Actividad Fungicida de La Afinina y Del Extracto Crudo de Raices de Heliopsis Longipes

7/29/2019 Actividad Fungicida de La Afinina y Del Extracto Crudo de Raices de Heliopsis Longipes

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ACTIVIDAD FUNGICIDA DE LA AFININA Y DEL EXTRACTO CRUDO DE RACESDEHeliopsis longipes EN DOS ESPECIES DE Sclerotium

FUNGICIDAL ACTIVITY OF AFINNIN ANDHeliopsis longipesCRUDE ROOT EXTRACT ON TWO Sclerotium SPECIES

Enrique Ramrez-Chvez1, Luis Lucas-Valdez1, Gil Virgen-Calleros2 y Jorge Molina-Torres1

1Departamento de Biotecnologa y Bioqumica. CINVESTAV-IPN, Unidad Irapuato. Apartado Postal629. 36500, Irapuato, Gto. ([email protected]). 2Departamento de Produccin Agr-cola del CUCBA. Universidad de Guadalajara. Las Agujas, Zapopan, Jal. Mxico.

RESUMEN

La exploracin de los recursos florsticos permite encontrar com-

puestos bioactivos que se pueden utilizar como alternativa en el

control de fitopatgenos. La tintura obtenida de las races de He-

liopsis longipes (Gray) Blake se ha utilizado en medicina tradi-

cional en la Sierra Gorda, en el rea central de Mxico, para

aliviar afecciones de la piel causadas por hongos. En este trabajose estudi la actividad fungicida de la afinina purificada, la

alcamida mayoritaria en races de Heliopsis longipes, y del ex-

tracto crudo de la raz de la misma planta, sobre los fitopatge-

nos Sclerotium cepivorum y S. rolfsii. Se observ una actividad

inhibitoria del crecimiento del micelio producido, en funcin del

peso seco, en cada tipo de fraccin adicionada al medio caldo

papa dextrosa (PDB). En los mismos ensayos se evalu el efecto

sobre el contenido de cidos grasos y ergosterol presentes en el

micelio, para elucidar el posible mecanismo de inhibicin del

fungicida natural. Los resultados mostraron que con una con-

centracin de 25 g/mL, la mayor concentracin evaluada de

afinina purificada, o del extracto crudo, el desarrollo micelial de

las dos especies de Sclerotium se inhibi completamente. El efec-

to de la afinina o el extracto crudo sobre los cidos grasos mayo-

ritarios en el micelio de ambos hongos indicaron que conforme

se increment las concentraciones del inhibidor el contenido de

estos cidos disminuy hasta valores no detectables en la mayor

concentracin evaluada. Un efecto similar se present para el

contenido de ergosterol en las dos especies de Sclerotium, el cual

disminuy cuando aument tanto el extracto crudo como la

afinina purificada. Se estim una dosis letal media similar para

la afinina purificada y para sta contenida en el extracto crudo:

en el caso de S. rolfsii entre 15 y 20 g/mL y para S. cepivorum

entre 5 y 10 g/mL. Sin embargo, el efecto general del extracto

crudo y de la afinina purificada fue similar en ambos hongos.

Palabras clave:Heliopsis longipes, Sclerotium cepivorum, Sclerotium

rolfsii, control biolgico, extractos vegetales.

Recibido: Febrero, 1998. Aprobado: Agosto, 1999.Publicado como ARTCULO en Agrociencia 34: 207-215. 2000.

ABSTRACT

The exploration of floristic resources permits discovery of bioactive

compounds that may be used as alternatives for the control of phy-

topathogens. At the Sierra Gorda, in Central Mxico, the tincture

obtained from theHeliopsis longipes (Gray) Blake roots, has been

used in traditional medicine to alleviate skin diseases caused by

fungi. This research involves the study of the fungicidal activity ofpurified affinin, which is the major alkamide in the root of the

Heliopsis longipes and of the crude root extract from the same

plant, on the phytopathogens Sclerotium cepivorum and S. rolfsii.

Growth inhibitory activity was observed when either fraction,

crude extract or affinin, was added to the potato dextrose broth

(PDB) medium. This activity was estimated by the dry weight of

the mycelium produced. In the same assay, the effect on the fatty

acids and ergosterol content in the mycelium was evaluated to ex-

plain the possible inhibitory mechanism of this natural fungicide.

The results showed that in a concentration of 25 g/mL, the great-

est concentration tried with purified affinin or crude extract, the

development of mycelium was completely inhibited in both Scle-

rotium species. The effect of the affinin or the crude extract on the

main fatty acids of the mycelium of both fungi indicated that, as

the concentration of the inhibitor is increased, the content of fatty

acids decrease to undetectable levels. A similar effect was observed

in the ergosterol content in both Sclerotium species; it is: the sterol

diminished when either the crude extract or the purified affinin

was introduced and the concentration increased. It was estimated

that a medium lethal dose is similar for purified affinin and for the

crude extract; the medium lethal dose for S. rolfsii was in the range

of 15 to 20g/mL and that for the S. cepivorum was in the range of

5 to 10 g/mL. However, the general effect of the crude extract

and the purified affinin was similar in both fungi.

Key words: Heliopsis longipes, Sclerotium cepivorum, Sclerotium

rolfsii, biological control, plant extracts.

