpidos, cidosnucleicos y varias coenzimas esenciales. Las plantas absorben la mayora delfsforo como ion dihidrogenofosfato H2PO4

- y pequeas cantidades como ionhidrogenofosfato HPO4

2-.No obstante, la mayor parte del elemento en el suelo,aproximadamente 95-99%, se encuentra en forma de fosfatos insolubles, loscuales no pueden ser utilizados por las plantas (Kang et al. 2002).

Como medida para suplir la carencia de fsforo en el suelo se ha recurrido a laaplicacin de fertilizantes fosfatados. Sin embargo, una considerable cantidad deestos fertilizantes es convertida rpidamente a compuestos insolubles, lo cual noresulta til para las plantas por terminar almacenados en el suelo (Narloch et al.2002). Con el fin de incrementar la presencia del elemento de forma asimilable

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para las plantas se fija la atencin enPseudomonas sp como solubilizadoras defsforo, ya que, crecen con rapidez y tiene la habilidad de metabolizar variedad desustratos (Ruiz, 2007). Al igual que Bacillus sp,porque posibilita la disponibilidadde fsforo soluble en el suelo y es importante en el ciclo de carbono y nitrgeno

(Zuiga et al.2011).

Como se ha dicho, resulta til estudiar el crecimiento de bacterias de interscientfico y la solubilizacin de fsforo de diferentes microorganismos de usoagroindustrial, despus de ser sometidos a diversos campos magnticos y analizarlos beneficios de esta prctica amigable con el medio ambiente.

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OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Analizar la influencia de densidades de flujo magntico en el crecimiento deEscherichia coli y Saccharomyces cerevisiae y en la capacidad de solubilizarfsforo de Pseudomonas sp y Bacillus sp; comparando respuestas segn lainformacin encontrada.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Discutir cmo la estimulacin magntica de E. coli yS. cerevisiaeintervieneen el crecimiento celular, segn la informacin cientfica recopilada.

Discutir el efecto sobre la solubilizacin de fsforo, segn la informacincientfica disponible, de estimular magnticamente a Pseudomonas sp yBacillus sp.

Evaluar la aplicacin industrial de la estimulacin magntica para el

crecimiento de E. coli, S. cerevisiae y solubilizacin de fosforo dePseudomonas sp y Bacillus sp.

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METODOLOGA

1. Recoleccin de informacin: Es realizada mediante las diferentesherramientas electrnicas proporcionadas por la biblioteca de laUniversidad Tecnolgica de Pereira. Institucin que facilita el acceso arevistas, libros y bases de datos. Adems, existen diferentes buscadoresacadmicos y sitios especializados.

2. Clasificacin de la bsqueda: Determinar la cantidad de citasbibliogrficas relevantes y desechar la informacin que no contribuye aldesarrollo del trabajo.

3. Redaccin monografa: Escribir de manera lgica, argumentativa yorganizada, todos los aspectos involucrados con la estimulacin magnticay los microorganismos en cuestin.

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CAPITULO 1

1 MARCO CONCEPTUAL

1.1 CAMPOS MAGNTICOS.

Los campos magnticos son generados por cargas en movimiento y medidos porla intensidad, que se define como la concentracin de lneas de fuerza porcentmetro cuadrado creadas en un campo magntico, y que existe en proporcina la accin del campo. La unidad de dicha intensidad es tesla y adopta esenombre en honor al cientfico Nikola Tesla (Ball, 2004). La estimulacin magnticapuede ser desarrollada mediante una bobina de Helmholtzque consiste de dos

bobinas circulares de radio R separadas por una distancia igual a su radio (Figura1). Cada bobina est formada por espiras hechas de un hilo conductor, aislado yenrollado que produce un campo uniforme en una regin situada entre las dosbobinas. Lo anterior, es obtenido gracias a que el campo magntico de cadaespira se aade al de la siguiente, por lo que, es agrupado en el centro y hayincremento de la intensidad en dicho punto (Ramsden, 2006; Alcalde, 2008). Enconsecuencia el radio de la bobina y su separacin tiene campo magntico nohomogneo, es decir, todos los puntos poseen diferente intensidad magntica, loque hace necesario colocar las muestras que se desean estimular en el centro dela bobina donde se concentra el campo magntico.

Figura 1. Parmetros Bobina de Helmholtz.(Ramsden, 2006)

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Por otra parte, Gaafar et al. (2006) utilizo estimulacin magntica implementandoun solenoide.Este dispositivo es un electromagneto que produce en el interior dela bobina un campo magntico intenso y homogneo, lo que significa que en todo

el circuito magntico se genera la misma cantidad de campo. Consiste en unalambre conductor largo enrollado en forma de espiras ubicadas una junto a laotra (Figura 2), una fuente de voltaje y a veces un ncleo de hierro. (Tipler yMosca, 2005; Enrquez, 2000).

Figura 2. Estimulacin magntica usando un solenoide.(Gaafar et al. 2006)

Otra forma de generar campos magnticos es mediante imanessuperconductores.Consta de electroimanes con la capacidad de soportar altasdosis de electricidad y fuertes campos magnticos uniformes y estables, difcilesde obtener por otras tcnicas. En comparacin con los electroimanesconvencionales, los superconductores poseen ventajas, entre ellas crearmagnitudes de campo grandes en el orden de 10 T, mayor eficiencia y bobinasms compactas al no necesitar canales para la circulacin de refrigerantes (Ford yFreedman, 2005; Lufkin, 2000).

La Figura 3 muestra el proceso implementado por Iwasaka et al. (2004) para

estimular magnticamente S. cerevisiaeutilizando imanes superconductores:

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Figura 3. Imn Superconductor para estimular magnticamente S. cerevisiae.(Iwasaka et al.2004)

Por otro lado, debido a su composicin electroltica, los seres vivos son por logeneral buenos conductores de electricidad. Adems, en los sistemas biolgicosexisten estructuras magnticamente influenciables como los radicales libres quepresentan propiedades paramagnticas y aquellas en las que intervienensustancias ferromagnticas. La respuesta de un sistema biolgico a un campomagntico externo depende tanto de las propiedades magnticas intrnsecas delsistema como de las caractersticas del campo externo y de las propiedades del

medio en el cual tiene lugar el fenmeno (Heredia et al.2003).En las ltimas dcadas, se ha presentado mucho inters en estudiar los posiblesefectos de los campos electromagnticos en sistemas biolgicos complejos y susaplicaciones en tratamientos, diagnsticos, monitoreo y control. Los camposmagnticos de bajas intensidades muestran diferencias significativas entre lasmuestras tratadas y el testigo, cuando la energa inducida por los magnetos esmayor que la energa trmica producida en el sistema durante el tratamiento(Recalde, 2013).

El campo magntico puede aplicarse en la estimulacin de microorganismos de

inters (Figura 4 y 5). A diferencia de otros mtodos es posible utilizarlo singrandes variaciones en las lneas tecnolgicas, disminuyendo as notoriamente loscostos en la produccin de la industria alimentaria (Barbosa et al. 2000). Endiferentes lugares del mundo se ha venido estudiando la estimulacin magnticade microorganismos para aumentar la fuente de biomasa, al igual que laproduccin de metabolitos de inters qumico, farmacutico e industrial,

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identificando factores que estimulen su produccin a gran escala (Luna et al.2011).

