6. RESULTADOS

6.1 FENOTIPO DE LAS MUTANTES CAX

6.1.1 Germinación de las semillas

Las semillas de Arabidopsis thaliana, tanto las tipo silvestre como las

mutantes, iniciaron su germinación alrededor de las 24 horas después de haber sido

sembradas. Sin embargo, no fue sino hasta las 96 horas cuando se observó que más

del 90% de las semillas habían germinado. Las semillas de las plantas WT y CAX1-

OE mostraron mayor porcentaje de germinación (superior al 70%) desde las 24

horas después de haberse sembrado. Las plantas con menor porcentaje de

germinación inicial fueron las mutantes cax1 (alrededor del 16%), mientras que las

mutantes cax3 presentaron un porcentaje de germinación inicial aproximado del

50% (Tabla 6.1).

Tabla 6.1 Porcentaje de germinación de las semillas de las plantas en estudio a las 24 y 96 horas después de haber sido sembradas.

Tipo de planta % germinación a las 24 hrs % germinación a las 96 hrsWT 74.1 93.9 cax1 17.0 96.8 cax3 53.3 100.0

CAX1-OE 70.7 91.7

35

6.1.2 Fenotipos observados

Respecto a los fenotipos de cada una de las plántulas de A. thaliana, fue

difícil diferenciar a las tipo silvestre (WT) de las sobreexpresoras CAX1-OE, pues

tuvieron tamaños similares, tanto en el ancho de sus cotiledones como en el largo de

las raíces (datos no mostrados). Ambos tipos de plántulas fueron las de mayor

tamaño de los cuatro tipos de plántulas estudiadas (Figura 6.1.b y 6.1.d). La mutante

cax1 fue la más fácil de distinguir, pues sus plántulas fueron las de menor tamaño,

con cotiledones angostos y doblados en comparación con los cotiledones grandes y

extendidos de las plántulas WT (Figura 6.1.e); además la longitud de su hipocótilo

fue aproximadamente dos milímetros menor que el de WT (Figura 6.1.a).

Finalmente, las mutantes cax3 mostraron un tamaño intermedio entre las plántulas

cax1 y WT; con cotiledones extendidos pero de menor tamaño que las WT y un

hipocótilo largo como las tipo silvestre (Figura 6.1.c).

Después de una semana de crecimiento, las plántulas de A. thaliana

alcanzaron una longitud de aproximadamente un centímetro y medio, y presentaron

sus primeras hojas; sus raíces midieron alrededor de un centímetro con una buena

verticalidad respecto al vector de gravedad. Algunas de estas plántulas comenzaron

a generar sus primeras raíces secundarias, justo por debajo del sitio en el que se

inició la raíz principal (datos no mostrados). No se encontraron diferencias claras

entre el fenotipo de las raíces de las mutantes cax3 y CAX1-OE respecto a la WT,

pero las raíces de las plántulas cax1 fueron más pequeñas que las de la WT. De

manera interesante, todas las raíces presentaron mayor densidad de pelos radicales

36

en el extremo superior y las plántulas cuya raíz se ‘enterró’ en el agar desarrollaron

un menor número de pelos radicales en esta zona.

(a) (b) (c)

(d)

(e)

Figura 6.1 Fenotipos de las plántulas de Arabidopsis thaliana a la edad de una semana de crecimiento: (a) cax1, (b) WT, (c) cax3, (d) CAX1-OE. (e) Las mutantes cax1 muestran menor tamaño que las plántulas WT y diferencias claras entre sus cotiledones.

