Encuentro de Seguridad Alimentaria y Nutrición

5º aniversario de la creación de la AESAN

Evaluación de la seguridad y eficacia de cepas probióticas con destino a la alimentación humana.

Probióticos aislados de la leche materna

Julio Boza

Santander

11 Septiembre 2007

Microbiota Intestinal

Hombre

Nº Células 1013

Microbiota

1014

Especies 1 >400

Peso 70 Kg 2 Kg

Cerebro 1.3 Kg

Corazón 0.6 Kg

10% Hombre/90% Bacteria

Microbiota Intestinal: Localización

Localización anatómica nºbacterias/g tejido Principales microorganismos

PIEL *

Frente 2x105

Staphilococcus epidermidis,

Staphilococcus epidermidis,

Axila 2,4x106

Corynebacterum,

Acinetobacter calcoaceticus

Espalda 3,1x102

S.epidermidis, Corynebacterium,

Malassezia furfur

Antebrazo 1x102

Dedos del pie Brevibacterium epidermidis

Folículos capilares Demodex folliculorum

Ingles Acinetobacter calcoaceticus

T. REPIRATORIO

Pulmones y bronquios 0 Esteriles

Fosas nasales 107-10

8S.epidermidis, S. Aureus,

Corynebacterium,Propionibacterium

Nasofaringe 106-10

7Moraxella catarrhalis,

Haemophilus influenzae,Neisseria

Streptococcus spp,

Orofaringe 106-10

7Mycoplasma salivarum,M.orale

Haemophylus parainfluenzae

T. GASTROINTESTINAL

Cavidad oral

Saliva 7x108

Streptococcus salivarius, S,sanguis,

S.mutans,S.mitior,Lactobacillus

Dientes Streptococcus,Lactobacillus

Corinebacterium,Propionibacterium

Streptococcus,filamentosas G+,

Encias Treponema,Haemophilus,Neisseria,

Eikenella

Esofago ? No evidencias de una flora común en

humanos

Estomago y los 2 primeros 1x104

Lactobacillus, Streptococcus,

tercios del I.delagado (Helicobacter pylori)

Lactobacillus,Enterococcus

Ileon 1x108

Enterobacterias(E.coli),Bacteroides,

Veillonella,Clostridium

E.coli,Bacteroides,Bifidobacterium,

Colon 1010

-1012

Peptostreptococcus,Clostridium

Bacillus,Eubacterium,Fusobacterium

Enterococcus

T. UROGENITAL

Uretra distal 1x105

E.coli,Lactobacillus,Staphilococci

Mucosa genital Mycobacterium smegmatis

Vagina entre pubertad y 1x108

Lactobacillus

menopausia Corynebacterium,Gardnerella vaginalis

Peptococcus,E.coli

Vagina antes de pubertad 1x108

Streptococcus,Staphilococcus

y tras menopausia

LECHE MATERNA 1x103-1x10

5Staphylococcus,Streptococcus,

Lactobacillus,Enterococcus

Microbiota Intestinal: Funciones

Hombre

Nº Células 1013Microbiota

1014Especies 1 >400

Peso 70 Kg 2 KgCerebro 1.3 KgCorazón 0.6 Kg

10% Hombre/90% Bacteria

Tienen alguna función?

Microbiota Intestinal: Funciones

Ilja Metchnikoff

““ Desde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidadeDesde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidades s de bacterias de de bacterias de áácido lcido lááctico en forma de productos alimenticios ctico en forma de productos alimenticios --

como leche agria, kefir o col fermentada como leche agria, kefir o col fermentada -- sometidos a un proceso de sometidos a un proceso de fermentacifermentacióón antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin n antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin

saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de putrefacciputrefaccióón en el organismo n en el organismo ““. . (L(L’’immunitimmunitéé dans les maladies dans les maladies

infectiouses)infectiouses)

1902- Los caucasianos vivían más tiempo

Consumo de leches fermentadas

Microbiota Intestinal: Funciones

Ilja Metchnikoff

““ Desde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidadeDesde tiempos inmemoriales, los hombres han asimilado cantidades s de bacterias de de bacterias de áácido lcido lááctico en forma de productos alimenticios ctico en forma de productos alimenticios --

como leche agria, kefir o col fermentada como leche agria, kefir o col fermentada -- sometidos a un proceso de sometidos a un proceso de fermentacifermentacióón antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin n antes de ser consumidos en estado crudo. Con ello, sin

saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de saberlo,han mitigado las nocivas consecuencias del proceso de putrefacciputrefaccióón en el organismo n en el organismo ““. . (L(L’’immunitimmunitéé dans les maladies dans les maladies

infectiouses)infectiouses)

