72º Congreso Argentino de

Bioquímica

2017 Dra. Débora Natalia Marcone Investigadora Asistente CIC CONICET Unidad de Virología, CEMIC-CONICET

Familia Picornaviridae

Pequeños (∅ 30 nm)

Desnudos

Cápside icosaédrica, 4 proteínas

VP1: Externa. El MAYOR blanco de la Rta Inmune

Cañón: se une a los Rc celulares, blanco de antivirales

VP2/VP3: Externas. También contribuyen a la antigenicidad

VP4:Interna. Interactúa con el genoma

Genoma ARN (+) cadena simple (7,2 kb)

único marco abierto de lectura1 poliproteína origina todas las proteínas por clivaje enzimático

Poliproteína

Clivaje Alternativo

Proteínas Estructurales

Proteínas

No Estructurales

Período de incubación ∼2 días

Síntomas: 7-14 días

◦ Con o sin Fiebre

Virus más frecuente resfrío común

niños: hasta 12 infecciones/año

adultos: 3-5 infecciones/año

Circulación anual, con dos picos en otoño y primavera

Asociados a:

◦ IRA alta: resfrío, otitis, sinusitis

◦ IRA baja: bronquiolitis, neumonía

◦ Sibilancias recurrentes

◦ Exacerbaciones de asma, EPOC y Fibrosis Quística

Alto impacto económico: directo (uso de recursos médicos) e indirecto (ausentismo laboral y escolar)

Nuevo Impacto clínico incorporación de métodos moleculares para

diagnóstico y tipificación

2/3 50%

45%

25%

Niños 8-14 días

Adultos 7-13 días

RN pretérmino 30 días

Inmunocomprometidos 1-4 meses

Peltola V, et al. Clin Micro Infect. 2013. 19 (7) Loeffelholz MJ, et al. Pediatrics 2014. 134;1144

Kainulainen L, et al. J Allergy clin Immunol 2010. 126

RT-PCR y secuenciación permiten diferenciar consecutivas infecciones con distintos tipos de RV de una

infección prolongada causada por un único tipo de RV

Contacto directo

Fomites: inoculación en nariz, ojos

Aerosoles

IMPORTANTE

Lavado de MANOS

buenos hábitos de Higiene

Unión a la cápside: Pleconaril, Vapendavir, Pirodavir Tremacamra (ICAM-1 soluble)

Formulaciones: oral o spray intranasal

Inhibidor de 3C proteasa: Ruprintivir

Interferón alfa 2

Ninguno demostró ser completamente eficaz y libre de efectos adversos

Sept. 2016Vacunas 10, 25 y 50 valente de RV-A en ratones y monos

Inactivadas formalina, alta cc Ag

Diagnóstico:

◦ Cultivo: dificultoso, solo RV-A y B

◦ RT-PCR en tiempo real

basada en 5’NCR

Tipificación: RT-PCR y secuenciación

◦ VP1: asignación de genotipos y clasificación taxonómica

◦ VP4/VP2: epidemiología molecular y asignación de genotipos provisionales (pat)

◦ 5’NCR

Tipificación

(549 pb)

5’NCR

Detección

(207 pb) Taxonomía

(860 pb)

Combinación de método diagnóstico (5’NCR) y análisis de filogenia de una región codificante de la cápside

Género Enterovirus: 12 especies (7 humanas)

◦ Enterovirus A, B, C, D

◦ Rinovirus -A 80 genotipos

-B 32 genotipos

-C 55 genotipos

Basada en divergencia de Nt de secuencias de la cápside:

◦ VP1 RV-A y C: 13% RV-B: 12%

◦ VP4/VP2 RV-A y C: 10,5% RV-B: 9,5%

PAT (provisionally assigned types): basados en VP4/VP2(pendiente VP1/genoma completo)

◦ RV-A: pat 1-4 RV-B: pat1-4 RV-C: 11 pat

(Simmonds, 2010; McIntyre, 2013; Picornavirus Study Group)