INTRODUCTION

Synthetic fungicides are largely used to controlphytopathogenic fungi; however, non-discrimina-tory use of these products has caused various prob-lems such as toxicity to people using them, as well as


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AGROCIENCIA VOLUMEN 34, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2000208

INTRODUCCIN

Los fungicidas sintticos son ampliamente utiliza-dos para el control de hongos fitopatgenos; sinembargo, el uso indiscriminado de estos produc-tos ha originado diversos problemas, como toxicidad a

los usuarios y daos al medio, por lo que se deben extre-mar las precauciones al utilizarlos (Wilson y Wisniewski,1989). Estos productos pueden actuar en forma preven-tiva o en algunos casos teraputicamente. A pesar de estolos fungicidas sintticos son de uso cotidiano y en Mxi-co su consumo fue cercano a 20 000 toneladas en 1992(AMIPFAC, 1993).

Ante esta situacin, una alternativa prometedora es eluso de los productos naturales derivados de las plantaspara el control de hongos fitopatgenos (Montes y Fi-gueroa, 1995). En el caso de microorganismos fitopat-genos existe informacin de cerca de 400 especies deplantas con propiedad fungicida y se estima que esta pro-

piedad es una caracterstica que se presenta frecuente-mente en algunos metabolitos secundarios (Grainge yAhmed, 1988). Por ejemplo, en plantas con actividadantifngica, se ha sugerido que algunos compuestos, de-nominados bioactivos, presentes en los extractos o acei-tes esenciales, son los responsables de dicha actividad(Shukla y Tripathi, 1987). Mller-Riebau et al. (1995)encontraron que los compuestos timol y carvacrol fue-ron los principios activos mayoritarios encontrados enSatureja thymbra y Thymbra spicata, respectivamente.Estos productos naturales mostraron buena actividadantifngica al compararlos con algunos fungicidas co-merciales, y en una concentracin de 100 g/mL hubo

una inhibicin completa del micelio de los fitopatge-nos:Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, Sclero-tinia sclerotiorum y Phytophthora capsici.

Saxena y Mathela (1995) detectaron la actividadantifngica de dos compuestos: acetato de iridodial--monoenol y actidina, aislados deNepeta leucophyla yN.clarkey, colectados en la regin del Himalaya. Estos com-puestos mostraron actividad contra fitopatgenos talescomo Sclerotium rolfsii y Macrophomina phaseolina endosis de 160g/mL y 240g/mL, respectivamente.

La mayora de las plantas que se han explorado enestudios de actividad biocida tienen antecedentes de apli-caciones en la medicina tradicional, algunos comotonificantes, vermfugos, saborizantes, edulcorantes, con-dimentos, etc. El chilcuague [Heliopsis longipes(Gray)Blake], comnmente conocido en la regin de la SierraGorda al norte de Guanajuato, presenta una actividadimportante como insecticida (Fisher, 1957) y sus raceshan sido utilizadas como vermfugo, anestsico local,as como condimento de alimentos y saborizante de be-bidas (Martnez, 1994). Esta planta acumula afinina enlas races y en las semillas. Este compuesto (Figura 1),

damage to the environment. For this reason, cautionshould be taken when handling them (Wilson andWisniewski, 1989). These products can act as preventa-tives or for therapeutic purposes. Notwithstanding theabove, synthetic fungicides are used daily. In Mxicofungicide consumption was almost 20 000 tons in 1992

(AMIPFAC, 1993).As a result of this situation, a promising alternative isthe use of natural products derived from plants to controlphytopathogenic fungi (Montes and Figueroa, 1995). Inthe case of phytopathogenic microorganisms, there is in-formation about 400 plant species with fungicidal prop-erties, and it is estimated that this characteristic is fre-quent in some secondary metabolites (Grainge and Ahmet,1988). For example, in plants with antifungal activity ithas been suggested that some compounds, called bioac-tive, found in extracts of essential oils, are responsiblefor such activity (Shukla and Tripathi, 1987). Mller-Riebau et al. (1995) found that thymol and carvacrol were

the main active ingredients found in Satureja thymbraand Thymbra spicata, respectively. These natural prod-ucts showed effective antifungal activity when comparedwith some commercial fungicides. In a concentration of100g/mL there was a complete mycelium growth inhi-bition of the phytopathogens:Rhyzoctoniasolani, Fusa-riummoniliforme, Sclerotiniasclerotiorum and Phytoph-thoracapsici.

Saxena and Mathela (1995) detected antifungal ac-tivity of two compounds: iridodial--monoenol acetateand actidine, isolated from Nepeta leucophyla and N.clarkey, collected in the Himalaya region. These com-pounds showed activity against phytopathogens such as

Sclerotium rolfsii and Macrophomina phaseolina in160g/mL and 240g/mL doses respectively.

Most of the plants explored in studies of biocide ac-tivity have antecedents in traditional medicine, some astonics, vermifuge, flavors, sweeteners, condiments, etc.Chilcuague [Heliopsis longipes (Gray) Blake], com-monly known in the Sierra Gorda north of Guanajuato,presents an important insecticide property (Fisher, 1957).Its roots have been used as vermifuge, local anesthetic,as well as food condiment and flavoring for drinks(Martnez, 1994). This plant accumulates affinin in itsroots and seeds. This compound is formed by a fatty acidchain containing 10 carbons with three unsaturatedbounds, linked to an isobutylamide (Figure 1). There is areport on the effect of affinin activity on the domestic fly(Crombie and Krasinki, 1962), on a lepidopterous popu-lation: Diaphania hyalinata, and on a dipter: Aedesaegipty (Jacobson, 1971).