1902- Los caucasianos vivían más tiempo

Consumo de leches fermentadas

Microbiota Intestinal: Funciones

Ilja Metchnikoff

FUNCION DE LA MICROBIOTA

Fisiología de las bacterias comensales

• Función nutritiva

• Función trófica

• Prevención de infecciones

• Inmunomodulación

Protección frente a Infecciones

Enterocito Muco

Fisiología de las bacterias comensales

• Competencia de unión

• Interacciones metabólicas

• Competencia por nutrientes

• Producción de sustancias antimicrobianas

FUNCIÓN INMUNOMODULADORA

Interacción con el Epitelio Intestinal (regulación génica)

Producción metabolitos inmunomoduladores

Inmunoactividad de los componentes bacterianos

El Sistema Inmunitario Intestinal

GALT/NALT:

80% de los linfocitos50% del total de Inmunoglobulinas90% del total de Ig A95-99% de Antígenos extraños

* 10% Hombre/90% bacteria

* 1014 células procariotas

* > 400 especies distintas

* 70.000 genes procariotas

Tiene algún efecto beneficiosopara la salud humana?

Se puede modular?

Flora Intestinal

Probióticos

Probióticos

• Metchnikoff 1902 �consumo leches fermentadas)

• Moro 1900; Beijerinck 1901; Cahn 1901; Cohendy 1906; Tissier 1906) � Infecciones intestinales

• Isaac Carasso (1919)

• Fabricación comercial yogur

• Farmacia y con receta médica

• Prevención y alivio trastornos muy diversos (diarrea, estreñimiento, dispepsia, colitis, colitis ulcerosa, cistitis, dermatitis, etc)

•Vergio (1957) “ probiotika ”

Probiótico

“Live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”

Probiótico:

Probiótico

- Viable (producto)- Conocido- Cantidad suficiente (caducidad)- Colonización del intestino (digestión)- Efectos beneficiosos

“Live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”

Efectos beneficiosos

Ampliamente demostrados Diarrea por antibióticos (Clostridium difficile) Diarrea por rotavirus

Diarrea por quimioterapia Diarrea del viajero Estimulación del Sistema Inmunitario Reducción metabolitos tóxicos en colon

Con evidencias Infecciones por Helicobacter pylori u otras

Reducción síntomas alérgicos Prevención de cáncer Absorción de minerales (Ca ) Producción de enzimas (ß-galactosidasa)

Probióticos

Mercado

Según el informe de Frost and Sullivan (2003) el valor del mercado de prebióticos en EEUU está cifrado para el 2003 en 143.9 millones de $, mientras que en Europa sería de 40.3 millones de $ con una proyección muy alta alcanzando valores de más de 400 millones de $ en EEUU para el 2010.

Mercado

Selección de bacterias probióticas

Criterios fundamentales:

• Correcta identificación al nivel de cepa

• Capacidad para llegar viable y en nºsuficiente a su lugar de acción

• Seguridad

• Efectividad real mediante ensayos clínicos

Selección de bacterias probióticas

I+D, regulación, producción y comercialización

Elementos clave

• Seguridad

• Eficacia

• Estabilidad

Seguridad (antecedentes)

• Normativa aplicable al empleo de cultivos microbianos varía, en el caso de que exista, dependiendo de los países.

• EFSA ha indicado la necesidad de legislar la utilización de microorganismos en alimentos destinados al consumo humano.

• En general, se han clasificado como suplementos dietéticos y en la fabricante no debe notificar la introducción de nuevas cepas a la autoridad relevante, con la excepción de Dinamarca.

• Estatuto danés (BEK nr. 282 af 19/4/2000) dossier ha de incluir estudios microbiológicos y toxicológicos, no especificando cuales.

• AFSSA (2002) propone un esquema de evaluación de seguridad para microorganismos a emplear en el sector agroalimentario. Indica estudios toxicológicos específicos, si fuesen necesarios.

Seguridad (antecedentes)

• Regulación Europea de Nuevos Alimentos (258/97 UE) incluye “alimentos o ingredientes alimentarios que contenga, consistan o se aíslen de microorganismos modificados genéticamente y también todos los que contengan, consistan o se aíslen de microorganismos.