Hospital Universitario CEMIC

UNVIR, CEMIC-CONICET

Realizar el diagnóstico de RV

Describir su frecuencia, estacionalidad, las coinfecciones y los cuadros clínicos asociados

Describir la epidemiología molecular de las cepas de RV circulantes

En:

I. niños menores de 6 años, internados o ambulatorios

II. recién nacidos pretérmino con patologías de base internados

III. adultos inmunocompetentes ambulatorios

con IRA alta y/o baja, en el Hospital Universitario CEMIC

876 Muestras Respiratorias con ficha epidemiológica

Procesamiento

Junio 2008 a Diciembre 2011

Inmunofluorescencia

Indirecta Directa

Extracción ARN viral (manual con columnas Qiagen)

RT-PCR en tiempo real (5’NCR de RV)

Análisis

Epidemiológico

Base de Datos

Distribución porcentual del diagnóstico de virus respiratorios

en 876 niños con IRA

IF

IF + RT-PCR

RSV: 23,6% hMPV: 7,3%

FluA: 3,3% PIV: 3,3% AdV: 2,9% FluB: 1,9%

HRV: 40,1%

RSV

hMPV

FluA PIV

AdV FluB

Negativos 58,7%

Positivos 41,3%

RSV

hMPV

FluA PIV AdV

FluB

HRV Negativos

26,6%

Positivos 73,4%

RSV

29,0%

hMPV

7,9%

FluA 2,9% PIV 1,7% AdV 3,3%

FluB

0,7%

HRV

45,8%

Negativos 20,0%

Positivos 80,0%

RSV

13,1%

hMPV 6,1%

FluA

4,0%

PIV 6,4%

AdV 2,0%

FluB

4,4%

HRV

29,0% Negativos

39,4%

Positivos 60,6%

Distribución porcentual de virus respiratorios Hospitalizados (n=579)

Ambulatorios (n=297)

Coinfecciones Duales 11 % HRV-RSV 58%, HRV-hMPV 19%,

HRV-AdV 11%, entre otras

Coinfecciones Duales 4,4 % HRV-RSV 23%, HRV-hMPV 23%,

HRV-PIV 23%, entre otras

1 1 1 1 1 1.43 1.85 2.21 1.72 2.77

3.35 3.22

5.58 5.90

3.67

24.1

10.1

14.3

8.48

12.4

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

Taquipnea Sibilancias Tiraje Bronquiolitis Hospitalización

Negativo HRV RSV HRV-RSV

OR 193.4 45.2 44.2

Coinfección RV-RSV: mayor riesgo asociado a gravedad y hospitalización

Marcone, Echavarria, et al (unpublished)

876 Muestras

Respiratorias

RT-PCR en

tiempo real

HRV

351 Muestras

RV positivas

45 RV positivas

seleccionadas

RT-PCR (5’NCR/VP4/VP2)