The extract obtained from other plants related to theHeliopsis longipes has also presented favorable resultsin the treatment of certain mycosis (athletes foot) andviruses in the case ofHerpessimplex andHerpeszoster


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RAMREZ-CHVEZET AL.: ACTIVIDAD FUNGICIDA DEHeliopsis longipes 209

Figura 1. Frmula estructural de la afinina N-isobutil 2E,6Z,8Edecatrien amida, principal componente bioactivo pre-sente en el extracto lipdico crudo de las races del chil-cuague (Heliopsis longipes).

Figure 1. Structural formula ofN-isobutil 2E, 6Z, 8E decatrienamid affinin, principal bioactive component, present inthe lipidic crude extract of the roots ofHeliopsis longipes.

formado por un cido graso de una cadena aliftica de10 carbonos con tres insaturaciones unido a una isobuti-lamina, pertenece al grupo de compuestos denominadoalcamidas olefnicas. Existen informes de la actividad

de la afinina con poblaciones de la mosca domstica(Crombie y Krasinki, 1962) y con poblaciones de un le-pidptero: Diaphania hyalinata y un dptero: Aedesaegipty (Jacobson, 1971).

El extracto obtenido a partir de otras plantas parien-tes deHeliopsis longipes tambin ha presentado resulta-dos favorables en el tratamiento de algunas micosis (piede atleta) y de virus en el caso deHerpes simplex y Her-pes zoster(Ospina et al., 1986). Sin embargo, se descono-ce la actividad de la afinina sobre hongos fitopatgenos.

Una de las ventajas de obtener sustancias tales comola afinina, producidas por biosntesis de plantas, es queno tienen efectos secundarios en el ecosistema, dado que

pueden ser metabolizados por uno u otro organismo, adiferencia de los fungicidas qumicos comnmente apli-cados hasta ahora.

En el presente trabajo se evalu la actividad fungicidade la afinina purificada, as como del extracto crudo delas races deH. longipes en dos especies de Sclerotium,que son importantes fitopatgenos agrcolas.

MATERIALES Y MTODOS

Los especmenes de Heliopsis longipes se colectaron en Puerto

de Tablas, municipio de Xich, ubicado en la Sierra Gorda de

Guanajuato, a altitudes entre 1500 y 2500 m en terrenos alterados de

bosque de encinos (Quercus spp.) y con pendientes pronunciadas. Laprecipitacin anual del lugar oscila entre 500 y 1000 mm con una

estacin de lluvias que ocurre de mayo a septiembre.

Para la obtencin del extracto crudo, 10 g de races secas y perfec-

tamente homogeneizadas, fueron extradas con 50 mL de acetato de

etilo en un sistema de extraccin continua (Tecator, Soxtec System HT

1043 Extraction Unit, Suecia) durante 2 h a 80 oC. El extracto as obte-

nido se resuspendi en 2 mL de etanol, se cuantific la concentracin

de afinina por cromatografa de gases y se guard a 4 oC hasta su

posterior utilizacin en los experimentos.

(Ospina et al., 1986). However, the effectiveness of affininon phytopathogenic fungi is unknown.

One of the advantages of obtaining substances suchas affinin, produced by biosynthesis of plants is that thereare no secondary effects on the ecosystem. These bioac-tives can be metabolized by one or another organism con-

trary to the chemical fungicides commonly used to date.In this research the fungicidal activity of purifiedaffinin was evaluated. Also the crude extract of the rootsofH. longipes in two Sclerotium species, important agri-cultural phytopathogens, was evaluated.

MATERIALS AND METHODS

The specimens ofHeliopsis longipes were collected in Puerto de

Tablas, municipio de Xichu, located in the Sierra Gorda in Guanajuato

at altitudes between 1500 and 2500 m in terrain which once was oak

forest (Quercus spp.) and on steep slopes. Annual precipitation of this

location is between 500 and 1000 mm and a rainy season from May to

September.To obtain the crude extract, 10 g of perfectly homogenized dried

root were extracted with 50 mL of ethyl acetate in continuous ex-

traction system (Tecator, Soxtec System HT 1043 Extraction Unit,

Sweden) during 2 h at 80 oC. The extract obtained was resuspended

in 2 mL of ethanol; the concentration of affinin was quantified by gas

chromatography and kept at 4 oC until later use in the experiments.

The affinin was purified from the crude extract by means of thin

layer chromatography (TLC) on 20x20 glass plates covered with a

0.5 mm thick layer of silica (Silica Gel 60 G, Merck). The plates were

developed with a solvent system consisting of hexane:ethyl acetate

(2:1 v/v). Then they were air dried, sprayed with a 0.02 % fluorescein

solution in ethanol and were observed under ultraviolet light. The

affinin appears as a dark blue line with a retention index (Rf) of 0.5.This band was collected from the plates and the components were

eluted with ethyl acetate and then evaporated to dryness with a nitro-

gen stream. This fraction, containing affinin, was resuspended again

in ethanol and was submitted to high resolution liquid chromatogra-

phy (HPLC), in a Microbondapack column C18 (Waters). Acetoni-

trile: water in a gradient from 40 to 70 % for 80 minutes at a flow of

1 mL/min was used as a solvent system. Affinin, the highest peak with

retention time of 23 minutes, was collected. The purity and quantifi-

cation of this amide was determined by gas chromatography (GC) in

Hewlett Packard Mod. 5890 provided with a flame ionization detector

(FID) and an injector with a split of 1:80. A Supelco SP-2330 capil-

lary column (30 m long x 0.32 mm i.d.) was used. The conditions for

this operation were 200 oC temperature of the injector and 250 oC for

the detector. The temperature of the oven was set at the beginning to

150 oC for 3 minutes, with a temperature increase rate of 4 oC/minute

up to a final temperature of 230 oC which was maintained for 15 min-

utes. Helium was used as carrier gas and 1 L was injected as a sample.