37

6.2 RESPUESTA GRAVITRÓPICA

Para estudiar posibles alteraciones en la respuesta gravitrópica de las raíces

de las mutantes cax, se indujo la respuesta gravitrópica en plántulas de una semana

de edad crecidas verticalmente. Tanto las raíces de las plántulas tipo silvestre como

las de las mutantes respondieron al estímulo gravitrópico aplicado, es decir, todas

las raíces desarrollaron una curvatura en su raíz como consecuencia del giro de 90°

respecto al vector de gravedad (Figura 6.2). Sólo algunas de las raíces que quedaron

hundidas en el agar mostraron una curvatura menos pronunciada o casi

imperceptible en comparación con las que lograron crecer por encima del medio

sólido. Además, el mayor cambio de ángulo de las raíces se observó durante las

primeras cuatro horas después del giro y fue más o menos constante a partir de las

seis horas (Figura 6.3)

Las plántulas WT generaron una mayor curvatura en su raíz, alcanzando un

ángulo mayor a los 70° a las 24 horas después del giro; mostraron además una

respuesta más rápida durante las primeras ocho horas de estimulación (Figura 6.4).

Entre las mutantes, las plantas cax1 mostraron la curvatura más grande a las 24

horas después del giro, quedando por arriba de las mutantes cax3 y de las

sobreexpresoras CAX1-OE, pero por debajo de la WT; sin embargo, las plántulas

cax1 desarrollaron la curvatura inicial más pequeña en las primeras ocho horas

después del estímulo gravitrópico (Figura 6.4). Las plántulas CAX1-OE fueron las

mutantes que mostraron una respuesta gravitrópica menor. Finalmente, las plántulas

cax3 fueron las únicas en presentar raíces con ángulos de giro mayores que los de la

WT en dos de los cuatro experimentos de estimulación gravitrópica (28-07-04 y 05-

38

08-04) y dentro de las primeras seis horas de giro; sin embargo, a las 24 horas

después del giro desarrollaron curvaturas menores a la WT.

Figura 6.2 Respuesta de las plántulas de A. thaliana al estímulo gravitrópico. Las puntas de las raíces desarrollan una curvatura de acuerdo al nuevo vector de gravedad.

39

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

Figura 6.3 Secuencia de la respuesta a la gravedad de la raíz de una plántula de A. thaliana WT. Respuesta al giro de 90° después de: (a) cero, (b) dos, (c) cuatro, (d) seis, (e) ocho y (f) 24 horas.

40

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CAX1 CAX3 OE WT

Ángu

lo d

e cu

rvat

ura

de la

raíz

(Gra

dos)

Tiempo después del giro (Horas)

(a)

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CAX1 CAX3 OE WT

Ángu

lo d

e cu

rvat

ura

de la

raíz

(Gra

dos)

Tiempo después del giro (Horas)

(b)

Figura 6.4 Respuesta gravitrópica general de las raíces de A. thaliana. Experimentos: (a) 28-07-04, (b) 05-08-04

41

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CAX1 CAX3 OE WT

Ángu

lo d

e cu

rvat

ura

de la

raíz

(Gra

dos)

Tiempo después del giro (Horas)

(c)

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CAX1 CAX3 OE WT

Ángu

lo d

e cu

rvat

ura

de la

raíz

(Gra

dos)

Tiempo después del giro (Horas)

(d)

Figura 6.4 Respuesta gravitrópica general de las raíces de A. thaliana. Experimentos: (c) 25-09-04, (d) 02-10-04.

42

6.2.1 Resultado del análisis estadístico de la respuesta gravitrópica

De los cuatro experimentos seleccionados para el análisis estadístico, en los

dos primeros, 28-07-04 y 05-08-04, y después de la aplicación de las pruebas t-

Student correspondientes (IC 95%), no se encontró ninguna diferencia en las

respuestas gravitrópicas entre las plántulas WT y las mutantes cax. Para el

experimento 28-07-04, sólo en una de las 15 pruebas de t-Student se encontró una

diferencia en el ángulo de giro entre la mutante cax1 y la WT a las ocho horas

(p<0.011) después de la aplicación del estímulo gravitacional.