Secuenciación

Filogenia Reconstrucción

demográfica

BA

39

8H

M3

20

01

10

BA

41

3H

M3 1

5 0

3 1

0

BA

424H

L3 1

2 0

4 1

0B

A415H

L3 0

8 0

3 1

0

96

HR

V-A

29

8

BA

184H

L3 1

8 1

1 0

8B

A180H

M3 2

1 1

0 0

89

7

HR

V-A

18

BA

102A

20

04 0

9

BA

447H

L3

19 0

5 10

HRV-A

29

HRV-A

66

HRV-A41

HRV-A33

BA171A 28 09 09

HRV-A22

BA82A 12 09 08

HRV-A1B

HRV-A88

BA394HL3 13 01 10

97BA126HM3 25 08 08

BA50A 23 07 08BA6HM3 02 06 08

95

BA27A 14 07 08BA117HL3 12 08 08

BA69HM3 02 07 08

8491

78

BA231HM3 05 05 09

BA194HM3 12 02 09

BA94A 02 01 09

BA96A

20 03 09

HRV-A

101

BA

89A 24 11 08

88

HR

V-A

65

BA

22H

L3 1

1 0

6 0

8

BA

182H

M3 0

7 1

1 0

8

100

BA

203H

M3 1

6 0

3 0

9B

A218H

M3 1

7 0

4 0

9

98

BA

192H

L3 0

9 0

2 0

9B

A20

7H

L3

17

03 0

9

93

98

HR

V-C

6

80

HR

V-C

1

95

HR

V-C

7

BA

431H

M3 0

4 0

5 1

0

10

0

BA

99A

13 0

4 0

9

HR

V-C

32

89 73

HR

V-C

9

BA

145A

16 0

6 0

9H

RV

-C5

BA

320H

M3

22 0

9 09

99

BA30

3HL3

14

08 0

9HRV-C

20 100HRV-C

4

BA90A 03 1

2 08

100

BA120A 18 05 09

BA284HL3 10 07 09

99

HRV-C2

91

BA178A 13 11 09HRV-C23

BA67A 08 08 08

99

BA158A 13 08 09

BA12A 27 06 08

82

BA305HM3 17 08 09

BA176HL3 07 10 08

89

BA193A 04 03 10HRV-C8

78

89

99

96

BA270HM3 27 06 09

HRV-B5

HRV-B27

HRV-B86

HRV-B

6

HRV-B

14

96

100

HEV-C

HE

V-B

HE

V-A

BA

188H

L3 2

6 1

2 0

8

HE

V-D

78

71

0.5

Se detectaron las 3 especies:

55% RV-A (n=24)

43% RV-C (n=19)

2% RV-B (n=1)

Análisis de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ). Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran valores superiores a 70%

Árboles de Máxima Verosimilitud de la región VP4/VP2 de las cepas BA ( ) y de referencia de HRV-A, B y C. Los valores en las ramas representan el valor porcentual de bootstrap sobre 1000 pseudoreplicas; sólo se muestran aquellos valores superiores a 70%.