Experiments

Wild strains of two species of Sclerotium: S.cepivorum and S.

rolfsii which were used, were provided by the Ecological Biochemical


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La afinina se purific a partir del extracto crudo mediante cro-

matografa en capa fina (TLC) sobre placas de vidrio de 20x20 cm

cubiertas con una capa de gel de slice (Silica Gel 60 G, Merck) de

0.5 mm de espesor. Las placas se desarrollaron con un sistema de

solventes constituido por hexano:acetato de etilo (2:1 v/v), despus

de lo cual se secaron al ambiente, se asperjaron con una solucin de

fluorescena a 0.02 % en etanol y se observaron bajo luz ultravioleta.

La afinina se presenta como una banda azul-oscura con una retencin

relativa (Rf) de 0.5. Esta banda se colect de las placas y los compo-

nentes se eluyeron con acetato de etilo el cual posteriormente se eva-

por a sequedad con una corriente de nitrgeno. Esta fraccin, conte-

niendo la afinina, se resuspendi en etanol y se someti a cromatogra-

fa de lquidos de alta resolucin (HPLC), en una columna Micro-

bondapack C18 (Waters). Como sistema de solventes se utiliz

acetonitrilo:agua en un gradiente de 40 a 70 % en 80 minutos a un

flujo de 1 mL/min. Se colect el pico mayoritario que present un

tiempo de retencin de 23 minutos correspondiente a la afinina. La

pureza y cuantificacin de esta amida se determin por cromatografa

de gases (CG) en un equipo Hewlett Packard Mod. 5890 equipado

con un detector de ionizacin de flama (FID), y un inyector con unradio de particin 1:80. Se utiliz una columna capilar Supelco SP-

2330 (dimensiones de la columna: 30 m x 0.32 mm i.d.). Las condi-

ciones de operacin fueron 200 oC para la temperatura del inyector y

250 oC para la del detector. La temperatura del horno se program de

manera que la inicial fuera 150 oC por 3 minutos, con una tasa de

incremento de 4oC/minuto, hasta una temperatura final de 230 oC la

que se mantuvo por 15 minutos. Se utiliz helio como gas acarreador

y se inyect 1 L de muestra.

Experimentos

Se utilizaron cepas silvestres de dos especies de Sclerotium: S.

cepivorum y S. rolfsii,proporcionadas por el Laboratorio de BioqumicaEcolgica del CINVESTAV, Unidad Irapuato. La actividad antifngica

de la afinina purificada y del extracto crudo conteniendo esta amida

se evalu con base en la capacidad de inhibicin del desarrollo micelial

de cada una de las dos especies de Sclerotium en condiciones in vitro.

Se efectuaron dos experimentos, uno utilizando afinina, y otro utili-

zando el extracto crudo. En cada experimento se evaluaron cuatro con-

centraciones de afinina: 5, 10, 15 y 25 g/mL contra S. rolfsii, y S.

cepivorum,adems de un testigo (0g/mL) en ambos casos. Alcuotas

de las fracciones evaluadas se incorporaron al medio papa-dextrosa

(PDB) previamente esterilizado en matraces de 125 mL conteniendo

50 mL de medio cuando la temperatura de ste fue de aproximada-

mente 50 oC. Por cada concentracin hubo tres repeticiones que fue-

ron inoculadas con discos de micelio de 5 mm de dimetro y se incu-baron en la oscuridad a 18 y 25 oC, para S. cepivorumy S. rolfsii

respectivamente. Despus de 10 das de incubacin se determin el

peso seco del micelio, variable a la cual se aplic un anlisis de varianza

de clasificacin simple.

Extraccin de lpidos totales. El micelio seco se someti a la

extraccin de lpidos totales, utilizando el sistema de extraccin con-

tinua Soxtec (ya mencionado) con un sistema de solventes de ex-

traccin cloroformo-metanol (2:1 v/v). El tiempo utilizado para la

extraccin fue de dos horas. Posteriormente el extracto lipdico se

Laboratory of CINVESTAV, Unidad Irapuato. The antifungal activ-

ity of purified affinin and the crude extract containing the amide was

evaluated taking into account the mycelium development inhibition

of each one of the two Sclerotium species in vitro. Two experiments

were performed, one using affinin, the other using crude extract. In

each experiment four concentrations of affinin were evaluated: 5,

10, 15 and 25 g/mL vsS. rolfsii, and S. cepivorum, and a control (0

g/mL) in both cases. Aliquots of the evaluated fractions were in-

corporated in the potato-dextrose broth (PDB) medium previously

sterilized in 125 mL flasks containing 50 mL of the medium its tem-

perature being approximately 50 oC. For each concentration there

were three replications which were inoculated with disks of myce-

lium 5 mm in diameter and incubated in darkness at 18 and 25 oC for

S. cepivorum and S. rolfsii respectively. After 10 days of incubation,

the dry weight of the mycelium was determined; a simple classifica-

tion analysis of variance was applied.

