ADRENOMEDULINA y PAMP Nuevas dianas terapéuticas para el ...

UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU

FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

SECCIÓN DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA

ADRENOMEDULINA y PAMP

Nuevas dianas terapéuticas para el diseño de

agentes antiproliferativos y/o antiangiogénicos

TESIS DOCTORAL

VIRGINIA ROLDÓS SERRANO

Madrid, 2008

Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra. Dña. Ana Ramos González,

Profesoras Agregadas de Química Orgánica y Farmacéutica ambas

pertenecientes a la Facultad de Farmacia de la Universidad San Pablo CEU,

CERTIFICAN:

Que la presente Memoria, titulada ADRENOMEDULINA Y PAMP, NUEVAS

DIANAS TERAPÉUTICAS PARA EL DISEÑO DE AGENTES

ANTIPROLIFERATIVOS Y/O ANTIANGIOGÉNICOS ha sido realizada bajo su

dirección en la Sección de Química Orgánica y Farmacéutica del Departamento de

Química de la Universidad San Pablo CEU, por la licenciada en Farmacia Dña.

Virginia Roldós Serrano, y autorizan su presentación para ser calificada como

Tesis Doctoral.

Montepríncipe, 24 de Junio de 2008

Fdo. Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa Fernández

Fdo. Dra. Dña. Ana Ramos González

VºBº Directora del Departamento

Beatriz de Pascual-Teresa Fernández

AGRADECIMIENTOS

Gracias a mis directoras de tesis Dra. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra.

Ana Ramos González. Cada una, a su modo, ha sabido enseñarme su gran

profesionalidad y trasmitirme su vasta experiencia con atenta dedicación, valiosas

enseñanzas que espero poder aplicar en el futuro con su misma pericia. Gracias

por su calidez humana, su paciencia infinita frente a mi tozudez, su comprensión y

su amistad. Gracias por su sentido del humor y sus constantes palabras de aliento

cuando parecía que los astros confabulaban en nuestra contra.

Gracias a la Dra. Sonsoles Martín Santamaría por su apoyo, consejos y

estímulo permanente, por su incondicional ayuda y su amistad.

Gracias al Dr. Miguel Julián Viñals por tantísimas horas de labor

compartida y solidaria, por sus enseñanzas, su optimismo y su amistad.

Gracias al Dr. Alfredo Martínez Ramírez por permitirme realizar una

estancia en su laboratorio del Departamento de Neuroanatomía y Biología Celular

del Instituto Cajal de Ciencias Neurobiológicas. Gracias por su apoyo permanente

y su vivo interés en nuestro trabajo. Gracias también a los Dres. José Rodrigo,

Ricardo Martínez Murillo, Patricia Fernández y Julia Serrano por su simpatía y

afectuosa acogida.

Gracias a la Dra. Sonia de Pascual-Teresa por permitirme realizar ensayos

de proliferación celular en su laboratorio del Instituto del Frío (CSIC) y por su

asesoramiento. Gracias a María Hidalgo por su desinteresada ayuda.

Gracias a los directores de la sección de Biología Vegetal y Ecología, de la

Sección de Parasitología y de la sección de Bioquímica por permitirme utilizar su

equipamiento para las pruebas biológicas.

Gracias al Dr. Antonio Pineda-Lucena del Centro de Investigación Príncipe

Felipe y sus colaboradores Dr. Rodrigo Carbajo y Dra. Anne Schott por la

realización de los experimentos de RMN.

Gracias a las Dras. Danièle Altschuh y Laurence Choulier de École

Supérieure de Biotechnologie (CNRS) por la realización de los experimentos SPR.

Gracias al Sr. Decano, Dr. Agustín Probanza Lobo, por su permanente

disposición y comprensión, por su apoyo sincero de siempre y su valiosa ayuda.

Gracias a los compañeros de departamento que me han acompañado en

estos años: Gema, Javier, Alberto, Álvaros, Marta, Amalia, Cristina, Teresa,

Mónica, Edu, Ana, Pilar, Susana y muy especialmente a mis compañeros de grupo

José María, José Juan y Mario, con quienes he compartido más estrechamente

nuestras horas de cacharreo. Gracias a Berta por su apoyo, su cariño, su simpatía

y generosidad. Gracias a Ángel por tantas horas de risas cómplices, por su

generosidad y su nobleza. Gracias a Irene por su preciosa amistad, por

perdonarme cientos de despistes y llegadas tarde, por su honestidad y su gran

corazón.

Gracias a la Universidad San Pablo CEU por la concesión de una beca

predoctoral y diversas ayudas para estancias y asistencias a congresos, así como

la utilización de sus instalaciones y medios.

Gracias a la Sociedad Española de Química Terapéutica por la concesión

del premio Ramón Madroñero.

Gracias a mi familia, especialmente a mi madre y mi hermana por apoyar sin

condiciones mis determinaciones, por estar siempre presentes y saber tender

infinitos puentes a través del océano. Gracias por su amor y entrega. Gracias por

hacerme ser mejor ser humano cada día.

Gracias a Mariano por sus palabras y sus silencios, su amor y su luz.

Gracias por compartir conmigo la infinita ilusión de nuestro hijo, nuestro sueño

mayor.

Finalmente gracias a Madrid. Nunca sospeché que podría querer otra

ciudad que no fuera mi Montevideo. Menos podía pensar en esta posibilidad

cuando no hay mar en este horizonte, están tan lejos los abrazos de los míos y el

sol de Castilla se empeña en resecar la tierra y mi piel. Por fortuna estaba

equivocada. Al principio tímidamente y después en alud, esta ciudad me mostró

seres humanos excepcionales y aunque ha habido de los otros, no hay

mezquindad capaz de empañar el brillo de esta villa.

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

ACTH Corticotropina

AM Adrenomedulina

AMPc Adenosín monofosfato cíclico

ARNm Ácido ribonucleico mensajero

Boc terc-butoxicarbonilo

BSA Albúmina sérica bovina

CGRP Péptidos relacionados con el gen de la calcitonina

CoMFA Análisis comparativo de campos moleculares

CRLR Receptor del tipo del receptor de la calcitonina

CV Validación cruzada

DCM Diclorometano

DMF N,N-Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido hexadeuterado

EM Espectro de masas

FEP Perturbación de energía libre

FMM Método multipolar rápido

GA Algoritmo genético

GB/SA Modelo generalizado de Born / Área superficial

GPCRs Receptores acoplados a proteínas G

GRIND Descriptores independientes de alineamiento

HTS Cribado de alto rendimiento

IBMX 3-Isobutil-1-metilxantina

IE Impacto electrónico

IR Infrarrojo

LBDD Diseño de fármacos basado en el ligando

LGA Algoritmo genético lamarkiano

LICA N-isopropil-N-ciclohexilamiduro de litio

MD Dinámica molecular

MEP Potencial electrostático molecular

MIF Campo de interacción molecular

MIP Potencial de interacción molecular

MM Mecánica molecular

MM-GBSA Mecánica molecular-área de superficie generalizada de Born

MMP-2 Metaloproteasa 2 de la matriz

MM-PBSA Mecánica molecular-Área de superficie Poisson-Boltzmann

MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

NCI Instituto Nacional del Cáncer

p.f. Punto de fusión

PAMP Péptido 20-N-terminal de la proadrenomedulina

PB Poisson-Boltzmann

PBC Condiciones de límite periódico

PBS Tampón fosfato salino

PC Componente principal

PCA Análisis de componentes principales

PDB Base de datos de proteínas

PKA Proteína cinasa dependiente de AMPc

PLS Mínimos cuadrados parciales

PMA Ácido fosfomolíbdico

PME Particle Mesh Ewald

QM Mecánica Cuántica

QSAR Relación estructura-actividad cuantitativa

QSAR-3D Relación estructura-actividad cuantitativa tridimensional

RAMP Proteína modificadora de la actividad del receptor

RMDS Desviación cuadrática media

RMN Resonancia magnética nuclear

SA Superficie accesible al disolvente

SAR Relación estructura actividad

SBDD Diseño de fármacos basado en la estructura

SDS Dodecilsulfato-d25 de sodio

SNC Sistema nervioso central

SPR Resonancia de plasma en superficie

TA Temperatura ambiente

TCA Ácido tricloroacético

TFE Trifluoroetanol

THF Tetrahidrofurano

TMS Tetrametilsilano

VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular

VS Cribado Virtual

Índice

Introducción 1

Antecedentes 1. Estructura

2. Biosíntesis, liberación y metabolismo

3. Receptores

4. Funciones

5. AM y PAMP: perspectivas de su aplicación terapéutica

6. Moduladores de la acción de AM

7. Diseño de fármacos

7. 1. Diseño indirecto

7. 2. Diseño directo

7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening

7. 2. 2. Dinámica Molecular

5

5

9

12

15

23

27

32

33

39

44

45

Capitulo I. Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales

I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 61

I. 2. Discusión de Resultados I. 2. 1. Síntesis

I. 2. 2. Actividad Biológica

65

65

71

I. 3. Conclusiones 89

I. 4. Parte Experimental I. 4. 1. Materiales y Métodos

I. 4. 2. Síntesis

I. 4. 2. 1. Cloruros de 4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio

I. 4. 2. 2. 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidin-1-carboxilato de

terc-butilo (21)

91

91

96

96

106

I. 4. 2. 3. Cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio (22)

I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-

4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34)

I. 4. 2. 5. 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (35)

I. 4. 2. 6. 2-(1-benzoil-4-hidroxi-piperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (36)

I. 4. 2. 7. 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato de metilo (38)

I. 2. 4. 8. Ácido 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoico (37)

I. 2. 4. 9. Ácido 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropanoico (39)

I. 2. 4. 10. (1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)(fenil)acetato de metilo (17)

107

107

115

116

116

117

117

118

I. 4. 3. Determinación de la afinidad I. 4. 3. 1. Ensayo de competición

I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR

I. 4. 4. Ensayos Biológicos

I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc

I. 4. 4. 2. Pruebas antiproliferativas

I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D

119

119

119

120

120

122

123

Capitulo II. Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP

II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 127

II. 2. Discusión de Resultados II. 2. 1. Cribado Virtual

II. 2. 2. Ensayo de competición

II. 2. 3. Determinación de la afinidad por SPR

129

129

140

142

II. 2. 4. Dinámica Molecular

II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica

II. 2. 6. Pruebas Antiproliferativas

II. 2. 7. Resonancia Magnética Nuclear

145

167

168

171

II. 3. Conclusiones 175

II. 4. Parte Experimental

II. 4. 1. Cribado Virtual




II. 4. 5. Angiogénesis: Ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo II. 4. 6. Pruebas antiproliferativas


177

177

182

183

184

186

187

188

Bibliografía 189

Introducción

Introducción

1

Introducción

La Adrenomedulina (AM) y el péptido 20-N-terminal de la

proadrenomedulina (PAMP) son dos péptidos biológicamente activos relacionados

entre sí y que desarrollan papeles muy importantes en la regulación de diversas

funciones biológicas.

La AM es un factor vital para la supervivencia de las células tumorales ya

que, además de comportarse como un factor de crecimiento, reduce la apoptosis,

su producción aumenta en situaciones de hipoxia y muestra una acusada actividad

proangiogénica en modelos ex vivo e in vivo.

El PAMP es aún más potente como factor angiogénico y su inhibición

provoca la reducción del crecimiento tumoral.

En el presente trabajo nos hemos planteado la búsqueda de pequeñas

moléculas que, a través de su unión a estos péptidos, puedan modular su

actividad. Especial interés poseen los moduladores negativos, por su potencial

utilidad como agentes antitumorales y/o antiangiogénicos.

Para este estudio se han aplicado dos estrategias diferentes de diseño de

fármacos. En el caso de la AM, al no disponer de la estructura tridimensional, se

ha llevado a cabo un diseño basado en el ligando. Por el contrario, la

disponibilidad de la estructura 3D del PAMP, ha permitido iniciar el estudio

mediante un cribado virtual para detectar moléculas que se unan al péptido.

En el capítulo I de esta memoria nos hemos centrado en la AM. En un

estudio de cribado farmacológico puesto a punto en el Instituto Nacional del

Cáncer de EEUU (NCI), se detectaron varios moduladores positivos y negativos de

AM con una interesante actividad hipotensora y antiproliferativa, respectivamente.

Introducción

2

En primer lugar se puso a punto un método de síntesis para obtener una

serie de compuestos estructuralmente relacionados con un cabeza de serie

previamente seleccionado mediante el citado cribado farmacológico llevado a cabo

en el NCI.

A continuación, se evaluó cualitativamente la afinidad por la AM de los

compuestos sintetizados mediante un estudio de competición con su anticuerpo

monoclonal. También se estudió de forma cuantitativa, con la técnica de

Resonancia de Plasma en Superficie (Surface Plasmon Resonance, SPR), la

capacidad de unión de los compuestos a la AM.

Los datos se utilizaron para establecer un modelo QSAR-3D que nos

permitió identificar ciertas características estructurales fundamentales para la

unión a la AM: la presencia de un grupo dador de enlace de hidrógeno y un anillo

aromático. Además, el modelo posee una alta capacidad predictiva y está siendo

utilizado para el diseño de nuevos moduladores más activos.

En la siguiente etapa se determinó la producción de AMPc mediante un

radioinmunoensayo, lo que nos permitió comprobar que los compuestos con un

ácido carboxílico libre se comportan como moduladores negativos de la AM.

Por lo tanto, todos los ácidos sintetizados se sometieron a ensayos de

actividad antiproliferativa en diferentes líneas celulares. El compuesto 16, que es

el que posee mayor afinidad por la AM, mostró una interesante actividad

antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon HCT116, por lo que ha

sido seleccionado para llevar a cabo ensayos in vivo en colaboración con el

Centro Integral Oncológico Clara Campal (CIOCC), Hospital de Madrid.

En el capítulo II de esta memoria, nos propusimos buscar pequeñas

moléculas capaces de modular la acción del PAMP. En primer lugar, se llevó a

cabo un cribado virtual, utilizando el programa AutoDock, de la colección de

compuestos del NCI (NCI diversity set), constituida por 1800 compuestos, junto

con 60 compuestos pertenecientes a nuestra quimioteca. Este cribado nos

permitió seleccionar los 50 compuestos con mayor afinidad de acuerdo a criterios

energéticos.

Introducción

3

A continuación se puso a punto un método para determinar

experimentalmente la afinidad de los ligandos por el PAMP, basado en la

competencia con un anticuerpo monoclonal antiPAMP. De esta forma se

seleccionaron los 20 compuestos más afines para realizar otros ensayos

biológicos y de afinidad.

Con la finalidad de profundizar en el conocimiento de las interacciones que

se establecen entre el péptido y un ligando que mostró afinidad por el PAMP

mediante SPR, se llevaron a cabo simulaciones de Dinámica Molecular (DM) del

complejo correspondiente y del péptido libre.

La simulación puso de manifiesto que las interacciones que más

contribuyen a la estabilidad del complejo son las interacciones de tipo catión-π

entre argininas del péptido y anillos aromáticos del ligando y de apilamiento

(stacking) entre anillos aromáticos de ambas especies.

Aplicando los métodos MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson

Boltzmann Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born

Surface Area) y el módulo NMODE de AMBER, se determinó la energía teórica de

unión del complejo PAMP-USP1K (∆Gbind) y se comparó con la energía de unión

calculada para el complejo entre el PAMP y un compuesto que experimentalmente

se ha demostrado que no se une al péptido (PAMP-USP1N). Por otro lado, para el

complejo PAMP-USP1K se calculó la contribución media de la entalpía de unión

de cada uno de los residuos del péptido, confirmando la importancia de las

interacciones detectadas en la simulación de dinámica molecular.

Recientemente, se ha comenzado a estudiar la interacción de nuestros

compuestos con PAMP utilizando técnicas de RMN. Esta técnica permite, no solo

confirmar la formación de los complejos, sino también obtener información

experimental sobre los residuos del péptido implicados en la unión, que podrían

confirmar los datos obtenidos en nuestro estudio teórico.

Finalmente, todos los compuestos que dieron positivo el ensayo de

competición con el anticuerpo monoclonal antiPAMP fueron evaluados en un

Introducción

4

ensayo de anillos aórticos de pollo, para determinar su actividad antiangiogénica,

pero desafortunadamente ninguno de ellos resultó activo.

Sin embargo, tres de ellos han mostrado una interesante actividad

antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon Caco-2.

Antecedentes

Antecedentes

5

La AM es un péptido biológicamente activo, que fue aislado por primera

vez en 1993 a partir de extractos de una línea celular de feocromocitoma humano,

un cáncer derivado de la médula adrenal, por un grupo de científicos japoneses

que buscaban péptidos capaces de estimular la producción de adenosín

monofosfato cíclico (AMPc) en plaquetas.1

El PAMP es una molécula peptídica multifuncional que posee varias

funciones biológicas entre las que se encuentra su papel proangiogénico que

favorece el crecimiento tumoral y su efecto inhibitorio de la secreción de

catecolaminas mediado por los receptores nicotínicos.

El papel de estos péptidos en la regulación de diferentes procesos

biológicos y, más específicamente, en enfermedades como el cáncer, los convierte

en atractivas dianas para el diseño de nuevos agentes antitumorales.

1. Estructura

La AM humana es un péptido de 52 aminoácidos con un puente disulfuro

entre los residuos 16 y 21 y con una tirosina amidada en su extremo carboxilo

terminal (Figura 1).1 El puente disulfuro genera un anillo de 6 aminoácidos, con

dos cadenas de diferente longitud que salen del mismo.

Antecedentes

6

Debido a sus características estructurales, la AM, el CGRP (calcinotin

gene-related peptide), la amilina y la calcitonina propiamente dicha están incluidos

dentro de la familia de los péptidos relacionados con el gen de la calcitonina. La

secuencia de la AM no presenta una homología alta con el CGRP (27%), sin

embargo, los péptidos AM, calcitonina, CGRP y amilina tienen características

estructurales comunes, tales como el ciclo de 6 ó 7 aminoácidos, generado por un

puente disulfuro intramolecular y la tirosina amidada en su extremo carboxilo

terminal.2, 3 Estas dos características estructurales son imprescindibles para la

actividad biológica de estos péptidos.4 Entre ellos existe un solapamiento de

acciones biológicas que puede ser debido en parte a la promiscuidad de sus

receptores.5

En el momento de iniciar este trabajo no existía ningún dato sobre la

estructura tridimensional de la AM y su resolución podría suministrar claves para la

determinación del mecanismo involucrado en la modulación de su actividad.

Los esfuerzos realizados en nuestro grupo de investigación para proponer

un modelo basado en la homología por el momento no han dado resultados

positivos, ya que no se conoce la estructura tridimensional de ninguna proteína

suficientemente homóloga.

Figura 1: Representación de la AM donde se muestra el puente disulfuro que da lugar al ciclo

entre los aminoácidos 16 y 21.

Antecedentes

7

Tampoco los modelos que obtuvimos por threading fueron de calidad

suficiente y no fue posible llegar a un consenso entre los distintos servidores

utilizados.6

En cuanto a los intentos de resolver su estructura mediante la técnica de

difracción de rayos X, no condujeron a ningún resultado positivo debido a que

sufre agregación y no fue posible conseguir cristales adecuados para su estudio.

Finalmente, y en el momento de imprimir esta tesis, ha sido posible obtener un

espectro de RMN con calidad suficiente para resolver la estructura tridimensional

de la AM. Este trabajo fue realizado por el Dr. Javier Pérez Castells (USP-CEU) y

el Dr. Jesús Jiménez Barbero del CIB (Centro de Investigaciones Biológicas).

El PAMP fue aislado por primera vez en 1993 al mismo tiempo que la AM.7

Posee una secuencia de 20 aminoácidos en la que su extremo carboxilo terminal

se encuentra amidado (PAMP-[1-20]; ARLDVASEFRKKWNKWALSR-amida).

La estructura tridimensional del PAMP y su conformación más estable fue

determinada en 2005 usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C y

modelado molecular.8 Evaluando las diferencias entre conformaciones obtenidas

del PAMP en dos disolventes, los autores de este trabajo determinaron que la

estructura consiste en una α-hélice desde la ARG2 hasta la ARG20 en

trifluoroetanol/agua (TFE/H2O) y desde ARG2 hasta ALA17 en dodecilsulfato-d25 de

sodio (SDS) (Figura 2). Este último se utiliza mucho en investigación estructural

puesto que, a través de la formación de micelas, genera un ambiente hidrófobo

que emula las membranas biológicas o el interior de las proteínas.9

Antecedentes

8

Figura 2: Estructura tridimensional del PAMP (Código PDB = 2FLY).

El hecho de que los residuos de 18 a 20 no adopten la conformación de α-

hélice en SDS sugiere que podrían tener un papel esencial en el reconocimiento y

unión del PAMP a su receptor. Esto coincide con los estudios de Mahata y cols.10

que demuestran la importancia de los residuos del extremo C-terminal en la

actividad fisiológica. Este grupo observó que la eliminación de la amida del

carboxilo terminal disminuye levemente la actividad y que la eliminación de los tres

aminoácidos de este extremo anulaba completamente la acción del PAMP en sus

receptores nicotínicos.

Pero no sólo el extremo C-terminal es necesario para la actividad. Belloni y

cols. determinaron que el fragmento peptídico PAMP-[12-20], no inhibe la

secreción de catecolaminas pero actúa como un antagonista débil de la actividad

del PAMP.11 El hecho de que el PAMP-[12-20] sea capaz de unirse a los

receptores nicotínicos aunque no produzca los mismos efectos que el PAMP

sugiere que los dos extremos N y C-terminal son fundamentales para la inhibición

de secreción de catecolaminas desde estos receptores.

Por otra parte, Martínez y cols.12 investigaron el potencial angiogénico del

PAMP en ensayos in vitro e in vivo. Observaron que el PAMP induce el

crecimiento de los vasos sanguíneos (respuesta dosis dependiente) y que el

fragmento peptídico PAMP-[12-20] produce una acción antagónica del PAMP,

inhibiendo su acción angiogénica. Estos resultados indican que los extremos C y

Antecedentes

9

N-terminal son fundamentales tanto para la actividad angiogénica como para su

acción inhibitoria de la secreción de catecolaminas.

2. Biosíntesis, liberación y metabolismo

Tanto la AM como el PAMP provienen del mismo gen y éste se ha

secuenciado en distintas especies (rata, cerdo, vaca, ratón y hombre).13-15

El gen humano contiene cuatro exones y tres intrones. La pérdida de los

tres intrones del ARNm recién transcrito da lugar al ARNm maduro denominado

Forma A (Figura 3). Después de la translación de la misma se produce una

prehormona de 185 aminoácidos llamada preproadrenomedulina. Ésta debe sufrir

distintas modificaciones post-transduccionales antes de producir la

proadrenomedulina y dar lugar a dos péptidos amidados: AM y PAMP (Figura 3).16

El PAMP es liberado de la proadrenomedulina por proteolisis en el primer grupo de

aminoácidos básicos (GLY42LIS43ARG44), después de lo cual tiene lugar la

amidación post-translacional del C-terminal del PAMP, en respuesta a la señal de

la GLY por la enzima monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas.

La AM secretada, también llamada AM inmadura, posee un aminoácido

más (GLY) y es convertida en AM madura por amidación enzimática. La enzima

amidante, monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas, es coexpresada con la

AM en diferentes tejidos y contiene dos dominios que catalizan dos reacciones

consecutivas: monooxigenasa hidroxilante de peptidilglicinas y lipasa α-amidante

de peptidilhidroxiglicinas.17, 18

Por otra parte, si el intrón 3 se conserva, se produce un ARNm más largo

(Forma B), que posee un codon prematuro. Este codon evita la transcripción de la

AM, dando lugar sólo a la producción de una prohormona más pequeña que solo

contiene PAMP.16

Esto explicaría que la relación PAMP/AM en las células y tejidos donde se

expresa el gen sea diferente dependiendo del tejido y la especie a la que

Antecedentes

10

pertenezca, e incluso el hecho de que solo uno de los péptidos esté presente

exclusivamente en determinados tipos de células.16

Figura 3: Representación esquemática de los pasos intermedios en la biosíntesis de la AM y el

PAMP. El gen de la AM humana tiene cuatro exones y tres intrones. El ARN maduro puede estar

presente en dos formas: A y B. La forma A se traduce en una proteína precursora, la

preproadrenomedulina, de un tamaño de 185 aminoácidos y da lugar a dos péptidos activos, la

AM y el PAMP. La forma B da lugar únicamente al PAMP.

La secreción de AM se ha estudiado en cultivos de células endoteliales,

células del músculo liso vascular y cardiomiocitos. Factores como el estrés

oxidativo, citoquinas proinflamatorias, angiotensina II, hipoxia e hiperglicemia

estimulan la producción de AM.19 En la médula adrenal, la AM es secretada junto

con las catecolaminas en respuesta a la estimulación colinérgica. A diferencia de

otros péptidos, la AM no se almacena en gránulos (excepto en las células

endocrinas pancreáticas), sino que se libera inmediatamente después de su

síntesis.

3’

Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4

Preproadrenomedulina

PAMP AM

Forma A

5’

Forma BStop

ARNm ARNm

PAMP

Pre ARNm

Antecedentes

11

En plasma, la AM se une específicamente al factor H del complemento.20

Con esta unión aumentan los efectos mediados por receptor, pero se suprimen los

efectos independientes de él, como la actividad antimicrobiana. Por otra parte, la

AM mejora la actividad del factor H, que es un inhibidor de la ruta alternativa de

activación del sistema del complemento. La AM unida al factor H no se puede

detectar en la mayoría de los ensayos que se hacen en el plasma, por lo tanto los

niveles de AM probablemente son más altos que los publicados en la mayoría de

los estudios. Pero además, los niveles altos de AM que se han detectado en

algunos estados clínicos, especialmente en el shock séptico, podrían estar

sobrestimados en estudios tempranos puesto que en esas circunstancias se

registra una disminución de la concentración de factor H en plasma.19

La AM circulante es rápidamente metabolizada con un tiempo de vida

media de aproximadamente 20 minutos. Los niveles de AM en aorta son más

bajos que en la arteria pulmonar, lo que sugiere que los pulmones podrían ser el

principal lugar de eliminación del péptido.19

Se ha observado la expresión del gen de la proadrenomedulina en la

mayoría de los órganos y tejidos, incluyendo el sistema nervioso central, glándulas

y sistema cardiovascular entre otros.21

Martínez y cols. estudiaron las secuencias de este gen a lo largo de la

evolución de diferentes especies vertebradas y observaron que mientras la

secuencia correspondiente a la AM no sufre grandes cambios, la correspondiente

al PAMP experimenta grandes variaciones.22 Entre ellas se encuentra la función

amida del C-terminal del PAMP que no está presente en peces y aves pero sí se

encuentra en todos los mamíferos estudiados. Las secuencias de este gen en

ratas, cerdos y humanos son idénticas en un 80% y los 12 residuos del extremo C-

terminal están conservados completamente en las tres especies.10

El PAMP se encuentra en plasma y orina, y en muchos tejidos humanos

como la médula adrenal, pulmones, hígado, bazo, páncreas, corazón

(especialmente en la aurícula derecha en una concentración considerable),

corteza cerebral y riñón, entre otros.23 Eto y cols. identificaron la presencia de

PAMP en diferentes tejidos humanos.23 Estos datos se recogen en la tabla 1.