A4

A1A2

A3

A5

HRV-A39BA171A 28 09 09

HRV-A64HRV-A94

HRV-A15HRV-A74

HRV-A22HRV-A82

HRV-A81HRV-A16

BA82A 12 09 08HRV-A56

HRV-A40HRV-A85

HRV-A1HRV-A1B

HRV-A54HRV-A98

HRV-A63HRV-A59

BA447HL3 19 05 10HRV-A43HRV-A75

HRV-A50HRV-A34HRV-A18

HRV-A76HRV-A33

HRV-A11HRV-A24

HRV-A90HRV-A9

HRV-A32HRV-A67

BA184HL3 18 11 08HRV-A55BA180HM3 21 10 08

HRV-A57HRV-A96

HRV-A61HRV-A73

HRV-A13HRV-A41

HRV-A21HRV-A60

BA102A 20 04 09HRV-A19HRV-A38

HRV-A23HRV-A30

HRV-A2HRV-A49

BA415HL3 15 03 10BA413HM3 08 03 10BA424HL3 12 04 10BA398HM3 20 01 10

HRV-A29HRV-A44

HRV-A25HRV-A62

HRV-A31HRV-A47

HRV-A66HRV-A77HRV-A10HRV-A100

HRV-A7HRV-A88

HRV-A58BA394HL3 13 01 10

HRV-A36HRV-A89

HRV-A8HRV-A95

HRV-A45BA126HM3 25 08 08

BA117HL3 12 08 08BA69HM3 02 07 08BA27A 14 07 08

HRV-A78BA50A 23 07 08BA6HM3 02 06 08

HRV-A12BA231HM3 05 05 09

HRV-A20HRV-A68

HRV-A28HRV-A53

BA96A 20 03 09BA94A 02 01 09BA194HM3 12 02 09

HRV-A101BA89A 24 11 08

HRV-A65HRV-A51

HRV-A71BA22HL3 11 06 08

HRV-A46BA182HM3 07 11 08

HRV-A80

100

75

9184

90

97

87

94

70

97

83

100

9998

84

99

99

72

97

9778

93

90

97

8993

8690

8973

86

92

92

70

96

80

0.5

HRV-B3

HRV-B37

HRV-B6

HRV-B14

HRV-B72

HRV-B86

HRV-B35

HRV-B79

HRV-B83

HRV-B92

HRV-B52

HRV-B48

HRV-B69

270HM3 27 06 09

HRV-B17

HRV-B70

HRV-B91

HRV-B4

HRV-B42

HRV-B5

HRV-B26

HRV-B99

HRV-B97

HRV-B84

HRV-B27

HRV-B93

7273

93

7194

79

84

84

0.5

C1

C2

BA192HL3 09 02 09BA207HL3 17 03 09

HRV-C10BA203HM3 16 03 09BA218HM3 17 04 09

HRV-C3HRV-C6

HRV-C1HRV-Cpat14HRV-Cpat16

HRV-C22HRV-C43

HRV-C21HRV-C7

BA431HM3 04 05 10HRV-C13

BA99A 13 04 09HRV-C32

HRV-C39HRV-C12

BA305HM3 17 08 09HRV-C44

BA176HL3 07 10 08HRV-C42HRV-C8

HRV-Cpat28HRV-C16

HRV-C17HRV-C31

BA193A 04 03 10HRV-C28

HRV-Cpat24HRV-C18HRV-Cpat27

HRV-C25BA178A 13 11 09

HRV-C24HRV-C19

HRV-C41BA12A 27 06 08

HRV-Cpat20HRV-C30HRV-C15

BA158A 13 08 09HRV-C23

BA67A 08 08 08BA120A 18 05 09BA284HL3 10 07 09

HRV-C40HRV-C2

HRV-C47HRV-C35

HRV-Cpat18HRV-Cpat19

HRV-C33HRV-C48

HRV-C14HRV-Cpat22HRV-C4

BA90A 03 12 08HRV-C49

HRV-C20HRV-C34

HRV-C45BA303HL3 14 08 09

HRV-Cpat17HRV-C29

HRV-C27HRV-C11

BA320HM3 22 09 09HRV-C5

HRV-C38HRV-C50

HRV-C46HRV-Cpat10

HRV-C36HRV-Cpat21

HRV-C26HRV-Cpat15

HRV-C37BA145A 16 06 09

HRV-C9

9980

91

99

79

9598

99

9186

85

99

7371

72

99

99

9278

98

99

99

9975

74

9992

8582

98

96

99

94

98

96

90

99

84

87

0.5

Para las 3 especies de RV se obtuvieron topologías similares con los 4 métodos de filogenia: RV-A: 14 genotipos (5 más frecuentes)

RV-B: 1 genotipo

RV-C: 15 genotipos (2 más frecuentes)

Distancia-p (entre clados A1 y A2)= 12,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos

divergen en más del 10,5% (McIntyre y col, 2013)

Clado A2: Posible nuevo genotipo de RV-A

Análisis de recombinación: Simplot, Chimera, Bootscan

Grupos: A2, 78, 12 (ancestro común con A2 y 78 por bayesianos) y 20 (outgroup)

no se encontraron eventos de recombinación

en los 420 nt correspondientes a VP4/VP2

Para realizar la confirmación es necesario amplificar y secuenciar VP1/ genoma completo

Perfiles demográficos bayesianos para la región VP4/VP2 de HRV-A y C

*Perfil de dinámica poblacional Constante

*Tasa de sustitución estimada elevada [2,3.10-2 s/s/a]

*Perfil de dinámica poblacional Constante

*Tasa de sustitución estimada elevada [1,9.10-2 s/s/a]

Las altas tasas estarían reflejando la dinámica de recambio de los distintos genotipos de rinovirus en el tiempo, y no las tasas de mutación de las dos especies, ya que se están analizando genomas de distintos

linajes realizar estudio de un genotipo particular.