En el experimento 25-09-04 se encontraron diferencias significativas entre

las tres mutantes y la WT. Para la mutante cax3 se encontró que la respuesta al

graviestímulo fue distinta de la WT a las dos (p<0.045), cuatro (p<0.018), seis

(p<0.005) y ocho (p=0.000) horas después del giro. La mutante cax1 sólo resultó

diferente a la WT en las respuestas de las seis (p<0.049) y ocho (p<0.013) horas

después del giro. Finalmente, las plantas CAX1-OE mostraron un giro en su raíz

distinto a la WT a las seis (p<0.032), ocho (p<0.001) y 24 (p<0.006) horas después

de la estimulación gravitrópica. Asimismo, para el experimento 02-10-04 se

observaron respuestas distintas entre las tres mutantes y la tipo silvestre. La mutante

cax3 respondió de forma diferente a la WT a las cuatro (p<0.008), seis (p<0.029) y

24 (p<0.024) horas después de giro. La mutante cax1 giró de forma distinta a la WT

a las dos (p<0.015), cuatro (p=0.000), seis (p<0.009) y ocho (p<0.034) horas

después del giro. Y la mutante CAX1-OE respondió diferente a la WT a las cuatro

(p<0.018), seis (p<0.021), ocho (p<0.025) y 24 (p<0.003) horas después del giro.

43

(Ver Apéndice C). En general, se encontró que la respuesta de las raíces de las

mutantes cax al estímulo de la gravedad fue menor a la respuesta de la línea

silvestre.

6.3 RESPUESTA ESTOMATAL

6.3.1 Tratamiento de la epidermis de A. thaliana con ABA

La incubación de la epidermis recién aislada de las hojas de A. thaliana en

solución de MES/KOH 10mM a pH 5.5 con KCl 50mM, bombeada con aire libre de

CO2 y colocada bajo la luz de una lámpara, ocasionó la apertura de los estomas a

partir de los 50 minutos de incubación, aunque la mayor apertura se alcanzó hasta

después de las dos horas. Sin embargo, es importante mencionar que fue difícil

medir los cambios en la apertura de los estomas.

Para determinar los efectos del ABA sobre la apertura de los estomas de las

diferentes plantas bajo estudio, inicialmente se expusieron epidermis aisladas a 5

µM de ABA –concentración que causa el cierre de los estomas en Commelina

communis. Esta concentración de ABA no causó una clara respuesta estomatal de

cierre en ninguna de las plantas, por lo que se decidió realizar un tratamiento

simultáneo de diferentes segmentos de epidermis, expuestos a diferentes

concentraciones de ABA (1 µM, 10 µM y 100 µM). Sorprendentemente, ninguna de

estas concentraciones de ABA causó cambio alguno en la apertura estomatal de

dichas epidermis; es decir, no se obtuvo el esperado cierre de los estomas inducido

44

por el ácido abscísico (Figura 6.5). Es importante recordar que los estomas de

dichas epidermis fueron previamente estimulados para abrirse, mediante su

incubación por cerca de dos horas en la solución amortiguadora.

6.3.2 Dificultad para analizar la respuesta estomatal en epidermis

La superficie de la epidermis de A. thaliana es irregular, por lo que los

estomas quedan en distintos planos, algunos inclinados y otros paralelos a la

superficie de soporte sobre la que la epidermis fue montada, lo cual hizo difícil la

medición del ancho del poro estomatal (Figura 6.6). Además, los estomas no se

distribuyen uniformemente en la epidermis, por lo que se encuentran unas zonas con

escasos estomas y otras donde son más abundantes, a lo largo de toda la superficie

de la hoja. Por otro lado, debido al pequeño tamaño de los estomas de A. thaliana

fue necesario utilizar el objetivo 40X para poder distinguir la apertura de los

mismos.

Como consecuencia de la irregularidad de la superficie de la epidermis, el

análisis de la respuesta estomatal al ABA, que consistía en medir el ancho del poro

estomatal, no fue posible en la mayoría de los casos, como se muestra en el ejemplo

de la Figura 6.7. Para poder resolver este problema, se decidió medir el ancho de las

dos células guarda (como se refiere en la sección 5.2.2 de Material y Métodos)

esperando que este parámetro fuera indicador del ancho del poro; pues se sabe que

antes de que el estoma se cierre, las células guarda pierden su turgencia y por tanto

se encogen (dejan de estar hinchadas).