Antecedentes

12

Los niveles de PAMP en plasma aumentan con varias enfermedades tales

como la hipertensión,24 insuficiencia renal crónica,25 insuficiencia cardiaca26 y

glomerulonefritis crónica.27

región ir-PAMPa

Médula adrenal 13.8 ± 7.93 Feocromocitoma 12.3 ± 9.82 Corazón aurícula derecha 5.72 ± 1.11 aurícula izquierda 1.11 ± 0.62 ventrículo derecho 0.10 ± 0.06 ventrículo izquierdo 0.06 ± 0.02 Pulmón 0.02 ± 0.01 Hígado 0.03 ± 0.01 Bazo 0.03 ± 0.02 Páncreas 0.09 ± 0.02 Riñón 0.06 ± 0.03 Intestino delgado 0.05 ± 0.02 Corteza cerebral 0.02 ± 0.01

a ir-PAMP: inmunoreactividad-PAMP (fmol/mg de tejido húmedo)

Tabla 1: Distribución de ir-PAMP en tejidos humanos

3. Receptores Se han clonado y secuenciado varios de los receptores potenciales para la

AM y han presentado diferente afinidad respecto a ella. Algunos de ellos son

capaces de reconocer, además de a la AM, a otros péptidos de la misma familia

como el CGRP. Todos estos receptores pertenecen a la superfamilia de

receptores con siete dominios transmembrana, capaces de activar la proteína G y

formaron parte en su momento del creciente grupo de receptores huérfanos, es

decir, carentes de ligando conocido.

Además de los siete dominios transmembrana, consta de una unidad

conocida como CRLR (calcitonin receptor like receptor ó receptor del tipo del

Antecedentes

13

G

activación[AMPc]

Señal

AC

GPCR

AM

Espacio extracelular

Espacio intracelular

receptor de calcitonina)28, 29 y una proteína modificadora de la actividad del

receptor (receptor-activity-modifying proteins, RAMP). Las RAMP parecen ser

necesarias para transportar el CRLR a la membrana plasmática y para determinar

su patrón de glicosidación. Por otro lado, deben estar presentes para reconocer al

ligando determinando la especificidad del receptor.30, 31 Existen tres tipos de

RAMPs y la asociación del CRLR con cada una de ellas da lugar a un tipo de

receptor específico diferente. La asociación con la denominada RAMP1 da lugar a

un receptor específico de CGRP, mientras que la asociación con RAMP2 se

traduce en un receptor específico de AM. Cuando la AM se une al receptor, la

proteína CRLR interacciona con la proteína G que activa la adenilatociclasa,

dando lugar a una elevación de los niveles de AMPc, que es el responsable final

de su actividad biológica (Figura 4).30

Figura 4: La AM se une al receptor, la proteína CRLR interacciona con la proteína G que

activa la adenilatociclasa y se elevan los niveles de AMPc.

Todo esto ha sido confirmado por varios trabajos, entre ellos, Kamitani y

cols. demostraron la expresión del complejo RAMP2/CRLR como un receptor

funcional de la AM en las células endoteliales y en las células de músculo liso

vascular humano.32

Se ha aislado otro posible receptor para la AM que se expresa

predominantemente en células hematopoyéticas.33 Su secuencia presenta una alta

Antecedentes

14

homología con la del receptor L1 de rata, pero cuando se expresó en células COS-

7 ni éste ni el receptor L1 resultaron funcionales.34

Además de estos receptores, el factor H afecta a algunas de las funciones

descritas para la AM in vitro y podría considerarse un receptor soluble. Pío y

cols.35 aislaron y caracterizaron esta proteína humana y observaron un aumento

en la producción de AMPc inducido por AM, cuando se incubó la línea celular Rat-

2 con AM en presencia de factor H. Se ha observado también que el factor H

produce un aumento en el crecimiento celular en la línea celular T-47D de cáncer

de mama y que aumenta la inhibición de la secreción de insulina mediada por

AM.36 Además, como se mencionó antes, el factor H bloquea el efecto

antimicrobiano de la AM con una respuesta dosis dependiente. Recíprocamente,

la AM influye sobre la función reguladora del factor H sobre el complemento.20

Por otra parte, en varios artículos se han publicado acciones de la AM a

través de mecanismos independientes de AMPc.37, 38

La AM también puede aumentar39, 40 o disminuir41 los niveles intracelulares

de Ca+2 independientemente del AMPc y estimular la óxido nítrico sintasa (NOS)

en células endoteliales.42 Tampoco en el caso de la activación de los canales de

K+ sensibles a ATP en células vasculares del músculo liso, la señalización es

dependiente de AMPc.43

Los sitios de unión del PAMP se distinguen muy bien de los receptores de

la AM aunque aún no se encuentran bien caracterizados.

Recientemente se han publicado datos que sugieren que el receptor

humano de corticostatina MrgX2, un receptor acoplado a proteína G, podría actuar

también como receptor del PAMP.44, 45 También existen publicaciones que

proponen receptores colinérgicos10, 46, 47 o mecanismos alternativos que involucran

varios receptores acoplados a proteínas G44, 48 como el receptor del péptido

liberador de gastrina (GRP-R),49 pero en todos los casos la afinidad del PAMP por

ellos es muy baja.

Antecedentes

15

4. Funciones

Cuando se aisló la AM, la elevación de AMPc intracelular fue el primer

camino de señalización observado. Esta capacidad de aumentar los niveles de

AMPc ha sido confirmada en distintos tipos celulares, tales como las células

endoteliales de vena umbilical humana,50 células mesangiales de rata,51 células

del músculo esquelético de rata,52 miocitos cardíacos durante el período

neonatal,53 células tumorales54 y fibroblastos de rata,55 entre otros.

El aumento en AMPc, como ya se ha mencionado, se produce por la

activación de la adenilatociclasa, que a su vez induce la actividad de la proteína

cinasa dependiente de AMPc (PKA).55

La importancia de la AM ha abierto un amplio campo de investigación que

se manifiesta en la creciente cantidad de artículos publicados en los últimos años

sobre sus interesantes funciones fisiológicas. Se han identificado muchas

funciones en las cuales la AM juega un papel fundamental. Entre otras, cabe

destacar su función vasodilatadora y broncodilatadora, la inhibición de la secreción

de numerosas hormonas, la regulación de la función renal y de la proliferación

celular. El libro editado por Martínez y Cuttitta56 contiene una revisión exhaustiva

sobre éstas y otras funciones de la AM. Se ha estudiado también la relación de

estas funciones de la AM con diversas enfermedades, como el cáncer, la

hipertensión y la diabetes.

En lo que respecta al PAMP, sus actividades biológicas han sido

confirmadas tanto en modelos humanos como animales. El PAMP se encuentra

elevado en una variedad de estados patológicos tales como la hipertensión,24 la

insuficiencia cardiaca,26 la insuficiencia renal crónica57 y el cáncer de próstata.58

La distribución intracelular de AM y PAMP en órganos endocrinos sigue el

patrón esperado para péptidos que actúan como hormonas, acumulándose en

gránulos secretores, como se observa en páncreas,59, 60 la pituitaria anterior,61 y

células del sistema endocrino difuso en el intestino,62 entre otros. En contraste,

algunos estudios ultraestructurales llevados a cabo en órganos no endocrinos, han

Antecedentes

16

mostrado una distribución diferente, que indica que estas moléculas también

poseen funciones a nivel intracelular. Recientemente, se ha publicado que tanto

AM como PAMP se unen a los microtúbulos y pueden regular las funciones del

citoesqueleto.63

4.1. Sistema cardiovascular

La administración sistémica de AM disminuye la tensión sanguínea debido

al descenso de la resistencia periférica vascular.64 Como consecuencia de ello,

aumenta el ritmo y flujo sanguíneo cardíaco.

Se ha observado aumento de los niveles de AM en plasma en situaciones

de hipertensión,65 fallo cardíaco,66 e infarto agudo de miocardio.67 En todos los

casos los niveles de AM en plasma descienden después de la recuperación.

El PAMP puede inducir vasodilatación por una variedad de mecanismos

que dependen tanto del sitio como de la especie: inhibición de la liberación de

norepinefrina de las terminaciones adrenérgicas en el lecho mesentérico

vascular,68 o vasodilatación directa o tono dependiente en ratas,69 o actividad

vasodilatadora mediada por AMPc en gatos.70 Se ha observado que en bovinos el

PAMP inhibe la síntesis y secreción de catecolaminas inducida por agonistas

nicotínicos.46, 71 Sin embargo, el mecanismo exacto o el sitio de acción del PAMP

aún se encuentra en estudio.

4. 2. Sistema nervioso central (SNC)

La AM y sus receptores se expresan abundantemente en el cerebro y los

niveles más altos se encuentran en tálamo, hipotálamo, adeno y neurohipófisis.72, 73

Los niveles de expresión no sólo se deben a la producción local, sino también al

hecho de que la AM puede atravesar la barrera hematoencefálica.74 Por lo tanto,

algunos de los efectos que se observan con la administración periférica de AM

podrían tener lugar vía SNC. Un ejemplo de ello son la inhibición de la ingesta de

Antecedentes

17

agua75 o de sal76 con la administración intracerebroventricular de AM. La

inactivación de la AM por anticuerpos específicos produce acciones opuestas.77

Contrariamente al efecto periférico hipotensor, la administración de AM a

nivel central aumenta la tensión sanguínea y el ritmo cardíaco por estimulación del

sistema nervioso simpático.78

4. 3. Aparato respiratorio

La AM causa vasodilatación y aumento del flujo sanguíneo en los

pulmones79 y también es capaz de producir broncodilatación.80 Recientemente se

ha demostrado con ensayos in vivo el papel fundamental de la AM en la regulación

de la hipertensión pulmonar. La hipertensión arterial pulmonar es la principal

complicación cardiovascular de las enfermedades respiratorias crónicas, y su

desarrollo constituye uno de los indicadores más importantes de mal pronóstico de

la enfermedad. El bajo tono vascular y la respuesta vasoconstrictora frente a la

hipoxia son característicos de la circulación pulmonar. En ellas tiene un papel

esencial el endotelio pulmonar. Las alteraciones estructurales de las arterias

pulmonares en la hipertensión arterial pulmonar afectan preferentemente a la capa

íntima y pueden lesionar las células endoteliales. Qi y cols.81 han demostrado que

la administración crónica de AM reduce la presión arterial pulmonar y desacelera

los cambios ultraestructurales de las arterias pulmonares en ratas hipóxicas, sin

hipotensión sistémica.

Además, como se mencionó antes, los pulmones tienen un importante

papel en el metabolismo de la AM.

El PAMP puede producir broncodilatación. Kanazawa y cols.82 llevaron a

cabo un estudio in vivo con cerdos de guinea anestesiados. Demostraron que

tanto la AM como el PAMP inhiben significativamente la broncoconstricción

inducida por acetilcolina e histamina en concentraciones de 10-7 M, aunque la

acción del PAMP es menos duradera y el efecto broncodilatador de la AM es casi

Antecedentes

18

100 veces mayor. Estos hallazgos sugieren que estos péptidos juegan un papel

importante en las funciones aéreas.

4. 4. El riñón y el balance electrolítico

La infusión intravenosa o intrarrenal de la AM aumenta la producción de

orina y la excreción de sodio. El efecto está asociado principalmente a la

vasodilatación, el aumento del flujo sanguíneo y la velocidad de filtración

glomerular. Sin embargo, la AM también inhibe la reabsorción tubular de sodio.

Además, dosis bajas del péptido aumentan la natriuresis sin afectar a la velocidad

de filtración glomerular, lo que sugiere un efecto predominantemente tubular.83

En las células mesangiales aumenta la concentración de AMPc y con ello

el coeficiente de filtración y la velocidad de filtración glomerular.84 Además, la AM

inhibe la migración y proliferación inducida por angiotensina II de estas células, así

como la producción de especies reactivas de oxígeno.85 Estos efectos tal vez

atenúan la progresión de nefropatías crónicas.

4. 5. Regulación hormonal

El papel primario de la AM en el cerebro parece ser la regulación del eje

hipotalámico-pituitario-adrenal. La AM regula la secreción de arginina-vasopresina

y oxitocina desde neuronas hipotalámicas y aumenta moderadamente la secreción

de hormona de crecimiento en humanos y somatotrofos de rata.86 Además, inhibe

la secreción de corticotropina (ACTH).87

Los efectos de la AM en la médula adrenal están principalmente

relacionados con la regulación de la zona glomerulosa en la corteza y en las

células cromafinas de la médula.88

Se ha demostrado en ensayos in vitro e in vivo que, a nivel del páncreas,

la AM inhibe la secreción de insulina.89

Antecedentes

19

El PAMP, al igual que otros péptidos que se encuentran en la médula

adrenal, afecta a la actividad secretoria de la corteza suprarrenal. Se ha

demostrado la presencia abundante de sitios de unión de [125I]PAMP en las

glándulas suprarrenales y que al igual que la AM, el PAMP inhibe la producción de

la aldosterona estimulada por la angiotensina-II y el K+, tanto en células de la zona

glomerulosa de ratas90 como de humanos.47, 91

Respecto a la glándula pituitaria, se ha observado que el PAMP se

encuentra en humanos, cerdos, ratas y ratones entre otros61, 92-94 y que es capaz

de inhibir la secreción basal de ACTH en cultivos celulares de pituitaria de rata.95

4. 6. Fisiología reproductiva

La AM posee una alta expresión en el aparato reproductor femenino y los

niveles del péptido varían a lo largo del ciclo menstrual. Los efectos de la AM en el

útero incluyen vasodilatación de vasos locales, relajación del músculo liso uterino,

angiogénesis, acciones antiapoptóticas y actividad antimicrobiana.96, 97

También en el aparato masculino la acción de la AM es importante, como

han puesto de manifiesto los estudios de su implicación en la erección.98

4. 7. Proliferación celular

La AM es capaz de inhibir o estimular la proliferación celular según el tipo

de células del que se trate. Estimula la proliferación de las células de la zona

glomerulosa de la corteza adrenal,99-101 en osteoblastos,102-104 células C6 de

glioma,105 además de muchas células de líneas tumorales.54, 106 Por el contrario, la

AM inhibe la proliferación de fibroblastos cardíacos de rata,107, 108 de células

mesangiales,109-111 de las células del músculo liso vascular107, 112, 113 y cultivos de

cardiomiocitos.114

La AM también puede actuar como un factor antiapoptótico de

supervivencia a través de una variedad de mecanismos.115-117

Antecedentes

20

Martínez y cols. han demostrado que células que sobreexpresan AM

muestran niveles más bajos de factores proapotóticos tales como Bax, Bid y

caspasa 8, junto con una mayor resistencia a la apoptosis respecto a células que

no han sido transfectadas.118

4. 8. Actividad Antimicrobiana

La AM está presente en una gran variedad de tejidos protectores (piel,

vías aéreas, tracto gentitourinario, tubo digestivo, córnea) y secreciones (saliva,

leche y sudor) implicadas en la defensa de la colonización microbiana. El papel

protector de la AM ha sido demostrado tanto para bacterias Gram-positivas como

Gram-negativas.119, 120

La unión de la AM al factor H del sistema del complemento provoca una

reducción de su actividad antimicrobiana.20

El PAMP humano posee actividad antimicrobiana contra Escherichia

coli.121 Sólo el PAMP de los primates es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano,

indicando que esta actividad ha aparecido recientemente en el árbol filogenético.22

Incluso se ven diferencias de comportamiento al comparar tres formas del péptido

que difieren ligeramente en su estructura. Mientras que la forma del PAMP con el

ácido carboxílico libre (no amidado) es más eficiente que el péptido maduro, el

péptido inmaduro que aún posee una glicina terminal no es activo.22 La habilidad

del PAMP para inhibir el crecimiento bacteriano parece estar relacionada con su

capacidad para insertarse en la membrana exterior, generando poros que afectan

a la integridad de la bacteria.22 Se han demostrado mecanismos similares para

otros péptidos antimicrobianos122 y el análisis por RMN del PAMP8 sugiere que su

estructura es compatible con un mecanismo de esta naturaleza.

Antecedentes

21

4. 9. Regulación de la absorción intestinal

La AM posee una gran potencialidad como agente antiinflamatorio e

inmunomodulador. A dosis muy bajas, del orden de nanomolar, favorece la

recuperación del tejido intestinal inflamado desencadenando un reequilibrio en la

expresión de las citocinas implicadas en el proceso patológico.123, 124

Por otra parte, debido a la presencia del PAMP en el tracto

gastrointestinal, se ha estudiado su posible participación en la absorción de azúcar

a nivel intestinal.125 Se ha demostrado que el PAMP aumenta la captación de

azúcar de concentraciones en torno a 10-12 a 10-7, y que esta acción se debe a la

alteración del transporte de α-glucósido de metilo con la implicación del AMPc.125

Estos estudios se han realizado en yeyuno de ratas y de ellos se deduce que el

PAMP podría tener un papel importante en la absorción de azúcares actuando

directamente sobre los enterocitos.

4. 10. Actividad angiogénica.

La implicación de la AM como agente angiogénico ha despertado gran

interés, pues se ha demostrado mediante el ensayo de membrana corioalantoidea

de pollo que la AM actúa como un potente factor angiogénico.126 Posteriormente

diversos estudios han confirmado la implicación de la AM en el proceso de

angiogénesis en distintos modelos celulares como endometrio humano,127

uterino,128 tumor endometrial129 y células de cáncer de mama.118

El PAMP también puede actuar como un potente factor angiogénico.12 Sus

receptores se encuentran en las células del endotelio microvascular humano y es

capaz de inducir neovascularización en modelos animales a concentraciones seis

órdenes de magnitud inferiores a otros factores proangiogénicos como el VEGF y

la AM.12 Se ha demostrado que las células endoteliales microvasculares humanas

responden al PAMP con aumento de la migración y de la formación de tubos en

los ensayos de Matrigel. Martínez y cols. demostraron que el potencial migratorio

Antecedentes

22

de las células endoteliales aumenta hasta cuatro veces al tratarlas con PAMP a

una concentración de 10-11 M. Además, la presencia de PAMP induce la expresión

de otros factores angiogénicos que incluyen AM, VEGF, factor de crecimiento de

fibroblastos básico (basic fibroblast growth factor, bFGF) y factor de crecimiento

derivado de plaquetas tipo C (PDGF-C).12 Estas observaciones sugieren que el

PAMP posee un efecto dual sobre las células endoteliales: por un lado una

estimulación directa a través de la unión a receptores específicos y por otro la

estimulación indirecta de la angiogénesis mediante la inducción de otros factores.

El PAMP es un agente angiogénico mucho más potente que la AM o el

VEGF cuando se aplica in vivo, por lo que podría tratarse de una de las moléculas

con mayor potencial angiogénico que se conoce.12

Se ha observado que, en presencia de un péptido capaz de inhibir

específicamente los efectos inducidos por el PAMP, se inhibe la angiogénesis

inducida en células tumorales y se retrasa el crecimiento del tumor en modelos de

xenotransplante.12

Por lo tanto, aquellas moléculas que actúen como moduladores negativos

de la acción del PAMP podrían actuar como antiangiogénicas y de esta forma

como antitumorales.

Antecedentes

23

5. AM y PAMP: perspectivas de su aplicación terapéutica

5. 1. Enfermedades cardiovasculares

Como se ha mencionado antes, la concentración de AM en plasma

sanguíneo se eleva en diversas situaciones de estrés que incluyen ejercicio físico

severo,130 fallo cardíaco,66 infarto de miocardio67 e hipertensión.65, 131, 132 En todos

estos casos, el aumento de AM va acompañado de una disminución de la presión

sanguínea y del flujo ventricular izquierdo. Normalmente también se observa una

clara correlación entre la concentración de AM circulante y la de los péptidos

natriuréticos atrial (ANP) y cerebral (BNP) que también poseen propiedades

hipotensoras.66 Estas elevaciones de AM en sangre vuelven a su nivel basal

después de la recuperación de la enfermedad correspondiente, necesitándose, en

el caso del fallo cardíaco, al menos tres semanas para la total normalización de

estos niveles.67

Estas observaciones, recogidas en pacientes aquejados de diversas

enfermedades, se corresponden fielmente con los experimentos realizados en

animales de laboratorio y en voluntarios sanos. Por ejemplo, se ha comprobado

que dosis tan bajas como 0.1 nmol/Kg de AM inyectada en una sola vez pueden

rebajar significativamente la presión arterial en ratas normales. Esta hipotensión

aparece relacionada con una reducción en la resistencia periférica total.133

Además, se ha observado que la AM produce un aumento en la tensión

desarrollada en el corazón, indicando un efecto ionotrópico positivo de esta

molécula.40 Estas observaciones se han corroborado por experimentos en los que

se sobreexpresó el ARNm de la AM mediante transferencia genética134 o en

ratones transgénicos.135

Se han hecho también estudios en voluntarios sanos y se ha comprobado

que a ciertas dosis (8 ng/Kg min. durante 90 min) se observa una marcada

reducción de la presión arterial, pero sin cambios en otros fenómenos afectados

por la AM, tales como la secreción de catecolaminas, renina, hormonas adrenales

Antecedentes

24

o péptidos natriuréticos, indicando que estos últimos efectos necesitan

concentraciones más altas o son regulados de forma paracrina o autocrina, más

que endocrina.136 Todos estos datos sugieren que la AM podría ser secretada en

el torrente circulatorio para contrarrestar los efectos de desviaciones patológicas

que afectan a la presión arterial, y que podría ser usada como un modulador

farmacológico en casos de hipertensión.137

Durante el infarto agudo de miocardio se observa un contínuo y lento

aumento de los niveles de AM en plasma,138 siendo especialmente altos los

niveles de AM en la circulación coronaria en la angina de pecho.139

Los niveles plasmáticos de AM se encuentran elevados también en la

insuficiencia cardiaca, en proporción con la severidad tanto sintomática como

hemodinámica de la patología y en correlación con otros péptidos natriuréticos.140,

141 Por todo ello existen indicios de que la AM podría ser beneficiosa en el

tratamiento de la insuficiencia cardiaca.142

5. 2. Diabetes

La acción inhibitoria de la secreción de insulina por parte de la AM se ha

estudiado profundamente en varias líneas celulares productoras de insulina tales

como RINm, N289, TR4, CRL 2057, CRL 1777 y CRL 2055.60

Cuando se agrega AM a células aisladas de los islotes pancreáticos se

produce una disminución dosis dependiente de la secreción de insulina. Si

además se agrega un anticuerpo monoclonal de AM, se induce un aumento de

cinco veces en la cantidad de insulina secretada.60 Un efecto similar se observa en

ratas.60, 143

En humanos, los niveles de AM en sangre están claramente elevados en

pacientes con diabetes tipo 2, si se comparan con los niveles en pacientes

normales.144, 145 Hayashi y cols. han propuesto que la hiperglicemia se estimula por

la expresión de AM vascular a través de un mecanismo proteína cinasa C

dependiente.146 Sin embargo, se ha demostrado que, cuando se excluyen de los

Antecedentes

25

estudios a los pacientes con nefropatías, los niveles de plasma no son

significativamente distintos de los que presentan los diabéticos o pacientes

sanos.147 Esto es particularmente evidente en pacientes con diabetes de tipo 1 e

insuficiencia renal, cuyos niveles de AM en plasma son mucho más elevados que

los correspondientes a diabéticos con otras complicaciones.148

También se ha sugerido que el aumento de los niveles de AM está

relacionado con un intento por proteger los órganos del daño oxidativo149 y que

esto podría explicar las diferencias en la producción de AM en pacientes

diabéticos de tipo 1 y 2.147, 150

En cualquier caso, puesto que la hiperglicemia es responsable de todos

los desórdenes asociados con la diabetes, un control de los niveles de glucosa en

sangre a través de la regulación de los niveles de AM podría ofrecer un

tratamiento alternativo a las terapias ya existentes para el tratamiento de esta

enfermedad. Especialmente si se tiene en cuenta que ratones knockout

heterócigos para AM que llegan a ser adultos, desarrollan en su edad madura

resistencia periférica a la insulina.151

5. 3. Cáncer

Se ha estudiado que la progresión del cáncer puede acelerarse en muchos

casos debido a ciertos péptidos fisiológicos capaces de inducir crecimiento tumoral

vía mecanismos autocrinos y paracrinos. La AM está profundamente implicada en

la carcinogénesis y la progresión de tumores.126, 152 La primera vez que se

identificó la AM se encontró en un tumor humano (feocromocitoma),1 pero pronto

fue localizada en una variedad de diferentes tipos de cáncer.

En las células cancerosas la AM se puede considerar como un factor de

supervivencia del tumor. Funciona como un péptido regulatorio multifuncional y su

acción consiste en regular varios aspectos de la fisiología de la célula maligna que

promueven su crecimiento. La AM es un factor de crecimiento para las células

tumorales, reduce la apoptosis, aumenta la movilidad de las células y constituye

Antecedentes

26

un agente angiogénico, promoviendo la neovascularización en un medio

hipóxico.118

Se ha observado la sobreexpresión de AM en tumores cerebrales,153 en el

epitelio de las vías aéreas y cáncer de pulmón154 y se ha demostrado su

participación por un mecanismo autocrino/paracrino que podría dirigir la

proliferación neoplásica.54 Se ha publicado otras pruebas de la capacidad de la AM

para estimular el crecimiento de las células tumorales.126, 155, 156 La actividad

proliferativa de la AM ha sido demostrada in vitro.157-160 Cuando un anticuerpo

monoclonal de AM se agrega a un cultivo de una línea celular de cáncer de mama,

se observa una reducción marcada de la proliferación y este efecto se puede

revertir agregando AM exógena.54

Un comportamiento acorde se ha observado in vivo. Las líneas celulares

de glioblastoma humano, el más maligno y común de los tumores cerebrales,

expresan altos niveles de ARNm de AM y esa AM inmunoreactiva es liberada al

medio de cultivo.161 Martínez y cols. caracterizaron el efecto de la sobreexpresión

de AM en tumores mamarios.118 Se transfectaron dos líneas celulares de cáncer

de mama (T47D y MCF-7) con un vector de expresión conteniendo la secuencia

genética que codifica la AM humana. Las células transfectadas expresaron niveles

altos de ARNm de AM, en comparación con las transfectadas con el vector vacío.

En un experimento preliminar in vivo, tres de cada diez ratones inyectados con las

células T47D transfectadas desarrollaron tumores, mientras que ninguno de los

inyectados con las células del vector vacío desarrolló la enfermedad.118

También se han publicado algunos casos en los que la AM inhibe la

proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata.162

La implicación de la AM como agente angiogénico también ha despertado

gran interés, pues se ha demostrado, mediante el ensayo de membrana

corioalantoidea de pollo, que la AM actúa como un potente factor angiogénico.126, 163

Posteriormente, diversos estudios han confirmado la implicación de la AM en el

proceso de angiogénesis en distintos modelos celulares.118, 129, 164-167

La hipótesis de que pueda detenerse la progresión de un tumor a través

del bloqueo de la angiogénesis inducida por la AM ha sido demostrada en

Antecedentes

27

experimentos in vivo.161, 168 Estas experiencias muestran el potencial de la AM

como nueva diana para el desarrollo de fármacos antitumorales que actúen

disminuyendo los niveles de AM.