Figura 4. Bobina para la exposicin de cultivos de clulas.(beda et al.2011)

Figura 5. Bobina para la exposicin de cultivos de clulas en Erlenmeyers.(Villalpanda et al.2011)

Relacionado con la estimulacin magntica de microorganismos, existenantecedentes. Fojt et al. (2004) estudiaron el campo magntico con Leclerciaadecarboxylata y Staphylococcus aureus resultando bajo crecimiento bacteriano,por lo que segn Strask et al. (2002) la exposicin magntica tiene efectobactericida. Adems, Streptococcus mutans fue expuesta al magnetismo,mostrando disminucin del crecimiento celular (Masahiro et al. 2000). Encontraste, Chacn et al.(2006) observaron que en Lactococcus lactisse produjo eldoble del volumen celular en presencia del campo magntico, y con respecto a

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Streptomyces avermitilis aument la produccin de metabolitos secundarios perose inhibi el desarrollo morfolgico del microorganismo (Mei et al.2011).

Zapata et al. (2002) atribuyeron los resultados anteriormente descritos a varios

factores: posibles alteraciones en la orientacin o estructura de las protenas delmicroorganismo, a cambios en el flujo de iones que atraviesan la membranaplasmtica al modificarse la velocidad de reproduccin celular, a variaciones en lamembrana lipdica y en la sntesis de ADN, produciendo como consecuenciamodificaciones del crecimiento bacteriano.

1.2 CRECIMIENTO MICROBIANO.

Todos los microorganismos requieren condiciones especficas para su ptimocrecimiento. Adems de las necesidades nutricionales, intervienen factoresexternos que permiten su reproduccin y que difieren para cada unicelular. Talesfactores incluyen: Actividad del agua, temperatura, pH y oxgeno. (Alarcn, 2001;Tucker y Featherstone, 2011).

1.2.1 Nutrientes.

Segn Tortora et al.(2007) los microorganismos exigen nutrientes como carbono,

nitrgeno, azufre, fsforo y otros elementos que varan de un organismo a otro.Dicha caracterstica est definida por la composicin qumica de la clula, suestructura gentica y el entorno en el que se desarrollan. Por tal razn, seencuentran en la naturaleza bacterias que pueden solubilizar fsforo,biodegradadoras de compuestos orgnicos, fijadoras de nitrgeno o por elcontrario desnitrificadoras, entre otras. En consecuencia, los unicelularesconvierten diferentes sustancias qumicas tomadas del medio y las utilizandependiendo de su fisiologa (Alarcn, 2001).

Starr et al.(2004) afirman que los mecanismos por los cuales los microorganismos

obtienen nutrientes, se pueden clasificar en: quimiohetertrofas, quimioauttrofas,fotoauttrofas, fotohetertrofas:

Las bacterias Quimiohetertrofas son parsitos que adquieren energa desu husped vivo.
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Cecie+Starr%22&source=gbs_metadata_r&cad=10http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Cecie+Starr%22&source=gbs_metadata_r&cad=10

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Las Quimioauttrofas se alimentan mediante sustancias orgnicas einorgnicas que utilizan como fuente de carbono.

Las Fotoauttrofas se valen, al igual que las plantas, de la fotosntesis para

absorber energa y obtienen carbono del CO2.

Las Fotohetertrofas adquieren energa del sol, pero recibe el carbono decompuestos orgnicos que provienen de otros seres vivos.

Por otro lado, la investigacin de cepas bacterianas en laboratorios, ha sidoposible por la implementacin de medios de cultivo artificiales ricos en nutrientesque permiten el crecimiento microbiano a temperatura y pH controlados. Estosmedios poseen los compuestos especficos que necesita cada tipo demicroorganismo existente, por tal razn, es esencial comprender losrequerimientos nutricionales del organismo en cuestin y suministrar el medioadecuado. Muestra de ello, es que Escherichia coli puede tener multiplicacincelular por las siguientes fuentes de alimento: Caldo bilis verde brillante, caldo deenriquecimiento para enterobacterias, entre otros, y sucede de la misma formapara todos los microorganismos (Corry et al.2012).

1.2.2 Actividad del Agua.

Bylund (2003), asegura que el agua representa el 80-90% de la clula microbiana.

Es el compuesto esencial para la proliferacin de microorganismos en todo tipo demedio de cultivo, ya que, en el se encuentran disueltos los nutrientes que aquellosorganismos aprovecharan de manera independiente.

En ausencia de humedad es imposible que las bacterias logren sobrevivir a menosque formen esporas. La escasez de agua se produce cuando la presin osmticase eleva, aumentando la concentracin de soluto en los medios, lo que causa unchoque osmtico en la bacteria, provocando la plasmlisis e influyendonegativamente en la proliferacin; adems, afecta las reacciones metablicas porno disponer de la cantidad de agua necesaria (Forbes,2009; Tortora et al.2007).

1.2.3 Temperatura.

Existen microbios en todos los ecosistemas, incluyendo aquellos ambientes queposeen temperaturas extremas como volcanes y zonas polares. Cuando elmicroorganismo est expuesto a temperaturas mayores a la que es capaz de
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22G%C3%B6sta+Bylund%22&source=gbs_metadata_r&cad=8http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Betty+A.+Forbes%22&source=gbs_metadata_r&cad=5http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Betty+A.+Forbes%22&source=gbs_metadata_r&cad=5http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22G%C3%B6sta+Bylund%22&source=gbs_metadata_r&cad=8

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crecer, se afecta las funciones metablicas de la clula, adems de las protenas ycidos nucledos, llevndola a inactivarse (Romero, 2007). Por tal razn, segnTortora et al.(2007) los unicelulares tienen temperatura ptima de crecimiento, esdecir, en la que se manifiesta mejor su proliferacin. Dicha caracterstica permite

clasificarlos en tres grupos principales: sicrfilos, mesfilos y termfilos.

Para los sicrfilos la temperatura ptima est cerca de 15 C.

Los mesfilos se propagan entre 26 y 40 C, siendo la mayora de seresmicroscpicos responsables de enfermedades en humanos, animales ydeterioro de alimentos.

Los termfilos entre 50 y 60 C, por lo que viven en climas clidos comoaguas termales.

Sin embargo, es importante resaltar que el crecimiento es menor en lastemperaturas mximas y mnimas del intervalo para cada organismo.

1.2.4 pH.

Determina la concentracin de iones hidrgeno que posee el entorno de unmicroorganismo. La mayora de las bacterias crece en pH cercano al neutro, esdecir, entre 6.5 y 7.5. Por otra parte, los hongos proliferan en valores alrededor de

5. Por tal razn, se ha agrupado a los microbios segn su exigencia de pH encategoras:

Acidfilos.

Neutrfilos.

Alcalfilos o basfilos.

Dicha necesidad a llevado a producir medios de cultivo que contengan la cantidad

de H

+

requerido para el crecimiento del organismo en cuestin, valindose desoluciones buffers como son las peptonas, aminocidos y sales de fosfato (Tortoraet al.2007).

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1.2.5 Oxgeno.

El oxigeno es el elemento determinante en la reproduccin celular. Su presencia

establece si crecer o no un ser microscpico, ya que, varia su requerimiento delas necesidades de cada organismo. Muestra de ello, es que no todos exigenincluir O2 en el medio para su propagacin (Romero, 2007). Esta caractersticapermite dividir los microorganismos en seis grupos:

Aerobias. Estrictas y facultativas:

Aerobias estrictas son las que requieren obligatoriamente de oxgeno parareproducirse, logrando generar ms energa a partir de nutrientes que losmicroorganismos anaerobios. Por el contrario, las aerobias facultativas puedensubsistir sin presencia del compuesto al valerse de la respiracin anaerbica omediante fermentacin (Tortora et al.2007).