Extraction of total lipids. The dry mycelium obtained was sub-

mitted to the extraction of total lipids using the Soxtec continuous

extraction system (already mentioned) with a chloroform-methanol

(2:1 v/v) solvent extraction system. The extraction time was two hours.Later, the lipidic extract was reduced to dryness and redissolved to a

volume of 1 mL with the same extraction solvent.

Quantification of fatty acids. For the quantification of fatty ac-

ids present in the mycelium, the fatty acids were submitted to saponi-

fication; lipid extracts were derived, obtaining methyl-esters in accor-

dance with the AOCS technique (1997). For this purpose a 500 L

aliquot of the lipid extract was used, 1 mL of a methanolic solution of

hydroxy of potassium 0.5 M was added and incubated at 90 oC for 10

minutes. Later 1 mL of boron trifluoride in methanol was added and it

was again incubated at 90 oC for 10 minutes. This solution was al-

lowed to cool. 2 mL of water were added to it. Last, the methyl-esters

were extracted with 3 mL of n-hexane, the organic fraction was sepa-

rated and taken to a volume of 200 L with absolute ethanol. Theseparation and quantification of fatty acids was done by GC, using the

equipment previously mentioned to evaluate affinin. The calibration

curves of the fatty acids were elaborated previously. The contents of

the fatty acids are reported as total micrograms in the culture.

Quantification of ergosterol. The ergosterol was purified from the

lipid fraction before saponification, from which 90L were applied to a

TLC plate, collaterally applying 20 L of a standard of ergosterol to a

concentration of 1 g/L. The plate was developed in a chloroform-

methanol (2:1 v/v) system. After 2 h the plate was removed and the

solvent was evaporated; later it was sprayed with fluorescein at 0.02 %

in ethanol to identify the band corresponding to ergosterol by means of

ultraviolet light at 250 nm. The band corresponding to ergosterol with a

Rf of 0.58 was separated from the plate. It was extracted with 3 mL of

ethyl acetate and resuspended in 100 L of ethanol. This sample was

quantified by GC in the same equipment, using a capilar column HP-1,

5 m x 0.53 mm and similar conditions to those previously mentioned.

The ergosterol content appears as total micrograms in the culture.

RESULTS AND DISCUSSION

The initial development of the mycelium in both fungi,on the basis of its dry weight in each culture was higher


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redujo a sequedad y se llev a un volumen de 1 mL con el mismo

solvente de extraccin.

Cuantificacin de cidos grasos. En este caso se saponificaron y

derivaron los extractos lipdicos, obtenindose metil-steres segn la

tcnica de la AOCS (1997). Para esto se utiliz una alcuota de 500 L

del extracto lipdico, se adicion 1mL de solucin metanlica de hi-

drxido de potasio 0.5 M y se incub a 90 oC durante 10 minutos.

Despus se le adicion 1 mL de trifluoruro de boro en metanol y nue-

vamente se incub a 90 oC por 10 minutos. Se dej enfriar y se le

adicionaron 2 mL de agua. Por ltimo se extrajeron los metil-steres

con 3mL de n-hexano, se separ la fraccin orgnica y se llev a un

volumen de 200L con etanol absoluto. La separacin y cuantificacin

de cidos grasos se llev a cabo por cromatografa de gases, mediante

el equipo mencionado para la evaluacin de afinina. Previamente se

elaboraron las curvas de calibracin de los cidos grasos mayorita-

rios. El contenido de cidos grasos se reporta como microgramos tota-

les en el cultivo.

Cuantificacin de ergosterol. El ergosterol se prepurific a par-

tir de la fraccin lipdica antes de la saponificacin, de la cual se apli-

caron 90 L a cromatografa en placa fina, aplicando colateralmente20 L de un estndar de ergosterol a una concentracin de 1 g/L.

La placa se desarroll en un sistema de solventes cloroformo-metanol

(2:1 v/v). Despus de 2 h, la placa fue retirada y se dej evaporar el

solvente; posteriormente se asperj con fluorescena a 0.02 % en etanol

para identificar la banda correspondiente a ergosterol mediante luz

ultravioleta a 250 nm. La banda correspondiente a ergosterol con un

Rf de 0.58 se separ de la placa, se extrajo con 3 mL de acetato de

etilo y se resuspendi en 100L de etanol. Esta muestra se cuantific

por cromatografa de gases en el mismo equipo de CG, empleando

una columna capilar HP-1 de 5 m x 0.53 mm y condiciones similares

a las anteriormente mencionadas. El contenido de ergosterol se pre-

senta como microgramos totales en el cultivo.

