22 al 25 agosto de 2017

72º Congreso Argentino de Bioquímica 2017

Asociación Bioquímica Argentina

La espectrometría de masas

en la identificación

bacteriana y su impacto clínico

Marisa Almuzara

Departamento de Bioquímica Clínica.

Laboratorio de Bacteriología.

Hospital de Clínicas.

Facultad de Farmacia y Bioquímica.

Universidad de Buenos Aires

Identificación bacteriana rápida y su impacto clínico

Streptococcus pneumoniae

Aislado de Hemocultivos en un paciente con

Diagnóstico clínico de NAC:

Agente etiológico de la Enfermedad Infecciosa.

Devela la naturaleza del agente etiológico

Streptococcus pyogenes

Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente con

celulitis de sus extremidades inferiores:

Bacteriemia con foco en piel y TCS

Staphylococcus epidermidis

Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente

pediátrico, con pielonefritis por E. coli:

Pseudobacteriemia por contaminación

Determina la importancia clínica

Con Enfermedad de Base:

Streptococcus agalactiae- Diabetes

Con Enfermedad Infecciosa:

Streptococcus pneumoniae

Neumonía-OMA-Meningitis

RELACIONA GENERO-ESPECIE CON ENFERMEDAD

Bacteriemia Primaria por Enterococcus

faecalis en paciente con neutropenia:

Traslocación colónica.

Bacteriemia secundaria por Escherichia coli:

Focos IU alta, infección intra- abdominal

PERMITE RECONOCER LA PUERTA DE ENTRADA

La identificación está estrechamente ligada a la

sensibilidad a los antibacterianos y define

muchas veces el tratamiento antimicrobiano

Sensibilidad constante a ciertos antibacterianos:

Streptococcus pyogenes- Streptococcus

agalactiae a penicilina

Resistencia de Enterobacter cloacae a

aminopenicilinas/+ inhibidores, cefalosporinas 1ra y

2da

Métodos para la identificación bacteriana

Convencionales

1-Pruebas bioquímicas

manuales

Esquema en tableros

Esquemas dicotómicos

(Algoritmos)

2- Identificación serológica

Comerciales

Manuales Automatizados

Fenotípicos

API Rapid ID

Vitek Phoenix

Microscan

Identificación fenotípica convencional

Características microscópicas: Coloraciones

Identificación fenotípica convencional

Características culturales

Tamaño de colonia

Hemólisis

Pigmento

Forma, Aspecto, Borde, Superficie

Identificación fenotípica convencional

Pruebas de identificación preliminar: (lectura inmediata): catalasa, oxidasa

Pruebas rápidas ( < 6h): hipurato, PYR, LAP, glicosidasas, ureasa,

indol, FAL, tributirina, tripsina, coagulasa

Pruebas lentas (24-h a 4-5 días): TSI (F/0), reducción de NO3, utilización de azúcares, Esculina, DNAsa, gelatinasa, CAMP, almidón, RM, VP, decarboxilasas, citrato, otras

Pruebas basadas en caracteres de resistencia: O129, Vancomicina, SPS, fosfomicina, desferrioxamina, colistina, bacitracina, optoquina

ID: 24 horas a 5-7 días

BNF

Algoritmos

GRUPO FLN-

GLUCOSA -

UREA + UREA-

NITRATO

+ ADH

- Cupriavidus pauculus

PYR +

+ Laribacter

-

Etilenglicol/ Etanol

+/+ Oligella

ureolytica

FALA+/GAS NO2+-/ DEF S

-/- Bordetella

bronchiseptica

FALA-+/GAS NO2 -/ DEF R

ACIDO DE XILOSA

+ Achromobacter xylosoxidans

(FRU -)

-

ACIDO DE FRUCTOSA

+ Pseudomonas pseudoalcaligenes

Xilosa -/+

- ESCULINA

-

TRIPSINA +

NITRATO

- MALTOSA/PYR

+ Cupriavidus

taiwanensis (CITRATO +)

+/-

Brevundimonas vesicularis

-/+

Inquilinus limosus

Fenotipo

Mucoso

-

PYR

+

DEF/COL

S/R Brevundimonas

diminuta

R/S

Pseudomonas alcaligenes FAL- PYR -

R/R

Inquilinus limosus

PYR +

Pigmento marrón

difusible. FAL+++

PYR

V(20%+)

+

CITRATO

-

COLISTINA

S NITRATO

R Pandoraea

DEF R

+

Comamonas SPP

-

CITRATO CITRATO

C. aquatica/ C kerstersii

-

Cupriavidus gilardi

DEF R

+ Advenella

incenata DEF V

+

NITRATO

N NITRATO

-

DEF DEF

R

Cupriavidus

respiraculii

S

Comamonas

terrigena

+

FENILACETATO/ ClNa

- Bordetella

hinzii

Figura 3, Grupo A: Llave para la identificación presuntiva de los bacilos gram-negativos no fermentadores FLN -, glucosa -