Anaerobias. Estrictas y facultativas:

Segn Montoya (2008) y Tortora et al. (2007) las anaerobias estrictas crecen enausencia de oxgeno nicamente, pues su existencia en el medio es letal, ya que,posiblemente acumulan en el citoplasma radicales libres superxido (O2

-) que sonuna forma toxica del oxgeno. Sin embargo, las anaerobias facultativas tienen lacapacidad de utilizar parte del elemento que se encuentra disponible en elentorno, aunque no sea imprescindible para su supervivencia.

Microaeroflicas y Capnfilos:

En contraste, los microaeroflicos necesitan O2en concentraciones menores a lasrequeridas por las anaerobias, porque su multiplicacin se inhibe. Por otro lado,existen bacterias que requieren concentraciones elevadas de CO2 y se conocencon el nombre de capnfilos (Montoya, 2008; Tortora et al.2007).

La tabla 1 muestra un resumen general de los factores que intervienen en elcrecimiento de los microorganismos.

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Tabla 1. Resumen de factores limitantes del crecimiento en microorganismos.Fuente (Autores).

CRECIMIENTO

Factor Clasificacin Caracterstica.

Nutrientes

QuimiohetertrofasLos sustraen de suhusped vivo.

QuimioauttrofasUtilizan sustanciasorgnicas e inorgnicas.

FotoauttrofasMediante la fotosntesis yel CO2.

Fotohetertrofas.Por fotosntesis y otrosseres vivos.

Actividad del agua.Todos losmicroorganismos.

80-90% de las clulas. Esimposible la proliferacinbacteriana en ausenciadel elemento.

Temperatura.

Sicrfilos.Crecimiento ptimo a15C

Mesfilos. 2640 C

Termfilos. 5060 C

pH.

Acidfilos. Aunque la mayora demicroorganismos crecenen pH entre 6.5 y 7.5existen diferentesexigencias.

Neutrfilos.

Alcalfilos o basfilos.

Oxgeno.

Aerobias estrictas.Necesitanobligatoriamente delelemento para vivir.

Aerobias facultativas.

Pueden sobrevivir en

ausencia o presencia deO2.

Anaerobias estrictas.nicamente crecen sinoxgeno.

Anaerobias Facultativas.Proliferan en ausencia opresencia de O2.

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Oxgeno.Microaeroflicas.

Requieran del elementoen pequeasconcentraciones.

Capnfilos.

Necesitan CO2a elevada

concentracin.

1.3 CURVA DE CRECIMIENTO CELULAR.

Las procariotas utilizan reproduccin asexual. Esto es, una clula madre se divideproduciendo dos hijas idnticas genticamente. Lo que lleva a concentrar miles declulas en grupos llamados colonias que tienen diferencias en su color, borde,

forma y superficie, caractersticas dependientes del tipo de microorganismo(Tucker y Featherstone, 2011). Adems, el crecimiento permite clasificar los seresmicroscpicos segn su forma en (Figura 6):

Bacilos (alargados).

Cocos (redondos).

Espirilos (hlice rgida).

Vibrios (coma).

Espiroqueta (hlice flexible).

a) Bacilos. b) Cocos. c) Espirilos. d) Vibrios. e) Espiroqueta.

Figura 6. Forma de las clulas bacterianas.(Tortora et al. 2007).

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Por otra parte, el proceso de multiplicacin se divide en cuatro fases: latencia,exponencial, estacionaria y muerte (Figura 7), y su duracin depende delmicroorganismo (Tucker y Featherstone, 2011).

1.3.1 Fase de Latencia.

Periodo de adaptacin de los microorganismos al medio que lo rodea. Aunque lasclulas no estn inactivas el nmero de ellas aumenta muy poco o nada y la etapapuede durar de horas a das (Negroni, 2009). Segn Silva et al.(2006) y Romero(2007), durante esta fase la bacteria produce enzimas esenciales y otras sustanciasque ayudan a su acoplamiento en el medio. Tambin, incrementan su actividadmetablica y se almacena ARN y otros productos que ayudan para el metabolismo.

A medida que va trascurriendo el tiempo de adaptacin comienza su duplicacin de

manera lenta.

1.3.2 Fase de Crecimiento Logartmico o Exponencial.

Terminado el periodo de adecuacin, empieza a notarse incremento de clulas, yaque, existen condiciones optimas de pH, temperatura y nutrientes. El crecimientoes mximo en esta etapa llegando a ser constante; por lo tanto, se genera unarelacin lineal entre el tiempo y el nmero de unidades formadas, como ilustra laFigura 5 (Negroni, 2009). Adems, existe mayor produccin de metabolitos, lo quela hace la fase para uso industrial. Sin embargo, cuando los microorganismosatraviesan el crecimiento exponencial, son ms susceptibles a perturbarse porentornos hostiles que perjudican su reproduccin (Tortora et al.2007).

1.3.3 Fase Estacionaria.

Romero (2007) y Tortora et al. (2007), aclaran que en esta fase las condicionesdeclinan, los nutrientes se agotan, empieza a concentrarse desechos nocivos y el

pH del medio de cultivo cambia a estado cido. Los seres microscpicos terminanmuriendo al generarse un ambiente txico en el que solo las bacterias ms fuerteslogran mantenerse vivas y multiplicarse. Con esto, inicia un periodo de equilibrioentre clulas vivas y muertas en que los organismos viables tienen actividadmetablica lenta.

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1.3.4 Fase de Declinacin o Muerte Celular.

A medida que trascurre el tiempo las condiciones empeoran cada vez ms al no

existir nutrientes e incrementarse los desechos txico. Por lo que, las bacterias nose encuentran en el ambiente propicio para seguir existiendo. Debido a suentorno, desciende el nmero de organismos de forma exponencial culminando enmuerte total de la poblacin (Tortora et al.2007).

Figura 7. Curva de Crecimiento Microbiano.(Tucker y Featherstone, 2011).

1.4 TIPOS DE REPRODUCCIN EN MICROORGANISMOS.

Los seres vivos, independientemente de la especie, necesitan propagarse, debidoa que es la nica manera de garantizar la prolongacin biolgica. Tal condicinobliga a que las clulas utilicen su capacidad de transmitir material gentico a sus

descendientes, produciendo seres idnticos a su antecesor (Jaramillo, 2004).Existen diferentes mecanismos por los que es posible la duplicacin, acontinuacin se exponen algunos de ellos:

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1.4.1 REPRODUCCIN ASEXUAL.

Se manifiesta principalmente en organismos unicelulares como bacterias y

hongos, entre otros. Consiste en la divisin mittica de la clula implicada, por loque es generado uno o varios seres genticamente idnticos al progenitor. Todoes posible debido a que el individuo tiene la capacidad de fragmentar odesprender parte de su cuerpo que contiene material gentico y desarrollar unnuevo individuo. En este tipo de reproduccin no es necesaria la presencia derganos reproductivos, esa ventaja hace que los organismos logren propagarse deforma rpida (Jaramillo, 2004). La reproduccin asexual se manifiesta de lassiguientes maneras:

1.4.1.1 Biparticin (divisin binaria).

En este proceso el cromosoma de la clula madre se replica, separndose haciaextremos opuestos del individuo (Figura 8). Despus crea la nueva pared entreambas porciones de material gentico, produciendo dos clulas que poseencromosomas idnticos a su antecesora (Pierce,2009).