RESULTADOS Y DISCUSIN

El desarrollo inicial del micelio de ambos hongos,con base en su peso seco por matraz de cultivo, fue ma-yor en el testigo (Figura 2) y dicho desarrollo empez adisminuir aun a las concentraciones mnimas de afinina,tanto en forma purificada como de extracto crudo en elmedio. Sin embargo, hubo una respuesta diferencial enfuncin del fitopatgeno. As, en S. rolfsii (Figura 2a)hubo disminucin continua del peso seco en el micelioal aumentar la concentracin del compuesto activo enel extracto de races de 5 a 25g/mL, nivel en el cual eldesarrollo micelial se inhibi casi por completo (90 %);un efecto similar present la afinina purificada en estagama de concentraciones, observndose una inhibicinde 80 % a la concentracin de 25g/mL. En S. cepivo-rum (Figura 2b) y a la concentracin de 10 g/mL elefecto del extracto crudo sobre el micelio fue mayorque en S. rolfsii, pues la inhibicin fue ligeramente su-perior a 60 %. En las concentraciones mayores, 15 y 25g/mL, el efecto se increment paulatinamente hasta

in the control (Figure 2). This development started to di-minish even at the minimum concentration of affinin inits purified form as well as in the crude extract. However,there was a difference in the response of each phytopatho-gen. In S. rolfsii (Figure 2a) there was a continuous di-minishing of dry weight in the mycelium as the concen-

tration of the active component in the root extract raisedfrom 5 to 25 g/mL at which level the mycelium devel-opment was inhibited almost completely (90 %); a simi-lar effect was observed in the purified affinin in theseconcentrations, a reduction of 80 % to the concentrationof 25g/mL. In S. cepivorum (Figure 2b) at a concentra-tion of 10 g/mL the effect of the crude extract on themycelium was greater than in S. rolfsii, since the reduc-tion was slightly above 60 %. In higher concentrations,15 and 25 g/mL, the effect increased gently until itreached a reduction of 80 % at 25g/mL, at which con-centration the purified affinin presented a slightly higherfungicidal activity (Figure 2b). The estimates of average

lethal doses for purified affinin, as well as for crude ex-tract, for S. rolfsii varied between 15 and 20 g/mL andfor S. cepivorum between 5 and 10g/mL. However, thegeneral effect of the crude extract and the purified affininwas practically the same in both fungi.

With respect to fatty acid contents in S. rolfsii, theaffinin did not present a significant effect on palmitic acid(C16:0), ester acid (C18:0) or oleic acid (C18:1). How-ever, the affect on linolenic acid (C18:2) was different.At a concentration of 25g/mL, it diminished 75 % withrespect to the control, while at 5, 10 and 15g/mL, nosignificant differences were noticed between these con-centrations. Conversely, the content of all fatty acids men-

tioned at a dose of 25g/mL (Figure 3a) diminished from85 to 100 %. This may suggest the activity of minor com-ponents other than affinin such as other alkamides presentin the crude extract (Molina Torres et al., 1995, 1996)may affect the synthesis of these acids, therefore dimin-ishing their contents.

With reference to the contents of the fatty acids C16:0,C18:0, C18:1, C18:2, and C18:3 present inS. cepivorum,a similar pattern was observed in each of them. They di-minished from 70 to 90 % from concentrations as low as10 g/mL of purified affinin and crude extract (Figure3b). It should be pointed out that the differences in theamount of linolenic acid found in Figures 3a and 3b ischaracteristic of each species.

On the other hand, the accumulation of ergosterolin the cultures ofS. rolfsii (Figure 4a) was less whenthe medium contained crude extract even in the lowestconcentration of 5 g/mL, without noticeable changeat 10 and 15g/mL; however, with 25g/mL the pres-ence of ergosterol was not detected. Purified affinin at aconcentration of 5 to 15g/mL had a greater effect thanthe crude extract which inhibited the accumulation of


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alcanzar una inhibicin de 80 % a 25 g/mL, concen-tracin en la cual la afinina purificada present una ac-tividad fungicida ligeramente mayor (Figura 2b). Lasestimaciones de las dosis letales medias tanto para laafinina purificada como para sta en el extracto crudo,para S. rolfsii vari entre 15 y 20g/mL y para S. cepi-vorum entre 5 y 10 g/mL. Sin embargo, el efecto ge-neral del extracto crudo y de la afinina purificada prc-ticamente fue similar en ambos hongos.

Con respecto al contenido de cidos grasos en S.rolfsii, la afinina no present efecto significativo sobre

los cidos palmtico (C16:0), esterico (C18:0), oleico(C18:1), excepto para el cido linoleico (C18:2), en elcual a la concentracin de 25g/mL hubo una disminu-cin de 75 % con respecto al testigo, mientras que a con-centraciones de 5, 10 y 15g/mL, no se observaron dife-rencias significativas entre stas. Por otro lado, el extrac-to crudo disminuy de 85 a 100 % el contenido de todoslos cidos grasos mencionados anteriormente a la dosisde 25 g/mL (Figura 3a). Esto podra sugerir la activi-dad, adems de afinina, de componentes minoritarios,

ergosterol between 50 and 70 % respectively, in rela-tion to the control, while in concentrations of 25g/mLthe presence of this sterol was not detected (Figure 4a).The effect on S. ceviporum by the presence of the crudeextract in the medium presented a great variability inconcentrations of 5 to 15 g/mL. However, at a con-

centration of 25 g/mL inhibition was total. Purifiedaffinin showed a most noticeable inhibiting affect inthe accumulation of ergosterol for this organism; fromthe low concentration where the reduction was approxi-mately 65 % it slowed almost totally to the concentra-tion of 15 g/mL until it disappears totally at concen-trations of 25g/mL (Figure 4b).