Pig.

rosa

Ox -

-

+

Chryseobacteriumanthropi

+

Indol

-

Roseomonas / Asaia

Urea

+

Roseomonas

-

Asaia

-

Pig. Marrón

difusible

Colonia

pequeña-

Kerstersia

-

B. holmesii+

B. parapertussis

+

Sphingomonas spp(Esc + ONPG +

Mani - Lac +)

EO-5 (Esc -

Pig. Amarillo)

Granullibacterbethesdensis

(Lactosa -)

Urea

+

Bordetella holmesii

B. parapertussis

Kerstersia

-

Mov -

Pig. amarillo

+

Nitrato

V

B. malleiMac Conkey +

Lactosa V

+

rápida

Brucella canisMac Conkey V

Lactosa -

Urea

+

+

C. anthropi

-

Acinetobacter spp

Indol

-

-NO-1

(Fastidioso)

Pig.

rosa

Ox -

-

+

Chryseobacteriumanthropi

+

Indol

-

Roseomonas / Asaia

Urea

+

Roseomonas

-

Asaia

-

Pig. Marrón

difusible

Colonia

pequeña-

Kerstersia

-

B. holmesii+

B. parapertussis

+

Sphingomonas spp(Esc + ONPG +

Mani - Lac +)

EO-5 (Esc -

Pig. Amarillo)

Granullibacterbethesdensis

(Lactosa -)

Urea

+

Bordetella holmesii

B. parapertussis

Kerstersia

-

Mov -

Pig. amarillo

+

Nitrato

V

B. malleiMac Conkey +

Lactosa V

+

rápida

Brucella canisMac Conkey V

Lactosa -

Urea

+

+

C. anthropi

-

Acinetobacter spp

Indol

-

-NO-1

(Fastidioso)

BNF

Acinetobacter spp.

ID Presuntiva: 24 horas

4 pruebas

• TSI Sin cambio

• Oxidasa +

• Inmóvil

• Glucosa +

• Indol +

• Gelatina +

• Almidon +

• Esculina +

• Manitol -

• ONPG +

• Colistina R

• Vancomicina Halo

• Pigmento Amarillo intenso

Chryseobacterium gleum indologenes

12 Pruebas

Tiempo de ID: 4-5 días

Cardiobacterium hominis ID presuntiva: 4-5 días ID : 4-5 dias

HACEK

Métodos fenotípicos de identificación

Comerciales

Automatizados

VITEK PHOENIX Microscan

Manuales

API Rapid ID Remel

ID: 24-48 HS; Rapid: 4 hs ID: 2 a 18 hs

Paneles de identificación

Identificación fenotípica por galerías comerciales

N 178 91 % ID correcta (n 162) 24.7 % requirió de pruebas adicionales ( n 44)

API Coryne Versión (2.0)

Lectura: 24 horas

48-72 hs si pruebas adicionales

Identificación fenotípica por galerias comerciales

N 188 93,10 % ID correcta (n 175) 32.45 % (n 61): requirió de pruebas adicionales (Vay y col, 2004. RAM)

Tiempo de ID: 48 Horas

Si pruebas adicionales: 3 -4 días

Identificación por sistemas comerciales automatizados

ID : menos de 10 hs Base de datos: aprox 456 taxas BGN, 114 CGP; 26 NH; 16 BGP; 47 Anaerobios N: 445 (87 % ID correcta)

64 pocillos de ID

Métodos Genotípicos para la identificación bacteriana

Biología Molecular

PCR convencional: Seq r RNA ribosomal 16 s, otros genes (rpo B, gyr B, rec A, secA) MLSA (Análisis multilocus de secuencias) Hibridizacion DNA-DNA

Otros métodos de identificación:

Proteómica

Perfiles de componentes bacterianos

Espectrométricos

Espectrometría de masa Perfil electroforético de Proteínas totales

(SDS-PAGE)

MALDI TOF

CID 2009

MALDI TOF en Argentina

MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight

(Vaporización/ionización por láser asistida por matriz a través de la detección de masas acorde al tiempo de vuelo)

5495.0

5417.9

4470.0

6264.1

10835.4

7274.5

7122.5

4736.2

9589.7

7828.2

8021.2

8847.6

8369.5

10259.6

10051.3

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4 x10

5000

6000 7000 8000 9000 10000 m/z

MALDI-TOF es una tecnología que ofrece un patrón de proteínas de un organismo desconocido y compara este patrón con una librería para finalmente presentar un score de esa comparación.