Finalmente, existen publicaciones que describen a la AM como un factor

inmunosupresor, que ayuda a las células tumorales a evadir las acciones del

sistema inmune.20, 169

El papel de la AM como regulador multifuncional de la carcinogénesis y

progresión del tumor está extensamente demostrado y la AM ha sido identificada

como una prometedora nueva diana en la búsqueda de terapias anticancerosas

eficientes.106, 157

6. Moduladores de la acción de AM

La actividad de la AM puede ser modulada de forma indirecta o directa. La

modulación indirecta implica la expresión génica,170-173 transcripción174-176 y

translación tanto de la AM como de sus receptores.

La modulación directa ocurre cuando los moduladores son capaces de

unirse a la AM madura. Hasta ahora se han descrito algunos moduladores

peptídicos y no peptídicos. Pío y cols.20 demostraron que el factor de complemento

H es capaz de unirse a la AM y que esta unión modula la bioactividad, tanto del

factor H como de la AM.

Se ha demostrado que algunas proteínas tienen un papel fundamental en

el metabolismo de la AM. Martínez y cols. han determinado que la AM se

fragmenta in vitro por la acción de la metaloproteasa 2 de la matriz (MMP-2).177 El

enzima MMP-2 produce fragmentos peptídicos a partir de la AM, algunos de los

cuales ejercen el mismo efecto que la AM sobre la tensión sanguínea, otros

ningún efecto y otros un efecto vasoconstrictor. Es importante mencionar que el

factor H previene dicha fragmentación.

También se ha demostrado que los fragmentos AM (22-52), AM (16-31) y

proAM (153-185) actúan como inhibidores de la unión de la AM con su receptor.178

Antecedentes

28

Sin embargo, el inhibidor fisiológico que ha resultado ser más eficaz hasta la fecha

es el anticuerpo monoclonal desarrollado en el laboratorio de los Drs. F. Cuttitta y

A. Martínez en Bethesda (Maryland, USA).179

Ninguno de estos compuestos es útil para su aplicación clínica ya que los

péptidos tienen normalmente una vida media corta, como resultado de la acción

de enzimas proteolíticos. Por otro lado, los anticuerpos pueden producir una

respuesta inmune del organismo, que reduce considerablemente su aplicabilidad.

Por ello es interesante la búsqueda de moléculas pequeñas, capaces de modular

la unión de la AM a sus receptores y proteínas de unión. Para detectar estos

compuestos, el método más adecuado es la realización de una búsqueda y

evaluación de actividad biológica (screening) dentro de una colección de

compuestos.

En el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de USA, integrantes de nuestro

grupo de investigación llevaron a cabo un estudio dirigido a la identificación de

moduladores positivos y negativos de AM, mediante la búsqueda en una colección

combinatoria de moléculas. Esta colección está constituida por alrededor de

250.000 compuestos, que forman parte del Programa de Desarrollo Terapéutico

de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos y que se encuentra a

disposición de los investigadores de este centro (http://dtp.nci.nih.gov/). El método

consistió en la puesta a punto de un cribado farmacológico (High Throughput

Screening, HTS) para detectar de forma rápida y eficaz la presencia de

compuestos que interaccionan con la AM. Una vez puesto a punto el método, se

realizó el cribado de unos 2000 compuestos y los candidatos obtenidos fueron

sometidos, en una segunda fase, a pruebas que permitieron comprobar los efectos

moduladores de dichas moléculas. Para ello se analizó la influencia de estos

compuestos en la elevación de AMPc inducida por AM en la línea celular Rat2,

que contiene receptores específicos para esta hormona peptídida. Este

experimento permitió clasificar los compuestos en moduladores negativos y

moduladores positivos de la AM. A continuación los moduladores negativos se

sometieron a evaluación biológica en distintas líneas celulares (H1299, T47D y

Antecedentes

29

MCF7), mientras que los moduladores positivos se sometieron a ensayos de

determinación de su efecto sobre la tensión arterial.179

Hasta el momento se han identificado por este procedimiento los

compuestos que se muestran en la figura 5 y que han sido clasificados como

moduladores negativos.

N

OHO

HO

N

OHHO

O

OH

OHO OHO

N

N

OS

O

O

N

N

N

NH2N

S

HO O

OOH

O

O

NHN

N

O OH

HO

O

NN

S

O

O

OH

NHO

O

1

H

Figura 5: Moduladores negativos de AM

Se trata de los primeros moduladores negativos de la AM de naturaleza no

peptídica, con potencial aplicación terapéutica, especialmente en el tratamiento del

cáncer. Suponen además una herramienta muy útil para el estudio del mecanismo

de acción de la AM y para el establecimiento de relaciones estructura-actividad.106

También se han identificado una serie de moduladores positivos, cuyas

estructuras se recogen en la figura 6. Ensayos in vivo han demostrado que estos

compuestos disminuyen la presión arterial en ratas, tal y como cabía esperar,

dado el efecto vasodilatador de la adrenomedulina.179

Antecedentes

30

Figura 6: Moduladores positivos de AM

Uno de los moduladores positivos que demostró un comportamiento

prometedor en los pasos de cribado antes mencionados, fue el bistriazol (color

azul, figura 6). En nuestro grupo de investigación se ha llevado a cabo la síntesis

de una serie de compuestos químicamente relacionados y se ha evaluado su

capacidad de competición por la AM.180 Los resultados se muestran en la tabla 2.

Con estos datos se llevó a cabo un estudio QSAR-3D usando técnicas

computacionales, con el fin de determinar los requerimientos estructurales para

una interacción eficiente con la AM. En casos como éste, en los cuales la

estructura del receptor aún no se conoce, los estudios de relación estructura-

actividad ayudan a menudo a elucidar los requerimientos esenciales de un

potencial ligando para interaccionar favorablemente con su diana, e

indirectamente suministran pistas acerca de las características del sitio de unión.

Con los resultados de la tabla 2 se ha derivado un modelo QSAR-3D con

una alta capacidad predictiva y que ha puesto de manifiesto dos características

relevantes para la unión a la AM: la presencia de un NH libre y de un grupo

aromático capaz de establecer interacciones hidrofóbicas a una determinada

distancia.

O

N

NN

NH

O

N

N N

N H

N

N

N

H

H H

H

OO

OH

O

HO

OHHN

N

N

N

N

OH

N

N N

N

N

OH

H

H O

H

HN

N

NN

O

OH

O

HO

Antecedentes

31

NN

N (CH2)nO

NN

NO

R' R'

RR

Serie 1

n R R’ % Competición 8 Ph NH-Ph 81

8 p-Cl-Ph NH2 19

8 2,4-diclorofenil NH2 48 8 2(1’-hidroxinaftil) NH2 42 8 1(2’-hidroxinaftil) NH2 46 8 p-Cl-Ph NH-Ph 51 8 2,4-diclorofenil NH-Ph 68 8 2(1’-hidroxinaftil) NH-Ph 83 8 1(2’-hidroxinaftil) NH-Ph 24 4 Ph CH2Ph 19 5 Ph CH2Ph 14 6 Ph CH2Ph 3 7 Ph CH2Ph 20

8 Ph CH2Ph 4

O O

HN

HN

(CH2)nPhO

O O

HNN

HOPh

Serie 2

NN

O (CH2)nPhO

NN

OOPh

Serie 3 n % Competición n % Competición 4 1 4 18 5 16 5 4 6 20 6 10 7 7 7 6 8 25 8 5

Tabla 2: Resultados del ensayo de competición para moduladores positivos de la AM.

Antecedentes

32

En el trabajo recogido en esta memoria se plantea un estudio similar con

moduladores negativos. El interés es aún mayor porque los compuestos que de él

se deriven tienen potencial utilidad como antitumorales y/o antiangiogénicos. No

existe ningún antecedente de moléculas pequeñas que actúen como moduladores

negativos de la AM, por lo tanto este trabajo representa una aproximación

novedosa al diseño de agentes antitumorales.

7. Diseño de fármacos La estrategia actual de búsqueda de nuevos y mejores medicamentos es

un proceso complejo e interdisciplinar que suele llevar entre 10 y 12 años de

investigación y desarrollo, con un gasto de 800 millones de euros, tras lo cual tan

solo entre 5-10% de las moléculas llegan a la fase de ensayo clínico y menos aún

son comercializadas. El uso de ordenadores ha facilitado y abaratado los costes

de cada etapa de investigación y desarrollo de un nuevo medicamento. En

particular, parte de nuestro trabajo se centra en el uso de técnicas

computacionales para el diseño de nuevos ligandos o lo que se denomina diseño

asistido por ordenador.

Actualmente, existen dos estrategias principales para abordar el diseño de

fármacos por técnicas computacionales: el diseño directo o basado en la

estructura y el diseño indirecto o basado en el ligando. Se habla de diseño de

ligandos (o de fármacos) basado en la estructura (structure based drug design,

SBDD) cuando se dispone de la estructura tridimensional del receptor o diana

terapéutica. Cuando se desconoce, o no se desea tener en cuenta la estructura

del receptor que constituye la diana farmacológica, el análisis de un conjunto de

ligandos que se unan a esa diana puede suministrar información muy útil para

diseñar moléculas más afines a dicho receptor. Ésta es la metodología que se

denomina diseño indirecto o diseño de fármacos basado en el ligando (ligand

based drug design, LBDD).

Antecedentes

33

En este trabajo se han abordado las dos estrategias. Como la estructura

tridimensional de la AM no se conoce, la búsqueda de moléculas capaces de

unirse a ella se realizó mediante diseño indirecto. En el caso del PAMP, para el

que se conoce la estructura 3D, nos planteamos un diseño de fármaco basado en

la estructura.

7. 1. Diseño indirecto La manipulación de una estructura cabeza de serie para obtener diversos

compuestos análogos y la evaluación cuantitativa de la actividad biológica de

éstos puede proporcionar información muy útil incluso cuando no se encuentre

ningún análogo de mayor actividad. El análisis de los resultados obtenidos puede

llevar al establecimiento de relaciones estructura-actividad o QSAR (Quantitative

Structure-Activity Relationships).

El concepto de QSAR se basa en el hecho de que las propiedades

biológicas de un compuesto están en función de parámetros fisicoquímicos, tales

como solubilidad, lipofilia, efectos electrónicos, ionización, estereoquímica, etc.181

Con el establecimiento de relaciones estructura-actividad se logran dos

objetivos: en primer lugar, el establecimiento del grupo farmacóforo, es decir, de la

estructura mínima responsable de la acción de las moléculas consideradas, que

debe ser común a todos los compuestos que ejerzan su acción farmacológica a

través de una misma interacción molecular con el receptor. En segundo lugar, el

establecimiento de cuáles son los sustituyentes que, situados sobre dicho

farmacóforo, conducen a un compuesto con propiedades terapéuticas óptimas (no

sólo en cuanto a actividad biológica, sino que se pueden relacionar con

selectividad de acción, distribución, toxicidad, etc.), es decir, optimización del

cabeza de serie.

Cuando las relaciones QSAR hacen uso de descriptores fisicoquímicos que

dependen de la estructura tridimensional de la molécula, entonces se habla de

QSAR-3D.182 Actualmente, su uso está muy extendido, no solo para predecir

Antecedentes

34

actividades, sino también para estimar otras propiedades (toxicidad,

biodisponibilidad, etc.).

Para llevar a cabo un estudio QSAR-3D se deben calcular los descriptores

químicos tridimensionales y correlacionarlos con actividades a través de análisis

estadístico multivariante.

Para determinar los descriptores interesa describir propiedades

fisicoquímicas de una molécula que tenga que ver con su posible modo de unión.

Estas propiedades estarán relacionadas con las fuerzas de interacción molecular.

Debido a que las interacciones ligando-receptor son óptimas a una determinada

distancia r, es útil construir una malla alrededor de cada ligando y calcular en

cada punto de esa malla o grid, su potencial de interacción molecular (molecular

interaction potential, MIP) con determinados grupos químicos, llamados sondas.

En el caso de que el cálculo del MIP considere una sonda protón y dicho cálculo

considere la función de onda de la molécula, entonces, se habla de potencial

electrostático molecular (molecular electrostatic potential, MEP). A la distribución

de valores de MIP alrededor de una molécula se le denomina campo de

interacción molecular (molecular interaction field, MIF). Existe una gran variedad

de descriptores para simular diferentes átomos o grupos funcionales. Por

ejemplo, existen desde descriptores para simular oxígenos carbonílicos a otros

que simulan grupos carboxílicos alifáticos. Se han desarrollado otros descriptores

denominados descriptores independientes de alineamiento (GRid INdependent

Descriptors, GRIND)183 que permiten obtener modelos QSAR-3D sin necesidad

de superponer los compuestos.

Una vez calculados los MIFs de una serie de moléculas, podemos

construir una matriz que correlacione cada valor de actividad con los valores del

MIF. Esta matriz tendrá tantas filas como moléculas (n) y tantas columnas como

puntos tenga el MIF, más el valor de actividad (x+1). La resolución de este

sistema se obtiene con la aplicación de métodos de análisis multivariante: análisis

de componentes principales (principal components analysis, PCA) y mínimos

cuadrados parciales (partial least square, PLS).

Antecedentes

35

El análisis de componentes principales (PCA) es un método de reducción

de variables. Normalmente, en estudios QSAR-3D, la matriz contiene menos de

100 objetos (que son los ligandos) y varios miles de variables x. Mirando

directamente estos números, nadie podría descubrir patrones, tendencias, pautas,

clusters (agrupamientos o conglomerados), etc. en los objetos. El PCA es una

técnica extremadamente útil para resumir toda la información contenida en la

matriz-X y ponerla en una forma inteligible.

En el análisis de componentes principales, las p variables originales (x)

son reemplazadas por un número menor de m nuevas variables (t) llamadas

componentes principales, de forma que la pérdida de información sea mínima. Ello

se consigue expresando cada nueva variable ti como un vector combinación lineal

de las p variables originales.

t1 = c11χ1 + c12χ2 + … + c1pχp

t2 = c21χ1 + c22χ2 + … + c2pχp

tm = cm1χ1 + cm2χ2 + … + cmpχp

Los componentes principales deben ser ortogonales, es decir, no estar

correlacionados entre sí. Cada nueva variable ti acumula, de forma decreciente

(desde 1 hasta m) el máximo de información original. En teoría se pueden obtener

tantos componentes principales como variables originales, si bien con un número

reducido m << p se retiene una cantidad suficiente de la información (varianza) de

las variables originales.

La información no contenida en las variables pi queda como varianza-X no

explicada, en una matriz residual (E), la cual tiene exactamente la misma

dimensionalidad que la matriz-X original.

Al reducir un espacio de cientos o miles de descriptores, que pueden

contener información redundante, a unas pocas variables (de 2 a 5, normalmente,

y totalmente independientes entre sí), la técnica del PCA permite disponer de las

descripciones multivariantes de una forma intuitiva, manejable y sobre todo

Antecedentes

36

interpretable.184 La distribución que adoptan los objetos (moléculas) en el espacio

de descriptores y su agrupamiento en conglomerados (clusters), se puede

visualizar a través de la representación gráfica de la matriz de puntuación (T)

(scoring). También se puede determinar cómo contribuyen las variables originales

a esta distribución, estudiando la relación entre variables originales y componentes

principales a través de la representación gráfica de la matriz de loadings (P’).

Una variante del PCA aplicada a los estudios de regresión es el método de

mínimos cuadrados parciales (PLS). Mientras que el PCA trabaja únicamente con

variables X, el análisis PLS es una técnica de regresión cuya finalidad consiste en

explicar una o más variables dependientes (Y) en términos de variables X.

Y = f(X) + E

Es posible crear múltiples modelos que satisfagan la ecuación. Entre ellos

el mejor es aquel que permita el cálculo de la variable y que corresponda

correctamente con el valor experimental, incluso para moléculas no incluidas en el

set de construcción del modelo. Estos son los modelo predictivos y pueden ser

utilizados para realizar estimaciones de confianza de los valores Y para nuevas

moléculas, antes de ser sintetizadas.

Los mejores modelos PLS que se puedan obtener están sujetos a la

misma limitación que cualquier otro modelo de regresión, es decir, un modelo de

regresión nunca puede ser mejor que la serie de datos a partir del cual se ha

obtenido. No es posible, por tanto, obtener información sobre áreas en las que no

haya suficiente variabilidad.

Una vez que ha finalizado este proceso es necesario hacer una validación

interna del modelo quimiométrico generado. Para ello, el método más empleado

es la validación cruzada (cross-validation, CV), que permite eliminar el riesgo de

correlaciones casuales. Funciona construyendo modelos reducidos (modelos para

los cuales se han excluido algunos objetos) y que se utilizan para predecir las

variables Y (normalmente actividad) de los objetos excluidos. Entonces, la Y

predicha se compara con la Y experimental, calculándose, entre otros índices, el

Antecedentes

37

q2 (coeficiente de correlación predictivo), que nos indica la calidad predictiva del

modelo.

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡

−

−−=

∑∑

2

22

)(`)(

1YYYY

q

A veces será necesario ajustar ligeramente el alineamiento del compuesto

o compuestos peor predichos y repetir los pasos anteriores hasta que se

encuentre un alineamiento mutuo que produzca un modelo QSAR-3D con alto

valor predictivo (alto valor de q2).

Es importante darse cuenta de que las variables Y, como cualquier otra

variable experimental, contienen errores. Los modelos tratarán de ajustar la Y

tanto como sea posible y, si se intenta mejorar demasiado el ajuste (fitting), el

modelo explicará también el ruido. Este fenómeno, denominado “sobreajuste”

(overfitting), es muy peligroso porque los modelos sobreajustados parecen muy

buenos modelos, pero no son capaces de predecir los valores de Y de objetos no

incluidos en el conjunto de entrenamiento.185

La capacidad de predicción de un modelo se atribuye a la existencia de

una relación verdadera entre los valores de las propiedades X (normalmente las

energías de los campos de interacción) y los valores de la propiedad Y

(normalmente la actividad de un fármaco). Incluso si los modelos QSAR-3D no son

capaces de explicar completamente los valores de la actividad, son muy valiosos

para identificar las áreas alrededor de las moléculas que más contribuyen a la

actividad. Estas regiones pueden ser consideradas como regiones importantes en

la interacción ligando-receptor, y pueden proporcionar pistas sobre cómo

interaccionan y por tanto ayudar al diseño de nuevos compuestos.

El análisis QSAR-3D tiene tres dificultades principales que superar. En

primer lugar, la identificación de las conformaciones bioactivas de los compuestos

flexibles que forman el conjunto de entrenamiento (training set). La conformación

bioactiva no se corresponde necesariamente con la estructura obtenida del

Antecedentes

38

análisis de la estructura cristalina o con la conformación en solución obtenida por

RMN. En la interpretación más sencilla, sobre todo para la actividad in vitro, la

conformación activa de un ligando se supone que es aquella que corresponde a la

conformación unida al receptor. En segundo lugar, la especificación de los criterios

para comparar las moléculas a la hora de construir un modelo QSAR-3D, lo que se

denomina alineamiento o superposición molecular. Por último, cada molécula del

conjunto de entrenamiento debe ser particionada respecto a las interacciones

intermoleculares (con el receptor). Es decir, se puede esperar que diferentes

partes de cada molécula tengan diferentes tipos de interacción con sitios de un

receptor común y/o en un medio común. Esta forma particionada de la molécula se

denomina farmacóforo de interacción.

Los métodos QSAR-3D más utilizados son el método CoMFA

(Comparative Molecular Field Análisis)186 y el método GRID/GOLPE.187 La

principal diferencia entre estos métodos es el tipo de descriptores que usan: el

método CoMFA calcula dos tipos de campos de interacción molecular: estérico (un

potencial de Lennard Jones 12-6) y electrostático (potencial culómbico); el método

GRID/GOLPE permite calcular un campo para cada sonda química implementada

en el programa GRID,188 que utiliza aproximaciones de la mecánica molecular.

Antecedentes

39

7. 2. Diseño directo

La investigación sobre fármacos que se realiza en la actualidad, a diferencia

de la llevada a cabo hasta hace dos o tres décadas, tiene su punto de mira en los

receptores moleculares. El avance en muchas disciplinas ha hecho posible la

identificación de numerosas macromoléculas diana: fundamentalmente ácidos

nucleicos y proteínas. Entre los avances más importantes realizados en el campo

de la biología molecular se encuentra la posibilidad de producir cantidades

suficientes de proteínas purificadas o del aislamiento desde su fuente natural.

Esto, añadido al avance en las técnicas de determinación estructural, hace que

puedan ser utilizadas como dianas para el diseño de fármacos. Los modelos de

receptores generados por ordenador (métodos teóricos) también nos pueden

servir para el diseño directo, aunque estos modelos deben ser de buena calidad.

El análisis detallado de los complejos ligando-receptor muestra que los

ligandos suelen adaptarse a la forma del sitio de unión, haciendo uso extenso de

su contribución hidrofóbica para la unión e interaccionando mediante enlaces de

hidrógeno. Todas estas observaciones han conducido a un enriquecimiento del

conocimiento del modo de unión desde el punto de vista fisicoquímico.

Los sistemas biológicos se rigen por la asociación no covalente, pero

altamente específica de moléculas. La acción de las hormonas, el reconocimiento

de antígenos por el sistema inmune o el control de la transcripción de ADN son

claros ejemplos.

Debido a que los ligandos que utilizamos como fármacos son moléculas

orgánicas pequeñas y que éstos tienen modos de interacción con sus receptores

muy específicos, el conocimiento del proceso de reconocimiento molecular es de

vital importancia para poder abordar el diseño de nuevos fármacos. El empleo de

técnicas computacionales que nos permitan, no sólo reproducir los procesos de

reconocimiento molecular, sino entenderlos y estudiarlos para, posteriormente,

predecir el comportamiento de determinados ligandos en el seno de los sitios

activos de distintas proteínas, ha permitido un avance muy significativo en el

Antecedentes

40

campo del diseño molecular basado en la estructura, que en general representa

uno de los mayores retos de la química farmacéutica actual.

El diseño basado en la estructura se basa en el análisis de la

complementariedad de los ligandos con una macromolécula en términos de forma,

volumen y otras propiedades fisicoquímicas. El éxito de este análisis puede

proporcionar información sobre nuevas entidades químicas que sean capaces de

interaccionar con distintos receptores terapéuticos o nuevos usos para ligandos ya

conocidos para otros receptores. La primera consecuencia de un diseño basado

en la estructura asistido por ordenador es la reducción drástica del número y de la

magnitud de las pruebas biológicas. En su lugar sólo es necesario probar aquellos

compuestos más prometedores.

El Protein Data Bank (PDB)189 es una base de datos de estructura 3D de

proteínas y ácidos nucleicos que es de dominio público y puede ser usada

libremente (figura 7).

85,1

14,3

0,40,2

Rayos-X RMN Microscopía Electrónica Otros

Figura 7: Aproximadamente el 85% de las estructuras disponibles en el PDB han sido

determinadas por cristalografía de rayos X, 14% por RMN, alrededor del 0.4% por

microscopía electrónica y sólo el 0.2% se determinaron con otros métodos.

Estos datos son enviados por científicos de todo el mundo. Los métodos

experimentales principales de resolución de la estructura de macromoléculas y de

complejos ligando-receptor son la cristalografía de rayos X y RMN. Otros métodos

Antecedentes

41

experimentales menos utilizados incluyen la microscopía electrónica, la difracción

electrónica, la transferencia de fluorescencia y la tomografía electrónica.

Además, cuando no se dispone de la estructura experimental de la

macromolécula problema, aún se pueden utilizar métodos directos de diseño de

fármacos acudiendo a técnicas de modelado molecular. Con éstas se pretende

obtener un modelo teórico de la estructura de la macromolécula, que si bien en

ningún caso será una representación exacta, nos puede permitir explorar las

zonas de interés con una cierta confianza.190 Las técnicas de modelado de

proteínas abarcan: Métodos ab initio, de reconocimiento de plegamiento (fold

recognition)191 y modelado por homología, entre otros.

Dependiendo del tipo de información experimental de que se disponga, la

predicción del modo de unión de un nuevo ligando a su receptor se puede abordar

de diferentes maneras. Es posible que la estructura del receptor objeto de estudio

haya sido resuelta formando complejos con más de un ligando, lo que sería la

situación ideal para el estudio del modo de unión. En ese caso es posible procesar

la información sobre el modo de unión de cada uno de los compuestos para

alinear nuevos ligandos y así conocer su posición de acoplamiento en la proteína.

En los casos en los que únicamente se dispone de uno de estos complejos

resueltos, la información puede ser suficiente para conocer el sitio de unión de

nuevos ligandos. Si se dispone de datos experimentales suplementarios, como

pueden ser estudios de mutagénesis dirigida, es posible un acoplamiento manual

del ligando, con la ayuda de programas de modelado molecular.

Si otros datos experimentales adicionales no están disponibles, es posible

utilizar métodos automáticos para explorar los posibles modos de unión de nuevos

ligandos al receptor problema. Estos son los programas de docking (anglicismo

que se podría traducir por acoplamiento), los cuales realizan una exploración

exhaustiva de posiciones relativas ligando-receptor, evaluando las interacciones

intermoleculares en cada posición explorada. Como resultado de esta exploración

se obtiene una colección de posibles posiciones de acoplamiento ligando-proteína,

que el programa ordena según la puntuación que su función de evaluación le ha

dado a cada solución (scoring). Estos dos pasos consecutivos (exploración y

Antecedentes

42

evaluación) se han resuelto de muy diversas formas en los programas de docking

disponibles.

El programa AutoDock192 es un conjunto de herramientas de docking o

acoplamiento automático. Realmente consiste en dos programas principales:

AutoDock, que lleva a cabo el acoplamiento del ligando en un conjunto de mallas

tridimensionales o grids que describen la macromolécula y AutoGrid, que pre-

calcula dichos grids.

AutoDock hace uso de una técnica de simulación tipo Monte Carlo para

explorar el espacio conformacional y de un sistema de evaluación rápida de la

energía, usando potenciales de afinidad molecular basados en mallas

tridimensionales. Esto permite realizar con eficacia el estudio de un problema de

acoplar un sustrato flexible en el sitio de unión de un receptor rígido. De este

modo, partiendo de la especificación de la estructura tridimensional del receptor,

de la información acerca de la libertad de rotación de los enlaces del ligando y de

una conformación arbitraria de partida, el procedimiento permite realizar un

acoplamiento que puede considerarse altamente efectivo.

La malla tridimensional o grid consiste en un enrejado tridimensional de

puntos regularmente espaciados, envolviendo, completa o parcialmente, a la

macromolécula objeto de estudio (figura 8). Ésta puede ser una proteína, una

enzima, un anticuerpo, el ADN, el ARN, o incluso un polímero o un cristal iónico.

Normalmente, el espaciado de los puntos de la malla varía desde 0,2 Å a 1,0 Å.

