94256056 Practica 3 Produccion de Tetraciclina

7/22/2019 94256056 Practica 3 Produccion de Tetraciclina

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Laboratorio de Biotecnologa de Cultivos Celulares

Prctica No. 3. Produccin de tetraciclina en cultivo lquido porSt r e p t o m y c e s a u r e o f a c ie n s en medio sinttico.

Elabor: IBT. Karen Gisela Moreno Guerrero

1. IntroduccinDesde tiempos remotos el hombre ha sacado provecho de los microorganismos,

utilizndolos en su beneficio para producir alimentos y bebidas principalmente. Sin embargo,desde el descubrimiento de la penicilina en 1929, tambin se han utilizado y cada vez enmayor medida para producir antibiticos.

Los antibiticos son sustancias producidas naturalmente por los microorganismospero que no son esenciales para su crecimiento. Su funcin en la naturaleza es la de brindaral microorganismo productor una ventaja competitiva sobre otra u otras poblacionesmicrobianas al contar con un arma que las elimine del medio por el que compiten. Su usoteraputico y medicinal en seres humanos, plantas y animales es destruir o detener el

crecimiento de microorganismos infecciosos que afecten al organismo vivo.Fue la imperiosa necesidad de antibiticos durante la Primera Guerra Mundial lo que

llev primero a la bsqueda de mtodos ms eficaces para la produccin de penicilina, elprimer antibitico usado masivamente y descubierto por Alexander Flemming en 1929.Posteriormente, la investigacin se encamin tambin a la bsqueda de nuevos antibiticos,siendo la mayora obtenidos de bacterias aisladas del suelo, principalmente de laspertenecientes al gnero streptomyces. As por ejemplo, tenemos a la actinomicina,descubierta por Waksman en 1940, la estreptomicina, estreptotricina, tetraciclina yclortetraciclina, por mencionar solo algunos de los ms conocidos.

Las tetraciclinas son un grupo de antibiticos de amplio espectro que se puedenobtener por sntesis qumica o bien por sntesis microbiana a partir de cultivos deStreptomyces aureofaciens, aunque se prefiere sta ltima sobre la sntesis qumica por subajo costo. Bsicamente, la estructura qumica de los tres derivados de tetraciclina es unsistema de anillos de naftaceno al que se aaden diferentes tomos constituyentes. As, laclortetraciclina tiene un tomo de cloro mientras que la oxitetraciclina un grupo oxhidrilo.

Evaluacin de la actividad de un antibitico.

El mtodo ms utilizado para evaluar la actividad de un antibitico o bien la sensibilidad deuno o ms microorganismos a ste es el antibiograma. Existen dos mtodos comunes pararealizar un antibiograma: por difusin en placa y por dilucin en caldo. El primer mtodo,tambin conocido como mtodo Kirby-Bauer, consiste en sembrar sobre una placa de agaral microorganismo de prueba y exponerlo a la accin del o los antibiticos a probar, que secolocan sobre el medio slido en discos de papel filtro o cilindros metlicos para localizar sudifusin. Al cabo de cierto periodo de incubacin (comnmente 24 horas) aparecer un halode inhibicin alrededor del disco del o los antibiticos que indica la resistencia delmicroorganismo. En el segundo, en tubos con caldo de cultivo se colocan distintas dilucionesdel antibitico de concentracin conocida. Los tubos se inoculan con el microorganismo deprueba y al trmino del periodo de incubacin se descartaran aquellos tubos en los que hayaturbiedad en el medio debida al crecimiento microbiano. El tubo que contenga ausencia demicroorganismos contendr la concentracin adecuada del antibitico.


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2. ObjetivosGeneral Utilizar un cultivo del actinomiceto Streptomyces aureofaciens para producir el antibitico

tetraciclina por fermentacin lquida en un medio sinttico.

Particulares

Evaluar la diferencia en la produccin de la tetraciclina al utilizar dos medios de cultivosintticos de diferente composicin.

Evaluar la actividad antimicrobiana y el rendimiento en la produccin del antibitico en elmedio de cultivo contra un estndar comercial de tetraciclina realizando unantibiograma.