Bruker Daltonics Inc, USA (Base de datos propia) Shimadzu Corporation, Japón (Base de datos SARAMIS) Otra Base de datos: Andromas

MALDI-TOF Hospital de Clínicas José de San Martín. UBA

Preparación de la muestra

a. Extendido directo o extracción directa con fórmico

b. Extracción con etanol-ácido fórmico-acetonitrilo

10 min

H2Od Etanol

Etanol

FA,

Acetonitrile

Placa target

Analito

Matriz: HCCA(α-ciano-4-hidroxi ácido hidroxicinámico)

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

Corrida en MALDI Biotyper

Placa Target

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

Corrida en MALDI Biotyper

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

+ + +

+

Corrida en MALDI Biotyper

02/2009

Tubo: Drift region

Detector de iones

Corrida en MALDI Biotyper

Qué tipo de score aceptamos?

• Fabricante

• > 2 nivel de especie

• > 1,7 - < 2 nivel de género

• < 1,7 Identificación no confiable: No se acepta

Se puede modificar este score:

Mediante la validación de grupos

De Bel et al, propone criterio LAC > 1,8 (25% más de iD correcta) JMM, 2011

MALDI TOF

Semejante al método molecular

(Gold standard)

Impacto clínico de la identificación de patógenos

emergentes por MALDI TOF

Cultivo: 72 horas de incubación

Coloración de Gram del urocultivo Importancia de la identificación rápida en la jerarquización clínica

Paciente masculino. 22 años.

Síndrome nefrótico. HTA por

glomerulonefritis. Reagudización de

su IRC. Diálisis trisemanal. TTO

empírico. TMS

99 % identidad con Actinotignum (Actinobaculum) schaalii

Identificación molecular:

Secuenciación del 16S rRNA

Identificación por Espectrometría de masa:

MALDITOF

3 a 5 minutos

Algoritmo de identificación fenotípico

Llave 1

CAMP –

MRS /Vanco

Algoritmo de identificación

Esc -/urea- /NO3-

- Pyz /PYR / Hip /Trib

+ / V /-/nd

A. bernardiae

- / - /+/-

A. turicensis

v / v /+/+

Actinotignum schaalii

+++/ R

Lactobacillus (II III)

(+) / S

Lactobacillus (I)

Bifidobacterium Alloscardovia

- /S

No β

hemólisis

Gram

5 -6 días

15 pruebas

Actinobaculum schaalii: identificación

Vancomicina

MRS

Nitrato urea Esculina

Pyr Hipurato Tributirina

SPS

Identificación por MALDI-TOF. Impacto clínico

• Permitió modificar la conducta terapéutica:

• Se suspendió el tratamiento con TMS y el

paciente recibió penicilina 1.500.000 UI c/12h por 14 días

• Permite atribuir el verdadero significado clínico a estos microorganismos en casos de piuria crónica inexplicable

Total N=234

ID Correcta

Sin resultado

ID Incorrecta 204: 87%

22: 9% 8: 3%

Identificación por Maldi-tof de microorganismos a partir de subcultivo de 3-4 hs en de botellas de Hemocultivos positivos comparada con subcultivo de 24 hs de incubación.

BGN N=117

ID Correcta

Sin resultado

ID Incorrecta

108: 92,30%

4: 3,4% 5: 4,3%

GP N=117

ID Correcta

Sin resultado

ID Incorrecta

96: 83 %

18: 15 % 3: 2%

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter

• Tratamiento empirico: vanco + imipenem

• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos

• ID por Malditof a partir del frasco:

Frasco 1: Staphylococcus epidermidis

Frasco 2: Staphylococcus simulans

Retrocultivo: negativo

• Tiempo de informe: 30 minutos Hay modificación de la conducta terapéutica

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter

• Tratamiento empírico: vanco + imipenem

• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos

• ID por Malditof a partir del frasco:

Frasco 1: Staphylococcus epidermidis

Frasco 2: Staphylococcus epidemidis

Retrocultivo: Staphylococcus epidermidis

• Tiempo de informe: 30 minutos

Hay modificación de la conducta terapéutica

ESBL

AMPc

KPC

OXA

NDM

Impacto clínico de la identificación rápida

Descalar tratamientos ATB de amplio espectro

por tratamientos específicos

Adecuar la terapia empírica inicial

Reducir tiempos de internación

Evitar estudios adicionales

Descartar contaminaciones

Reduce Costos

Métodos de Identificación

Identificación convencional: 24 horas a 5-7 días.

Identificación por galerías comerciales: Lectura rápida: 4 horas Lectura habitual: 24 a 48 horas Identificación por sistemas automatizados:

2 a 18 Horas Maldi tof: 3 a 5 min!!! (96 muestras/hora)

Base de datos L imitada

Conclusiones MALDI TOF

Identificación rápida y precisa Base de datos para un amplio espectro de bacterias

Herramienta útil para identificar especies “raras” o

infrecuentes en infecciones humanas

La aplicación de MALDI TOF sobre muestra directa en particular los HC es una de las aplicaciones más prometedoras

MALDI TOF supera por la exactitud y rapidez a la

identificación fenotípica y molecular hasta ahora conocida

MUCHAS GRACIAS