Cada punto dentro del mapa de grid almacena la energía potencial experimentada

por un átomo “sonda” o grupo funcional, situado en el interior de cada celda de la

rejilla. Esta energía potencial se debe a la interacción con todos los demás átomos

de la macromolécula. A partir de estos supuestos se debe especificar un nivel de

número de puntos de enrejado en cada dimensión, nx, ny y nz. La energía de la

sonda en cada punto del enrejado se determina mediante el conjunto de

parámetros necesarios para este particular tipo de átomo y la suma de todos los

átomos de la macromolécula, dentro de un radio de no enlace y de todas las

interacciones recíprocas existentes.

Antecedentes

43

Figura 8: representación de una malla tridimensional o grid, los vértices de esta malla

están representados en color verde y está constituida por un conjunto de puntos (puntos

de grid) que se encuentran a una distancia regular los unos de los otros (espaciado o

grid spacing) (color violeta). En cada uno de estos puntos se coloca un átomo-sonda

(probe atom) (color azul).

Los mapas de grid se necesitan para aquellos tipos de átomos presentes en

el ligando que está siendo acoplado. Por ejemplo, si el ligando acoplado es un

hidrocarburo, entonces sólo se requieren mapas de grid de carbono e hidrógeno.

En la práctica, sin embargo, los hidrógenos no polares no se tienen en cuenta de

forma explícita, de tal modo que sólo sería necesario el mapa de enrejado del

carbono, para los átomos de carbono unidos entre sí. Esto ahorra tiempo de

cálculo y espacio en disco.

Las últimas versiones de AutoDock utilizan algoritmos genéticos que han

permitido afrontar, por un lado, el funcionamiento correcto con un sistema que

tenga más de ocho enlaces con libertad de rotación y, por otro, estimar si el

ligando se une con una constante de afinidad milimolar, micromolar o nanomolar.

La versión 3.0 de AutoDock192 ofrece varios algoritmos de búsqueda para

explorar un problema de docking dado: Monte Carlo Simulated Annealing (SA),

Algoritmo Genético (GA) y un algoritmo híbrido entre algoritmo genético y

búsqueda local, conocido como Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA). En

general, el método LGA proporciona mejores resultados en la búsqueda de la

energía más baja del sistema. Además, AutoDock incluye un campo de fuerzas de

Antecedentes

44

energía libre de enlace evaluado empíricamente, que permite la predicción de

energías libres de enlace y, en consecuencia, de constantes de asociación para

los ligandos acoplados.

7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening

El descubrimiento de compuestos activos para una diana terapéutica

representa un paso limitante en el proceso de descubrimiento de fármacos. Los

avances en la automatización y el desarrollo de los métodos bioanalíticos han

permitido la aplicación de técnicas HTS, que implica poder realizar ensayos

farmacológicos a millones de compuestos. Un ejemplo que ilustra claramente la

importancia de esta metodología es el hallazgo de oxadiazoles para el tratamiento

de la esquistosomiasis, recientemente publicado en Nature.193

A pesar de que el número de compuestos que pueden ser evaluados

mediante HTS es muy elevado, este número es muy pequeño en comparación con

el astronómico número de estructuras moleculares que podrían tener interés

biológico. Conforme el coste computacional ha disminuido, los investigadores han

dirigido sus esfuerzos a desarrollar métodos computacionales que realicen

cribados virtuales (virtual screenings o cribados in silico) de los compuestos con

potencial interés farmacológico.

Los métodos de cribado virtual deben desarrollarse basándose en un

algoritmo lo suficientemente rápido como para evaluar millones de compuestos

potenciales, pero manteniendo la suficiente precisión como para identificar

satisfactoriamente un subconjunto de compuestos entre los cuales se espera que

haya algún cabeza de serie. De acuerdo con estos requisitos, los métodos de

cribado basados en la estructura utilizan una representación muy simplificada de

las propiedades del receptor: un enrejado (grid) y una función de puntuación

empírica o semiempírica para estimar la fuerza de unión. La función de puntuación

(scoring function) puede variar mucho de unos programas a otros y es difícil

establecer la efectividad real de cada una de ellas.

Antecedentes

45

Para el cribado virtual se pueden utilizar bases de datos de compuestos

(quimiotecas) de dominio público, entre las que se encuentran la base de datos

ACD (Available Chemicals Directory)194, ZINC195, NCI (base de datos del NCI)196,

CSD (Cambridge Structural Database)197 y por supuesto quimiotecas disponibles

previo pago o colecciones privadas de compuestos.

Como el coste de realizar cribados virtuales es mucho menor y más rápido

que los métodos de HTS, pueden proporcionar la clave para limitar el número de

compuestos que hay que evaluar mediante HTS aumentando la eficacia del

proceso de descubrimiento de moléculas con interés farmacológico.

7. 2. 2. Dinámica Molecular

La dinámica molecular constituye una de las principales herramientas en el

estudio de la estructura, dinámica y termodinámica de macromoléculas biológicas.

Prueba de ello son los numerosos artículos científicos publicados hasta el año

2007 que hacen referencia a esta técnica (más de 60.000, algunos de ellos citados

más de 2.000 veces). Esta herramienta computacional calcula el comportamiento

de un sistema molecular a lo largo del tiempo. En este tiempo, es posible que

sucedan desde vibraciones de enlace o cambios conformacionales hasta

movimientos alostéricos, dependiendo del tiempo de integración que se utilice. En

todo caso, la dinámica molecular proporciona cambios en las posiciones de los

átomos de una manera dinámica.

La dinámica molecular se basa en la segunda ley de Newton del

movimiento. Integrando las ecuaciones de movimiento para cada átomo, se puede

obtener la trayectoria que viene definida por las posiciones, las velocidades y las

aceleraciones de los átomos a lo largo del tiempo de simulación.

La dinámica molecular es por tanto un método determinista, lo cual significa

que, una vez conocidas las posiciones y las velocidades de los átomos, es posible

predecir el estado del sistema en cada momento del futuro o del pasado. Las

Antecedentes

46

posiciones iniciales pueden ser obtenidas de la resolución de estructuras mediante

métodos experimentales, como se vio anteriormente.

Al conjunto de estados accesibles a una molécula se le denomina espacio

de fase. Se trata de un espacio 6N-dimensional, ya que el estado de un sistema

de N átomos queda definido al especificar las 3N coordenadas atómicas y los 3N

momentos.

Según la ecuación de la segunda ley de Newton:

iii amF =

donde Fi es la fuerza ejercida sobre el átomo i, y mi y ai son la masa y la

aceleración de ese átomo.

La fuerza sobre un átomo puede ser calculada a partir del cambio en la

energía potencial entre la posición actual y una posición cercana. Esto se conoce

como el gradiente de energía potencial U:

UF ii −∇=

Las energías potenciales pueden ser calculadas mediante el empleo de

métodos de mecánica molecular (MM) o mediante mecánica cuántica (QM). La

MM sólo se puede aplicar en aquellos casos en los que no se produzcan cambios

drásticos en la estructura electrónica, como puede ser la ruptura de un enlace. La

QM, sin embargo, sí puede ser utilizada en esas circunstancias.

Es posible predecir la posición de cada átomo a lo largo del tiempo

mediante el conocimiento de la fuerza y de la masa de cada uno de los átomos.

Para ello es necesario realizar la evaluación de las variables en intervalos muy

pequeños de tiempo (del orden de femtosegundos). El resultado de unir todos

estos pequeños intervalos de tiempo se llama trayectoria. En la práctica, las

trayectorias no se obtienen directamente de la ecuación de movimiento ya que

carece de solución analítica. En primer lugar se calculan las aceleraciones

mediante la resolución de la siguiente ecuación:

Antecedentes

47

2

2

dtrdm

drdU i

ii

=−

en el caso más sencillo donde la aceleración es constante:

dtdva i

i =

a partir de la integración de la ecuación, se calculan las velocidades:

0vtav ii +=

y así

dtdrv i

i =

las posiciones se pueden obtener de la integración de la ecuación anterior:

0rtvr ii +=

Combinando esta ecuación con la expresión de velocidad, se obtiene la

siguiente ecuación que relaciona la posición r a un tiempo t en función de la

aceleración a, la posición inicial r0 y la velocidad inicial v0:

002 rtvatr ++=

Por lo tanto, para calcular la trayectoria de un sistema molecular sólo se

necesitan las posiciones iniciales de los átomos, la distribución inicial de las

velocidades y la aceleración que se determina mediante el gradiente de la función

de energía potencial. Estos datos se obtienen de diferentes formas:

- La topología inicial del sistema se obtiene a partir de datos experimentales o

modelos teóricos.

- La distribución inicial de velocidades se suele obtener al azar mediante la

aplicación de una distribución de Maxwell-Boltzmann a la temperatura del

estudio.

- La energía cinética (K) se define en términos de momento de los átomos (p)

Antecedentes

48

∑=N

i

i

mppK

1

2

21)(

- La energía total del sistema (Hamiltoniano) es la suma de la energía

potencial y la cinética,

)()(),( rUpKprH +=

Se pueden calcular propiedades termodinámicas a partir de una simulación

de dinámica molecular. El valor instantáneo de temperatura se relaciona con la

energía cinética por medio del momento de los átomos según la siguiente

ecuación:

)3(221

2

NTkm

pK BN

i

i == ∑=

donde N es el número de átomos del sistema. Para un sistema aislado, el

momento de traslación total y el momento angular total están conservados y se les

puede asignar un valor cero mediante la elección de velocidades iniciales

apropiadas.

La energía potencial es función de la posición de todos los átomos (3N) del

sistema. Debido a la complejidad de este sistema, no existe una solución analítica

a la ecuación de movimiento y debe ser resuelta numéricamente.

Entre los algoritmos que resuelven numéricamente la ecuación de

movimiento se encuentran el de Verlet,198 leap-frog,199 un derivado de Verlet

conocido como Velocity-Verlet200 y el algoritmo de Beeman.201

Antecedentes

49

7. 2. 2. 1 Condiciones especiales de la dinámica molecular202

Utilización de restricciones

Los movimientos experimentados por una molécula flexible se pueden

distinguir por su frecuencia. Así, podemos hablar de movimientos que tienen lugar

con muy alta frecuencia, como las vibraciones de enlace y de movimientos que

tienen lugar con baja frecuencia, como pueden ser los cambios conformacionales

importantes. Como se ha descrito anteriormente, la evaluación de la posición de

los átomos no se realiza de forma continua, sino que se realiza a determinados

intervalos de tiempo.

Estos intervalos de tiempo pueden ser mayores o menores y no existe un

intervalo ideal ya que depende bastante del tipo de información que deseemos

obtener. Si el intervalo de tiempo es muy pequeño, la trayectoria no recogerá

información de la mayoría del espacio multidimensional aunque nos proporcionará

gran información sobre las vibraciones de enlace. Si el intervalo de tiempo es muy

grande, existe la posibilidad de que surjan errores al integrar el algoritmo, ya que

durante el tiempo entre una integración y la siguiente podrían haberse producido

movimientos de los átomos que violen la ecuación de movimiento, lo que se

reflejaría en un error matemático que detendría la simulación. Normalmente, en el

caso de los sistemas moleculares, se suele escoger como tiempo de integración la

décima parte del tiempo que tarda en realizarse el movimiento más rápido. El

movimiento más frecuente es el del alejamiento-acercamiento del enlace,

especialmente aquél que implica un hidrógeno cuyo período de vibración es de 10

fs, por lo que se suele escoger un intervalo de tiempo de 1 fs.

El coste computacional es mayor cuanto menor sea el intervalo de tiempo

de integración. En el caso de que no sea crucial el conocimiento de los

movimientos de vibración de los enlaces, es posible constreñir éstos a un valor de

equilibrio sin afectar al resto de grados de libertad del sistema, lo cual permite

Antecedentes

50

aumentar el intervalo de tiempo de integración y por tanto reducir el coste

computacional.

Una constricción o restricción es un requerimiento que el sistema debe

cumplir. Es posible constreñir enlaces, ángulos, etc., de tal manera que se fuerza

al sistema a adoptar los valores específicos de esa constricción a lo largo de la

simulación.

Se han desarrollado algoritmos que permiten constreñir movimientos, lo

cual aumenta la velocidad de la simulación. El más conocido es SHAKE,203 que se

aplica al final de cada paso y que se encarga de poner todos los enlaces en sus

respectivos valores de equilibrio permitiendo utilizar intervalos de tiempo de

integración superiores (en torno a 2 fs). SHAKE puede ser utilizado para constreñir

distancias de enlace, ángulos de enlace y diedros, aunque esto puede llevar a

disminuir los posibles cambios conformacionales.

Control de la presión y de la temperatura

Las dinámicas moleculares a temperatura constante introducen un término

λ para ajustar las velocidades y mantener el sistema a la temperatura deseada. El

sistema está acoplado a un baño externo que es el encargado de mantener

constante la temperatura, proporcionando calor o extrayendo calor del sistema.204

21

1)(

1 ⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−+=

tTTt o

τδλ

Los métodos para ajustar la presión a un valor constante funcionan de

manera similar. En este caso se acopla un baño de presión que es análogo al

baño de temperatura y se escala el volumen de la caja de simulación por el factor

λ, que en este caso corresponderá a:

))((1 0PtPt

p

−−=τδλ

Antecedentes

51

Condiciones de límite periódico (Periodic Boundary Conditions, PBC)

Las condiciones de límite periódico surgen como solución al problema de

las fuerzas que experimentan los átomos alojados en los extremos terminales de

la caja de simulación (normalmente una caja de disolvente), ya que estos átomos,

al estar en el límite de la caja, no experimentan las mismas fuerzas que el resto de

los átomos que sí están rodeados de otros átomos en todas las direcciones.

Las condiciones de límite periódico hacen que un sistema se comporte

como si estuviera replicado N veces en el espacio en idénticas celdas formando

una red periódica, en la que cada una de estas celdas es un sistema periódico

simple. Las coordenadas de las partículas que se encuentran en las celdas

replicadas se relacionan directamente con las partículas de la celda original

mediante simple translación. Las fuerzas que experimentan las partículas de la

celda original son calculadas con las partículas de esa misma celda y lo mismo

pasa con las celdas imagen. Si una partícula sale de una celda durante la

simulación se reemplaza por una partícula de una imagen que entra en la celda

por el lado opuesto.

El empleo de las condiciones de límite periódico proporciona una manera

efectiva y rápida de solucionar el problema de los extremos de la caja de

simulación, aunque entran en juego nuevos problemas, como el cálculo de las

fuerzas de largo alcance, que pueden traspasar el límite de la caja y hacer

necesario tener en cuenta las celdas replicadas. Las fuerzas de largo alcance sólo

pueden ser correctamente calculadas mediante la suma de las réplicas del

sistema original. Sin embargo, esto supone un esfuerzo computacional muy

importante por lo que se han desarrollado algunos métodos para poder resolver

este problema, como el del sumatorio de Ewald205 o el fast multipole method

(FMM).206

Antecedentes

52

Distancia de corte (Cut-off)

La cantidad de información que se debe procesar en el cálculo de una

trayectoria de dinámica molecular puede llegar a ser abrumadora. Por ello se

utilizan distancias de corte (cut-off) que permiten reducir el espacio de cálculo

definiendo la distancia máxima a la cual se tienen en cuenta las interacciones

entre átomos. Más allá de esta distancia, las interacciones se desprecian. Esta

aproximación es particularmente interesante en cuanto al cálculo de las

interacciones no enlazantes se refiere, ya que están consideradas como la parte

más costosa desde el punto de vista computacional.

La utilización de un cut-off para las interacciones no enlazantes está

generalmente aceptado para las interacciones de tipo van der Waals, ya que éstas

tienden rápidamente a cero a medida que la distancia entre átomos es mayor. Sin

embargo, en el caso de las interacciones iónicas de átomos cargados, la

dependencia respecto de la distancia es mucho menor que en el caso anterior, por

lo que el empleo de la distancia de corte no es completamente correcto.

El método de Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 corrige este problema

relacionado con las interacciones electrostáticas. PME transforma el cálculo de

sumatoria de todas las interacciones electrostáticas posibles en otros dos términos

de convergencia mucho más rápida:

0EEeEeE recdirele ++=

donde Eedir se refiere al espacio directo, Eerec se refiere al espacio recíproco y E0 es

una constante.

Cuando se utiliza este método, las interacciones de rango corto o de

espacio directo son calculadas mediante un potencial culómbico modificado,

mientras que el resto de las interacciones o de espacio recíproco son calculadas a

través del sumatorio de vectores. En el cálculo del espacio directo se utilizan

distribuciones gaussianas para representar las cargas originales, que hacen

converger el término más rápidamente que en su forma original. Dichas

Antecedentes

53

distribuciones son posteriormente contrarrestadas mediante distribuciones

gaussianas de carga inversa en el cálculo del espacio recíproco. En el método

PME se optimiza el cálculo del espacio recíproco a través de la transformación

mediante interpolación de las cargas puntuales a mallas tridimensionales. Dichas

mallas son posteriormente tratadas mediante transformadas de Fourier, las cuales

reducen notablemente el coste computacional.

Tratamiento del disolvente. El agua como disolvente

El agua influye profundamente en la mayor parte de los fenómenos

bioquímicos y la unión de los ligandos a sus receptores no es una excepción. El

disolvente acuoso juega un papel clave en la determinación de la preferencia

conformacional de los ligandos y sus receptores, a la vez que modula las fuerzas

de unión que experimentan entre sí. El efecto hidrofóbico que gobierna muchas de

las interacciones fármaco-receptor es una consecuencia directa de interacciones

desfavorables de solutos no polares en medio acuoso, por este motivo es esencial

tener en cuenta los efectos de solvatación para poder predecir cuantitativamente

las afinidades de unión.

Se han desarrollado numerosos métodos para modelar los efectos del

disolvente, tanto para pequeñas moléculas como para macromoléculas, utilizando

desde modelos de solvente continuo, pasando por la inclusión de moléculas de

disolvente hasta la utilización de métodos híbridos.208, 209 Estas técnicas han sido

desarrolladas tanto para estudios de mecánica molecular como para mecánica

cuántica.

La energía de solvatación se define como la diferencia entre el coste

energético necesario para crear una cavidad en el disolvente y la energía que se

libera debido a las interacciones atractivas de dispersión y electrostáticas que se

producen entre el disolvente y el soluto. Las fuerzas electrostáticas se refuerzan

debido a la polarización tanto en el soluto como en el disolvente. La entropía

también juega un papel importante en cuanto a que el disolvente alrededor del

Antecedentes

54

soluto puede estar más ordenado que si se trata el disolvente en bruto. El

disolvente también reduce la interacción intramolecular de las cargas del soluto y

por lo tanto, puede alterar la preferencia conformacional del soluto.

Debido al coste computacional, las simulaciones con solvente explícito se

llevan a cabo normalmente empleando métodos de mecánica molecular. Los

efectos de la polarización debidos al disolvente se pueden mimetizar mediante el

uso de modelos de solvatación continuos por inclusión de un campo de reacción.

Estos modelos se utilizan tanto en MM como en QM. Los métodos híbridos

consisten en que la primera esfera de solvatación está modelada mediante

moléculas de disolvente explícito, mientras que el resto del disolvente se trata

como modelo continuo. Los métodos que mimetizan adecuadamente la

polarización del soluto pueden ser estudiados únicamente mediante QM.

Disolvente explícito

La inclusión de solvente de forma explícita, de manera que se trata a nivel

atómico, es una de las formas más exactas, pero también más costosas

computacionalmente. En la mayor parte de los casos, se tratan en condiciones

periódicas de contorno (PBC): la molécula de soluto se sitúa en el centro de la

celda y el espacio vacío en ella se rellena con moléculas de solvente. En este

caso, AMBER210 realiza el tratamiento de las interacciones de largo alcance con el

método de sumas de Ewald.

Otra forma de solvatar explícitamente consiste en rodear la molécula con

una capa (cap) de moléculas de solvente y sin tratamiento de condiciones

periódicas de contorno. En este caso, el número de moléculas de agua requeridas

es menor que en PBC, por lo que resulta más asequible computacionalmente que

la solvatación explícita periódica. Para prevenir la evaporación de las aguas en el

límite solvente-vacío, se aplican stochastic boundary conditions mediante la

restricción de un potencial harmónico.

Antecedentes

55

En la versión de AMBER 8210 se ha implementado un modelo alternativo

de solvatación para el tratamiento de esta capa de aguas respecto a versiones

anteriores de AMBER. Así, se incluye una corrección para el campo de reacción

de las aguas que están situadas tras la capa (cap), calculado mediante el método

de diferencias finitas de Poisson-Boltzmann. No se trata de un modelo de

solvatación implícito, como los que se presentan posteriormente, ya que no trata la

generalidad del sistema mediante este modelo.

Las regiones interiores al radio de la capa de aguas (soluto + solvente

explícito) se detallan a nivel atómico y el resto se trata como un medio continuo.

Se destaca que en versiones anteriores de AMBER, se permitía la inclusión de

una cap de aguas que solvatase parcialmente el sistema (normalmente la región

activa). En AMBER 8,210 la esfera de aguas ha de englobar a todo el soluto ya que

modela como un continuo todo aquello más allá del radio de la capa.

Disolvente implícito

La descripción exacta del entorno acuoso puede resultar

computacionalmente cara: la solvatación explícita de una proteína de tamaño

medio requiere miles de moléculas de agua.

Actualmente, la alternativa de reemplazar estas aguas discretas por un

sistema “virtual” de aguas está cobrando gran popularidad. Consiste en modelar

un medio infinito continuo con las propiedades dieléctricas e hidrofóbicas del agua.

Esto es lo que hacen los modelos de solvente implícito, basados en la teoría

clásica de Poisson-Boltzmann (PB). En ellos, el soluto se detalla a nivel atómico,

mientras que las moléculas de solvente y posibles electrolitos se tratan como un

continuo sin estructura, caracterizado por una constante dieléctrica del solvente

(εs). En el interior de la cavidad del soluto, la constante dieléctrica toma valores

característicos de proteínas (εint=2-8) o 1.

Aparte del coste computacional más reducido, estos modelos implícitos

presentan una serie de ventajas frente a la representación explícita del agua,

Antecedentes

56

como evitar el equilibrado del sistema (temperatura y presión); el soluto puede

explorar más rápidamente el espacio de fases debido a la ausencia de viscosidad

asociada a los modelos explícitos; se modela la solvatación en un volumen infinito,

evitándose artefactos del sistema periódico y se facilita la estimación de energías

de estructuras solvatadas. Sin embargo, se pierde también la posibilidad de

analizar interacciones estructurales soluto-solvente, como la formación de enlaces

de hidrógeno.

7. 2. 2. 2. Cálculo de la afinidad de unión Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area (MM-GBSA) Molecular Mechanics-Poisson Boltzman Surface Area (MM-PBSA)

MM-PBSA y MM-GBSA son métodos para evaluar energías libres de unión

o para calcular energías libres absolutas de moléculas en solución.

Las energías son evaluadas de acuerdo a una estrategia desarrollada por

Srinivassan, Kollman y Massova.211, 212 Están basadas en mecánica estadística y

contiene los distintos términos fisicoquímicos que intervienen en el proceso de

unión de un ligando a una proteína, fenómeno esquematizado en la Figura 9.

+

Figura 9: Esquema de unión de un ligando y proteína, con el desordenamiento de

aguas que produce el efecto hidrofóbico.

Inicialmente, la proteína y el ligando se hayan solvatados por moléculas de

agua. Tras la unión, las interacciones intermoleculares no enlazantes (suponiendo

que no hay unión covalente), estabilizan el complejo. El cambio entrópico asociado

al proceso es debido a la reducción de libertad conformacional del ligando (supone

∆G

Antecedentes

57

una reducción de entropía) y por el denominado efecto hidrofóbico producido por

el desordenamiento de las moléculas de agua, inicialmente ordenadas en torno al

ligando y receptor, contribuyendo positivamente al cambio entrópico.

Termodinámicamente, corresponde a la siguiente ecuación donde las

interacciones intermoleculares establecen la variación entálpica.

∆Gbind = GC – (GR + GL)

donde C, R y L son complejo, receptor y ligando.

El objetivo fundamental del método MM-PBSA/GBSA es calcular la

diferencia de energía entre dos estados:

R (aq) + L (aq) C (aq)

R (vac) + L (vac) C (vac)

∆GRsolv ∆GL

solv ∆GCsolv

∆Gbind,vac

∆Gbind,solv

El método combina mecánica molecular, el modelo Poisson-Bolzmann

para las interacciones electrostáticas en el caso de PBSA y la ecuación

generalizada de Born en GBSA, cálculos de área de la superficie accesible al

disolvente y análisis de modo normal para la entropía. La energía libre de unión es

expresada como:

∆Gbind, solv = ∆Gunión, vacío + ∆GC solv – (∆GL

solv + ∆GR solv)

donde ∆Gbind, solv es la energía libre de unión, ∆Gbind, vacío es la energía libre de

asociación entre proteína y ligando en fase gaseosa y ∆GC solv, ∆GL

solv y ∆GR solv

Antecedentes

58

corresponden a las energías libres de solvatación de complejo, ligando y receptor,

respectivamente. Además:

∆Gbind, vacío = ∆GMM - T∆S

donde ∆GMM es la diferencia de energías de enlace, ángulo, ángulo diedro,

electrostática y de van der Waals entre productos (complejo) y reactivos (ligando y

receptor) calculadas con el campo de fuerzas de AMBER. La energía libre de

solvatación está compuesta por dos términos, uno electrostático y otro no polar:

∆GMM = ∆GvdW + ∆Gelec + ∆GINT

∆G solv = ∆Gsolv pol + ∆G np

El término electrostático supone la contribución más importante, debido a

la fuerza de las interacciones soluto-solvente. Este término no sólo incluye estas

interacciones, sino también el trabajo necesario para generar el campo de

reacción del solvente inducido por la distribución de cargas del soluto. ∆Gsolv pol

equivale a la mitad de la energía de interacción soluto-solvente. Esta contribución

electrostática se evalúa a partir de modelos continuos del solvente: bien a partir de

la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann mediante el método de

diferencias finitas (el método se denomina MM-PBSA)213 o mediante un modelo

Generalizado de Born (MM-GBSA).214 En teoría, los resultados obtenidos por MM-

GBSA ó MM-PBSA son similares, aunque el modelo generalizado de Born es más

rápido.

El término de interacciones no-polares es proporcional al área de la

superficie accesible al disolvente (solvent accesible surface area, SA),215 que

describe el área sobre la cual se produce contacto ligando–proteína, según la

ecuación:

∆Gsolv np = γSASA + β

Antecedentes

59

donde la tensión superficial γ y el término independiente β se fijaron en 0.005 kcal

mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con PB y 0.0072 kcal

mol–1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con GB. La superficie

accesible se determina a partir de la posición del centro de una sonda esférica

(que representa una molécula de solvente, de radio 1.4 Å) que rueda sobre la

superficie de van der Waals de la proteína. Incrementando el valor de los radios de

van der Waals por el radio de la sonda, se obtienen los radios denominados

expandidos (expanded atom radii).

Capítulo I Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales

I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo

Objetivos y Plan de Trabajo

61

I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo

Desde el descubrimiento inicial de la AM por Kitamura y cols.1 se han

publicado un gran número de trabajos describiendo su mecanismo de acción y su

gran potencial como diana terapéutica. Los datos de que se dispone hasta el

momento parecen indicar que el control de los niveles de AM con moduladores

negativos podría tener importantes efectos en el tratamiento de diversas

enfermedades.

