19 OFICINA ESPAOLA DEPATENTES Y MARCAS

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11 Nmero de publicacin: 2 281 35551 Int. Cl.:

C12N 5/10 (2006.01)C12N 15/12 (2006.01)C12N 15/62 (2006.01)C12N 15/63 (2006.01)C07K 14/705 (2006.01)C07K 14/71 (2006.01)C07K 14/715 (2006.01)C07K 16/18 (2006.01)A61K 38/16 (2006.01)G01N 33/53 (2006.01)G01N 33/567 (2006.01)

12 TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA T386 Nmero de solicitud europea: 00959229 .686 Fecha de presentacin : 14.08.200087 Nmero de publicacin de la solicitud: 121849187 Fecha de publicacin de la solicitud: 03.07.2002

54 Ttulo: ADN que codifica una subunidad humana 5-HT3-C del receptor de serotonina 5-HT3.

30 Prioridad: 01.09.1999 US 388349

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:01.10.2007

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:01.10.2007

73 Titular/es: Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc.U.S. Route 3202Raritan, New Jersey 08869, US

72 Inventor/es: Dubin, Adrienne, E.;Erlander, Mark, G.;Huvar, Arne;Huvar, Rene yBuehler, Lukas, K.

74 Agente: Ungra Lpez, Javier

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, dela mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo seconsiderar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 delConvenio sobre concesin de Patentes Europeas).E

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Venta de fascculos: Oficina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

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DESCRIPCIN

ADN que codifica una subunidad humana 5-HT3-C del receptor de serotonina 5-HT3.

Antecedentes de la invencin

La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) es un transmisor qumico multifuncional que an as sealiza receptoresde la superficie celular. Se han definido farmacolgicamente al menos catorce subtipos de receptores de serotonina(Julius, 1996). Trece de los catorce receptores conocidos son receptores acoplados a la protena G y el nico receptorde 5-HT ionotrpico, el receptor 5-HT3 de tipo 3, es un canal catinico no selectivo regulado por ligando, de activacinrpida, nico entre los receptores de monoaminas conocidos (Derkach et al., 1989). El receptor 5-HT3 se localizaexclusivamente en neuronas en los sistemas nerviosos central (Waeber et al., 1989; Yakel et al., 1991) y perifrico(Fozard, 1984). La activacin del receptor 5-HT3 conduce a la despolarizacin de la membrana y a un aumento delCa2+ intracelular. El receptor 5-HT3 es la diana de antagonistas (granisetrn y ondansetrn) selectivos contra la nuseainducida por quimioterapia citotxica y anestesia general (Gralla, 1998). Hay algunas pruebas de que los receptores 5-HT3 de serotonina son importantes en la recepcin del dolor, ansiedad, cognicin, actividad de las neuronas motorascraneales, procesos sensoriales, modulacin del afecto y las consecuencias comportamentales del abuso de drogas(Greenshaw y Silverstone, 1997; Lambert et al., 1995; Passani y Corradetti, 1996).

Existen dos subunidades conocidas para el receptor 5-HT3 humano. 5-HT3-A (Bellli et al., 1995; Miyake et al.,1995) y 5-HT3-B (Davies et al., 1999). Estas tienen similitudes estructurales y funcionales con el nicotnico, el GABA-rgico y otros canales inicos regulados por ligando (Barnard, 1996; Gurley y Lanthorn, 1998; Maricq et al., 1991).La subunidad modificante 5-HT3-B para el receptor 5-HT3 de serotonina puede explicar ciertas observaciones de quelos receptores 5-HT3 de diversas preparaciones tienen diferentes propiedades farmacolgicas, cinticas, de permeabi-lizacin y dependientes de voltaje (Peters et al., 1992) (Dubin et al., manuscrito presentado a JBC). Sin embargo, laspruebas bioqumicas sugieren que los receptores 5-HT3 pueden existir como heteromultmeros compuestos por ms de2 subunidades. Los receptores purificados a partir de diversas fuentes mediante cromatografa de afinidad normalmen-te muestran al menos 2 bandas de protena principales con masas moleculares en el orden de 54 y 38 kDa (Lambert etal., 1995). El receptor 5-HT3-A corresponde a la original (Turton et al., 1993). El receptor 5-HT3 purificado por afi-nidad a partir de crtex cerebral de cerdo est compuesto por al menos 3 componentes separables, en base a la tincincon plata de protenas en geles desnaturalizantes (Fletcher y Barnes, 1997). Varias de estas bandas de protena no lasreconocen anticuerpos especficos dirigidos contra la subunidad 5-HT3-A recombinante (Fletcher y Barnes, 1997), ysus tamaos son demasiado grandes (52-71 kDa) para considerarlos fragmentos de 5-HT3-A degradados (Fletcher yBarnes, 1998).