It should be noticed that the two species of fungi hada different content of ergosterol, the value of the controlbeing higher in S. rolfsii (353 g) than in S. cepivorum(117g) in the initial inoculum. In both cases the ergos-terol content in the presence of 25 g/mL of purifiedaffinin or in the crude extract is within the limit of the

technical detection used. The reduction of the ergosterolcontent cannot be considered a specific inhibition as itproceeds in parallel with the diminishing of the dry weightof the mycelium; therefore it can be taken as an index ofthe growth of the fungus.

The inhibitory action on the ergosterol synthesis is aphenomenon already documented for some systemic fun-gicides among which are the group of the triazols(Ragsdale and Sisler, 1990). The presence of ergosterolprovides the basis for the selection of two types of anti-fungal agents, those which interact with the membrane,and those which interfere with its biosynthesis. The im-portance of the antifungal agents stimulates the research

of the biosynthesis of ergosterol (Gow and Geoffrey,1995). This work is just an initial research on the effectthe affinin presents in the ergosterol content in these fungi.More detailed studies are required on the possible inhibi-tory mechanism of this antifungal agent to show in whichpart of the biosynthesis ergosterol takes effect.

The action mechanism by which affinin affects theacid synthesis in fungi is still unknown. If the synthesisof fatty unsaturated acids in fungi is similar to the anaero-bic mechanism used byEscherichia coli, it could be thataffinin inhibits the activity of the hydroxydecanoil-de-hydratase enzyme (HDDase). This enzyme initiates thefatty acids desaturation pathway and is inhibited specifi-

cally by 3-decynoil-N-acetyl cysteamine (Kass, 1968).The structure of the inhibitor has an aliphatic chain, of10 carbons unsaturated, in its active allene form, in posi-tion two and an amide which reminds us of the affininstructure (Figure 1). It would be expected that the toxic-ity mechanism implies the inhibition of the fatty acid syn-thesis, the acetyl-coenzyme A, common precursor to bothpathways, would favor the accumulation of ergosterol.The effect on the sterol biosynthetic pathway requires amore detailed study.

Figura 2. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) deHeliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre el pesoseco del micelio de Sclerotium rolfsii (a) y S. cepivorum(b). Las barras horizontales indican la desviacinestndar de tres repeticiones.

Figure 2. Effect of the crude extract ( ) concentrations ofHeliopsislongipes and purified affinin ( ) on the dry weight ofthe mycelium ofSclerotium rolfsii (a) and S. cepivorum(b). The horizontal bars indicate standard deviation ofthree replications


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Figura 3. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) deHeliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre elcontenido de cido linoleico (C 18:2) en Sclerotium rolfsii(a) y S. cepivorum (b). Las barras horizontales indicanla desviacin estndar de tres repeticiones.

Figure 3. Effect of the concentrations of the crude extract ( ) ofHeliopsis longipes and purified affinin ( ) on the linoleicacid content (C18:2) in Sclerotium rolfsii (a) and S.

ceviporum (b). The horizontal bars indicate the standarddeviation of three replications.

Figura 4. Efecto de las concentraciones del extracto crudo ( ) deHeliopsis longipes y afinina purificada ( ) sobre elcontenido de ergosterol en Sclerotium rolfsii (a) y S.

cep ivorum (b). Las barras horizontales indican ladesviacin estndar de 3 repeticiones.

Figure 4. Effect of the concentrations of the crude extract ( ) ofHeliopsis longipes and purified affinin ( ) on the ergos-terol content in Sclerotium rolfsii (a) and S. ceviporum(b). The horizontal bars indicate the standard deviationof three replications.

como otras alcamidas presentes en el extracto crudo (Mo-lina Torres et al., 1995, 1996) sobre la sntesis de estoscidos disminuyendo as su contenido.

En cuanto al contenido de los cidos grasos C16:0,C18:0, C18:1, C18:2 y C18:3 presentes enS. cepivorum,se observ un patrn similar para cada uno de stos, loscuales disminuyeron de 70 a 90 % desde concentracio-nes tan bajas como 10g/mL tanto de afinina purificadacomo del extracto crudo (Figura 3b). Cabe destacar quelas diferencias en la cantidad de cido linoleico observa-das en las Figuras 3a y 3b es caracterstica de cada espe-

cie (Wassef, 1977).Por otra parte, la acumulacin de ergosterol en los

cultivos de S. rolfsii (Figura 4a) fue menor cuando elmedio contena extracto crudo an a la concentracinmnima de 5g/mL, mantenindose sin cambio notorioa 10 y 15 g/mL; sin embargo, con 25g/mL ya no sedetect la presencia de ergosterol. La afinina purifica-da, a las concentraciones de 5 a 15g/mL, tuvo un efectomayor que el extracto crudo ya que inhibi entre 50 y70 % la acumulacin del ergosterol, respectivamente,

CONCLUSIONS

Affinin and crude extract found inHeliopsis longipesshowed maximum antifungal activity for Sclerotiumrolfsii and S. cepivorum, measured on the basis of thegrowth of the total mycelium, at concentrations of 25g/mL. The responsible compound of the antifungal ac-tivity is affinin but it is possible that other bioactive com-pounds present in the crude extract participate, since therewere some differences between the action of purifiedaffinin and the crude extract. It is also possible that other

compounds present in the crude extract, different fromaffinin, affect the reduction of the accumulation of thefatty acids C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2 in the S. rolfsiimycelium. The crude extract and affinin reduce the con-tent of such fatty acids, and also of C18:0, in the S.cepivorum mycelium. The affinin and the extract reducethe accumulation of the ergosterol content in the culture,from the minimum concentration evaluated (5 g/mL)in the S. rolfsii as well as in the S. cepivorum. The me-dium lethal dose estimated was similar for the purified


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affinin and for the crude extract; between 15 and 20g/mL in the case ofS. rolfsii and between 5 and 10g/mLfor S. cepivorum. However, the general effect of the crudeextract and the purified affinin was practically similar inboth fungi.