De especial interés para nosotros es su relación con el cáncer. Se ha

demostrado que la AM estimula el crecimiento celular, es un agente angiogénico

(estimula la vascularización en tejidos tumorales) y un inhibidor de la apoptosis.

El objetivo de este trabajo es la búsqueda de compuestos de bajo peso

molecular, capaces de ejercer un control negativo sobre los niveles de AM y que,

como consecuencia, puedan presentar actividad antiangiogénica y/o antitumoral.

El estudio es totalmente original y novedoso, ya que hasta el momento los únicos

compuestos no peptídicos con conocida afinidad por la AM y capaces de regular

sus funciones son los detectados en el cribado realizado en el NCI, que

constituyen el punto de partida de la investigación que se lleva a cabo en nuestro

grupo de trabajo en esta área.

De entre los diez compuestos que han demostrado interaccionar con la

AM actuando como moduladores negativos (figura 5), para este trabajo hemos


62

elegido el ácido 1, como cabeza de serie para llevar a cabo la síntesis y

evaluación biológica de una serie de moduladores negativos de la AM. Ello nos

permitirá establecer la relación estructura actividad de este tipo de compuestos y

proponer nuevas estructuras con mayor afinidad y actividad biológica.

Concretamente, nos hemos propuesto la síntesis y evaluación biológica de

dos series de compuestos. Una de ellas consiste en derivados de piperazinas de

tipo A donde R es un grupo etilo o bencilo. La otra serie de compuestos

relacionados son las piperazinas de tipo B, donde se ha eliminado el centro

estereogénico y se ha aumentado la variedad estructural del radical R (figura 10).

HO

N

OCH3

O

RN

HOOH

OAr

R

Tipo A Tipo B

H

+Cl-N

HOOH

OPh

1

H

+Cl-

Figura 10: Compuesto 1 y estructuras químicas de los derivados de

piperazinas de tipo A y B

I. 1. 1. Síntesis

En primer lugar nos planteamos poner a punto rutas de síntesis que

permitieran acceder a los derivados propuestos, utilizando métodos

convencionales. Una vez optimizados los procedimientos, se pretende diseñar

quimiotecas de tamaño pequeño utilizando técnicas combinatorias de síntesis en

paralelo. Con ello se pretendía obtener de forma rápida compuestos con una gran

variedad estructural y establecer la relación estructura-actividad para cada una de

las series.


63

I. 1. 2. Ensayo de competición

La determinación de la actividad biológica se ha estructurado en varias

etapas. En primer lugar, la evaluación de la habilidad de los compuestos

sintetizados para competir por la unión a la AM con su anticuerpo monoclonal. El

ensayo de competición con su anticuerpo ha sido desarrollado por miembros de

nuestro grupo de investigación179 y permite evaluar simultáneamente y de forma

sencilla un gran número de compuestos, entre ellos las colecciones de

compuestos que se obtengan utilizando técnicas de síntesis combinatoria.

I. 1. 3. Resonancia de Plasma en Superficie y QSAR-3D

Otro de los objetivos de este trabajo es el estudio de la capacidad de los

compuestos para unirse a la AM utilizando la técnica de Resonancia de Plasma en

Superficie (SPR) y con los datos obtenidos llevar a cabo un estudio QSAR-3D.

I. 1. 4. Producción de segundos mensajeros

Con el fin de comprobar que los compuestos sintetizados se comportan

como moduladores negativos de AM, nos hemos propuesto determinar la

producción de segundos mensajeros, mediante un radioinmunoensayo que

permite detectar los niveles intracelulares de AMPc. Cuando la AM se une a su

receptor se produce una elevación de los niveles de AMPc intracelulares, el cual

actúa como segundo mensajero. Para asegurar que los nuevos compuestos son

moduladores negativos de la acción de la AM, se expone la línea celular Rat2 (que

contiene los receptores específicos de la AM) a una mezcla formada por 100 nM

de AM (como agonista) más uno de los compuestos. La disminución de los niveles

de AMPc se analiza mediante un radioinmunoensayo comercial.179


64

I. 1. 5. Ensayos de proliferación celular

Finalmente nos proponemos evaluar la actividad antiproliferativa en

células tumorales de los compuestos que, con las técnicas anteriores, se muestren

como potenciales moduladores negativos. Las células tumorales serán

suministradas por el grupo de investigación del Dr. Alfredo Martínez (Consejo

Superior de Investigaciones Científicas, Instituto Cajal) y se mantendrán en cultivo

en su laboratorio. Para evaluar la capacidad antiproliferativa de los compuestos,

las células se sembrarán en placas de 96 pocillos y se expondrán a los

compuestos. Al final del experimento el número de células se evaluará mediante

las técnicas de MTT o tiñéndolas con sulforrodamina. Por otra parte, el grupo de

investigación del Dr. Manuel Hidalgo del Centro Integral Oncológico Clara Campal

(CIOCC), Hospital de Madrid, se hará cargo de evaluar la actividad antiproliferativa

en otras líneas celulares.

I. 2. Discusión de Resultados

65

I. 2. Discusión de Resultados

I. 2. 1. Síntesis

En este apartado se describe síntesis de una serie de compuestos

derivados del compuesto 1. Como ya se mencionó anteriormente, este compuesto

constituye el cabeza de serie elegido para, mediante modificaciones estructurales,

conseguir pequeñas quimiotecas de una variedad estructural tal que permitan

establecer relaciones estructura-actividad.

La síntesis de los derivados de piperazina de tipo A se recoge en el

esquema 1. En esta serie se ha sustituido el anillo bencénico por otros sistemas

con grupos atrayentes y donadores de electrones en distintas posiciones.

Asimismo se ha sustituido el anillo bencénico por tiofeno y naftaleno.

N

HOOH

OPh

1

H

+Cl-

66

También, aprovechando la disponibilidad de otra piperidona comercial, se

han preparado análogos de los compuestos anteriores con piperidonas N-bencil

sustituidas. Para la síntesis de todos estos compuestos se ha utilizado el método

descrito por Blicke y Zinnes216 para la síntesis de 1, en la que se hace reaccionar

el ácido fenilacético con N-etil-4-piperidona o N-bencil-4-piperidona en presencia

de iPrMgCl como base.

ArOH

O N

O

RCl

-NR

HOAr

COOH

H+

(a)

1- 24

+

1: Ar = Ph; R = CH3CH22: Ar = Ph; R = PhCH23: Ar = p-Br-Ph; R = CH3CH24: Ar = m-CH3-Ph; R = CH3CH25: Ar = m-HO-Ph; R = CH3CH26: Ar = m-Br-Ph; R = CH3CH27: Ar = p-Br-Ph; R = PhCH28: Ar = m-Br-Ph; R = PhCH2

9: Ar = p-CH3-Ph; R = CH3CH210: Ar = p-CH3-Ph; R = PhCH211: Ar = m-CH3-Ph; R = PhCH212: Ar = m-HO-Ph; R = PhCH213: Ar = 2-tienil; R' = CH3CH214: Ar = 2-tienil; R' = PhCH215: Ar = 1-naftil; R' = CH3CH216: Ar = 1-naftil; R' = PhCH2

Esquema 1. Reactivos (a) iPrMgCl, tolueno

La reacción se completó con rendimientos moderados para todos los

derivados propuestos. Sin embargo, la dificultad del procedimiento se centró en la

purificación de los productos obtenidos, ya que se trata de sales muy polares que

no fue posible someter a cromatografía en columna sobre gel de sílice o alúmina.

La purificación se basó en efectuar extracciones sucesivas en caliente con

nitrometano, a fin de separar las impurezas insolubles de los productos solubles

en este disolvente en caliente. Este método fue adecuado para aislar los

67

compuestos 1-5 y 13-16 con una pureza suficiente para obtener microanálisis

correctos.

En otros casos (compuestos 6-12) resultó útil tratar la sal inicialmente

formada con óxido de propileno en etanol a reflujo para liberar el grupo amino y

volver a formar el hidrocloruro tratando el residuo con HCl/AcOEt.217 Sin embargo,

aunque el procedimiento conduce a compuestos aparentemente puros por RMN 1H y 13C, en algunos casos no se obtienen con suficiente pureza como para

conseguir microanálisis correctos. También se intentaron, sin éxito, otros métodos

de purificación como recristalización, resinas de intercambio iónico y cromatografía

en columna.

Para solucionar este problema se intentó poner a punto un método que

permitiese obtener los ácidos puros por hidrólisis de los ésteres correspondientes.

Éstos deberían ser fáciles de obtener en una reacción de Reformatsky a partir del

α-bromo éster y la piperidona correspondientes. Sin embargo, al llevar a cabo la

reacción de Reformatsky partiendo de bromofenilacetato de metilo y N-etil-4-

piperidona no se obtuvo el α-hidroxiéster 17, sino que se recuperaron los

compuestos de partida inalterados.

N

HOOCH3

O

17

NR

HOOCH3

O

18 : R=COCH319 : R=Boc

NBoc

HOAr

COOH

20

Una alternativa a la reacción de Reformatsky consiste en la formación del

enolato del éster con una base fuerte218 (LICA suele ser la base de elección en

68

estos casos), y posterior adición de la cetona. De esta forma se consiguió obtener

el éster (17) con un 12% de rendimiento.

Desafortunadamente, cuando la reacción se intentó extender a otros

ésteres arilsustituídos o a la N-acetil-4-piperidona (para la síntesis de 18) o N-Boc-

4-piperidona (para la síntesis de 19), no se consiguió aislar los productos

deseados, por lo que esta vía no fue útil para ampliar la sustitución de nuestros

sistemas en estas posiciones.

La N-Boc-4-piperidona es un compuesto comercial y su utilización en este

tipo de reacciones tiene la ventaja de que, por eliminación posterior del grupo terc-

butoxicarbonilo, seguido de alquilación o acilación de la amina formada, se podría

acceder a una gran variedad de compuestos diferentemente sustituidos en el

átomo de nitrógeno. Puesto que la reacción con LICA no tuvo éxito, se intentó

obtener el ácido 20 por reacción del ácido fenilacético con N-Boc-4-piperidona en

las condiciones habituales. Sin embargo tampoco en este caso la reacción tuvo

éxito.

Para la síntesis de los derivados de tipo B decidimos partir de isobutirato

de metilo, para el cual están descritas varias reacciones de condensación con

distintas cicloalcanonas en presencia de LICA y que transcurren con rendimientos

excelentes.218

El isobutirato de metilo se hizo reaccionar con N-Boc-4-piperidona y la

reacción transcurrió con un alto rendimiento (87%) obteniéndose el N-Boc-

derivado 21 (esquema 2). En este caso se trata de un compuesto neutro fácil de

aislar y purificar. La posterior desprotección del grupo amino se realizó

burbujeando HCl (g) a través de una solución en AcOEt enfriada a 0 ºC. Esta

reacción transcurrió con un 75% de rendimiento y resultó mucho más eficaz que la

desprotección con ácido trifluoroacético (33%) que se había ensayado

previamente. El cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio

(22) obtenido es un intermedio clave para la obtención de una serie de ésteres con

una amplia variedad de sustituyentes en el átomo de N. Así, el compuesto 22 pudo

alquilarse de manera sencilla y con buenos rendimientos utilizando el bromuro de

69

alquilo correspondiente y K2CO3, en periodos que van desde las 6 a 24 horas

(esquema 2).

El compuesto dibencilado 34 se obtuvo aplicando el mismo procedimiento

a partir de 22 y bromuro de bencilo, pero utilizando 2 equivalentes del haluro y

empleando un tiempo de reacción mucho mayor que para la formación de 24.

OCH3

O

NBoc

HOOCH3

O

NH2

HOOCH3

O

+

NR

HOOCH3

O

Cl-

(c)

21 22

(a)

(d)

23-33

23: R = CH2=CH-CH224: R = PhCH225: R = p-NO2PhCH226: R = (CH2)2CHCH227: R = p-Cl PhCH228: R = p-CF3PhCH229: R = HOCH2CH230: R = (CH3CH2)2NCH2CH231: R = p-CH3OPhCH232: R = CH3OCH2CH2

(b)

33: R = HC C CH2

Esquema 2. Reactivos (a) LICA, THF, -78 ºC; (b) N-Boc-4-piperidona THF, -78 ºC; (c)

HCl (g), AcOEt, 0 ºC; (d) R-Br, K2CO3, DMF, TA.

La evaluación biológica de esta nueva serie de ésteres nos puede dar una

idea de la implicación del grupo carboxilo en la unión a la AM. Por otro lado, nos

puede dar información sobre la influencia de la sustitución en el átomo de

nitrógeno sobre la actividad biológica, que puede estudiarse a través de los

70

propios ésteres si éstos resultan activos, o a través de los ácidos que pueden

obtenerse por hidrólisis de los mismos.

Otra ventaja que presentan estos nuevos sistemas es que se ha eliminado

el centro estereogénico presente en la serie de compuestos 1-17, que puede

complicar la evaluación biológica, ya que en caso de que la actividad antitumoral

sea interesante, será necesario resolver la mezcla racémica y evaluar cada uno de

los enantiómeros por separado.

Los derivados 35 y 36 se sintetizaron por reacción directa del isobutirato

de metilo con N-etil-4-piperidona y N-benzoil-4-piperidona, respectivamente, ya

que estos reactivos son comerciales.

N

HOOH

O

34

Ph

Ph

NR

HOOCH3

O

35: R = CH2CH336: R = PhCO

N

HOOH

O

37

Para conseguir un compuesto de la serie con la función ácido carboxílico

libre se realizó la hidrólisis de 35 en medio básico (NaOH 0.5 M) y THF como

disolvente para dar el ácido 37.

También se ha preparado el 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato

de metilo (38), análogo al compuesto 35, en el que se ha sustituido el anillo de

piperidina por un ciclohexano y el ácido 39 procedente de su hidrólisis (Esquema

3). Estos compuestos, junto con la amida 36, pueden aportar datos sobre la

importancia de la presencia de un nitrógeno básico sobre la actividad biológica.

71

OCH3

O HOOCH3

O

38

(a)

(b)

(c) HOOH

O

39

(d)

Esquema 3. Reactivos (a) LICA, THF, -78 ºC; (b) 4-etilciclohexanona, THF, -78 ºC; (c)

NaOH, THF, ∆; (d) HCl 10%.

I. 2. 2. Actividad Biológica I. 2. 2. 1. Evaluación del porcentaje de competición

El primer ensayo que se llevó a cabo fue un experimento de competición

con el anticuerpo monoclonal de la AM. A través de este ensayo se evaluó

cualitativamente la afinidad de los diferentes compuestos sintetizados, estimando

la habilidad de los mismos para interferir en la unión entre la AM y su anticuerpo

monoclonal, siguiendo la misma metodología descrita por Martínez y cols.179, 219

Un anticuerpo monoclonal neutralizante es capaz de unirse a un epítopo

del péptido, crítico para reconocimiento del receptor. Aquellas moléculas capaces

de interrumpir la unión péptido-anticuerpo podrían ser buenos candidatos como

moduladores de la acción biológica del péptido.

El fundamento del mismo se representa en la figura 11. En una placa de

96 pocillos en la que se ha adsorbido AM se añaden los compuestos a ensayar.

Después de 1 hora se agrega el anticuerpo monoclonal de AM (AcαAM) marcado

con peroxidada, manteniendo el sistema a temperatura ambiente durante una hora

más. El anticuerpo marcado se unirá a la AM en las posiciones en las que consiga

desplazar a los compuestos. Después de lavar, se agrega el sustrato de la

peroxidasa (dihidrocloruro de o-fenilendiamina), de forma que la reacción

72

AcαAM marcado

Sustrato

color

AM AM AM AM AM Base del pocillo

color

colorimétrica que tiene lugar es directamente proporcional a la unión del

anticuerpo marcado con la AM, e inversamente proporcional a la unión del

compuesto a la AM. Un compuesto de alta afinidad bloqueará la unión del

anticuerpo con la AM de modo que no habrá generación de color y la absorbancia

registrada será baja. Por el contrario, compuestos que posean poca afinidad por la

AM producirán un registro de absorbancia mayor.

Figura 11: Fundamento del método empleado en la evaluación del porcentaje de

competición con el anticuerpo monoclonal de AM.

Las placas se organizan de manera que haya lugares concretos para los

controles internos de inhibición negativos (0% de afinidad, no se adicionan

antagonistas potenciales), controles internos de inhibición positivos (100% de

afinidad, se adiciona anticuerpo no marcado) y también pocillos sin AM que se

utilizan para determinar uniones no específicas.

Los compuestos se colocan en cada placa por duplicado y a su vez cada

placa se realiza por duplicado. Los controles internos positivos (que a su vez son

negativos de inhibición) son útiles para definir el máximo de absorbancia. Y los

controles internos positivos de inhibición son útiles para verificar que el ensayo ha

transcurrido normalmente, puesto que una inhibición positiva se traduce en una

disminución de color.

73

Los valores de absorbancia nos permiten calcular valores del porcentaje

de competición, que resultan útiles para evaluar de forma cualitativa el

comportamiento de cada compuesto frente a la AM.

A pesar de que el compuesto 1 pertenecía a los 121 compuestos capaces

de interferir significativamente en la unión de la AM y el anticuerpo según los datos

publicados,179 en nuestras manos mostró una muy modesta reducción de la

absorbancia. Sin embargo, las modificaciones estructurales sobre el compuesto

han conducido a un aumento de la afinidad en once casos (compuestos 5, 13, 16,

21, 22, 24, 25, 30, 33, 34 y 35) como puede observarse en las tablas 3, 4 y 5.

Debe tenerse en cuenta que las variaciones estructurales propuestas no

son tan drásticas como para esperar grandes variaciones en los registros de

absorbancia. Sin embargo, los resultados parecen indicar que la presencia del

grupo carboxilo no es imprescindible para la unión con la AM, como se observa

para los compuestos de tipo B. Tampoco la eliminación del centro estereogénico

parece afectar a la afinidad.

comp Ar R % A±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b] % AMPc±SD[c]

1 Ph CH3CH2 99.2 ± 5.6 3.1 ± 1.5 73.1 ± 6.9 (***)

3 p-Br-Ph CH3CH2 106.4 ± 0.0 n.u.

5 m-HO-Ph CH3CH2 85.4 ± 17.8 8.3 ± 1.3 78.1 ± 2.4 (**)

13 2-tienil CH3CH2 94.1 ± 5.0 92.1 agr. 93.2 ± 8.9 (ns)

14 2-tienil PhCH2 102.3 ± 1.8 19.0 79.9 ± 3.8 (**)

15 1-naftil CH3CH2 105.4± 7.8 2.8 ± 0.3 97.0 ± 6.4 (ns)

16 1-naftil PhCH2 92.1 ± 0.0 14.4 ± 2.4 84.3 ± 6.4 (*)

Tabla 3: Estructura química y datos biológicos de piperazinas de tipo A. [a] % Absorbancia en

ensayo de competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con compuestos

en solución 200 µM; n.u., no existe unión; agr., probablemente agregado; [c] % de la

producción de AMPc evaluado con AMPc [125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no

significativa; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.

74

comp R % A±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b] % cAMP±SD[c]

21 Boc 93.0 ± 1.5 n. u.

22 H 92.5 ± 4.6 2.4

23 alil 103.9 ± 4.9 1.5 ± 0.7

24 PhCH2 91.1 ± 8.5 4.9 ± 2.3 122.4 ± 3.2 (*)

25 p-NO2-PhCH2 88.1 ± 11.9 6.6 ± 1.4

28 p-CF3-PhCH2 100.7 ± 2.1 3.5 ± 1.7 118.2 ± 5.2 (*)

29 HOCH2CH2 106.8 ± 2.8 n. u.

30 (CH3CH2)2NCH2CH2 96.4 ± 4.9 1.1 ± 0.1 89.9 ± 5.1 (*)

31 p- CH3O-PhCH2 105.5 ± 9.0 7.6 ± 1.4 104.2 ± 0.6 (ns)

33 propargil 99.1 ± 7.6 2.2

35 CH3CH2 94.4 ± 1.7 n.u. 92.5 ± 5.1 (ns)

36 PhCO 109.4 ± 5.3 n.u.

Tabla 4: Estructura química y datos biológicos de piperazinas de tipo B. [a] % Absorbancia

en ensayo de competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con

compuestos en solución 200 µM; n.u., no existe unión; [c] % de la producción de AMPc

evaluado con cAMP [125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no significativa; *, P<0.05;

**, P<0.01; ***, P<0.001.

75

comp estructura % A ±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b]

% AMPc±SD[c]

34 N

HOCOOCH3

Ph Ph

Cl-+

97.6 ± 7.7 11.4 112.4 ± 4.1 (*)

39

HOCOOH

111.5 ± 8.2 n.u.

Tabla 5: Estructura química y datos biológicos de 34 y 39. [a] % Absorbancia en ensayo de

competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con compuestos en

solución 200 µM; n.u., no existe unión; [c] % de la producción de AMPc evaluado con cAMP

[125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no significativa; *, P<0.05; **, P<0.01; ***,

P<0.001.

Los resultados obtenidos en este ensayo preliminar sugieren la necesidad

de aplicar una técnica más sensible como la Resonancia de Plasma en Superficie

(SPR), que permite realizar una evaluación cuantitativa de la unión de nuestros

compuestos con la AM.

I. 2. 2. 2. Resonancia de Plasma en Superficie

Para establecer inequívocamente la caracterización de la unión entre AM y

los compuestos sintetizados se llevó a cabo un estudio utilizando la técnica de

SPR con la tecnología Biacore. La AM se inmovilizó covalentemente sobre la

superficie de un sensor sCM5 cubierto por una matriz de dextrano. Los distintos

compuestos o analitos se inyectaron sobre la superficie con un flujo continuo. El

cambio en el índice de refracción, que está relacionado con la acumulación de

masa en la superficie del sensor, se registra en función del tiempo. Las curvas de

interacción resultantes se denominan sensorgramas y su análisis matemático

76

permite caracterizar cuantitativamente las interacciones moleculares: parámetros

cinéticos y de afinidad, constantes de unión, estequiometría, concentración activa,

etc. La unión de las pequeñas moléculas fue medida en unidades de respuesta

relativa (RU) que dependen de la masa del compuesto unido a la AM inmovilizada.

En la figura 12 se recogen las curvas SPR para dos compuestos que no se unen a

la AM (3, 39), un compuesto con una respuesta moderada (15) y uno de los

compuestos con mayor afinidad (16). El efecto en los dos últimos casos es dosis

dependiente.

Las tablas 3, 4 y 5 resumen la respuesta en equilibrio a una concentración

200 µM para todos los compuestos, normalizadas ajustándolas respecto al peso

molecular (RU*100/PM). El valor RU (3.1 ± 1.5) para el compuesto 1 indica que

posee una afinidad moderada por la AM. Este resultado está de acuerdo con la

baja afinidad observada en el experimento de competición por el anticuerpo

monoclonal mencionado anteriormente, pero no concuerda con la afinidad

previamente descrita para este compuesto (Ka = 1.30 x 108 ± 1.57 x 107).179 Sin

embargo, lo más interesante de este estudio es que las modificaciones

estructurales realizadas sobre el compuesto cabeza de serie nos han permitido

obtener compuestos con mayor afinidad por la AM, tales como los compuestos 5,

14, 16, 31 y 34 que muestran valores de RU entre dos y tres veces más altos que

el compuesto 1.

En este punto es importante resaltar que los compuestos capaces de

interferir en la unión entre la AM y su anticuerpo monoclonal deben unirse en una

región específica del péptido que es crítica para el reconocimiento del receptor.

Por ello, un resultado negativo en este ensayo no tiene por qué dar lugar a

resultados negativos en experimentos de SPR, puesto que el ligando podría unirse

a una región diferente del péptido. Este podría ser el caso del compuesto 31 que,

de acuerdo con el ensayo de competencia preliminar, no se une a la AM, mientras

que la respuesta en SPR indica que sí existe unión.

77

Figura 12: Curvas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s

para los compuestos 39 (a), 3 (b), 15 (c) y 16 (d) a diferentes

concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM) sobre AM.

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150

Tim e s

RU

Res

pons

e

a.

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 tiempo (s)

5 4 3 2 1 0

-1 -2 -3 -4 -5

Res

pues

ta (R

U)

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150

Tim e s

RU

Res

pons

e

b.

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130

5 4 3 2 1 0

-1 -2 -3 -4 -5

Res

pues

ta (R

U)

tiempo (s)

Res

pues

ta (R

U)

-5

-3

-1

1

3

5

7

9

11

13

15

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150

Tim e s

RU

Res

pons

e

c. 15

13 11 9 7 5 3 1

-1 -3 -5

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150

Tim e s

RU

Res

pons

e

-50 -10 10 30 50 70 90 110 130 15tiempo (s)

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 15tiempo (s)

15 13 11 9 7 5 3 1

-1 -3 -5

Res

pues

ta (R

U)

d.

78

Las medidas de SPR fueron realizadas por la Dra. Danièle Altschuh, la

Dra. Laurence Choulier y la Dra. Sonsoles Martín-Santamaría en el Laboratorio de

Biotecnología de Interacciones Moleculares, Escuela Superior de Biotecnología de

Estrasburgo (Francia).

I. 2. 2. 3. Estudios QSAR- 3D

Con el objetivo de racionalizar los resultados obtenidos en SPR se llevó a

cabo un estudio QSAR-3D. Esta metodología nos permitió estudiar cuáles son las

características estructurales que los compuestos deben poseer para ser capaces

de unirse a la AM. Los resultados obtenidos son útiles para el diseño de análogos

más afines.

El modelo QSAR-3D se derivó empleando el programa Almond 3.3.0220

utilizando descriptores independientes de alineamiento (GRIND).221 Para este

estudio se eligieron 4 sondas GRID:188 DRY (representa interacciones

hidrofóbicas), O (oxígeno de carbonilo sp2 como aceptor de enlaces de H), N1 (NH

de tipo amida, como donador de enlace de H) y la sonda TIP (como descriptor de

la forma molecular). Usando estas cuatro sondas se obtuvo una matriz de 500

variables con 13 objetos y 10 correlogramas de 50 variables cada uno. Para

reducir el número de variables se llevó a cabo un diseño factorial fraccional (FFD)

implementado por Almond. Se usaron los valores que por defecto sugiere el

programa. El análisis de mínimos cuadrados parciales (PLS) dio lugar a un modelo

con tres variables latentes con un r2 = 0.93. La validación cruzada del modelo para

3 PCs se llevó a cabo usando el método leave-one-out (LOO), grupos aleatorios y

el método leave-two-out generando valores de q2 de 0.82, 0.79 y 0.76,

respectivamente.

La calidad del modelo obtenido se evaluó con la predicción de la unión del

compuesto 28, que no estaba incluido en el conjunto de entrenamiento. El valor

79

que predijo el modelo fue similar al valor obtenido experimentalmente. En la figura

13 se muestra el gráfico representando los valores experimentales frente a los

valores calculados para la unión con la AM.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Respuesta Experimental (RU)

Pred

icci

ón d

e la

Res

pues

ta (R

U)

1

315

2233

3023

15

25

34 16

14

24

28

Figura 13: Representación gráfica de la respuesta experimental (RU) en SPR frente a los

valores obtenidos con el modelo predictivo. El compuesto 28 se representa en color rojo.