Figura 8. Reproduccin asexual por biparticin.(Pierce,2009)
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Benjamin+A.+Pierce%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Benjamin+A.+Pierce%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Benjamin+A.+Pierce%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Benjamin+A.+Pierce%22

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1.4.1.2 Gemacin.

Tipo de reproduccin frecuente en levaduras, en el que la clula desarrollaprotuberancias o yemas que pasan por un periodo de alargamiento hasta

desprenderse, formando as un individuo nuevo semejante al progenitor (Figura 9)(Montoya, 2008; Jaramillo, 2004).

Figura 9. Levadura en proceso de Gemacin.(Tortora et al.2007).

1.4.1.3 Mitosis.

Segn Flores (2004) y Passarge (2009), es la divisin propia de las eucariotas.Tambin conocido como cariocinesis, que genera dos clulas hijas genticamenteidnticas al dividirse el ncleo de forma equitativa. Se desarrolla en varias fases(Figura 10).

1. Profase: Periodo en que los cromosomas son condensados volvindosems cortos y gruesos. Adems, empieza a formarse el huso mittico, el cualse ocupa de orientar los cromosomas hacia polos opuestos de la clulamediante los centriolos.

1. Metafase:El huso mittico se forma totalmente como filamentos finos. Loscromosomas se unen a las fibras del huso, para ser desplazadas al plano

ecuatorial de la clula.

2. Anafase: Se separa el centrmero quedando dos cromtides de cadacromosoma, que sern extradas hacia los polos de la clula.
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22

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3. Telofase: El huso es desintegrado al dispersarse las fibras. Se rompe lamembrana nuclear para formar dos nuevas envolturas y es dividido elcitoplasma, adems las cromtides llegan a sus polos.

1. Profase.

Huso.

2. Metafase.

Plano ecuatorial.

3. Anafase.

4. Telofase.

Figura 10. Divisin celular por mitosis.(Flores, 2004)

LaTabla 2 es un resumen de los tipos de reproduccin celular:

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Tabla 2. Propagacin celular. Fuente (Autores).Tipos de reproduccin Celular.

Biparticin.

Una clula madre se

divide en partes igualesproduciendo dos hijascon cromosomasidnticos a la progenitora.

Gemacin.

Las clulas creanprotuberancias que sedesprenden formandootro individuo.

Mitosis.

Tipo de reproduccin eneucariotas que se divideen: Profase, metafase,anafase y telofase.

1.5 ALGUNOS MTODOS PARA MEDIR CRECIMIENTO CELULAR ENMICROORGANISMOS.

El crecimiento celular es un parmetro muy importante en el estudiomicrobiolgico. Por tal motivo, han sido creadas tcnicas adecuadas,

desarrolladas hace aproximadamente cien aos por cientficos, que posibilitan elanlisis confiable de resultados (Tortora et al. 2007) obtenidos al estimularmagnticamente microorganismos. A continuacin se citan algunos de ellos:

1.5.1 Recuento en placa.

Es el mtodo ms utilizado. Se basa en presumir que cada clula se divide hastaformar una colonia. Segn Fojt et al.(2009), en la prctica esto no es verdico, yaque, en el laboratorio se suele utilizar muestras pequeas de colonias que son

compuestas por ms de una sola clula. De ah que la tcnica se reporte en UFC(Unidades Formadoras de Colonias), que se conoce como el nmero de bacteriasvivas capaces de formar una colonia.

Para garantizar la lectura correcta del nmero de elementos presentes en cadacaja de Petri, es necesario que las colonias no se encuentren aglomeradas, puesen esas condiciones es imposible identificarlas individualmente y no se desarrollan

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de manera adecuada. Por tal motivo, se deben implementar diluciones ensoluciones estriles (Figura 11) que permiten disminuir la carga microbiana ycalcular las UFC de la muestra inicial (Tortora et al.2007).

Figura 11. Diluciones sucesivas.(Tortora et al.2007)

Cada dilucin requiere 9 ml de caldo estril, a los que ser adicionado 1 ml de lamuestra problema, la solucin es homogenizada en un tubo tapa rosca marcadocomo Dilucin 10-1 para sembrarlo en caja de Petri (segn el mtodo deseado),igual que lo muestra la Figura 11. Posteriormente, es tomado 1 ml de la solucin10-1 para agregarlo en 9 ml de caldo contenido en un tubo de ensayo marcadocomo 10-2 y sembrarlo. El proceso es repetido cuantas veces necesite el analistahasta llegar a la cantidad de microorganismos viables que desee, permitiendo assu recuento adecuado. Aadido a eso, es preciso escoger un mtodo de siembraentre las diferentes tcnicas existentes, es decir, por diseminacin y profundidad,donde la ltima es tambin conocida con el nombre de vertido en placa. (Tortora et

al. 2007). Conjuntamente, es importante sembrar por triplicado, pues este es unmtodo sensible porque existe muchos factores que intervienen en los resultadoscomo: Desarrollo de colonias muy pequeas que son pasadas por alto al realizarel recuento, adems no todas se forman a la misma velocidad en idnticascondiciones de incubacin (Madigan et al,2004).
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22

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1.5.2 Filtracin.

Segn Leiva (2006) este mtodo es frecuente para determinar la carga microbiana

en agua. Se utiliza una membrana estril con poros de 0,45 m que impiden elpaso de las bacterias, por lo que son retenidas en aquel filtro que posteriormentees incubado sobre un medio selectivo. La tcnica permite saber si la muestra delquido posee coliformes totales o fecales, debido a que las colonias desarrollancierta coloracin, dependiendo al medio de cultivo. Mostrando dicha caractersticaesta el agar Endo, que posee sulfito de sodio y fucsina bsica permitiendo crecersolo bacterias gram negativas, en este medio las colonias de coliformes sonrosadas (Figura 12) ya que el microorganismo tiene la capacidad de fermentarlactosa.

Figura 12. Colonias rojas de coliformes en medio tipo-Endo que contiene lactosa.

(Leiva, 2006)

1.5.3 Nmero ms probable (NMP).

Desarrollada por la tcnica de fermentacin en tubos mltiples, la cual permiteestablecer mediante clculos de probabilidades la presencia y cantidad decoliformes o microorganismos que no crecen en medios slidos en una muestra

dada. El mtodo se basa en que las bacterias del compuesto a analizar, puedensepararse agitando el medio de cultivo liquido y de esa manera quedar biendistribuidas, resultando una suspensin de bacterias homognea. Mediantediluciones seriadas es inoculada la muestra problema en tubos de ensayo estrilesque contienen el medio adecuado, permitiendo as que solo en algunas dilucionescrezcan bacterias. De esta manera se produce una mezcla de resultados positivos

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y negativos que permite estimar el NMP de microorganismos presentes (Roldn yRamrez, 2008).

La Tabla 3expresa resultados de una muestra de agua con 95% de confiabilidad,

arrogados por clculos estadsticos al observar 3 series de 5 tubos que revelan serpositivos (poseen turbiedad y/o produccin de gas) o negativos (ningn cambio,por lo tanto no existe crecimiento) con respecto a la proliferacin microbiana:

Combinacin depositivos

ndice deNMP/100 ml

Lmite de confianza de 95 %Inferior Superior

4-2-0 22 9 564-2-1 26 12 654-3-0 27 12 674-3-1 33 15 774-4-0 24 16 80

5-0-0 23 9 865-0-1 30 10 1105-0-2 40 20 1405-1-0 30 10 1205-1-1 50 20 1505-1-2 60 30 180

5-2-0 50 20 1705-2-1 70 30 210

5-2-2 90 40 2505-3-0 80 30 2505-3-1 110 40 3005-3-2 140 60 360

Tabla 3. NMP para calcular carga microbiana.(Tortora et al.2007).