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en relacin con el testigo, mientras que en concentra-ciones de 25 g/mL ya no se detect la presencia delesterol (Figura 4a). El efecto sobre S.cepivorum por lapresencia del extracto crudo en el medio present unagran variabilidad en concentraciones de 5 a 15g/mL,sin embargo, a la concentracin de 25g/mL la inhibi-

cin fue total. Para este organismo la afinina purificadamostr un efecto de inhibicin ms notable en la acu-mulacin de ergosterol, desde la menor concentracindonde se observa una reduccin de aproximadamente65 %, decayendo despus casi totalmente a la concen-tracin de 15g/mL hasta desaparecer en su totalidad ala concentracin de 25 g/mL (Figura 4b).

Destaca que las dos especies de hongos tuvieron undiferente contenido de ergosterol siendo mayor el valoren el testigo para S.rolfsii (352g), que en S. cepivorum(117g), en el inculo inicial. En ambos casos el conte-nido de ergosterol, en presencia de 25g/mL de afininapurificada o en el extracto crudo, est en el lmite de

deteccin de la tcnica utilizada. La reduccin en el con-tenido de ergosterol no se puede tomar como una inhibi-cin especfica puesto que es paralela a la disminucindel peso seco del micelio por lo que se puede tomar comoun ndice de crecimiento del hongo.

La accin inhibitoria sobre la sntesis de ergosterol esun fenmeno ya documentado para algunos fungicidassistmicos sintticos, entre ellos el grupo de los triazoles(Ragsdale y Sisler, 1990). La presencia de ergosterol pro-vee las bases para la selectividad de dos tipos de agentesantifngicos, aquellos que interactan con la membrana,y los que interfieren en su biosntesis. La importancia delos agentes antifngicos estimula la investigacin sobre

la biosntesis de ergosterol (Gow y Geoffrey, 1995) y estetrabajo es solo una investigacin inicial sobre el efectoque presenta la afinina en el contenido de ergosterol enestos hongos, requirindose de estudios ms detalladossobre el posible mecanismo de inhibicin de este agenteantifngico que muestre en qu parte de la biosntesisdel ergosterol se efecta.

El mecanismo de accin por el cual la afinina afectala sntesis de los cidos en hongos todava se descono-ce. Si la sntesis de cidos grasos insaturados en hongoses similar al mecanismo anaerbico que utilizaEscheri-chia coli, pudiera ser que afinina inhibiera la actividadde la enzima hidroxidecanoil-deshidratasa (HDDasa).Esta enzima inicia la ruta de desaturacin de cidosgrasos y es inhibida especficamente por el 3-decinoil-N-acetil cisteamina (Kass, 1968). La estructura del inhi-bidor tiene una cadena aliftica de 10 carbonos, una in-saturacin, en su forma activa de aleno, en posicin dosy una amida recordando la estructura de la afinina (Fi-gura 1). Sera de esperarse que si el mecanismo de toxi-cidad implica la inhibicin de la sntesis de cidos grasos,la acetil coenzima A, precursor comn a ambas rutas,

favoreciera la acumulacin de ergosterol. El efecto so-bre la ruta de sntesis de este esterol requiere de un estu-dio ms detallado.

CONCLUSIONES

La afinina y el extracto crudo presentes enHeliopsislongipes mostraron la mxima actividad antifngica paraSclerotium rolfsii y S. cepivorum, medida con base en elcrecimiento total del micelio, a concentraciones de 25g/mL. El compuesto responsable de la actividad anti-fngica es la afinina, pero es posible que participen otroscompuestos bioactivos presentes en el extracto crudo yaque hubo algunas diferencias entre la accin de la afininapurificada y la del extracto crudo. Tambin es posibleque otros compuestos presentes en el extracto crudo, di-ferentes a la afinina, afecten la reduccin de la acumula-cin de los cidos grasos C16:0, C18:0, C18:1 y C18:2en el micelio de S. rolfsii. El extracto crudo y la afininadisminuyen el contenido de tales cidos grasos, ademsde C18:3, en el micelio de S. cepivorum. La afinina y elextracto reducen la acumulacin del contenido de ergos-

terol en el cultivo, desde la concentracin mnima eva-luada (5g/mL), tanto para S. rolfsii como para S. cepi-vorum. La dosis letal media estimada fue similar para laafinina purificada y para el extracto crudo: entre 15 y20g/mL en el caso de S. rolfsii y entre 5 y 10g/mLpara S. cepivorum. Sin embargo, el efecto general delextracto crudo y de la afinina purificada prcticamentefue similar en ambos hongos.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa de Mxico por el

apoyo otorgado a los siguientes proyectos: CONACYT 26398 y SHIGO

97-810.

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El prestigio nacional e internacional de AGROCIENCIA le ha merecido estar incluida en el:

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Actividad Fungicida de La Afinina y Del Extracto Crudo de Raices de Heliopsis Longipes

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