La inspección de los correlogramas DRY-DRY y DRY-O mostró

claramente que la intensidad de la interacción se correlaciona con la unión (figura

14). Las variables representan pares de nodos a aquellas distancias a las que las

sondas DRY y O presentan interacciones favorables. Las interacciones más

fuertes (colores rojo y magenta en la figura 14) corresponden a los compuestos 14

y 16, que pertenecen a la serie de tipo A (R = PhCH2) y poseen un anillo

aromático en el Cα. Este residuo probablemente interaccione con un bolsillo

hidrofóbico en el receptor, hecho que concuerda con las interacciones favorables

80

con la sonda DRY. Por otra parte, estos compuestos poseen un grupo hidroxilo

que podría estar actuando como un donador de enlaces de hidrógeno en su

interacción con el receptor, característica que concuerda con las interacciones

favorables que poseen estos compuestos con la sonda O. Es importante indicar

que estos mismos rasgos habían sido identificados como relevantes para la unión

con la AM en el modelo QSAR-3D derivado para los moduladores positivos.180

Figura 14: Superposición de correlogramas DRY-DRY y DRY-O (representan las

interacciones con las regiones hidrofóbicas de los ligandos (DRY-DRY)).

En cuanto a los derivados de tipo B, ninguno de ellos mostró una fuerte

afinidad por la AM (todos los valores de RU son inferiores a 10), sugiriendo que la

presencia del anillo aromático en el Cα es favorable para la unión con el péptido.

DRY-DRY DRY-O

Prod

ucto

de

ener

gías

de

inte

racc

ión

DRY-DRY DRY-O

Prod

ucto

de

ener

gías

de

inte

racc

ión

81

Sin embargo, el éster 34, con un patrón de sustitución similar en el Cα pero con un

segundo grupo bencilo unido al N de la piperazina, mostró un valor de RU de 11.4.

El grupo bencilo adicional podría compensar la ausencia del anillo aromático en el

Cα, aunque la presencia de la carga positiva sobre el átomo de nitrógeno podría

contribuir también a aumentar su afinidad.

La figura 15 muestra las relaciones geométricas entre algunas regiones de

interacción favorable con la sonda DRY (amarillo) y algunas regiones de

interacción favorable con la sonda O (rojo), identificando posibles bolsillos donde

las interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno son favorables para la

unión.

Es importante mencionar que la inclusión de las variables de los

correlogramas TIP mejora considerablemente la calidad del modelo, hecho que

confirma la importancia de la descripción de la forma en los modelos QSAR-3D.

Figura 15: Interacciones presentes en el compuesto 16. Las superficies representan las

interacciones con la sonda DRY (amarillo) y la sonda O (rojo).

82

En el futuro se diseñarán compuestos con grupos complementarios

dirigidos a los posibles bolsillos capaces de mejorar las interacciones favorables.

Por ejemplo, cuando el compuesto 40, se introduce en el modelo QSAR-3D, éste

predice para dicha molécula un RU = 14.11. Su síntesis es sencilla siguiendo el

método que hemos usado hasta ahora, es decir la condensación del ácido 2-

(benzo[b]tiofen-3-il) acético con N-bencil piperidona. El ácido 2-(benzo[b]tiofen-3-il)

acético se puede obtener por hidrólisis del nitrilo correspondiente que es

comercial.

N

HOOH

O

S

40

I. 2. 2. 4. Análisis de segundos mensajeros

El hecho de que algunas moléculas pequeñas sean capaces de unirse a la

AM no significa que sean capaces de modular su acción. Esta característica puede

ser evaluada a través de la determinación de la producción de AMPc, un segundo

mensajero intracelular, en células Rat2. La línea celular Rat2 contiene receptores

específicos para la AM y reacciona frente a ella elevando su contenido de AMPc

intracelular.55 Esta línea celular fue proporcionada por el American Tissue Culture

Collection (Manassas, VA).

El estudio se llevó a cabo con un grupo de compuestos seleccionados y

consta de dos etapas. En la primera etapa se prepararon dos placas de 24 pocillos

83

con células confluentes Rat2 y a continuación se añadieron bacitracina y 3-

isobutil-1-metilxantina (IBMX). La bacitracina actúa como un inhibidor de proteasas

y el IBMX es un inhibidor de la fosfodiesterasa que, por tanto, evita la degradación

del AMPc. Se incubaron las células durante 15 minutos a 37 ºC en esta solución. A

continuación, se añadieron los compuestos a caracterizar a una concentración tal

que la concentración final fue 100 nM. Como control positivo se utilizó forskolina,

que es un potente activador de proteínas G. Se dejó actuar a los compuestos

durante 5 minutos a 37 ºC y a continuación se detuvo la reacción colocando la

placa en hielo. Se añadió etanol absoluto frío y se extrajo la suspensión de células

de cada pocillo. Cada una de ellas constituye una muestra a evaluar en el

radioinmunoensayo.

El radioinmunoensayo para el AMPc se realizó siguiendo el protocolo del

kit RPA 509 de Biotrack (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).20 El sistema

utiliza como trazador AMPc marcado con 125I, junto con un antisuero altamente

específico y sensible. El ensayo se basa en la competición entre el AMPc no

marcado y una cantidad fija de AMPc marcado con 125I por un número limitado de

sitios en el anticuerpo específico. Si las cantidades de anticuerpo y ligando

radioactivo están fijas, la cantidad de ligando radioactivo unido al anticuerpo será

inversamente proporcional a la concentración de AMPc presente en las muestras

analizadas.

libre

[125I ] AMPc

AMPc

+ Anticuerpo

unido

[125I ] AMPc - Anticuerpo

AMPc - Anticuerpo

El anticuerpo unido al AMPc se hizo reaccionar después con un anticuerpo

secundario que está unido a partículas de polímeros magnetizables (Amerlex-M).

La separación de la fracción unida al anticuerpo se efectuó por centrifugación de la

84

suspensión del Amerlex-M. Esta es la fracción que se midió en el contador de

radioactividad.

Los resultados se resumen en las tablas 3, 4 y 5. Todos los ácidos

carboxílicos (compuestos de tipo A y 39), reducen los niveles de AMPc, en

concordancia con la función de moduladores negativos esperada. En ausencia de

AM ninguno de los compuestos mostró respuesta alguna.

Sorprendentemente, todos los ésteres sometidos a este ensayo

produjeron un aumento de los niveles de AMPc, comportándose como

moduladores positivos. Estos hechos sugieren que la presencia del ácido

carboxílico es esencial para la acción como modulador negativo. Sin embargo,

existen otros rasgos estructurales, como la ausencia del grupo arilo en el Cα, que

también podrían tener influencia en este cambio de comportamiento. Para

descartar esta posibilidad se sintetizó y analizó el éster metílico del compuesto 1.

Se observó que aunque el éster 17 mantiene su afinidad por la AM en el ensayo

de competición con el anticuerpo monoclonal (%A = 78.1 ± 3.7), se comporta

como un modulador positivo aumentando los niveles de AMPc hasta 116.8 ± 1.3.

Una conclusión similar puede obtenerse por comparación del éster 35 y el ácido

correspondiente 37 cuyos registros de AMPc son 92.5 ± 5.1 (ns) y 71.35 ± 4.4

(***) respectivamente.


Como parte de la evaluación biológica del compuesto 16, también se

realizó el ensayo de proliferación en una variedad de líneas celulares (T47D,

CT2A, A549 y H1299). La línea T47D se compone de células de cáncer de mama

que expresan bajos niveles basales de AM. Esto permite saturar los sitios activos

del péptido trabajando a muy bajas concentraciones de las moléculas a estudiar.

Con el fin de complementar y ampliar los resultados con esta línea celular, se

trabajó con las otras tres líneas celulares tumorales que se encontraban

disponibles en el laboratorio. Con este ensayo pretendíamos observar si los

85

compuestos sintetizados alteraban la proliferación celular, esto es, si inhibían el

crecimiento celular.

El ensayo consistió en la incubación de un número determinado de células

por pocillo junto con el compuesto a ensayar a una concentración de 1 µM. Se

utilizaron para ello placas de 96 pocillos. Al cabo de 5 días de incubación,

aplicando una técnica de tinción que utiliza sulforrodamina B, se midió el grado de

proliferación alcanzado.

También como método colorimétrico para determinar el número de células

viables en el ensayo de proliferación se utilizó el kit comercial CellTiter 96® AQueous

One Soluction Cell Proliferation Assay.

La medida se realizó por octuplicado y en todos los casos se utilizó

doxiciclina como control positivo, ya que se trata de un potente inhibidor de la

proliferación celular. Además, se incluyeron en cada placa una columna sin células

(blanco) y una columna con células, pero sin compuesto de prueba (control

negativo).

Con ninguna de estas cuatro líneas celulares se observaron resultados

prometedores. Por otra parte, en el Centro Integral Oncológico Clara Campal del

Hospital de Madrid, se probó 16 en otras cuatro líneas celulares: L3.6-pl

(células de tumor de páncreas humano),222 Panc-1 (células de tumor de

páncreas humano),223 HCT-116 (células de cáncer de colon humano)224 y HT29

(células de cáncer de colon humano).225 Solamente en el caso de las líneas

celulares HCT-116 y HT29 se obtuvieron resultados interesantes. El

compuesto 16 se probó en un rango de concentración 0.1 a 10 µM y los

resultados se resumen en la figura 16 .

En éstas dos líneas celulares, 16 fue capaz de inhibir la proliferación

celular y de forma dosis dependiente. En el caso de la línea celular HCT-116 la

inhibición es mucho más acusada que la que realiza el control, mientras que

para la línea celular HT29, aunque la inhibición de la proliferación celular es

modesta, el resultado es interesante puesto que se trata de una línea celular

86

muy resistente. Es por ello que el compuesto 16 ha sido seleccionado para ser

sometido a ensayos de actividad in vivo, que se llevarán a cabo en el Hospital

de Madrid.

HCT-116

0

20

40

60

80

100

120

5FU VR24

Prol

ifera

ción

(%)

0.1 uL 1.0 uL 10.0 uL

HT29

0

20

40

60

80

100

120

5FU VR24

Prol

ifera

ción

(%)

0.1 uL 1.0 uL 10.0 uL

Figura 16: Porcentaje de proliferación celular en presencia del compuesto 16 comparado con 5-fluorouracilo en

las líneas celulares de cáncer de colon HCT-116 y HT29 a las concentraciones of 0.1, 1 y 10 µM.

I. 3. Conclusiones

Conclusiones

89

I. 3. Conclusiones

Se sintetizó una serie de compuestos estructuralmente relacionados con el

cloruro de 4-[carboxi(fenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (1), compuesto que fue

detectado como modulador negativo de AM en el cribado farmacológico previo de

una parte de la colección de moléculas del NCI.

Se evaluó la afinidad por AM de los compuestos sintetizados utilizando el

ensayo de competición en la unión de la AM con su anticuerpo monoclonal. Si bien

el compuesto 1 mostró una muy modesta reducción de la absorbancia, muchos de

los compuestos sintetizados mejoraron este comportamiento.

Se llevó a cabo un estudio más profundo evaluando cuantitativamente la

capacidad de los compuestos para unirse a la AM con técnicas de Resonancia de

Plasma en Superficie. Los datos obtenidos mostraron que los compuestos 5, 14,

16, 31 y 34 poseen una mayor afinidad por la AM que el compuesto 1.

Un estudio QSAR-3D permitió la identificación de ciertos rasgos

estructurales que podrían ser claves para la unión de las moléculas a la AM, como

son la presencia de un dador de enlaces de H y un anillo aromático. El modelo

obtenido resulta valioso para el diseño de nuevos derivados con mayor afinidad.

Se evaluó la habilidad de los compuestos para modificar los niveles

intracelulares de AMPc en células Rat2, a través de su unión a la AM. Esta última

Conclusiones

90

determinación mostró que la presencia de un grupo ácido carboxílico libre es

esencial para obtener moduladores negativos de la AM como potenciales agentes

antiangiogénicos y antitumorales.

Finalmente, el compuesto con mayor afinidad por la AM (16), de acuerdo a

los datos proporcionados por SPR, fue seleccionado para estudiar su actividad

antiproliferativa en varias líneas celulares. Este compuesto mostró una interesante

actividad antiproliferativa en dos líneas celulares de cáncer de colon (HCT-116 y

HT29) muy resistentes a otros agentes como el 5-fluorouracilo, por lo que ha sido

elegido para llevar a cabo estudios in vivo.

I. 4. Parte Experimental

Parte Experimental

91

I. 4. Parte Experimental

I. 4. 1. Materiales y Métodos

I. 4. 1. 1. Métodos generales de síntesis

Las reacciones sensibles al aire se realizaron bajo atmósfera de argon.

Los reactivos líquidos se transfirieron utilizando jeringas y cánulas, a través de

septos.

La purificación de los crudos de reacción se llevó a cabo por cromatografía

en columna, utilizando gel de sílice Merck 230-240 mesh con el eluyente indicado

en cada caso. El análisis de los productos de reacción se realizó por cromatografía

en capa fina (Kiesegel 60F-254). Para el revelado de las mismas se utilizó luz UV

(λ = 254 nm), yodo y/o ácido fosfomolíbdico.

Los espectros de RMN 1H, y 13C fueron registrados en un espectrómetro

Brucker-AC-300. La multiplicidad de las señales en el RMN 1H se da como sigue: s

= singlete, sa = singlete ancho, t = triplete, m = multiplete, d = doblete, c =

cuadruplete, dd = doblete de doblete, td = triplete de dobletes, da = doblete ancho,

etc. Los valores de las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hz. Los

valores de los desplazamientos químicos (δ) se dan en partes por millón (ppm),

utilizando TMS como referencia interna. En los espectros de RMN 13C se utilizó

Parte Experimental

92

como referencia el CDCl3, DMSO-d6, o CD3OD en su señal central (77.0, 39.7, 49.0

ppm, respectivamente).

Los espectros de IR se realizaron en un espectrofotómetro Perkin- Elmer

1330 y se dan en cm-1. Los puntos de fusión se determinaron en un tubo capilar

abierto en un aparato Stuart Scientific SMP3.

Los espectros de masas (EM) de impacto electrónico (IE) se registraron en

el Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad San Pablo-CEU, en un

espectrómetro ESQUIRE 3000 de Brucker Daltonics, provisto de fuente de

ionización APCI/ESI, dependiendo de las características del compuesto, y trampa

iónica.

Los análisis elementales (C, H, N) se llevaron a cabo en el servicio de

Microanálisis de la Universidad Complutense de Madrid con un analizador

elemental LECO CHNS-932.

I.4. 1. 2. Actividad biológica

Se propuso un protocolo de ensayo que permitió evaluar cómo influyen los

compuestos sintetizados, posibles moduladores negativos, en la interacción de la

AM con sus receptores.

Se realizaron cuatro tipos de experimentos: a) estudio de competición con

el fin de determinar cualitativamente el grado de interacción que existe entre las

moléculas de la serie y la AM; b) Resonancia de Plasma en Superficie; c) estudio

de la producción de segundos mensajeros; d) ensayos de proliferación celular.

Para la primera fase, se recubrió con AM el fondo de una placa de 96

pocillos y a continuación se agregaron los compuestos. Al añadir un anticuerpo

monoclonal marcado, éste compite con los compuestos y se une a la AM. La

cantidad de anticuerpo que se une a la AM puede ser cuantificada por un método

colorimétrico después de eliminar el anticuerpo no unido mediante lavados de la

placa.

Parte Experimental

93

En el segundo experimento se determina la habilidad de los compuestos

sintetizados para unirse a la AM a través de la Resonancia de Plasma en

Superficie (SPR).

El tercer experimento consiste en la evaluación de las moléculas

sintetizadas como moduladores negativos o positivos de la AM. Para ello se

realiza un ensayo de segundos mensajeros, como el AMPc, cuyo nivel intracelular

se determina mediante técnicas de radioinmunoensayo.

Finalmente, los compuestos con mayor actividad se sometieron a ensayos

de proliferación celular.

Equipos

Para las medidas de absorbancia en los ensayos de proliferación se utilizó

un espectrofotómetro Titertek Multiskan PLUS.

En el radioinmunoensayo para las medidas de radioactividad se utilizó un

contador Gamma 1470 WizardTM.

Los estudios de SPR se llevaron a cabo en un aparato Biacore T100 (GE

Healthcare Biacore, Uppsala, Sweden).

Líneas celulares

Para los ensayos biológicos de los compuestos se utilizaron varias líneas

celulares:

Rat2: • Características: Fibroblastos de rata, con receptores específicos para la AM.55

• Procedencia: Instituto Cajal (CSIC)

Parte Experimental

94

T47D118 • Características: Células de cáncer de mama, que expresan bajos niveles basales

de AM y que han sido utilizadas en ensayos de apoptosis y proliferación.


CT2A226 • Características: células de astrocitoma de ratón


A549227 y H1299228 • Características: células no pequeñas de carcinoma de pulmón


L3.6-pl222

• Características: células de tumor de páncreas humano

• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid

Panc-1223

• Características: células de tumor de páncreas humano


HCT-116224 • Características: células de cáncer de colon humano

• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid HT29225 • Características: células de cáncer de colon humano


Parte Experimental

95

Reactivos químicos e inmunológicos

Se utilizó AM humana sintética procedente de los laboratorios Bachem.

El anticuerpo monoclonal MoAbG6 fue proporcionado por los doctores

Alfredo Martínez y Frank Cuttitta, de la Cell and Cancer Biology Branch, NCI

(Bethesda, MD).

Parte Experimental

96

I. 4. 2. Síntesis

I. 4. 2. 1. Síntesis de cloruros de 4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio

Método general

A una disolución de cloruro de isopropilmagnesio (2M, 3 equivalentes) en

Et2O se adiciona bajo atmósfera de argon, una disolución del correspondiente

ácido (1.5 equivalentes) en tolueno anhidro. La mezcla de reacción resultante se

calienta a reflujo durante 24 h. A continuación, se añade una disolución de la

correspondiente piperidona (1 equivalente) en benceno anhidro vía cánula. La

suspensión resultante se calienta a reflujo hasta que se observa la total

desaparición de los compuestos de partida por cromatografía en capa fina. Una

vez enfriado, el crudo de reacción se vierte sobre una mezcla hielo/HCl

concentrado. Se reserva la fase acuosa y la fase orgánica se extrae tres veces

con una disolución acuosa de HCl al 10 %. Las fases acuosas combinadas se

lavan con Et2O y se elimina el agua a presión reducida. El sólido obtenido se

suspende en nitrometano y se refluye durante 30 minutos. Una vez filtrada la

disolución en caliente se repite el procedimiento (3 veces) refluyendo el residuo

con nitrometano. Finalmente se elimina el disolvente bajo presión reducida

obteniéndose los ácidos correspondientes en forma de hidrocloruros.

Parte Experimental

97

Método general de purificación de hidrocloruros.

A una disolución de cada uno de los hidrocloruros (1 equivalente) en EtOH

absoluto, se adiciona óxido de propileno en exceso. La mezcla de reacción se

agita a temperatura ambiente durante 24 h y el sólido obtenido se filtra a vacío y

se lava con EtOH absoluto. Al ácido libre en AcOEt se adiciona una disolución de AcOEt saturada con

HCl (g). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 h, y el

sólido obtenido se filtra a vacío y se lava con AcOEt.

Parte Experimental

98

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(fenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (1)

A partir de ácido fenilacético (2.00 g, 15 mmol) en tolueno (20

mL), N-etil-4-piperidona (1.27 g, 10 mmol) en tolueno (20 mL)

y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30 mmol) se obtuvo 1

(2.42 g, 81%) como un sólido marrón claro; p.f. 80-85 ºC; IR:

νmax = 1690, 3400; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.31 (t, J =

7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.84-2.16 (m, 4 H, 2CH2), 3.09-3.43 (m, 6

H, 2NCH2 y CH2CH3), 3.72 (s, 1 H, CH), 7.30-7.37 (m, 3 H,

ArH), 7.43-7.46 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 9.7, 32.6, 34.0,

53.1, 61.4, 69.5, 128.9, 129.4, 131.0, 135.8, 175.6; análisis elemental calc (%)

para C15H22ClNO3: C 60.10, H 7.40, N 4.67; encontrado C 60.32, H 7.25, N 4.33.

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (2)

A partir de ácido fenilacético (2.00 g, 15 mmol) en tolueno

(20 mL), N-bencil-4-piperidona (1.89 g, 10 mmol) en tolueno

(20 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30 mmol)

se obtuvo 2 (0.89 g, 25%) como un aceite marrón; IR: νmax

= 1690, 3350; EM (IE): m/z 326 [M]+; RMN 1H (300 MHz;

DMSO-d6): δ = 1.65-1.99 (m, 4 H, 2CH2), 3.13 (sa, 4 H,

2NCH2), 3.65 (s, 1 H, CH), 3.65 (d, J = 4.9 Hz, 2 H,

CH2Ph), 7.31-7.53 (m, 8 H, ArH), 7.63 (sa, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 21.2, 47.3, 58.9, 68.2, 70.0, 127.5, 128.2, 128.8,

129.8, 129.9, 131.0, 131.5, 135.0, 173.1; análisis elemental calc (%) para

C20H24ClNO3: C 64.84, H 6.81, N 3.78; encontrado: C 64.79, H 6.83, N 3.75.

N

HO

OH

O

HCl

N

HO

OH

O

HCl

Parte Experimental

99

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(p-bromofenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (3)

A partir de ácido (4-bromofenil)acético (1.00 g, 5 mmol) en

tolueno (11 mL), N-etil-4-piperidona (0.38 g, 3 mmol) en tolueno

(4 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol) se obtuvo

3 (0.75 g, 66%) como un sólido amarillento; p.f. 80-82 ºC; IR: νmax

= 1720, 3400; EM (IE): m/z 344 [M+2]+, 342 [M]+; RMN 1H (300

MHz; DMSO-d6): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.81-2.13 (m,

4 H, 2CH2), 3.13 (c, J = 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.19-3.43 (m, 4 H,

2NCH2), 3.71 (s, 1 H, CH), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, ArH), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2 H,

ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.0, 31.0, 31.5, 47.0, 50.8, 60.0, 120.8,

130.9, 132.1, 134.5, 172.7; análisis elemental calc (%) para C15H21BrClNO3: C

45.41, H 5.84, N 3.53; encontrado: C 45.72, H 5.56, N 3.50.

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-metilfenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (4)

A partir de ácido (3-metilfenil)acético (1.00 g, 7 mmol) en

benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.56 g, 5 mmol) en tolueno

(7 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13 mmol) se

obtuvo 4 (0.80 g, 58%) como un sólido marrón; p.f. 82-85 ºC; IR:

νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 278 [M]+; RMN 1H (300 MHz;

CD3OD): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.79-2.11 (m, 4 H,

2CH2), 2.34 (s, 3 H, CH3), 3.09-3.42 (m, 6 H, 2NCH2 y CH2CH3),

3.68 (s, 1 H, CH), 7.14-7.15 (m, 1 H, ArH), 7.21-7.26 (m, 3 H, ArH); RMN 13C (75.4

MHz; DMSO-d6): δ = 9.0, 21.1, 30.8, 31.8, 47.0, 50.8, 60.7, 127.0, 127.9, 128.0,

130.5, 134.9, 137.0, 173.2.

N

HO

OH

O

HCl

N

HO

OH

O

HCl

Br

Parte Experimental

100

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-hidroxifenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (5)

A partir de ácido (3-hidroxifenil)acético (1.50 g, 10 mmol) en

benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.84 g, 7 mmol) en

benceno (8 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 22

mmol) se obtuvo 5 (0.44 g, 25%) como un aceite amarillo; IR

νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 280 [M]+; RMN 1H (300 MHz;

CD3OD): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.87-2.07 (m, 4 H,

2CH2), 3.12 (c, J = 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.29-3.31 (m, 4 H, 2NCH2), 3.64 (s, 1 H,

CH), 6.72-6.75 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 6.85-6.91 (m, 2 H, ArH), 7.15 (t, J = 7.9

Hz, 1 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 31.0, 47.1, 50.9, 56.0,


para C15H22ClNO4: C 57.05, H 7.02, N 4.44; encontrado: C 57.17, H 7.00, N 4.37.

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-bromofenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (6)


benceno (8 mL), N-etil-4-piperidona (0.38 g, 3 mmol) en

benceno (7 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol)

y después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1,

se obtuvo 6 (0.44 g, 40%) como un aceite marrón; IR: νmax =

1720, 3320; EM (IE): m/z 344 [M+2]+, 342 [M]+; RMN 1H (300

MHz; DMSO-d6): δ = 1.19 (m, 3 H, CH3), 1.70-2.04 (m, 4 H,

2CH2), 3.00-3.04 (m, 4 H, 2NCH2), 3.25-3.32 (m, 2 H, CH2CH3), 3.70 (s, 1 H, CH),

7.31 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, Ar H), 7.43 (d, J = 7.3 Hz, 1H, Ar H), 7.51 (d, J = 7.9 Hz, 1

H, ArH), 7.66 (s, 1 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 30.8, 31.1,

56.1, 60.1, 68.2, 121.3, 129.2, 130.2, 130.3, 132.5, 137.8, 172.6.

N

HO

OH

O

HCl

Br

N

HO

OH

O

HCl

OH

Parte Experimental

101

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(p-bromofenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (7)


benceno (6 mL), N-bencil-4-piperidona (0.57 g, 3 mmol) en

benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol),

después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1, se obtuvo 7 (0.14 g, 13%) como un sólido blanco; p.f. > 160 ºC

dec; IR: νmax = 1720, 3340; EM (IE): m/z 406 [M+2]+, 404 [M]+;

RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.64-2.02 (m, 4 H, 2CH2),

3.11 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.65 (s, 1 H, CH), 4.25 (s, 2 H, 2CH2Ph),

7.35-7.44 (m, 5 H, ArH), 7.52-7.55 (m, 4 H, ArH); RMN 13C (75.4

MHz; DMSO-d6): δ = 30.5, 47.2, 58.6, 60.1, 68.1, 120.8, 128.8, 129.5, 130.9,

131.4, 132.1, 134.5, 140.8, 172.7.

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-bromofenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (8)

A partir de ácido (3-bromofenil)acético (0.50 g, 2.3 mmol) en

benceno (3 mL), N-bencil-4-piperidona (0.29 g, 1.5 mmol) en

benceno (2 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (2 mL, 4.6 mmol)

y después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1,

se obtuvo 8 (0.60 g, 91%) como un aceite marrón; IR (neat): νmax

= 1730, 3340; EM (IE): m/z 406 [M+2]+, 404 [M]+; RMN 1H (300

MHz; DMSO-d6): δ =1.82 (sa, 4 H, 2CH2), 3.08 (sa, 4 H, 2NCH2),

3.67 (s, 1 H, CH), 4.24 (s, 2 H, CH2Ph), 4.40 (sa, 1 H, OH), 7.30

(dd, J = 7.3, 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.40-7.44 (m, 4 H, ArH), 7.49-7.54 (m, 3 H, ArH),

7.65 (s, 1H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 30.8, 47.9, 58.4, 60.4, 68.7,

120.8, 127.9, 128.8, 129.5, 130.9, 131.4, 132.1, 134.5, 137.6, 140.8, 172.9.