3. Desarrollo experimental

1.1.

Ma t e r i a l e s Cepas microbiolgicasStreptomyces aureofaciensEscherichia coli

Staphylococcus aureus

Para la preparacin de la cepa de Streptomyces

Reactivos

GlucosaPeptonaKH2PO4MgSO4*7H2OAgar-agarAgua destilada

Materiales

1 caja Petri de 100x15 mm1 matraz Erlenmeyer 250 mL1 esptula de acero inoxidable

Charolas de polipropileno o aluminio parapesarEncendedor

Equipo

AutoclaveBalanza analticaCampana de flujo laminarIncubadora a T=30CLmparas de alcohol

1 probeta graduada de 100 mL1 vaso de precipitados de 100 mL

Para la preparacin del inculoReactivos

NaClSucrosaHarina de soyaCitrato de sodiocido actico(NH4)2SO4

MgSO4*7H2OKH2PO4K2HPO4CaCO3MnSO4*4H2OZnSO4*7H2OK2Cr2O7


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Agua destilada

Materiales3 tubos de ensaye roscados de 16x150mm1 matraz Erlenmeyer de 125 mL

3 Pipetas graduadas de 10 mL1 probeta graduada de 100 mL1 vaso de precipitados de 100 mL1 esptula de acero inoxidable

Algodn

Charolas de polipropileno o aluminio parapesarEncendedor1 clipPropipeta

EquipoAutoclaveBalanza analticaCampana de flujo laminarIncubadora con agitacin reciprocante orotatoria a T=30CLmparas de alcohol

Para la fermentacin lquida

Reactivos

Sucrosacido acticocido ctricoCitrato de sodio*5H2O(NH4)2SO4MgSO4*7H2OKH2PO4K2HPO4CaCO3MnSO4*4H2OZnSO4*7H2OK2Cr2O7

Agua destiladaMateriales

1 matraz Erlenmeyer de 125 mL

1 probeta graduada de 50 mL

1 pipeta de 5 mL1 propipeta1 esptula de acero inoxidableAlgodnCharolas de polipropileno o aluminio parapesarEncendedor1 clip

Equipo

AutoclaveBalanza analtica

Campana de flujo laminarIncubadora con agitacin rotatoria aT=30C y 200 rpmLmparas de alcohol

Para el antibiograma

Reactivos

Medio para antibiticos No.1 y 2 o AgarMueller-HintonCaldo Luria o Caldo nutritivo

Estndar de tetraciclina comercialAgua destilada

Materiales

Embudo Buchner de 4.5 cmMatraz Kitazato de 125 mLDesecadorPapel filtro Whatman No. 4 de 4.5 cm5 tubos Eppendorf

Puntas azules estriles1 hisopo6 crculos de papel filtro de 4.5 cm o 6penicilindros

1 tapa de caja PetriPinzas de diseccinEncendedorPlumn indelebleVernier o regla milimtrica

Equipo

Balanza analticaBomba de vaco


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Campana de flujo laminarEstufa de secadoMicropipeta de volumen variable de 100-1000 L

IncubadoraLmparas de alcohol

1.2. Mt o d o s1.1.1. Preparacin de la cepa para iniciar el cultivo

Preparar las cajas Petri de 15 x 100 mm conteniendo cada una por lo menos 30 mL de AgarWaksman, de acuerdo con la siguiente formulacin:

Componente g/LGlucosa 10.0Peptona 5.0KH2PO4 1.0

MgSO4*7H2O 0.5Agar agar 20

Inocular las cajas Petri con suspensin de esporas o micelio de Streptomyces aureofaciens.Incubar a 30C por un periodo de 10 das para favorecer la esporulacin.