45

(a) (b)

Figura 6.5 Respuesta nula de los estomas de A. thaliana WT a la estimulación del ácido abscísico (ABA). (a) Control, 0 min. (b) Después de 60 min de incubación en ABA 10 µM.

Figura 6.6 Topografía de la epidermis de las hojas de A. thaliana WT obtenida por microscopía de barrido (2000X). Adquirida en: http://remf.dartmouth.edu/images/ ArabidopsisSEM/

46

Figura 6.7 Fotos de epidermis de A. thaliana mostrando la dificultad para medir el ancho del poro de los estomas debido a sus posiciones en distintos planos.

Regresión Lineal R2 SD N P

0.07353 2.24136 36 .10968

54 56 58 60 62 64 66 68 70

0

2

4

6

8

10

12

Anch

o de

l por

o

Ancho de las células guarda

Figura 6.8 Relación del ancho del poro con el ancho de las células guarda de A. thaliana WT.

47

6.3.3 Relación entre el ancho del poro y el ancho de las dos células guarda.

Para poder analizar la respuesta estomatal, se decidió medir el ancho de las

dos células guarda que forma cada estoma y saber si existía una correspondencia

con el ancho del poro. Para ello se midieron el ancho del poro y el ancho de las

células guarda de los estomas que se encontraban en el mismo plano del

portaobjetos donde se montó la epidermis. Graficando la distancia entre los

extremos externos de dos células guarda contra el ancho del poro se obtuvo la

gráfica de la Figura 6.8. El análisis de los datos obtenidos mostró que no hubo una

relación lineal entre el ancho del poro y el ancho de las células guarda de los

estomas (r2 = 0.074). Por lo tanto, la distancia entre los extremos de dos células

guarda de un mismo estoma no fue un parámetro que nos permitiera inferir en

forma indirecta el grado de apertura del poro estomatal.

6.3.4 Respuesta a la Fusicoccina

Debido a la falta de respuesta de los estomas expuestos al ABA, se procedió

a determinar si esto era debido a que las células guarda pudieran estar dañadas,

mediante el estudio del efecto de la Fusicoccina sobre la apertura de los estomas.

Las epidermis recién aisladas de las plantas de A. thaliana WT se incubaron en

fusicoccina (5 µM) esperando que el poro del estoma se abriera, como se ha

reportado ampliamente en la literatura (Eun y Lee, 2000), pero no se observó

ninguna modificación en la apertura estomatal (Figura 6.9). Como se mencionó

anteriormente, se encontraron las mismas dificultades para hacer la medición del

ancho del poro debido a la irregularidad topográfica de la superficie epidermal.

48

6.3.5 Viabilidad de las células de las epidermis aisladas de A. thaliana.

Como consecuencia de la falta de respuesta de las células guarda a los

tratamientos de ABA y fusicoccina, se procedió a verificar la viabilidad de las

células de las epidermis aisladas mediante la ayuda de la tinción con el colorante

vital Rojo Neutro, el cual puede permear a través de las membranas celulares.

Después de incubar las epidermis recién aisladas de A. thaliana por quince minutos

en una solución al 0.01% de Rojo Neutro, se observó que al menos un 50% de las

células epidérmicas estaban vivas; lo cual indicaba que durante el proceso de

aislamiento de las epidermis, un gran número de células se dañaron (Figura 6.10.a).