N

HO

OH

O

HCl

Br

N

HO

OH

O

HCl

Br

Parte Experimental

102

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(p-metilfenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (9)

A partir de ácido (4-metilfenil)acético (1.00 g, 6.7 mmol) en

benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.57 g, 4.5 mmol) en

benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13.4

mmol) y después de purificar por el método general descrito en

1.4.2.1, se obtuvo 9 (0.14 g, 11%) como un aceite marrón; IR:

νmax = 1720, 3320; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.34-1.44

(m, 3 H, CH3), 1.86-2.23 (m, 4 H, 2CH2), 2.50 (s, 3 H, CH3), 3.22-

3.26 (m, 4 H, 2NCH2), 3.47-3.51 (m, 2 H, CH2CH3), 3.85 (s, 1 H,

CH), 5.31 (s, 1 H, OH), 7.37 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.51 (d, J = 7.3 Hz, 2 H,

ArH), 9.37 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 20.6, 31.6,

47.1, 50.9, 60.5, 68.2, 128.7, 129.7 132.0, 136.6, 173.3.

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(p-metilfenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (10)




mmol), después de purificar por el método general descrito en

1.4.2.1, se obtuvo 10 (0.50 g, 29%) como un sólido blanco; p.f. >

180 ºC dec; IR: νmax = 1760, 3500; EM (IE): m/z 340 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.66-1.88 (m, 4 H, 2CH2), 2.27 (s, 3

H, CH3), 3.12 (sa, 4 H, 2NCH2) 3.61 (s, 1 H, CH), 4.24 (s, 2 H,

CH2Ph) 5.10 (sa, 1 H, OH), 7.14 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.26 (d,

J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.45-7.47 (m, 5 H, ArH), 9.39 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4

MHz; DMSO-d6): δ = 30.1, 31.5, 47.3, 58.9, 60.6, 68.2, 128.7, 128.8, 129.5, 129.6,

129.8, 131.5, 131.9, 136.5, 173.2; análisis elemental calc (%) para C21H26ClNO3: C


N

HO

OH

O

HCl

CH3

N

HO

OH

O

HCl

CH3

Parte Experimental

103

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-metilfenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (11)





1.4.2.1, se obtuvo 11 (0.24 g, 29%) como un aceite marrón;

IR: νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 340 [M]+; RMN 1H (300

MHz; DMSO-d6): δ = 1.53-1.82 (m, 4 H, 2CH2), 2.18 (s, 3 H,

CH3), 3.01 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.50 (s, 1 H, CH), 4.13 (sa, 2 H,

CH2Ph), 5.02 (sa, 1 H, OH) 6.99-7.11 (m, 4 H, ArH), 7.34-7.39 (m, 5H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 21.1, 31.3, 47.3, 58.5, 60.9, 68.2, 126.9, 128.0,

128.7, 128.8, 129.5, 129.7, 130.4, 131.4, 134.9, 137.1, 173.1. Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-hidroxifenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (12)

A partir de ácido (3-hidroxifenil)acético (1.50 g, 9.8 mmol) en


benceno (10 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30.0


1.4.2.1, se obtuvo 12 (0.69 g, 29%) como un sólido amarillo;

p.f. > 105 ºC desc; IR: νmax = 1760, 3500; EM (IE): m/z 342

[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.62-1.99 (m, 4 H,

2CH2), 3.05-3.13 (m, 4 H, 2NCH2), 3.54 (s, 1 H, CH), 4.25 (sa, 2

H, CH2Ph), 5.09 (sa, 1 H, OH), 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 6.76 (d, J = 7.3 Hz, 1

H, ArH), 6.84 (s, 1 H, ArH), 7.10 (dd, J = 7.3, 7.9 Hz, 1 H, ArH) 7.45-7.61 (m, 5 H,

ArH), 9.45 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 30.1, 47.5, 59.0,

61.0, 68.3, 114.5, 116.7, 120.8, 128.9, 129.1, 129.6, 129.8, 131.5, 136.2, 157.1,

173.2 .

N

HO

OH

O

HCl

CH3

N

HO

OH

O

HCl

OH

Parte Experimental

104

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi-(2-tienil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (13)

A partir de ácido 2-tienilacético (2.00 g, 14 mmol) en benceno

(10 mL), N-etil-4-piperidona (1.20 g, 9 mmol) en benceno (10

mL) y cloruro de isopropilmagnesio (14.1 mL, 28 mmol) se

obtuvo 13 (3.23 g, 92%) como un sólido marrón; p.f.>106ºC

descompone (AcOEt); IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 270

[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.19 (t, J = 7.3 Hz, 3 H,

CH3), 1.70-2.10 (m, 4 H, 2CH2), 3.01 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.37 (sa, 2 H, CH2CH3),

3.99 (s, 1 H, CH), 5.25 (sa, 1 H, OH), 7.00 (m, 1 H, tiofeno-H), 7.06 (d, J = 3.1 Hz,

1 H, tiofeno -H), 7.46 (d , J = 4.9 Hz, 1 H, tiofeno -H); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-

d6): δ = 9.0, 30.9, 31.3, 47.0, 50.8, 56.9, 126.2, 128.0, 136.1, 172.4; análisis

elemental calc (%) para: C13H20ClNO3S: C 51.06, H 6.59, N 4.58, S 10.49;

encontrado: C, 51.29, H 6.32, N 4.62, S 10.27.

Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi-(2-tienil)metil]-4-hidroxipiperidinio (14)

A partir de ácido 2-tienilacético (2.00 g, 14 mmol) en benceno

(10 mL), N-bencil-4-piperidona (1.80 g, 10 mmol) en benceno

(10 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (14.1 mL, 28 mmol) se

obtuvo 14 (2.50 g, 71%) como un sólido marrón; p.f. >115 ºC

descompone (AcOEt); IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 332

[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.68-2.17 (m, 4 H,

2CH2), 3.13 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.98 (s, 1 H, CH), 4.25 (sa, 2 H,

CH2Ph), 5.23 (sa, 1 H, OH), 6.97-7.04 (m, 2 H, tiofeno-H), 7.43-7.44 (m, 4 H,

tiofeno-H and ArH), 7.60-7.67 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ =

30.7, 31.2, 47.1, 56.9, 58.7, 126.2, 126.6, 128.0, 128.7, 129.4, 129.9, 131.6,

136.1, 172.4; análisis elemental calc (%) para: C18H22ClNO3S: C 58.77, H 6.03, N

3.81, S 8.72; encontrado: C 58. 41, H 6.14, N 3. 77, S 8.89.

N

HO

OH

O

HCl

S

N

HO

OH

O

HCl

S

Parte Experimental

105

Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(naftil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (15)

A partir de ácido 1-naftilacético (2.0 g, 11 mmol) en benceno

(7 mL), N-etil-4-piperidona (0.89 g, 7 mmol) en benceno (8

mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 22 mmol) se

obtuvo 15 (1.25 g, 51%) como un sólido blanco; p.f. > 124 ºC

descompone (AcOEt); IR: νmax = 1710, 3400; EM (IE): m/z

350 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.15 (t, J = 7.3

Hz, 3 H, CH3), 1.83-2.01 (m, 4 H, 2CH2), 2.96 (c, J = 7.9 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.19-

3.26 (m, 2 H, NCH2), 3.38-3.44 (m, 2 H, NCH2), 4.69 (s, 1 H, CH), 7.48-7.59 (m, 3

H, ArH), 7.61-7.90 (m, 2 H, ArH), 8.6 (d, J = 8.6 Hz, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4

MHz; CDCl3): δ = 9.0, 30.5, 32.3, 47.0, 50.8, 53.4, 69.0, 123.8, 125.2, 125.6,


para: C19H24ClNO3 .1H2O: C 62.03, H 7.12, N 3.81; encontrado: C 62.39, H 6.84,

N 4.32. Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(naftil)metil]-4-hidroxipiperidinio (16)

A partir de ácido 1-naftilacético (1.12 g, 6 mmol) en benceno

(7 mL), N-bencil-4-piperidona (0. 75 g, 4 mmol) en benceno (8

mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 12 mmol) se

obtuvo 16 (0.18 g, 11%) como un sólido blanco; p.f. > 204 ºC

descompone (AcOEt); IR: νmax = 1690, 3460; EM (IE): m/z

376 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.74-1.88 (m, 4

H, 2CH2), 3.18-3.31 (m, 4 H, 2NCH2), 4.25 (s, 2 H, CH2), 4.72

(s, 1 H, CH), 7.45-7.47 (m, 8 H, ArH), 7.79-7.90 (m, 2 H, ArH), 8.22 (d, J = 8.6 Hz,

2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 30.4, 32.5, 47.6, 49.2, 59.2, 68.7,

124.1, 125.4, 126.0, 126.9, 127.1, 128.4, 129.1, 129.2, 129.7, 129.9, 131.4, 131.7,

132.6, 134.0, 173.8; análisis elemental calc (%) para: C24H26ClNO3 . 2 H2O: C


N

HO

OH

O

HCl

N

HO

OH

O

HCl

Parte Experimental

106

1. 4. 2. 2. Síntesis de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidin-1-carboxilato de terc-butilo (21)

Sobre una solución de N,N-ciclohexilisopropilamina (4.1 mL,

25 mmol) en 20 mL de THF seco, enfriada a -78 ºC, con

agitación y bajo atmósfera de argon, se agrega, gota a gota

15.75 mL de nBuLi (1.6 M, 25 mmol) y se deja agitando

durante 30 minutos. A continuación se agrega lentamente

una solución de isobutirato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF seco (5 mL) y se

deja agitar a -78 ºC durante 30 minutos. Finalmente se añade una solución de N-

terc-butoxicarbonil-4-piperidona (3.3 g, 17 mmol) en THF seco. La mezcla de

reacción se deja agitando a -78 ºC durante 24 h y luego se diluye en AcOEt y se

lava tres veces con agua (20 mL). Las fases orgánicas se secan con Na2SO4

anhidro, se filtra el desecante y el disolvente se evapora a vacío. Se obtiene un

aceite que se purifica por cromatografía en columna en gel de sílice y AcOEt-

Hexano (1:1) como eluyente dando lugar a 26 (4.45 g, 87%) como un sólido

blanco; p.f. 80-81 ºC (AcOEt); IR: νmax = 1650, 1720, 3480; EM (IE): m/z 324

[M+Na]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.46 (s, 9 H, 3CH3),

1.41-1.50 (m, 2 H, CH2), 1.62 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 3.10 (td, J = 12.6,

2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 3.92-3.97 (m, 2 H, CH2); RMN 13C (75.4

MHz; CDCl3): δ = 20.7, 28.7, 31.3, 39.0, 39.7, 49.6, 52.2, 72.6, 79.3, 154.8,

178.9; análisis elemental calc (%) para: C15H27NO5: C 59.78, H 9.03, N 4.65;

encontrado: C 59.40, H 8.79, N 4.68.

N

HO

O

O

O O

Parte Experimental

107

I. 4. 2. 3. Síntesis de cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil) piperidinio (22)

A través de una solución de 21 (4.46 g, 15 mmol) en AcOEt (40

mL) enfriada a 0 ºC se hace pasar una corriente de cloruro de

hidrógeno durante 15 minutos. A continuación la solución se

evapora a vacío. Se obtiene 22 (2.7 g, 75%) como un sólido

blanco; p.f. 176-177 ºC (AcOEt); IR: νmax = 1710, 2700, 3300; EM (IE): m/z 202

[M]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.41-1.46 (m, 2 H, CH2),

1.65 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 2.85-2.90 (m, 2 H, CH2), 3.03 (td, J = 12.9,

2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8,

29.8, 41.4, 51.4, 52.5, 71.5; análisis elemental calc (%) para: C10H20ClNO3: C

50.52, H 8.58, Cl 14.91, N 5.89, O 20.19; encontrado: C 50.06, H 8.39, N 5.95.

I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34) A una solución de cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio

(22) (1 equivalente) en DMF (2 mL aprox.) a temperatura ambiente se añade

K2CO3 (2 equivalentes) y a continuación el haluro de alquilo correspondiente (1

equivalente). La mezcla de reacción se agita a TA hasta que completa la reacción

(de 4 a 24 h). Se adiciona agua (10 mL) y la mezcla se extrae con AcOEt (3x15

mL). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución saturada de NaCl

y se secan sobre Na2SO4 anhidro. La solución se filtra y se evapora a vacío. Se

obtiene un residuo que se purifica por cromatografía en gel de sílice.

N

HO

O

O

HHCl

Parte Experimental

108

Síntesis de 2-(1-alil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (23)

A partir de 22 (0.10 g, 0.4 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.14 g,

0.8 mmol) y bromuro de alilo (0.043 mL, 0.4 mmol), y después de

una cromatografía en columna del crudo con AcOEt como

eluyente, se obtuvo el compuesto 23 (0.042 g, 41 %) como un

aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3500; EM (IE): m/z 242 [M+H]+;

RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.44-1.49 (m,

2 H, CH2), 1.79 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 2.30 (td, J = 12.1, 2.2 Hz, 2 H,

CH2), 2.73-2.76 (m, 2 H, CH2), 3.02 (d, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2), 3.42 (s, 1 H, OH),

3.71 (s, 3 H, OCH3), 5.13-5.22 (m, 2 H, C=CH2), 5.82-5.85 (m, 1 H, C=CH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 48.9, 49.5, 52.0, 61.8, 72.3, 117.8, 135.2,

178.9 .

Síntesis de 2-(1-bencil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (24)

A partir de 22 (0.50 g, 2.1 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.58

g, 4.2 mmol) y bromuro de bencilo (0.25 mL, 2.1 mmol), y

después de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt

como eluyente, se obtuvo el compuesto 24 (0.23 g, 38%) como

un aceite amarillo; IR: νmax = 1700-1720, 3500; EM (IE): m/z 292

[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.42 (da, J = 11.5 Hz,

2 H, CH2), 1.77 (ta, J = 13.2 Hz, 2 H, CH2), 2.37-2.44 (m, 2 H, CH2), 2.70-2.74 (m, 2

H, CH2), 3.36 (s, 1 H, OH), 3.51 (s, 2 H, CH2Ph), 3.67 (s, 3 H, OCH3), 7.27-7.33 (m,

5 H, ArH) ; RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.6, 31.3, 48.8, 49.4, 51.7, 62.9, 72.1,

126.6, 127.9, 128.9, 138.4, 178.5 .

N

HO

O

O

N

HO

O

O

Parte Experimental

109

Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-nitrobencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (25)

A partir de 22 (0.10 g, 0.4 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3

(0.12 g, 0.8 mmol) y bromuro de 4-nitrobencilo (0.09 g, 0.4

mmol), y después de una cromatografía en columna del

crudo con AcOEt como eluyente, se obtuvo el compuesto 25

(0.07 g, 48%) como un sólido amarillo; p.f. 77-78 ºC; IR: νmax

= 1700, 3460; EM (IE): m/z 337 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;

CDCl3): δ = 1.25 (s, 6 H, 2CH3), 1.43-1.47 (m, 2 H, CH2), 1.80 (td, J = 12.6, 4.4 Hz,

2 H, CH2), 2.40-2.51 (m, 2 H, CH2), 2.63-2.67 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 1 H, OH), 3.61

(s, 2 H, CH2Ph), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H), 8.17 (d, J =

8.8 Hz, 2 H, Ar-H) ; RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 41.2, 52.1, 53.0,

61.9, 72.0, 123.5, 123.7, 129.2, 129.7, 178.9; análisis elemental calc (%) para:

C17H24N2O5: C 60.70, H 7.19, N 8.33, encontrado: C 59.87, H 7.05, N 8.25.

Síntesis de 2-(1-ciclopropilmetil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (26)


1.7 mmol) y bromuro de metilciclopropilo (0.11 g, 0.8 mmol), y

después de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt-

MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo el compuesto 26 (0.12 g,

55%) como un aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3500; EM (IE): m/z 256 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.07-0.14 (m, 2 H, CH2), 0.47-0.55 (m, 2 H, CH2), 0.83-

0.93 (m, 1 H, CH), 1.25 (s, 6H, 2CH3), 1.48 (da, J = 11.6 Hz, 2 H, CH2), 1.85 (td, J =

13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.30 (d, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2), 2.35-2.43 (m, 2 H, CH2),

2.90-2.93 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 1 H, OH), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4

MHz; CDCl3): δ = 3.9, 8.1, 20.7, 31.2, 48.9, 49.5, 52.0, 63.6, 72.2, 77.2, 178.9.

N

HO

O

O

NO2

N

HO

O

O

Parte Experimental

110

Síntesis de 2-[1-(4-clorobencil)-4-hidroxipiperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (27)

A partir de 22 (0.15 g, 0.6 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.18

g, 1.3 mmol) y cloruro de p-clorobencilo (0.10 g, 0.6 mmol), y

después de una cromatografía en columna del crudo con

AcOEt-MeOH (1:1) como eluyente, se obtuvo el compuesto

27 (0.18 g, 85%) como un sólido blanco; p.f. 59-60 ºC; IR:

νmax = 1710, 3540; EM (IE): m/z 326 [M+H]+, 328

[M+H+2]+;RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ =1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.43 (da, J=11.0 Hz,

2 H, CH2), 1.77 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.32-2.41 (m, 2 H, CH2), 2.63-2.67

(m, 2 H, CH2), 3.47 (s, 2 H, CH2Ph), 3.69 (s, 3 H, OCH3), 7.26 (sa, 4 H, Ar-H);

RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.3, 48.9, 49.5, 52.1, 62.1, 72.3, 128.3,

130.5, 178.9 .

Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-trifluorometilbencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (28)


(0.18 g, 1.3 mmol) y bromuro de p-trifluorobencilo (0.15 g,

0.6 mmol), y después de una cromatografía en columna del

crudo con AcOEt como eluyente, se obtuvo el compuesto

28 (0.21 g, 94%) como un aceite amarillo; IR: νmax = 1340,

1700, 3500; EM (IE): m/z 360 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;

CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.42-1.47 (m, 2 H, CH2), 1.79 (td, J = 13.2, 4.4

Hz, 2 H, CH2), 2.37-2.46 (m, 2 H, CH2), 2.65-2.68 (m, 2 H, CH2), 3.43 (s, 1 H, OH),

3.57 (s, 2 H, CH2Ph), 3.70 (s, 3 H, OCH3), 7.46 (d, J = 8.3 Hz, 2 H, Ar-H), 7.56 (d,

J = 8.3 Hz, 2 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 49.1, 49.6,

52.1, 62.4, 72.3, 122.4, 125.0, 125.1, 125.1, 125.2, 126.0, 129.2, 178.2; análisis

elemental calc (%) para: C18H24F3NO3: C 60.16, H 6.73, N 3.90; encontrado: C

59.77, H 6.69, N 3.94.

N

HO

O

O

Cl

N

HO

O

O

CF3

Parte Experimental

111

Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(2-hidroxietil)-piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (29)


1.7 mmol) y 2-bromoetanol (0.11 g, 0.8 mmol), y después de una

cromatografía en columna del crudo con AcOEt-MeOH (9:1)

como eluyente, se obtuvo el compuesto 29 (0.07 g, 34%) como

un aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 246 [M+H]+; RMN 1H (300

MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 3 H, CH3), 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.43-1.48 (m, 2 H, CH2),

1.74-1.84 (m, 2 H, CH2), 2.38-2.45 (m, 2 H, CH2), 2.56-2.58 (m, 2 H, CH2), 2.71-

2.77 (m, 2 H, CH2), 3.45 (d, J = 6.6 Hz, 1 H, 1/2CH2), 3.65 (d, J = 6.6 Hz, 1 H,

1/2CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.5, 48.8,

49.5, 52.1, 57.8, 59.2, 72.2, 178.9.

Síntesis de 2-[1-(2-dietilaminoetil)-4-hidroxipiperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (30)


1.7 mmol) y 2-cloro-N,N-dietiletanamina (0.15 g, 0.8 mmol), y

después de una cromatografía en columna del crudo con

AcOEt-MeOH-NH3 (9:1:0.1) como eluyente, se obtuvo el

compuesto 30 (0.086 g, 34%) como un aceite amarillo; IR: νmax

= 1720, 3300; EM (IE): m/z 301 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.05 (t, J

= 7.2 Hz, 6 H, 2CH3), 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.44-1.48 (m, 2 H, CH2), 1.85 (td, J =

13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.48 (ta, J = 11.0 Hz, 4 H, CH2), 2.60 (c, J = 14.3, 7.1 Hz,

4 H, 2CH2), 2.80-2.83 (m, 2 H, CH2), 3.48 (s, 1 H, OH), 3.71 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.6, 20.8, 31.4, 47.4, 49.6, 50.2, 52.0, 56.5, 72.3,

178.9.

N

HO

O

O

OH

N

HO

O

O

N

Parte Experimental

112

Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-metoxibencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (31)


(0.23 g, 1.7 mmol) y bromuro de 4-metoxibencilo (0.17 g,

0.8 mmol), y después de una cromatografía en columna

del crudo con AcOEt-MeOH-NH3 (1:1:0.1) como eluyente, se obtuvo 31 (0.05 g, 20%) como un sólido blanco; p.f. 65-

67 ºC; IR: νmax = 1690, 1720, 3500; EM (IE): m/z 322

[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.40-1.44 (m, 2 H,

CH2), 1.76 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.29-2.38 (m, 2 H, CH2), 2.66-2.70 (m,

2 H, CH2), 3.34 (s, 1 H, OH), 3.46 (s, 2 H, CH2Ph), 3.70 (s, 3 H, OCH3), 3.79 (s, 3

H, OCH3), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H); RMN 13C

(75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 48.8, 49.6, 52.0, 55.2, 62.4, 72.4, 113.4, 130.3,

158.5, 178.9; análisis elemental calc (%) para: C18H27NO4: C 67.26, H 8.47, N

4.36; encontrado: C 66.74, H 8.31, N 4.46.

Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(2-metoxietil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (32)


1.7 mmol) y 2-bromoetilmetiléter (0.12 g, 0.8 mmol), y después de

una cromatografía en columna del crudo con AcOEt como

eluyente, se obtuvo 32 (0.11 g, 49%) como un aceite amarillo; IR:

νmax = 1720, 3490; EM (IE): m/z 260 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23

(s, 6 H, 2CH3), 1.45 (dd, J = 13.7, 2.2 Hz, 2 H, CH2), 1.85 (td, J = 13.2, 4.4 Hz, 2

H, CH2), 2.41 (ta, J = 11.6 Hz, 2 H, CH2), 2.61 (t, J = 6.1 Hz, 2 H, CH2), 2.77-2.81

(m, 2 H, CH2), 3.35 (s, 3 H, OCH3), 3.44 (s, 1 H, OH), 3.53 (t, J = 6.1 Hz, 2 H,

CH2), 3.71 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.7, 31.2, 49.3, 49.5,

51.9, 57.8, 58.7, 69.9, 72.1, 178.8.

N

HO

O

O

OCH3

N

HO

O

O

O

Parte Experimental

113

Síntesis de 2-(4-hidroxi-1-prop-2-inilpiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (33)


1.7 mmol) y bromuro de propargilo (0.13 g, 0.8 mmol), y después

de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt-MeOH-

NH3 (9:1:0.1) como eluyente, se obtuvo 33 (0.09 g, 45%) como un

sólido amarillo; p.f. 66-67 ºC; IR: νmax = 1730, 3260, 3490; EM (IE): m/z 240

[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.50 (dd, J = 13.2,

2.2 Hz, 2 H, CH2), 1.82 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.27 (t, J = 2.2 Hz, 1 H,

CH), 2.53-2.61 (m, 2 H, CH2), 2.75 (dt, J = 11.0, 2.2 Hz, 2 H, CH2), 3.28 (d, J = 2.8

Hz, 2 H, CH2), 3.44 (s, 1 H, OH), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz;

CDCl3): δ = 20.7, 31.4, 46.9, 48.1, 49.5, 52.0, 71.9, 72.9, 79.2, 178.8; análisis

elemental calc (%) para: C13H21NO3: C 65.25, H 8.84, N 5.85; encontrado C 64.71,

H 8.63, N 5.68.

N

HO

O

O

Parte Experimental

114

Síntesis de bromuro de 1,1-dibencil-4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil) piperidinio (34)

A partir de 22 (0.50 g, 2 mmol) en DMF (10 mL), K2CO3

(0.58 g, 4 mmol) y bromuro de bencilo (0.50 mL, 4 mmol),

y después de una cromatografía en columna del crudo con

AcOEt-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 34 (0.53 g,

54%) como un sólido blanco; p.f. 87-88 ºC; IR: νmax = 1710,

3400; EM (IE): m/z 382.33 [M]+; RMN 1H (300 MHz;

CDCl3): δ = 1.29 (s, 6 H, CH3), 1.84-1.88 (d, 2 H, CH2), 2.36-2.45 (t, 2 H, CH2),

3.56-3.64 (t, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 3.72-3.81 (t, 2 H, CH2), 4.00 (s, 1 H,

OH), 4.77 (s, 2 H, CH2), 5.22 (s, 2 H, CH2), 7.28-7.24 (m, 8 H, Ar-H), 7.71-7.74 (d,

2 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.83, 27.80, 50.82, 52.65, 61.79,

67.68, 70.38, 79.49, 128.24, 128.71, 130.24, 130.67, 131.75, 132.00, 134.18,

134.88, 178.24; análisis elemental calc (%) para: C24H32BrNO3 . 1H2O: C 60.00, H

7.13, N 3.03; encontrado: C 59.77, H 6.92, N 2.92

N

HO

O

O

Br

Parte Experimental

115

I. 4. 2. 5. Síntesis de 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (35)

Para la síntesis de 35 se aplicó el procedimiento descrito

anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 15.8 mL) en

hexano, isopropilciclohexilamina (4.1 mL) en THF anhidro (20

mL), isobutirato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF anhidro (5

mL) y N-etil-4-piperidona (2.29 mL, 17 mmol) en THF anhidro (5

mL), y después de una cromatografía en columna del crudo con

DCM-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 35 (3.59 g, 92%) como un aceite

amarillo; IR: νmax = 1720, 1740, 3500; EM (IE): m/z 230 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;

CDCl3): δ = 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3), 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.47 (dd, J = 13.7,

2.8 Hz, 2 H, CH2), 1.80 (td, J = 13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.26-2.35 (m, 2 H, CH2),

2.43 (c, J = 7.1 Hz, 2 H, CH2), 2.74-2.78 (m, 2 H, CH2), 3.42 (s, 1 H, OH), 3.72 (s,

3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.8, 20.6, 31.2, 48.4, 49.4, 51.8,

52.1, 72.2, 178.7.