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Ejemplo (Tabla 4.):

Para las series 1,2 y 3 existen 4, 2 y 0 tubos respectivamente, positivos (presenciade turbidez) lo que significa crecimiento celular. Por lo tanto, segn la Tabla 3, el

nmero ms probable de microorganismos es de 22NMP/100ml y el 95 % de lasmuestras con este resultado poseen entre 9 a 56 bacterias.

Tubos 1 2 3 4 5

Serie 1 Sin cambio Turbidez Turbidez Turbidez Turbidez

Serie 2 Turbidez Sin cambio Turbidez Sin cambio Sin cambio

Serie 3 Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio Sin cambio

Tabla 4. Modelo de ensayo para calcular NMP.(Autores)

1.5.4 Espectrofotometra y escala de Mcfarlan.

Cuando los seres microscpicos se reproducen en medios lquidos, estos cultivos

se tornan turbios demostrando as la propagacin. Ya que la turbidez es unparmetro practico para controlar la carga microbiana, es til implementarmtodos que permitan determinar la concentracin de microorganismos en mediosde cultivo acuosos, que por tiempo y recursos, no es posible su recuento en placa.Por ello, se recurre al espectrofotmetro, pues permite medir con exactitud lacantidad de organismos del medio al tener una solucin lo bastante turbia, esdecir, que existan entre 10 a 100 millones de bacterias por cada mililitro (Tortora etal.2007).

El fotmetro mide la intensidad de una fuente luminosa que incurre sobre algunasuperficie. Con microbios, el haz de luz a una longitud de onda determinada,atraviesa la solucin bacteriana, por lo tanto, entre ms seres se encuentran en lasuspensin, menos luminosidad llegara a la clula fotoelctrica (Figura 13). Deeste modo, el detector del instrumento mostrar dicho fenmeno en unidades queel observador pueda analizar, es decir, % de transmitancia o absorbancia, donde

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la absorbancia ser til para graficar la curva de crecimiento que permite estimarla concentracin de microorganismos (Tortora et al.2007; Delgadillo et al.2010).

Figura 13. Fundamento de Espectrofotometra en crecimiento celular.(Tortora et al.2007).

Por otro lado, la turbidez estndar de 0,5 o escala de Mcfarland, mediante oncealcuotas de BaCl22H20 y H2SO4 almacenadasen tubos de ensayo bien sellados,permite comparar la solucin bacteriana motivo de anlisis con parmetros yaestablecidos y presumir la cantidad de microorganismos presentes (Figura 14). Setrata de una serie de tubos con turbidez definida, donde cada solucincorresponde a una concentracin bacteriana, por lo tanto se toman como basepara establecer la carga microbiana de la solucin motivo de anlisis (Tabla 5).Laexactitud de la escala es verificada mediante fotometra, ya que, a 625 nm laabsorbancia de la turbidez 0,5 debe ser entre 0,08 - 0,1 y de esta manera se

garantiza que concuerde con los valores de concentracin microbiana estipulados(Perilla et al.2004).

En la Figura 14se comparan tres tubos. El a forma parte de la turbidez estndarde Mcfarland y se confronta conb, la solucin bacteriana motivo de estudio que noes traslucida porque los microorganismos cuando crecen en medio acuoso
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Gerard+J.+Tortora%22

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Tabla 7. Procedimientos para medir crecimiento de microorganismos. Fuente(Autores).

Tcnicas para valorar crecimiento celular.

Mtodo Caracterstica.

Recuento en placa.

Los resultados sonreportados en UFC y elmtodo propone que seformada una colonia porclula.

Filtracin.Es utilizada generalmentepara recuento decoliformes en agua.

Nmero ms probable.

Mezcla de tubos quemediante probabilidadespermiten estimar elnmero microorganismospresentes en unamuestra dada.

Espectrofotometra.

Mediante la turbidez de lasuspensin bacteriana a

una longitud de ondadeterminada es medida lacantidad demicroorganismospresentes.

Turbidez estndar de 0,5o escala de Mcfarland.

Serie de tubos conturbidez definida, que secomparar con losmicroorganismos en

medio acuosos paraestimar cualitativamentela concentracin.

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1.5.5 DETERMINACIN DE LA SOLUBILIZACIN DE FOSFATOS EN ELLABORATORIO.

1.5.5.1 Preparacin del inculo.En un matraz con 100 ml de caldo de nutrientes se inocula con el cultivo de agarinclinado de Pikovskaya y se incuba a 30 0,2 C durante 48 h. Las clulas sesepararan del caldo mediante centrifugacin a 10.000 rpm durante 20 min, selavan dos veces con agua destilada estril y se resuspenden en agua destiladaestril. Esta suspensin se utiliza como inculo. Todos los pasos se llevan a caboen condiciones aspticas. (Ramani, 2011).

Los siguientes medios de cultivo se utilizan para el aislamiento, identificacin ydeteccin de bacterias solubilizantes de fosfato:

Medio de agar / caldo de Pikovskaya (g / l)

Glucosa 10 g; fosfato triclcico (TCP) 5 g; sulfato de amonio 0,5 g; cloruro desodio 0,2 g; cloruro de potasio 0,2 g; sulfato de magnesio 0,1 g; extracto delevadura 0,5 g; sulfato de manganeso, rastrear; ferroso sulfato, traza; agar, seaaden 15 g a 1 L de agua destilada, el pH se ajusta a 7,0 0,2 antes de laesterilizacin. Despus de la esterilizacin se aade 50 g/ml ciclohexamidaaspticamente al medio de enfriado (60 C) para inhibir el crecimiento de hongos(Ramani, 2011).

Agar modificado de Pikovskaya: (g / l)

El medio anterior se modifica mediante la adicin de 4,0 ml de 0,16% de solucinde azul de bromofenol (en etanol) a 1 litro del medio antes de la esterilizacin. Seutiliza el medio para la deteccin de fosfato soluble basado en la zona clara de lasolubilizacin de fosfato alrededor de las colonias.

0,02% de NaCl en el medio de agar original del Pikovskaya se sustituye pordiferentes concentraciones (0,04 a 25%) de NaCl.

El pH se ajusta a 7,0 0,2 antes de la esterilizacin (Ramani, 2011).

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Caldo modificado de Pikovskaya: (g / l)

0,02% de NaCl en caldo de la Pikovskaya fue sustituido por diferentesconcentraciones (0,02%, 0,06, 0,1%, 0,2%, 0,6% y 1%) de NaCl que tiene la CE

correspondiente 2 (2,10, 2,69, 3,35, 4,91, 9,74 y 15,51 mS cm -1 ,respectivamente, a 25 C) (Ramani, 2011).

Fosfato triclcico (TCP) se sustituye de forma individual por el fosfato ferroso (FP),fosfato de aluminio (AP) y el fosfato diclcico (DCP) en la cantidad equivalente a229 mg% de P2O5.

TCP fue reemplazado con los fosfatos de roca (RPS) y harina de hueso (BM) encantidad equivalente a 100 mg% de P2O5.

El pH se ajusta a 7,0 0,2 antes de la esterilizacin (Ramani, 2011).