Cabe señalar que las células que se tiñeron mayormente fueron las células guarda de

los estomas (Figura 6.10.a). También se tiñeron con Rojo Neutro epidermis que

habían sido incubadas en la solución amortiguadora de MES/KOH 10mM y KCl

50mM, bombeada con aire libre de CO2 y bajo luz. Estas epidermis se tiñeron

menos que aquellas recién aisladas de las hojas, lo que indicaba que la viabilidad de

las células epidérmicas disminuyó con el tiempo (datos no mostrados). Finalmente

se tiñeron epidermis tratadas con ABA por cerca de dos horas, después de haber

estado incubadas en la solución amortiguadora libre de CO2 y bajo luz, por al menos

una hora; es decir, se usaron epidermis que habían sido aisladas aproximadamente

tres horas antes. En estas muestras se observó que las células guarda y sólo unas

pocas células epidérmicas, que curiosamente estaban cercanas o junto a las células

guarda, estaban aún viables (teñidas de rojo; Figura 6.10.b).

Estos resultados indican que la viabilidad de las células epidérmicas en

epidermis aisladas disminuyó conforme transcurrió el tiempo. Es importante

49

recalcar que inicialmente sólo alrededor del 50% de las células epidérmicas

presentes en la epidermis aislada estaban vivas.

6.3.6 Respuesta estomatal en hojas completas de A. thaliana

Dado que no se observó ninguna respuesta en los estomas de las epidermis

aisladas ante los tratamientos con ABA y fusicoccina como consecuencia de un

posible daño a las células epidérmicas, se decidió realizar el ensayo con ABA pero

ahora sobre las hojas completas de A. thaliana. El objetivo de estos estudios fue

comprobar si el efecto mecánico del desprendimiento de la epidermis tenía un

efecto negativo sobre la actividad de las células guarda.

Las hojas en las que los estomas no se encontraban abiertos se incubaron en

la solución amortiguadora de MES/KOH 10mM con KCl 50mM, bombeada con

aire libre de CO2 y bajo iluminación. Después de aproximadamente una hora de

incubación, se observó un ligero aumento en la apertura de los estomas.

Posteriormente estas hojas se incubaron en solución de ABA 10 µM por al menos

una hora pero no se observó un cierre claro de los estomas (Figura 6.11).

El análisis de la respuesta estomatal en las epidermis unidas al mesófilo, fue

aún más complicado que el de las epidermis aisladas. En general, fue difícil

observar claramente la apertura de los poros, ya que un mismo estoma parecía estar

abierto o cerrado, según el plano de enfoque que se empleara. (Ver Figura 6.12.

Comparar con Figura 6.7). Por estas razones ya no se realizaron más ensayos con

hojas completas de A. thaliana, a pesar de que aparentemente se evitaba la afección

50

sobre la viabilidad de las células epidérmicas ante el desprendimiento de la

epidermis.

Figura 6.9 Ausencia de respuesta de los estoma de A. thaliana WT a la estimulación por fusicoccina. (a) Control, 0 min. (b) Después de 60 min de incubación en fusicoccina 5µM.

(a)

(b)

Figura 6.10 Viabilidad de las células epidérmicas en segmentos de epidermis aislada de A. thaliana tipo silvestre. La coloración roja de las células indica que están vivas. (a) Tinción sobre epidermis recién aislada; células guarda viables. (b) Tinción sobre epidermis tratada por dos horas con ABA 10 µM.

51

(a) (b)

Figura 6.11 Respuesta al ABA de los estomas de A. thaliana en hojas intactas (epidermis unida al mesófilo). (a) Control, 0 min. (b) Después de 60 min de incubación en ABA 10 µM.

Figura 6.12 Hoja de A. thaliana mostrando la dificultad para distinguir los estomas y por lo tanto, para medir el ancho del poro de los mismos.

52

6.3.7 Tratamientos en Commelina communis

Debido a lo difícil que fue obtener observaciones claras con los estomas de

A. thaliana bajo los diferentes tratamientos, fue necesario comprobar que el

procedimiento experimental era el adecuado. Por lo tanto se procedió a realizar

estudios similares con otra especie que ha sido empleada ampliamente para el

estudio de la fisiología de los estomas. Esta planta fue Commelina communis la cual

permite el fácil aislamiento de la epidermis, mantiene la viabilidad de casi todas las

células epidérmicas, con células guarda relativamente grandes y que facilita la

medición de los cambios en la apertura de los poros de los estomas.