•Aditivos y adyuvantes no entran en el ámbito de dicha regulación

• Uso de microorganismos como aditivos y adyuvantes es ambiguo.

• Interpretación literal (258/97 UE) “cualquier cepa no comercializada antes de 1997 debería ser o haber sido sometida a un procedimiento (duro y costoso) para evaluar su seguridad”

QPS: Presunción de seguridad cualificada

2002

Ventajas:

• Marco legal unificado UE

• Evitarían o reducirían pruebas innecesarias y/o repetitivas para microorganismos con larga tradición de uso favoreciendo el desarrollo de nuevos productos

• Evaluación seguridad limitada a aspectos relevantes dependiendo del organismo en cuestión

QPS: Presunción de seguridad cualificada

2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos

2003: EFSA responsable evaluación seguridad alimentos

Seguridad

Seguridad

Seguridad

Seguridad

Seguridad

Seguridad

Seguridad

Seguridad

QPS

QPS

Seguridad

Evaluación1.- Género, especie, cepa

• Técnicas tradicionales:

• medios selectivos

• patrones de fermentación específicos

• Técnicas moleculares: tests fenotípicos y genéticos

• fracción 16s RNA

• presente en todas las células

• se detecta con facilidad

• posee numerosas regiones variables

• existencia ���� secuencias (> 100.000 en bases de datos (http://rdp.cme. msu.edu/html)

EvaluaciónTipaje de cepas

Amplificación al azar de DNA polimórfico (RAPD)

- Perfiles eelectroforéticos que varían según el polimorfismo (huella dactilar característica)

- Cómoda, rápida, poca cantidad DNA, no presupone concimientos previos secuencia, se pudendistinguir fácil, rápida y simultaneamente muchos organismos

- Muy sensible a condiciones amplificación

EvaluaciónTipaje de cepas

Electroforesis en campo de pulso (PFGE)

2. Tests in vitro potencial probiótico

• Resistencia acidez gátrica

• Resistencia sales biliares

• Adherencia al mucus y/o células epiteliales

• Actividad antimicrobiana frente a patógenos

• Capacidad de reducir adhesión patógenos a cel. epiteliales

• Actividad hidrolítica frente a sales biliares

• Perfil inmunológico

Evaluación

Seguridad

• Determinar las propiedades intrinsecas de bacterias y cepas (factores de adhesión, degradación de mucinas, resistencia a antibióticos, transferencia de plásmidos, actividades enzimáticas no deseables, activ hemolítica, producción aminas biógenas, producción de D-láctico, etc).

• Determinar los efectos de los metabolitos producidos por las bacterias.

• Estudiar la capacidad infectiva de células humanas (in vitro) y de animales inmunocomprometidos.

•Determinar la toxicidad aguda tras la ingestión de grandes cantidades de bacteria.

•Determinar sus efectos beneficiosos (dosis-respuesta) en modelos animales sanos y de enfermedad inducida.

• Estudiar la aparición de efectos secundarios en ensayos de intervención en voluntarios o pacientes.

Seguridad

Especie DL50 (g/kg peso)Streptococcus faecium AD1050 >6.6

Streptococcus equinus >6.4

Lactobacillus fermentum AD002 >6.6

Lactobacillus salivarius AD0001 >6.5

Lactobacillus GG (ATCC 53103) >6.0

Lactobacillus helveticus >6.0

Lactobacillus bulgaricus >6.0

Bifidobacterium longum 25

Donohue et al. 1998

• Fase 1: Seguridad

• Fase 2: Eficacia-doble ciego (efectos adversos, síntomatología, signos, well-being, reducción de riesgo de enfermedades, recuperación de enfermedades, etc)

• Fase 3: Efectividad en comparación con terapia estándar

• Fase 4: Vigilancia

- Repetir estudios en centros independientes.

- Publicación resultados en revistas científicas

Eficacia (Ensayos humanos)

Health claims

• Género, especie y cepa

• Número mínimo de viables de cada cepa a final de la vidad del producto

• Porción alimento que contenga la dosis efectiva del probiótico para que produzca el efecto beneficioso

• Alegación salud específica

• Condiciones almacenamiento

• Detalles de la compañía para información al consumidor

Alegaciones de salud y etiquetado