1.6 MEDIDA DE LA SOLUBILIZACIN DE FSFORO.

1.6.1 En medio slido:

En el medio que contiene agar modificado de azul de bromofenol de Pikovskayamediante la observacin de zona clara solubilizante TCP (Fosfato triclcico)

alrededor de las colonias. Todas las placas se incuban a 28 C 0,2 C durante24 h. Se mide la zona de solubilizacin de fosfato que rodea la colonia(halo). Tamao de la zona clara se calcula restando dimetro de la colonia menosel dimetro total del halo.

1.6.2 En medio lquido.

La actividad en caldo de Pikovskaya contiene 0,5% de TCP (Fosfato triclcico). En

un matraz que contenga 100 ml de caldo de Pikovskaya se inocula aspticamente1,0 ml de inculo. Medio no inoculado sirve como control y se incuba a 28 0,2 C durante 21 das bajo condiciones estticas y se agita a 12 intervalos h. 10,0 mlde medio se retira en cada tercer da y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min.El sobrenadante se analiza para determinar su contenido de agua soluble enfsforo por el mtodo de molibdofosfrico reducida chlorostannous azul cido

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descrito por Jackson (1973). El pH final del medio se mide utilizando medidor depH contra la solucin tampn estndar. El experimento se lleva a cabo portriplicado.

Entre los gneros bacterianos ms estudiados por su capacidad para solubilizarfosfatos se encuentran: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia,Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus, Aerobacter, Flavobacterium,

Azotobacter y Erwinia observando una cantidad considerablemente mayor en larizosfera, en comparacin con el suelo no rizosferico (Kumar, 2001). Igualmente,se ha documentado la actividad fosfato solubilizadora por diferentes hongos(Prez, 2012).

Fueron seleccionadas Pseudomonas sp. y Bacillus sp. sobre la base de latolerancia a la sal y la actividad de solubilizacin de fsforo con diferentes formas

de fosfatos (Ramani, 2011).

1.7 SOLUBILIZACIN DE FSFORO.

1.7.1 Ciclo del Fsforo.

Es el proceso de circulacin del elemento en la corteza terrestre. El P seencuentra principalmente en la litosfera, tambin existe en huesos fsiles, rocasfosfatadas y excremento de aves. Las lluvias y los ros disuelven el fsfororetenido en las diversas fuentes para ser asimilado por las plantas a travs de lasraces. El proceso hace que el fsforo sea integrado en los cidos nucleicos parautilizarlo en el material gentico de los microorganismos. Al morir las plantas, sereintegra el fsforo al suelo como fosfato soluble por la accin de las bacterias. Sinembargo, el fsforo puede drenarse por la erosin, llegando al mar donde lo tomananimales y seres humanos para consumo, o como medio para producirfertilizantes, por lo que el fsforo regresa al suelo (De la llata, 2003; Manahan,2007).

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1.7.2 Capacidad de solubilizar fsforo de los microorganismos.

El fsforo es uno de los nutrientes inorgnicos ms requeridos por plantas, ya que

hace parte de las molculas de ADN, ARN y posibilita la transferencia de energacomo ATP (Barroti et al. 2001). En el suelo, el elemento limita la produccin yrendimiento vegetal aunque se encuentre presente en formas inorgnicas yorgnicas, debido a que se halla en concentraciones bajas que varan de 5 y 30mg Kg-1, tales niveles son producidos al reaccionar el fosforo del suelo con ionesde Calcio, Hierro o Aluminio que provocan precipitacin o fijacin, disminuyendode esta forma la disponibilidad para las plantas (Fernndez et al. 2004). Adems,segn Pea y Cardona (2010) su disponibilidad est ligada a la naturaleza delsuelo, donde una variable importante es el pH que debe ser entre 5.5 y 7.9.

Los fosfatos inorgnicos aplicados como fertilizantes qumicos son retenidos en elsuelo y como resultado no son aprovechados por los cultivos. Por ello, se estimaque la solubilizacin de rocas fosfatadas y de otras fuentes de fsforo inorgnicopor los microorganismos del suelo es una opcin para elevar la cantidad delelemento disponible para las plantas (Fernndez et al. 2004).

La actividad microbiana en la rizosfera es de gran transcendencia, al solubilizar losfosfatos no disponibles para la planta, los cuales se encuentran bajo formasorgnicas e inorgnicas. La habilidad para solubilizar los fosfatos se encuentrapresentes en abundantes microorganismos como bacterias, levaduras,

actinomycetes y hongos de vida libre que han sido relacionados con el incrementoen la disponibilidad de fsforo en el suelo. Se ha estimado que entre el 10 - 50 %de la flora bacteriana existente en el suelo posee la capacidad de solubilizarfsforo, algunos de ellos con mayor eficacia como Pseudomonas, Micrococcus,Bacillus y Flavobacterium (Pea y Cardona, 2010). A travs de las aplicaciones delos biofertilizantes a base de microorganismos solubilizadores de fosfatos, ladisponibilidad de fsforo puede incrementarse y el producto de su accin (fosfatosoluble) puede ser absorbido eficientemente por las plantas (Fernndez et al.2004).

El fsforo es limitante para la produccin de cultivos y se ha estimado que losrecursos mundiales de fosfato de roca de bajo costo pueden ser agotados para elao 2050 (Vance et al.2003). La falta de fsforo de bajo costo ha sido reconocidacomo una potencial crisis futura en la agricultura. La mejora de la absorcin defsforo en las plantas y su utilizacin tendr algunos impactos significativos en laagricultura y en el medio ambiente (Singh y Satyanarayana, 2011).

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En el laboratorio es evidente que los microorganismos tienen la capacidad desolubilizar fosfato cuando el medio de cultivo presenta zonas claras, conocidascon el nombre de halos, que rodean las colonias. Sin embargo, existenorganismos que no forman halos por lo que es necesario realizar pruebas

cuantitativas en medio lquido (Bonilla, 2005).

1.8 Resistencia a los Antibiticos.

Los antibiticos son sustancias producidas por bacterias, hongos y actinomicetos,que inhiben el crecimiento de otro microorganismo o lo elimina; son de bajo pesomolecular y tambin se pueden obtener por sntesis qumica. La resistencia a esosagentes se debe a que el organismo ha desarrollado mecanismos que restanactividad al antibitico o lo hacen intil, por lo que disminuye su sensibilidad (Dazet al. 2001). Segn, Restrepo et al. (2003) los aspectos que hacen posible esaresistencia son: mutaciones espontaneas que afectan a los genes codificadores dela molcula ligada al antibitico, reorganizacin gentica u obtencin de plsmidosque otra bacteria transfiere permitiendo pasar dicha resistencia de una clulamedre a sus hijas.

Forbes (2009) explica que la resistencia a los frmacos por parte de unmicroorganismo se distingue en:

Intrnseca o inherente: Se presenta de forma natural, siendo parte de laestructura gentica, por lo que es una caracterstica del microorganismo.Esta particularidad hace posible identificar ciertas bacterias o grupos portener resistencia predecible a los antibiticos.

Adquirida: Es impredecible. Puede obtenerse por mutaciones o genes deotra bacteria, provocando alteraciones en la composicin gentica de laclula y con ello cambio en su fisiologa y estructura.

La disminucin de la sensibilidad de algunas bacterias a los antibiticos se

produce gracias a que los microorganismos poseen la capacidad de eliminar elfrmaco antes de que este ejerza su accin sobre la clula, tambin puedeninactivar enzimticamente el medicamento o restringir la entrada del mismo almicroorganismo (Restrepo et al. 2003). Adems, cuando se someten aestimulacin magntica tambin han demostrado resistencia a los antibiticos(Ibraheim et al.2013)

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2 CAPITULO 2

ESTIMULACIN MAGNTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO.