1.1.2. Preparacin del inculo para la fermentacinPreparar el medio para el inculo de acuerdo con la siguiente formulacin:

Componente Cantidad/LSucrosa 30.0 gHarina de soya 5.0 gCitrato de sodio (Na3C6H5O7*5H2O) 1.0 g(NH4)2SO4 3.3 gMgSO4*7H2O 0.25 gKH2PO4 0.10 gK2HPO4 0.10 gCaCO3 1.00 gMnSO4*4H2O 0.01 gZnSO4*7H2O 0.04 gK2Cr2O7 0.016 mgcido actico (CH3COOH) 0.40 mL

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121C por 15minutos. Inocular con suspensin de esporas o suspensin miceliar (hechas con solucinsalina) de Streptomyces aureofaciens obtenidos de la cepa inoculada en el agar Waksman.Incubar a 30C de 48 a 72 hr con agitacin reciprocante con 3 in a 97 ciclos/min oagitacin rotatoria a 200 rpm.

1.1.3. Fermentacin lquidaPreparar el medio A o B, segn la siguiente formulacin:


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Medio A Medio BComponente Cantidad/L Cantidad/LSucrosa 30 g 40 gcido ctrico(H3C6H5O7*H2O

-------- 12.8 g

Citrato de sodio

(Na3C6H5O7*5H2O)2.5 g --------

(NH4)2SO4 3.3 g 6.0 gMgSO4*7H2O 0.25 g 0.25 gKH2PO4 0.10 g 0.15 gK2HPO4 0.10 g --------CaCO3 1.0 g 11.0 gcido actico (CH3COOH) 0.40 g --------MnSO4*4H2O 0.01g 0.01 gZnSO4*7H2O 0.04 g 0.04 gK2Cr2O7 0.016 mg 0.016 mg

Colocar 50 mL de medio en un matraz Erlenmeyer de 125 mL y esterilizar a 121C por 15

minutos. Inocular el medio para fermentacin con 2.5 mL del inculo. Incubar a 30Cdurante 4 a 6 das con agitacin rotatoria a 200 rpm.

1.1.4. Antibiograma para la evaluacin de la actividad antimicrobiana yconcentracin de la tetraciclina en los medios de cultivo A y B.

a) Preparacin de las placas para el antibiograma.Preparar 1 caja Petri con 20 mL de medio para antibiticos 1 y 2 o agar Mueller-Hinton.Paralelamente, preparar un cultivo de 24 horas de Escherichia coli en caldo Luria oStaphylococcus aureus en caldo nutritivo. Empapar un hisopo estril en la suspensin delcultivo cuidando de retirar el exceso presionando y rodando el hisopo sobre las paredes deltubo antes de retirarlo. Extender de forma homognea (ver el esquema) en tres direccionessobre toda la superficie de la placa de agar, cuidando de no dejar sitios sin cubrir. Incubaren posicin invertida a 37C durante 24 horas una vez que han sido colocados los discos conel antibitico.

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Figura 1. Esquema para la siembra del inculo en las placas para antibiograma.

b) Determinacin de la biomasa (en peso seco) y clarificacin del medio de cultivoRetirar el matraz de fermentacin de la incubadora y filtrar el medio al vaco a travs de undisco de papel filtro Whatman No. 4 (previamente tarado a peso constante) para retener la


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biomasa. NO DESECHAR EL MEDIO FILTRADO. Posteriormente, colocar el papel filtro en unhorno de secado a 60C durante 1 hora. Dejar enfriar en un desecador y determinar labiomasa producida en peso seco.

c) Antibiograma para determinar la actividad y concentracin de la tetraciclinaPreparar una solucin madre de 1000 g/mL a partir de un estndar comercial de

tetraciclina. De la solucin madre preparar las siguientes diluciones: 125 g/mL, 250 g/mL,500 g/mL y 750 g/mL.

Colocar sobre las placas de agar Mueller-Hinton o medio para antibiticos 1 y 2 previamenteinoculadas con el microorganismo de prueba cinco crculos de papel filtro como lo muestrael esquema, previamente embebidos en 200 L de cada una de las diluciones del estndarde tetraciclina, incluida la dilucin madre. En el centro de la caja Petri colocar un sextocrculo de papel filtro embebido en 200 L del medio de cultivo filtrado. Marcar sobre la tapade la caja las concentraciones correspondientes de tetraciclina. Incubar las cajas en posicininvertida a 37C durante 24 horas.

125g/mL

1000g/mL

750g/mL

500g/mL

250g/mL

Mediode

cultivo

Figura 2. Esquema para la colocacin de los crculos de papel filtro en la caja Petri.