La incubación de las epidermis aisladas de C. communis que no mostraban

los estomas abiertos en la solución amortiguadora de MES/KOH 10mM con KCl

50mM, bombeada con aire libre de CO2 y bajo la luz, permitió que la apertura del

poro de los estomas aumentara. Una vez abiertos los estomas, se llevó a cabo el

tratamiento con ABA, incubando las epidermis por alrededor de una hora en una

solución de ABA 10 µM. Este tratamiento causó el cierre en los poros estomatales;

el cambio en la apertura del poro fue claro hasta las dos horas de tratamiento

(Figura 6.13).

En experimentos adicionales, se estudió el efecto de la fusicoccina sobre la

apertura del poro de los estomas de C. communis. La incubación en una solución de

fusicoccina 5 µM se realizó inmediatamente después del aislamiento de la

epidermis, donde se pudo observar que la apertura de los estomas aumentó después

de media hora de incubación, aunque la apertura fue mayor a las dos horas de

tratamiento (Figura 6.14). Estos resultados contrastan con los observados en A.

53

thaliana donde los estomas permanecieron con la misma apertura a lo largo del

tratamiento (Figura 6.8).

La medición del ancho del poro de los estomas fue mucho más sencilla en C.

communis, pues la superficie de la epidermis de esta especie es lisa, los estomas son

de mayor tamaño que los de A. thaliana (pudiéndose observar definidamente con el

objetivo de 40X) y se encuentran distribuidos uniformemente en toda la hoja.

Por otro lado, se analizó la relación entre el ancho del poro y el ancho de las

células guarda de C. communis como en el caso de A. thaliana (Ver sección 6.3.3),

para confirmar que nuestra propuesta de análisis era válida. La gráfica que se

muestra en la Figura 6.15, resume los datos obtenidos de varias epidermis de C.

communis, donde se puede observar que la relación ancho de dos células guarda

contra ancho del poro fue lineal. El análisis de regresión lineal de estos datos mostró

que la relación entre dichos anchos es confiablemente lineal (r2 = 0.87); es decir, el

ancho de las células guarda se puede emplear para estimar el ancho del poro

formado entre ellas.

Finalmente, se comprobó la viabilidad de las células epidérmicas de C.

communis mediante la tinción con Rojo Neutro sobre las epidermis recién aisladas y

se pudo observar que casi el 100% de las células presentes se tiñeron de rojo, lo cual

indica la viabilidad de todas las células, tanto epidérmicas como estomatales (Figura

6.16). Después de dos hora de haberse mantenido las epidermis en solución

MES/KOH 10mM a pH 5.5 con KCl 50mM, burbujeada con aire libre de CO2 y

bajo iluminación, la viabilidad de las células epidérmicas de C. communis no

mostró un cambio significativo.

54

Figura 6.13 C. communis, respuesta estomatal al ABA 10 µM (a) 30 min y (b) Dos horas en incubación.

(b)

(a)

55

56

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

Figura 6.14 C. communis bajo tratamiento con fusicoccina 5µM. (a). Control (tiempo 0); respuesta a la fusicoccina después de (b) 15 min, (c) 30 min, (d) 45 min, (e) 1 hora, y (f) 2 horas después de iniciado el tratamiento.

Regresión lineal

R2 SD N P .87277 1.58335 22 <0.0001

80 85 90 95 1004

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Anc

ho d

el p

oro

Ancho de las células guarda

Figura 6.15 Relación entre el ancho del poro y el ancho de las células guarda de C. communis

Figura 6.16 Viabilidad de las células epidérmicas en trozos de epidermis recién aislada de C. communis La coloración roja de las células indica que están vivas; las distintas intensidades de rojo se presentan por diferencias en el pH.

57