2.1 Escherichia coli.

E. colies el microorganismo mas estudiado por el ser humano. Su descubrimientose remonta a 1885, gracias al pediatra Theodor Escherich (1857-1911) quien aislla bacteria de las heces de uno de sus pacientes, y por tal motivo se le atribuyedicho nombre (Johnson, 2011). Se reproduce con facilidad en ambientescotidianos para el hombre y animales tales como tierra, agua y plantas, ya que, sutemperatura ptima de crecimiento se encuentra en 37C (Allauca, 2005), lo que la

hace pertenecer al grupo de los mesfilos. Dicha caracterstica vuelve a estebacilo un ser habitual en el intestino grueso y delgado, por ello es elmicroorganismo ms relacionado con enfermedades gastrointestinales usuales enpersonas y animales (Koneman y Allen, 2008).

Se identifica por ser miembro de la familia enterobacteriaceae. Es un bacilo gram

negativo, aerobio facultativo que mide 1 x 2 m (Figura 15); goza de una solacadena en espiral de ADN, se mueve mediante flagelos pertricos, no produceesporas y forma fimbrias y pilis (Snchez y Trejo, 2006). E. colies fermentadorade lactosa y a partir de glucosa fermenta manitol; adems es positiva para indol ydescarboxilasa de lisina. Tambin, es motivo de investigacin su resistencia aantimicrobianos y la capacidad de producir toxinas, fortaleza originada en losplsmidos porque contienen informacin gentica que lo hace posible (Romero,2007).

Figura 15. Vista de Escherichia colien Microscopio de Fuerza Atmica.(Klinth et al.2012)

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Para cultivar en laboratorio, es necesario a 37 C utilizar como medio de cultivoagar EMB, que es especfico y da una tonalidad caracterstica de estemicroorganismo: verde metlico brillante. Este agar es el ms utilizado, ya que,contiene azul de metileno actuando como agente inhibitorio del crecimiento de

bacterias gram positivas (Alarcn, 2001). Sin embargo, es capaz de crecer enmuchos otros medios sintticos como agar cromognico, base de agar endo, agareosina azul de metileno, caldo lactosado, entre otros (PANREAC, 2009).

En lo referente a la estimulacin magntica E. coli ha sido objeto de variosestudios, entre ellos se ha observado la respuesta del crecimiento del bacilo, comose describe a continuacin:

Segn Shin-ichiro et al. (2002) y Zhang et al. (2002), E. coli fue expuesta acampos magnticos durante el periodo de crecimiento exponencial resultando en

muerte bacterial al presentarse disminucin de clulas, en comparacin con elcontrol, por lo que, los investigadores sugieren que la estimulacin ocasionacambios en el metabolismo de la clula y varia el pH del medio Luria Bertani absico, porque E. colitoma los aminocidos y los transforma en sustancias comoel amoniaco. Adems, al afectar la proliferacin del microorganismo tambin existeinterferencia en la actividad oxido-reductiva y esa variacin se incrementa amedida que aumenta el tiempo de exposicin (Strask et al.2002).

Asimismo, mediante un ensayo Fojt et al. (2004) comparan los efectos de laestimulacin magntica con la viabilidad del bacilo, mediante conteo de UFC. En

esta ocasin E. coli fue expuesta al campo magntico en la fase logartmica,encontrando que el nmero de unidades disminuye, en equivalencia con el control,de manera exponencial al aumentar dos variables: tiempo de exposicin ydensidad de flujo magntico. La causa de muerte bacterial no es clara, pero sepresume, se debe a posibles cambios biolgicos como es la alteracin en eltransporte de iones y formacin de radicales libres producidos por la estimulacinelectromagntica, adems concluyeron que dicho efecto empieza desde elmomento en que se enciende el campo magntico.

De la misma forma, Wenjin et al.(2009) encontraron como el nmero de UFC se

ve afectado negativamente cuando incrementa el tiempo de estimulacinelectromagntica y aumenta la temperatura a la que es realizado este ensayo (25a 40 C), producindose dao en la superficie de las clulas implicadas. Sinembargo, una vez E. coli ha logrado adaptarse al ambiente hostil, empieza adisminuir la cantidad de bacterias inhibidas. Segn Filipic et al. (2012) E. coliresponde dependiendo la densidad de flujo magntico, por ejemplo, a 17 mT se

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afect el crecimiento de manera negativa, pero a 5 y 50 mT la influencia fuemenos pronunciada. Aun as, la estimulacin magntica aument los niveles de

ATP y la actividad enzimtica, que se presume es manifestada al luchar E. coliporadaptarse al entorno, por la presencia del campo magntico.

En otro caso, Bajpai et al. (2014) demostraron como utilizar la estimulacinmagntica aadiendo un sustrato con propiedades de magnetizacin afecta elcrecimiento de esta poblacin bacteriana, pues los resultados revelaron inhibicinen un 83 % al pasar 4 h de exposicin. No obstante, confirmaron que sinimplementar el sustrato tambin se influye negativamente en la propagacin de E.coli porque causa dao en su membrana desintegrndola y produciendo liberacinde material intracelular (Bajpai et al.2012). Asimismo, segn Kamel et al.(2013), a40, 80, 120 y 160 mT produce disminucin de clulas viables y variaciones en lasensibilidad a ciertos antibiticos.

Debido a los resultados, Belyaeva (2011) afirm que tales efectos dependendirectamente de las variables fsicas y biolgicas que forman parte del entorno queenvuelve al microorganismo al ser estimulado magnticamente. Por tal razn, E.coli disminuye la tasa de crecimiento cuando es tratada a 2 mT y con tiempos deexposicin de 4,6 y 8 horas, y pasadas 24 horas el nmero de clulas bacterianasaumenta, por lo que, los investigadores opinan que el microorganismo poseecapacidad de adaptarse al campo magntico (Segatore et al.2012).

Por otro lado, segn la densidad de flujo magntico y tiempo de exposicin ser el

efecto en las clulas expuestas. Muestra de ello, es que en algunos casos E. colisometida a este tipo de estimulacin electromagntica no han sufrido ningn tipode transformacin en su capacidad de multiplicarse como lo afirman Del Re et al.(2003). Y Segn Esmekaya et al. (2013), a 2 mT y 24 horas la exposicin alcampo no produce ningn cambio en la viabilidad de las clulas, pero s afecta sumorfologa al formarse poros y desintegrar la membrana.

Por el contrario,Nawrotek et al.(2014) yFijakowskiet al.(2014) encontraron quela exposicin al campo magntico incrementa la reproduccin celular de E. coli.Del mismo modo, un estudio realizado por Nascimento et al.(2003) mostr que la

magneto-estimulacin puede influir positivamente la multiplicacin en presencia deglucosa, al incrementar la entrada del azcar por la membrana celular, disminuir lafase estacionaria y aumentar el tiempo que E. coli permanece en periodo decrecimiento logartmico.

Es evidente que los resultados cambian dependiendo del campo magnticoaplicado, por tal razn Babushkina et al.(2005) aseguran que utilizar frecuencias
http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Nawrotek,+Pawe$x0142/$N?accountid=45809http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Nawrotek,+Pawe$x0142/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809

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bajas produce incremento de la proliferacin bacteriana. Tambin, Gaafar et al.(2006) concluyeron que el tiempo de exposicin hace variar drsticamente elcrecimiento de este bacilo, por lo que, depende en mucho del tiempo como factorclave. Por ello, Rodrguez et al. (2006), hallaron modificacin en el crecimiento

bacterial a 0,1 Tesla y 6,5 horas, al manifestarse incremento de 100 %comparndolo con el control no estimulado.