Al trmino de la incubacin, medir el dimetro de los halos de inhibicin en los estndaresde tetraciclina y el medio de cultivo.

Para calcular la concentracin del antibitico en el medio de cultivo, graficar el logaritmo dela concentracin de las diluciones de tetraciclina contra el dimetro del halo de inhibicin.Interpolar en el grfico el dimetro del halo en el papel embebido con el medio de cultivopara conocer la concentracin de antibitico en el mismo. La ausencia de halo de inhibicinen el sexto crculo indicar que no hubo produccin de antibitico.

4. ResultadosReportar los periodos reales y temperaturas de incubacin durante la fermentacin y en elensayo del antibiograma.

Reportar la biomasa producida en el medio de cultivo de fermentacin en peso seco.

Esquematizar o fotografiar los resultados de los antibiogramas para cada antibiticoobtenido con los medios A y B.


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Trazar la grfica de del halo de inhibicin vs. Log [antibitico] y reportar la concentracinpara el antibitico en los medios A y B.

Reportar el dimetro del halo de inhibicin para los antibiticos obtenidos en los medios A yB.

5. Anlisis de resultadosHacer un comparativo de las diferencias obtenidas en cantidad de biomasa, actividad yproduccin de antibitico entre los medios A y B, sustentando de manera concisa ycomprobable las respuestas con la bibliografa consultada.

Explicar si las diferencias obtenidas se deben a solo unos constituyentes del medio de cultivoen particular o toda la formulacin en conjunto. Explicar tambin el efecto de loscomponentes del medio de cultivo sobre la produccin del antibitico.

Explicar tambin si el antibitico obtenido es tetraciclina, oxitetraciclina o clortetraciclina ypor qu.

6. ConclusionesConcluya de manera clara y concisa sobre el cumplimiento de los objetivos. Incluya tambinperspectivas o puntos de vista.

7. Cuestionario1. Describe las caractersticas del genero streptomyces.2. Qu otro microorganismo es utilizado para producir tetraciclina adems del

Streptomyces aureofaciens?

3. Esquematiza la molcula base de la tetraciclina con los diferentes tomosconstituyentes para obtener los derivados oxitetraciclina y clortetraciclina.

4. Cul es el mecanismo de accin de la tetraciclina?5. A que se refiere el trmino espectro de un antibitico?6. Qu otros gneros microbianos son productores de sustancias antibiticas?7. Cul es la diferencia entre un agente bacteriosttico, bacterioltico y bactericida?8. Cules son los metabolitos primarios y secundarios? A cul de ellos pertenece la

tetraciclina?9. Qu son un medio sinttico y uno no sinttico?10.Describe al menos un mtodo empleado para la purificacin de antibiticos.11.Por qu otro mtodo, aparte de la fermentacin lquida, es posible producir

antibiticos? Descrbelo.


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12.Explica al menos un mtodo para la obtencin y seleccin de cepas mutantessobreproductoras de antibiticos.

13.Menciona al menos tres microorganismos comnmente empleados en losantibiogramas. Menciona tambin las caractersticas del Agar Mueller-Hinton, que lohacen un medio ideal para las pruebas de sensibilidad a antibiticos.

14.Cules son las otras aplicaciones de los antibiogramas, adems de utilizarse paracuantificar un antibitico?

15.Describe el procedimiento que comnmente se utiliza para aislar nuevas cepasproductoras de antibiticos.

8. Referencias bibliogrficas Brock D.T., Madigan T.M. Microbiologa. 6a ed. Prentice Hall. Mxico 1993 Darken, Berenson, Shirk, Sjolander. Production of tetracycline by Streptomyces

aureofaciens in synthetic media. Applied Microbiology. 1960 January; 8(1): 4651

Scragg, A. Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas Biolgicos en ProcesosTecnolgicos. Ed. Limusa. Mxico 1992

ENCB-IPN. Microbiologa Prctica. 2 ed. Mxico 1998 ENCB-IPN. Manual de Prcticas de Bacteriologa Mdica. Mxico 2003

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