El ensamblaje heteromrico de subunidades a menudo produce canales con funcin alterada en comparacin concanales homomricos. Se ha informado que una cantidad en aumento de subunidades son elctricamente silenciosascuando se expresan en solitario pero inhiben profundamente la funcin de clases especficas de canales en estudios deco-expresin (Kv8, Kv9, Kir1.3) (Hugnot et al., 1996; Salinas et al., 1997; Salinas et al., 1997; Shuck et al., 1997;Stocker et al., 1999). Como los receptores 5-HT3, los canales de potasio regulados por voltaje son hetermeros desubunidades similares (Jan y Jan, 1997). Kv8.1 y los miembros de la familia Kv9 tienen la capacidad de suprimirla expresin funcional de miembros de la familia de canales de potasio especficos cuando se co-expresan a nive-les altos (Hugnol et al., 1996; Salinas et al., 1997; Salinas et al., 1997; Stocker et al., 1999). Los experimentos deinmunoprecipitacin revelan co-ensamblaje de Kv8.1 con Kv2 (Hugnot et al., 1996). Kv8.1 no parece alcanzar lamembrana plasmtica cuando se expresa en solitario (Salinas et al., 1997) y no se produce el ensamblaje homomricode subunidades de Kv9 (Stocker et al., 1999).

La expresin funcional del canal de potasio de entrada Kir1.3 en oocitos de Xenopus no fue detectable, sin embar-go, la co-expresin de Kir1.3 con Kir1.1 o Kir1.2 redujo las corrientes resultantes de la expresin de estas subunidadesrectificadoras de entrada en solitario, coherente con una influencia negativa de la expresin de Kir1.1 y Kir1.2 (Shucket al., 1997).

Existen varios canales mutantes de origen natural que reducen la funcin de canalizacin. En una forma de ataxiaepisdica, las mutaciones en el gen que codifica Kv1.1 suprimen la funcin de las subunidades de Kv1.1 de tiposilvestre (Mathur et al., 1999; Zerr et al., 1998). En la forma LQT1 de mutaciones A177P o T311I de KvLQT1del sndrome de QT largo, tienen un efecto dominante negativo de corrientes producidas por KvLQT1 con o sinminK cuando se expresan combinaciones de subunidades del canal en oocitos de Xenopus (Shalaby et al., 1997).La expresin de estos mutantes de KvLQT1 individualmente o en combinacin, produjo canales inactivos cuando seexpresaban individualmente e inhibi las corrientes de KvLQT1 de tipo silvestre de manera negativa dominante.

Un mutante de HERG de origen natural G601 es una mutacin hipomrfica (es decir, una forma mutante especficade un gen que muestra una funcin cualitativamente similar a la del estado normal, pero con cuantitativamente menosfuncin), dando como resultado una amplitud de corriente reducida y representa un nuevo mecanismo que refuerzaLQT2 (Furutani et al., 1999).

Se ha presentado un amplio intervalo de conductancias de canales individuales para la subunidad receptora 5-HT3-A y receptores 5-HT3 endgenos en clulas nativas. Esta variacin es atribuible en parte a la formacin heteromricade 5-HT3-A con subunidades 5-HT3-B (Davies et al., 1999). Los receptores homomricos mostraron una conduc-

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tancia sub-pS mientras que los receptores heteromricos mostraron gran conductancia del canal individual (16 pS)(Davies et al., 1999). Se ha informado de la modulacin de la conductancia de los receptores 5-HT3. Van Hooft y co-laboradores han demostrado que la conductancia de receptores 5-HT3 en clulas N1E-115 depende de las condicionesde fosforilacin (Van Hooft y Vijverberg, 1995).

Una necesidad insatisfecha en este campo, es la capacidad de reconstruir un sistema de expresin recombinanteque imita completamente el complejo del receptor 5-HT3 en tejido natural, debido probablemente a complejos recep-tores incompletos situados en la superficie celular. Creando un modelo ms relevante fisiolgicamente del complejoreceptor 5-HT3 usando sistemas in vitro, ser ms fcil desarrollar y ensayar nuevos compuestos teraputicos para eltratamiento de enfermedades asociadas con el receptor de serotonina 5-HT3. Esta necesidad insatisfecha se ha satisfe-cho mediante el aislamiento y caracterizacin de una nueva molcula de ADNc de la subunidad del receptor 5-HT3,denominada en lo sucesivo en este documento 5-HT3-C. Usando un sistema de expresin recombinante, se han aisladomolculas de ADN funcionales que codifican la subunidad. Se describen las propiedades biolgicas y estructurales deesta protena, as como la secuencia de aminocidos y nucletidos. La protena recombinante es til para identificar mo-duladores del complejo receptor de serotonina 5-HT3, y para reconstituir una respuesta fisiolgica al receptor 5-HT3ms realista en sistemas recombinantes. La co-expresin del 5-HT3-A con la subunidad 5-HT3-C reduce la funcinbiolgica del receptor 5-HT3-A para algunos moduladores conocidos de receptores 5-HT3. Los modulados identifica-dos en el ensayo descrito en este documento son tiles como agentes teraputicos. Las molculas de ADN recombinan-tes, y porciones de las mismas, son tiles para aislar homlogos de las molculas de ADN, identificar y aislar