En la siguiente tabla se describe la respuesta de E. coli al ser sometida adiferentes campos magnticos:

Tabla 8. Resumen de parmetros utilizados para estimular magnticamente E. coliFuente (Autores).

Autor(es)Tiempo deexposicin(minutos)

Temperatura(C)

Densidad decampo

magntico(mT)

Medio decultivo.

Efecto sobreel

crecimiento.

Belyaev(2011)

15 No aplica 0,021CaldoLuria

Inhibicin

Bajpai etal.(2012)

30,60,120,240

37 100MedioLuria

BertaniInhibicin

Bajpai etal.(2014)

30, 120,240

37 100

MedioLuria

Bertanicon

hidroxiapatita y

magnetita.

Inhibicin

Filipic et

al.(2012).0 -25 28 + 0.5 5,17,50.

MedioLuria

Bertani.Inhibicin

Fojt et al.(2004)

30 20 - 25 10Caldo TY y

Agarnutritivo.

Inhibicin
http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809http://search.proquest.com.ezproxy.utp.edu.co/indexinglinkhandler/sng/au/Bajpai,+Indu/$N?accountid=45809

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Gaafar etal.(2006)

360 -960 37 2Agar

nutritivo.Inhibicin

Kamel etal.(2013).

1440,2880, 4320

No aplica 40, 80, 120,160

Agar

MacConkey y caldonutritivo.

Inhibicin

Shin-ichiro etal.(2002)

720 43 5200 -6100MedioLuria

Bertani.Inhibicin

Strasak etal.(2002)

0 -12 20 - 25 2.7 -10Caldo TY y

Agar

nutritivo.

Inhibicin

Wenjin etal.(2009)

0 -60 25 - 4045, 450 -

3.500

MedioLuria

Bertani.Inhibicin

Zhang etal.(2002)

0 -1500 No aplica 50,100,200,400,600

Preparadocon:

Extractode carne,

peptona,extracto delevadura,

Cloruro desodio yagua

destilada.

Inhibicin

Del Re etal. (2003)

3480 37 0,1 - 1MedioLuria

Bertani.

Ningncambio

Esmekayaet al.(2013)

1440 No aplica 2

MedioLuria

Bertanicon FeCl3.

Ningncambio

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Babushkinaet al.(2005)

1080 No aplica 25MedioLuria

Bertani.Incremento

Fijakowskiet al.(2014)

60 No aplica 25 -34 No aplica Incremento

Nascimentoet al.(2003)

480 No aplica 0.5Caldo

glucosa.Incremento

Nawroteket al.(2014)

30 -150 No aplica 30 No aplica Incremento

Rodrguezet al.(2006)

60 - 720 No aplica 100 -1000

Agarnutritivo,

peptona yextracto de

carne.

Incremento

Segatoreet al.(2012)

0 -24 37 + 0.3 2Caldo

MuellerHinton.

Incremento
http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Fija%C5%82kowski%2C+K%29

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2.2 Saccharomyces cerevisiae.

El gnero Saccharomycesfue expuesto por primera vez en 1838 por Meyer. Con

el paso de los aos, se han realizado cambios del mismo hasta clasificarlo en dosprincipales grupos: Saccharomyces sensu stricto y Saccharomyces sensu lato. Lacategora sensu stricto enlaza las levaduras relacionadas con S. cerevisiae en suorigen o historia evolutiva, conocido como filogenia; adems este tipo demicroorganismos se caracteriza por ser utilizado en la industria alimentaria. Porotra parte, el grupo sensu lato encierra todos los dems miembros del gnero(Fleet, 2006).

Saccharomyces cerevisiae es eucariota, anaerobia facultativa, la forma de su

clula es elipsoidal de aproximadamente 5 m de dimetro, posee una

temperatura optima de crecimiento entre 37-40 C y se reproduce por gemacinmultilateral, ms o menos cada 90 minutos. Adems, la levadura puedepropagarse como haploide o diploide y sufrir mitosis (Dickinson y Schweizer,2004: Pez, 2010).

Las clulas haploides existen de dos tipos: ay . Para la formacin de diploides(a/) se requiere elementos haploides de ambas tipologas ay que se conjuganentre s cuando cada una forma protuberancias que logran fusionarse al entrar encontacto. Al llegar el momento en que los nutrientes se agotan, las clulasdiploides atraviesan la meiosis formando cuatro esporas capaces de germinar al

poseer de nuevo condiciones favorables para su crecimiento. Sin embargo, segeneran como haploides, dos del tipo a y dos (Figura 16) (Dickinson ySchweizer, 2004).

La figura siguiente describe el proceso de reproduccin de los tipos de clulasmencionadas:
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9

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Diploide.

Seudohifas.

Fase

Estacionaria.

Esporulacin.

Conjugacin.

a

FaseEstacionaria.

Filamentos

Invasivos.

Haploide.

(Dickinson, 2004)

() y (a)

(a/)

Figura 16. Reproduccin de Clulas Haploide y Diploide de la Levadura S. cerevisiae

(Dickinson y Schweizer, 2004)
http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9http://www.google.com.co/search?hl=es&tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22J.+Richard+Dickinson%22&source=gbs_metadata_r&cad=9

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S. cerevisiae puede crecer en diferentes medios de cultivo dentro del laboratorio.Con este objetivo, ha sido implementado los siguientes agares: Glucosa y patataque es til en la identificacin y recuento de la levadura en productos alimenticios,BHI, nutritivo, Maltosa Sabouraud y agar diferencial. Tambin algunos

presentados en el mercado como agar o caldo: extracto de malta para aislamientoy otros fines, Glucosa Sabouraud, entre otros (PANREAC, 2009).

Por otra parte, las levaduras han sido de inters investigativo porque soneucariotas unicelulares, fciles de manipular y con capacidad de reproducirse demaneras rpidas. Adems, S. cerevisiaees extensamente estudiada por su usoen alimentos, entre ellos vino y pan, por lo que se considerada muy til en laelaboracin de diferentes tipos de vveres que enriquecen las mesas de muchoshogares (Blackburn, 2006). Esto es posible, debido a que son utilizadas sustanciasde desecho que provienen de la fermentacin alcohlica, tales como etanol ydixido de carbono, y contribuyen a producir los comestibles (Tortora et al.2007).

La estimulacin magntica de S. cerevisiae ha mostrado resultados variables:

Novk et al. (2007) y Otabe et al. (2009), encontraron que el campo magnticoadems de disminuir el nmero de UFC, retarda el crecimiento de esta levaduracuando elimina parte de ellas, mientras otras clulas, se adaptan al ambienteadverso en el que se encuentran. Por ello, Iwasaka et al. (2004), afirma que laexposicin al campo magntico tiene efecto bactericida. Tambin, Markkanen etal. (2001) hallan como la radiacin UV, junto con este tipo de estimulacin

electromagntica, tiene mayor capacidad de disminuir la cantidad de clulaspresentes de S. cerevisiae,comparndolo con la falta de electro-estimulacin.

Por otro lado, segn Egami et al. (2010) el efecto depende del tiempo y laintensidad del campo magntico suministrado. En vista de ello, Anton-Leberre etal.(2010) afirman que la interaccin con el campo magntico a 16 T y 8 horas, noproduce cambios en la forma en que se propaga S. cerevisiae o su sistemabiolgico. Al igual, Ruiz et al. (200

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