HRV-A HRV-C p

(n=16) (n=10)

n (%) n (%)

Hospitalizados ≤ 3 días 7 (43,8) 5 (50,0) 0,688

Hospitalizados > 3 días 9 (56,3) 5 (50,0)

Requerimiento de Oxígeno 13 (81,3) 9 (90,0) 0,280

Requerimiento de cuidados intensivos 3 (18,8) 2 (20,0) 0,999

Asistencia Respiratoria Mecánica 2 (12,5) 1 (10,0) 0,999

Comparación de la evolución clínica de niños hospitalizados con HRV-A o C

No existen diferencias significativas en la evolución de la internación entre los niños con HRV-A o C

Tampoco existen diferencias significativas entre los antecedentes y la clínica de los niños con HRV-A o C

Distribución estacional de las 3 especies de RV y los 7 clados detectados

Circulación simultánea de clados y cepas de RV de distintos genotipos de las 3 especies, principalmente A y C. Los clados mostraron un patrón de

circulación estacional, donde un genotipo parece reemplazar a otro

RV es el virus mas frecuente en niños con IRA

Circulación anual, con picos otoño y primavera

Mayor gravedad en coinfección con RSV

Predomino de RV-A y C, con alto número de genotipos co-circulando

No se observó asociación de genotipos con mayor gravedad

6 pretérmino que desarrollaron IRA

RV único agente etiológico detectado

Filogenia: ◦ Junio/Julio 2014 RV-C43 (1 caso)

RV-C1 (2 casos camas contiguas)

◦ Agosto/Septiembre 2014 RV-A pat (2 casos)

RV-C6 (1 caso)

Distancia-p: entre RV-A pat y referencia A63 10,5% Criterios para la genotipificación de RV-A consideran que distintos genotipos divergen en

más del 10,5% (McIntyre y col, 2013)

Posible nuevo genotipo de RV-A

dd/mm/yyyy

SL (27 SEG)

DBP, ductus

PL (27 SEG)

DBP, ductus

CM (30 SEG)

DBP

HR (29 SEG)

IT (36 SEG)

Trisomía 18

BP (28 SEG)

Ductus, síndrome Distress respiratorio

C43 C43 C43 -

A pat

A pat

A pat

A pat

C1 C1 C1 C1 C1 C1 -

Invierno Primavera

C6 C6

- C1 -

A75 -

- A103

- A pat

A pat

RV causan IRA baja grave en RN pretérmino con patologías de base

Período de positividad: 7 a 28 días

Sucesivas infecciones por distintos genotipos

Co-circulación de diferentes genotipos en UTIN

Posible nuevo genotipo de RV-A

Se confirmó la transmisión nosocomial en dos episodios diferentes

Marcone, Echavarria, et al (unpublished)

Adultos inmunocompetentes con IRA que concurrieron a Emergencias CEMIC (Abril-Septiembre 2016)

30/112 RV positivos = 27% 23/30 (77%) único agente por Panel Respiratorio- FilmArray, Biofire

Flu-A 20%, hCoV 11%, RSV 9%, hMPV 6%, PIV 4%, AdV 3%, FluB 2%

Diagnósticos clínicos :

◦ CVAS 7%

◦ Sme gripal 53%

◦ Laringotraqueítis 7%

◦ Bronquitis 27%

◦ Neumonía 3%

Cepas de RV aún no tipificadas

Los RV son los virus más frecuentes en niños y adultos con IRA

Gran diversidad genética y co-circulación de genotipos

En coinfección con RSV pueden asociarse a cuadros de mayor gravedad

Importancia de nuestro estudio: Incorporación del Diagnóstico de RV en la rutina del Hospital CEMIC desde 2012 para los pacientes internados

Epidemiología molecular de RV: ◦ Conocer las cepas circulantes en distintas

poblaciones de la Ciudad de Buenos Aires:

niños

recién nacidos con patologías de base

adultos

◦ Describir nuevos genotipos que aparecen en circulación

Este conocimiento puede contribuir a la formulación de futuras vacunas para RV

Unidad de Virología, Laboratorio de Virología y Departamento de Pediatría

Hospital Universitario CEMIC y Mater Dei

Proyecto IRAB - PICT 2006.650

A todos los médicos, bioquímicos, kinesiólogos, enfermeras y personal técnico, por reclutar pacientes, obtención de datos clínicos, de muestras respiratorias y su procesamiento.