N

HO

O

O

Parte Experimental

116

I. 4. 2. 6. Síntesis de 2-(1-benzoil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (36)


anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 3.15 mL) en hexano,

isopropilciclohexilamina (0.83 mL, 5 mmol) en THF anhidro (10 mL),

isobutirato de etilo (0.57 mL, 5 mmol) en THF anhidro (2 mL) y N-

benzoil-4-piperidona (0.676 g, 3.3 mmol) en THF anhidro (5 mL), y

después de una cromatografía en columna del crudo con hexano-AcOEt (9:1) como

eluyente, se obtuvo 36 (0.39 g, 39%) como un sólido blanco; p.f. 88-89 ºC; IR: νmax =

1640, 1740, 3450; EM (IE): m/z 306 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.17 (s, 6

H, CH3), 1.31-1.68 (m, 4 H, 2CH2), 3.07-3.42 (m, 2 H, CH2), 3.65 (s, 3 H, OCH3), 7.32

(s, 5 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.7, 31.3, 32.2, 37.9, 43.5, 49.4, 52.2,

72.8, 126.8, 128.4, 129.5, 136.1, 170.2, 178.8; análisis elemental calc (%) para:

C17H23NO4 .1H2O: C 63.14, H 7.79, N 4.33; encontrado: C 62.98, H 7.56, N 4.45.

I. 4. 2. 7. Síntesis de 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato de metilo (38)


anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 14.9 mL) en hexano,

isopropilciclohexilamina (3.95 mL, 24 mmol) en THF anhidro (10 mL),

isobutirato de etilo (2.7 mL, 24 mmol) en THF anhidro (2 mL) y 4-

etilciclohexanona (2.00 g, 16 mmol) en THF anhidro (5 mL), y después de una

cromatografía en columna del crudo con hexano-AcOEt (9:1) como eluyente, se obtuvo

38 (4.54 g, 87%) como un aceite incoloro; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.87 (t, J =

7.1 Hz, 3 H, CH3), 0.95-1.10 (m, 2 H, CH2), 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.24-1.57 (m, 9 H,

4CH2 y CH), 3.13 (sa, 1 H, OH), 3.70 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ =

11.36, 20.76, 27.60, 29.46, 31.41, 38.84, 49.91, 51.71, 73.82, 178.91; análisis

elemental calc (%) para: C13H24O3: C 66.98, H 10.59; encontrado: C 67.31, H 10.23.

N

HO

O

O

O

HO

O

O

Parte Experimental

117

I. 4. 2. 8. Síntesis de ácido 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoico (37)

Sobre una solución de 35 (0.20 g, 0.9 mmol) en THF (7.5 mL) se

agrega una solución acuosa de NaOH (5 mL, 0.5 M) y la mezcla

se refluye durante 2 días. A continuación se agrega lentamente

una solución acuosa de HCl 10% hasta la aparición de un sólido

blanco, que se filtra y lava con agua dando lugar al compuesto 37 (0.07 g, 37%);

p.f. 189 ºC (descompocición); EM (IE): m/z 217 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;

CDCl3): δ = 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.25 (s, 3 H, CH3), 1.36 (td, J = 7.2, 1.7 Hz, 3 H,

CH3), 1.94 (d, J = 14.9 Hz, 2 H, CH2), 2.14 (td, J = 13.2, 2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.14-

3.47 (m, 6 H, 3CH2). 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.25 (s, 3 H, CH3), 1.36 (td, J = 7.2, 1.7

Hz, 3 H, CH3), 1.94 (d, J = 14.9 Hz, 2 H, CH2), 2.14 (td, J = 13.2, 2.7 Hz, 2 H,

CH2), 3.14-3.47 (m, 6 H, 3CH2); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 22.03, 24.17,

30.95, 49.51, 49.37, 52.80, 71.83, 180.37. I. 4. 2. 9. Síntesis de ácido 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropanoico (39)

Sobre una solución de 38 (0.30 g, 1.3 mmol) en THF (9 mL) se

agrega una solución acuosa de NaOH (11 mL, 0.5 M) y la mezcla

se agita a TA durante 24 h. A continuación se agrega una

solución acuosa de HCl 10% y la mezcla se extrae con Et2O (3 x

20 mL). Los extractos se secan (Na2SO4), filtran y concentran a

sequedad. La purificación del residuo mediante cromatografía en columna usando

AcOEt como eluyente condujo a 39 (0.25 g, 88%) como un sólido blanco; p.f. 70-

71 ºC; EM (IE): m/z 237.05 [M+Na]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.87 (t, J =

7.1 Hz, 3 H, CH3), 0.95-1.10 (m, 2 H, CH2), 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.24-1.57 (m, 9 H,

4CH2 y CH), 3.13 (sa, 1 H, OH), 3.70 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3):

δ = 11.43, 20.75, 27.54, 29.63, 31.22, 38.72, 50.11, 74.67, 183.23.

N

HO

OH

O

HO

OH

O

Parte Experimental

118

I. 4. 2. 10. Síntesis de (1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)(fenil)acetato de metilo (17)


anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 2.1 mL) en

hexano, isopropilciclohexilamina (0.55 mL) en THF anhidro (3

mL), fenilacetato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF anhidro (5

mL) y N-etil-4-piperidona (0.5 mL, 3 mmol) en THF anhidro (2

mL), y después de una cromatografía en columna del crudo con

CHCl3-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 17 (0.11 g, 12%) como un aceite

amarillo; EM (IE): m/z 278 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CD3OD): δ = 1.09 (t, J =

7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.59-1.70 (m, 4 H, 2CH2), 2.36-2.64 (m, 4 H, 2NCH2), 2.50 (c, J

= 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.65 (s, 3 H, OCH3), 3.72 (s, 1 H, CH), 7.24-7.33 (m, 3 H,

ArH), 7.42-7.44 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.7, 34.0, 36.8,

48.2, 48.4, 52.1, 52.2, 59.7, 70.2, 127.7, 128.4, 129.5, 134.1, 174.6.

N

HO

O

O

Parte Experimental

119

I. 4. 3. Determinación de la afinidad

I. 4. 3. 1. Ensayo de competición

Se adsorbe AM en placas de PVC de 96 pocillos (adsorción pasiva)

incubando 50 µL de AM (100 µg/µL) en cada pocillo durante 1 h.

Después de descartar la solución sobrenadante, se añaden 200 µL de

suero de albúmina bovina 1% (BSA) en tampón fosfato (PBS). Después de 1 h la

solución sobrenadante se vuelve a aspirar y se añaden 50 µL de una solución 1µM

de los compuestos a analizar.

Después de 1 h se añaden 50 µL de anticuerpo marcado con peroxidasa

(2.4 µg/mL) y la solución se deja reaccionar durante 1 h más. Tras lavar con BSA

1% en PBS, se estimula la actividad de la peroxidasa usando hidrocloruro de o-

feniletilendiamina como sustrato. El producto de reacción se cuantifica en un lector

de placas (Spectra Rainbow; Tecan, Raleigh, NC) a 450 nm. Cada placa contiene

varios controles internos, incluyendo pocillos sin AM para evaluar las uniones no

específicas; pocillos donde no se agrega ningún compuesto para obtener de ellos

el máximo registro de color; y pocillos donde se adiciona anticuerpo sin marcar

como control positivo de inhibición. Cada compuesto se ensaya por duplicado en

la misma placa. Los resultados son aceptados cuando son reproducibles en tres

placas independientes. La variación intraensayo fue del 6% y la variación

interensayo fue del 13%. La sensibilidad del ensayo se determinó con el

anticuerpo frío y fue 12 nM con un rango dinámico de 12 nM a 54 nM.

I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR

Usando un equipo Biacore T100 (GE Heathcare Biacore, Uppsala, Suecia)

se llevó a cabo un análisis de interacción molecular en tiempo real. Todos los

experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC. En la célula de flujo 2 (Fc 2) de un chip

sensor sCM5 se inmovilizaron 1800 unidades de resonancia (RU) de AM usando

Parte Experimental

120

el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las especificaciones del

fabricante (BIAapplications Handbook). Fc 1 fue tratada igual que Fc 2 pero sin la

inyección de AM y se utilizó como referencia. Los estudios se llevaron a cabo con

un flujo de 30 L/min con HBS-DMSO (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4

mM EDTA, 5% DMSO) como tampón. Las muestras de los compuestos en

concentraciones de entre 10 y 200 µM en HBS-DMSO se inyectaron durante 1

min sobre las superficies de referencia y la de la AM, seguido de una post-

inyección durante 2 min. La regeneración se llevó a cabo con dos inyecciones de

30 s de NaCl 0.5 M, seguidas de 2 min. de estabilización. Típicamente, los 10

primeros ciclos consistieron en inyecciones de HBS-DMSO para asegurar que la

superficie se encontraba totalmente equilibrada. También se inyectó HBS-DMSO

antes de cada nuevo compuesto. Los datos del biosensor fueron analizados

usando el software Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 (GE Healthcare). Como

el DMSO a menudo genera cambios en el índice de refracción mayores a las

señales esperadas de los compuestos, los datos fueron corregidos teniendo en

cuenta las posibles diferencias en el índice de refracción generadas por el DMSO

entre las células de flujo.229

I. 4. 4. Ensayos biológicos I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc

Este ensayo se realizó siguiendo protocolos anteriormente publicados.20

Se prepara una placa de 24 pocillos con células confluentes añadiendo 500 µL de

una suspensión de células Rat2 en medio R10 (1x105 células por pocillo) y

dejando incubar una noche. A continuación se lava dos veces con TIS. El medio

TIS consiste en medio RPMI 1640 (Invitrogen) al que se añaden 10 µg/mL de

transferrina, 10 µg/mL de insulina y una concentración 50 nM de selenito sódico.

La transferrina transporta hierro al interior de la célula. La insulina actúa como

factor de crecimiento, evitando que las células entren en apoptosis. El selenito

sódico, por su parte, actúa como antioxidante.

Parte Experimental

121

Se añaden luego 250 µL de TIS con 1% BSA, 1 mg/mL de bacitracina y

100 µM de IBMX. Se incuban las células durante 15 min. a 37 ºC en esta solución.

A continuación, se añaden los compuestos que se desea analizar a una

concentración tal que la concentración final sea 100 nM. Como control positivo se

utiliza forskolina (50 µM) que es un potente activador de proteínas G. Se deja

actuar a los compuestos durante 5 minutos a 37 ºC y a continuación se detiene la

reacción colocando la placa en hielo. Se añaden 250 µL de etanol absoluto frío,

que extrae completamente los contenidos celulares. Las células pegadas al fondo

se homogenizan raspando con la punta de una pipeta y la suspensión se transfiere

a tubos. Las muestras se congelan a –80 ºC hasta que se realice el

radioinmunoensayo.

Radioinmunoensayo para AMPc

El radioinmunoensayo para el AMPc se realiza siguiendo el protocolo del

kit RPA 509 de Biotrack (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).20

En primer lugar se equilibran todas las muestras y productos del kit a

temperatura ambiente. Después se rotulan tubos de polipropileno con 25 fmol, 50

fmol, 100 fmol, 200 fmol, 400 fmol, 800 fmol y 1600 fmol, y se agregan 500 µL de

buffer (kit) en todos los tubos. En el tubo 1600 fmol se agregan 500 µL de estándar

(32 pmol/mL) y se agita vigorosamente. A partir de esta solución se preparan las

siguientes diluyendo a la mitad sucesivamente con los tubos restantes. Alícuotas

de 100 µL de cada dilución proporcionarán siete niveles de AMPc estándar

diferentes entre 25 y 1600 fmol.

Por otra parte, se rotulan tubos de polipropileno por duplicado para

cuentas totales (TC), tubos de cero estándar (B0), estándares (7-20) y muestras

(21-68). Se agregan 100 µL de tampón en los tubos de cero estándar, 100 µL de

estándar en los tubos 7-20, y 100 µL de cada muestra a ensayar en los tubos

correspondientes.

Parte Experimental

122

Inmediatamente se adicionan 100 µL de antisuero a todos los tubos excepto los

correspondientes a TC. Todos los tubos se agitan vigorosamente en un vortex, se

cubren con un film de plástico y se incuban 3 horas entre 2-8 ºC.

Se agita la botella conteniendo el anticuerpo secundario Amerlex-M hasta

obtener una suspensión homogénea y se adicionan 500 µL a cada tubo excepto a

los TC. Se agita con vortex y se incuba 10 minutos a temperatura ambiente.

Después se separa la fracción unida al anticuerpo por centrifugación (10

minutos, a 1500 rpm) y se extrae el sobrenadante. Por último se mide la

radioactividad presente en cada sedimento. Después de restar el valor de unión no

específica, se construye la curva de calibrado y se interpolan en ella las medidas

de las muestras problema.


En el caso de las líneas celulares T47D, CT2A, A549 y H1299, en una

placa de 96 pocillos se siembran células de la línea elegida (1x104 células por

pocillo) en 50 µL de RPMI 1640 sin suero. Las placas se mantienen en un

incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se añaden los

compuestos y 5 días después se realizan las medidas. Para el revelado con la

solución comercial, CellTiter 96® AQueous One Soluction Cell Proliferation Assay, se

añaden 20 µL a cada pocillo de la placa. Inmediatamente se incuba la placa entre

1-4 h a 37 ºC en una atmósfera de 5% de CO2. Finalmente, se registra la

absorbancia a 492 nm.

Para las líneas celulares PANC-1, L36PL, HCT-116 y HT29, se

siembran en una placa de 96 pocillos 5 x 103 células por pocillo. Las placas se

mantienen en un incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se

añaden los compuestos en concentración creciente y también el control 5-

fluorouracilo (5-FU) para HCT116 y HT29, y gemcitabina para PANC-1 y

L36PL, en presencia de suero fetal bovino 0.5%. Después de 96 horas, se

agregan en cada pocillo, 0.02 mL de una solución de bromuro de 3-(4,5-

Parte Experimental

123

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (5 mg/mL en PBS; Sigma) y las placas se

incuban 3 h a 37 ºC. A continuación el medio se reemplaza por 0.1 mL de

DMSO por pocillo. Se agitan las placas y se mide la absorbancia a 570 nm

usando un lector de placas multipocillo (Modelo 550, Bio-Rad, Inc., Hercules,

CA). Cada experimento se realiza por triplicado para cada concentración y se

lleva a cabo por lo menos tres veces.

I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D

La estructura 3D de los compuestos se construyó con el grupo carboxílico

protonado, es decir, en su forma neutra y el sustituyente voluminoso en el C4 de la

piperidina se colocó en posición ecuatorial.

Para todos los compuestos se consideró la misma configuración absoluta

del centro estereogénico. La geometría se optimizó a nivel AM1 usando los

programas ChemDraw Ultra 10.0 y Gaussian98.230

Los datos de SPR (tablas 3, 4 y 5) se usaron como variables y.

Las conformaciones obtenidas se analizaron utilizando la metodología

GRIND con el programa Almond 3.3.0.

Se eligieron las sondas DRY, O y N1 para representar las funciones

potencialmente importantes del sitio de unión. La sonda TIP fue también incluida

para considerar la forma de la molécula.

El espaciado de malla se fijó en 0.5 Å (smooth window = 0.8 unidades de

grid). El número de nodos filtrados se situó en 100, con un 50% de peso relativo

de los campos. Almond produjo diez grupos de variables: cuatro

autocorrelogramas y seis correlogramas cruzados. La línea base se eliminó para

hacer el escalado. La validación cruzada se realizó bien usando el método leave-

one-out (LOO) o por asignación de compuestos al azar en cinco grupos,

realizando la validación cruzada en estos grupos y luego repitiendo todo el poceso

20 veces. No se encontraron diferencias importantes entre ambos métodos de

validación.

Parte Experimental

124

Todas las operaciones se llevaron a cabo en un PC Intel Pentium 4

usando el sistema operativo Linux RedHat 9.

Capítulo II Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP

II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo


127

II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo

De todas las acciones biológicas del PAMP nos ha interesado

particularmente su capacidad para actuar como un potente factor angiogénico. El

presente trabajo plantea la búsqueda de pequeñas moléculas que, a través de la

unión con el PAMP, puedan actuar como moduladores negativos de su acción, y

como consecuencia, puedan presentar interés como agentes antiangiogénicos.

Para ello nos planteamos llevar a cabo un cribado virtual basado en la

estructura del PAMP y utilizando la quimioteca de compuestos conocida como NCI

Diversity Set.231 Mediante el uso de este cribado virtual se pueden seleccionar

aquellos compuestos que tengan mayor afinidad por el PAMP, para someterlos en

una segunda etapa a ensayos de afinidad que confirmen experimentalmente la

predicción teórica.

Del mismo modo se pretende analizar una pequeña colección de

compuestos sintetizados en nuestro laboratorio, que proceden de otros trabajos

realizados en nuestro grupo de investigación.180, 232

Una vez ordenados los compuestos de acuerdo a su energía de unión al

péptido, se pretende profundizar en las interacciones ligando-péptido predichas

por el programa para los compuestos con energía de unión más favorable.

En una segunda etapa, es necesario poner a punto un método para

determinar experimentalmente la afinidad de los ligandos al PAMP, basado en la

competencia con un anticuerpo monoclonal del PAMP, que nos permita evaluar los


128

compuestos seleccionados y confirmar de manera preliminar las predicciones del

estudio de docking.

Los compuestos que muestren afinidad por el PAMP, se seleccionarán

para una evaluación cuantitativa con la técnica de SPR.

También se probará la actividad como agentes antiangiogénicos de los

compuestos seleccionados, mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de

embrión de pollo,118 así como su capacidad antiproliferativa en una línea celular de

cáncer de colon, Caco-2.

Las interacciones entre algunas de las pequeñas moléculas seleccionadas

y el PAMP se analizarán más profundamente mediante estudios de dinámica

molecular y cálculos teóricos de energías.

II. 2. Discusión de Resultados

Discusión de Resultados

129

II. 2. Discusión de resultados II. 2. 1. Cribado Virtual En los últimos años el cribado virtual (Virtual Screening: VS) se ha

transformado en una herramienta de gran utilidad para el descubrimiento de nuevos

fármacos. El VS supone un complemento del HTS y un criterio para la racionalización

de la síntesis. Los posibles hits determinados por HTS son reales pero, por sí solos,

no contribuyen a ampliar el conocimiento del modo de interacción con su diana

farmacológica. Sin embargo, el VS proporciona hits potenciales que aportan

información acerca del modo de interacción ligando-receptor. Además, esta técnica

es relativamente barata (ahorra la adquisición de reactivos y robotización), rápida y

permite considerar un número de compuestos in silico mucho mayor al que se

accede experimentalmente.

En este trabajo se ha seleccionado la colección de moléculas del NCI

conocida como NCI Diversity Set, ya que se trata de una base de datos de libre

acceso, preparada para AutoDock y nuestro grupo posee experiencia en la utilización

de la misma.233

Para iniciar la búsqueda de pequeñas moléculas capaces de unirse al

PAMP, en primer lugar se preparó la estructura del péptido con el formato y

características adecuadas para su utilización con el programa AutoDock. Se refinó la

lista del NCI, eliminando los compuestos de la denominada “problem list” que

contiene algunos archivos cuya calidad no está comprobada. También se eliminaron

aquellos que poseen átomos diferentes de C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Del mismo


130

modo se construyeron los archivos correspondientes a los compuestos de nuestra

quimioteca.

A continuación se realizó el docking de forma automática para un total de

2436 estructuras, 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set y 600 confórmeros

correspondientes a 60 compuestos pertenecientes a nuestra colección particular. Existen antecedentes que demuestran que la región activa del péptido se

encuentra en el extremo carboxilo terminal.12 Por este motivo, la compañía

Evogenix (Sydney, Australia), dentro de su proyecto de desarrollar un anticuerpo

monoclonal humanizado contra PAMP utilizable en clínica, desarrolló un

anticuerpo monoclonal αPAMP específicamente para este epítopo del péptido.234

Este anticuerpo es el que posteriormente se utilizó para los ensayos de afinidad.

Por lo tanto, en nuestro estudio de cribado virtual enfocamos el docking

solamente a esta región del péptido, tal y como se muestra en la figura 17.

Figura 17: Estructura 3D del PAMP y localización y dimensiones de la caja construida

para la realización del docking.

ARG20

62 Å

37 Å

45 Å ARG20

62 Å

37 Å

45 Å62 Å

37 Å

62 Å62 Å

37 Å

45 Å45 Å


131

Los resultados se ordenaron según la energía de unión al PAMP predicha

en el estudio de docking y, a continuación, se seleccionaron los 50 compuestos

que mostraron las energías de interacción más favorables para su posterior

evaluación en el ensayo de competición.

En la tabla 6 se muestran las estructuras químicas de los 50 compuestos

seleccionados junto con los valores de energía de unión obtenidos y los

aminoácidos que intervienen en las interacciones detectadas.

Se analizaron los complejos péptido-ligando uno a uno, a través de una

inspección visual (SYBYL 7.3), localizando los aminoácidos que podrían estar

implicados en la unión, según criterios de distancia (4 Å). Esta distancia es lo

suficientemente amplia para incluir interacciones de van der Waals, enlaces de

hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, etc.

Los primeros 14 compuestos presentan estructuras relacionadas y

pertenecen a nuestra quimioteca (código USP). Todas ellas se encuentran en un

rango de energía entre -14.17 y -11.56 kcal mol-1, que corresponde a una

diferencia de 2.61, valor cercano al que corresponde a la desviación estándar de

AutoDock (2.1 kcal mol-1)192 y por lo tanto se puede considerar que todas ellas

poseen una afinidad similar desde el punto de vista teórico.


132

Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.

Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)

Unión al PAMP

% A SPR

USP1K O

NN

N

O NN

N-14.17

ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10

85.8 ± 5.5 positivo

USP3L O

NN

O

NN

OO

-13.89

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,

ARG10

104.4 ± 5.8 -

USP1L NN

NO

N

NNO

-13.51

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10,

PHE9

84.4 ± 2.7 dudoso

USP3N O

NN

OO

NN

O

-13.35 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13

84.8 ± 6.1 negativo

USP2M O O O

NHHN

OO O

HN

HN

-13.25

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10, PHE9


USP1J ONN

N

O

NN

N

-13.07

ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10,

PHE9

97.3 ± 8.7 -

USP2J O O O

HNHN

O

O O

HNHN

-13.06

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, ASN14, TRP13, ARG10,

2 enlaces H (TRP13)

99.5 ± 3.4 -


133


Unión al PAMP

% A SPR

USP2L O

O O

NHHN

OO O

NHHN

-12.81

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, ASN14, TRP13, LYS12

2 enlaces H (TRP16)

104.9 ± 2.9 -

USP2K O

O O

HN

HN OO O

NHHN

-12.31

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13,

LYS12 1 enlace H (TRP13)

99.0 ± 7.6 -

USP3M

NN

ON

N

OO O -12.29

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10,

PHE9

82.2 ± 11.9 insol.

USP2N O O O

HNHN O

O O

HNHN -12.18

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13

129.4 ± 11.5 -

USP3J O

NN

O

NN

OO

-12.10

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10, PHE9


USP1N ONN

N

O

NN

N

-11.85 ARG20, SER19, ALA17, TRP16,

TRP13

94.0 ± 3.2 -

USP1M ONN

N

O

NN

N

-11.56 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10

108.5 ± 6.3 -


134


Unión al PAMP

% A SPR

371884

N

NN

NH2

NN

H2N

NHH

-10.22 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13

103.9 ± 9.0 -

371876 N

H2NN N

N

NH2


98.6 ± 5.8 -

371878

NH2

NN

NN

H2N

-9.46


ARG10

104.3 ± 6.5 -

3354 HOO O


91.2 ± 2.1 -

611615

N

O

O

O PO

O

O

H

-9.29

ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10,

PHE9 1 enlace H (ARG10)

107.0 ± 14.8 -

26645 HO

O O -9.23

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13

98.4 ± 7.5 -

160391 OH

ON

O

NH

O CF3

CF3

F3C

F3CH

-9.24

LEU18, LYS15, ASN14, LYS12, LYS11, ARG10

3 enlaces H (LYS 15, 12, 11)

92.1 ± 2.6 -

64111 PP

H

H

-9.16 ARG20, ALA17, TRP16, TRP13

84.6 ± 7.2 agregac.


135


Unión al PAMP

% A SPR

343227

Cl

NNN

N

Cl

NN

-8.95


ARG10 1 enlace H (ARG10)

88.0 ± 8.6 insol.

372046

NH2

N N

NN

NH2

-8.90


109.0 ± 7.8 -

00067 NN

N

N

NN


96.5 ± 2.3 -

49487 NS

NNN

S

S

N

N

N N

S

H

H

H

H

-8.90


ARG10


659162 CF3

NSSN

HNF3C H

N

-8.86

ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13

2 enlaces H (TRP13,16)

109.0 ± 12.5 -

372294

O

O

N

ON

N

O2N

HH

H


92.7 ± 2.4 -

128437

N O

N O

HO3S

H

H

-8.69


ARG10

101.1 ± 5.9 -


136


Unión al PAMP

% A SPR

42384

NH2

N

NN

N

S

-8.67 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10

91.4 ± 5.1 -

116654

OHO

NHHO3S

N

-8.65 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,

TRP13

96.7 ± 4.4 -

87877

OHN

NN

SO3H

HO3S

-8.63




42258 NN

HN

NH

-8.63


ARG10

89.7 ± 2.3 agregac.

113491 N

ON

NNNN

N

ON

ON

N

O

-8.62



76.4 ± 2.3 insol.

282027 HN

NHNN

N

HN

N NN

NH


95.3 ± 1.7 -

116702 O

NN

-8.60 ARG20, SER19, ALA17, TRP16,

TRP13

72.1 ± 9.3 dudoso


137


Unión al PAMP

% A SPR

106221

O

N

NN

O

N

NN

ON

O

N

NO

H

H

H

-8.59


1 H enlace (ARG10)

95.1 ± 3.3 -

23922

NH2


105.5 ± 2.1 -

26273 OHO

HO OH

NN

S

N N

-8.57


ARG10

109.2 ± 8.1 -

211736 NH2 H

N

NN

N

HP -8.57


76.0 ± 0.4 agregac.

23217 N

S

NHH

-9.09


ARG10


601364 HO S

O

O O N

NN N

O

SHO O

O

-8.54

ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,

TRP13 1 enlace H (ARG20)


299589

Cl

NN

NO

HNO

NH-8.51


1 enlace H (ARG10)

80.1 ± 21.3 agregac.


138


Unión al PAMP

% A SPR

172614 NN

SN

NHO

HO ON N

NH2

NO2

-8.51 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,

TRP13

86.3 ± 4.6 dudoso

361814

O

NN

O

O

NS

O

N

S

-8.50

ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,

TRP13 1 enlace H (TRP13)

92.5 ± 0.4 -

56452 S

N N

NH2

NN

-8.48


85.5 ± 8.8 dudoso

327705

ClS N

NN

O

O

-8.47


1 enlace H (ASN14)

88.4 ± 6.1 agregac.

632536 HN

NH

HN

-8.46 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13

96.2 ± 7.8 -

270718 OH

OClCl

Cl

ClCl

Cl

Cl

Cl

Cl

ClCl

ClS

HO O

O

-8.45

ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,

ARG10 2 enlaces H

(ASN14, ARG10)

97.4 ± 1.2 -

126710 O

N

H2N

N

NH2

NO2

ClCl

-8.45

ARG2, VAL5, ALA6, PHE9,

ARG10, TRP13, 2 enlaces H (ARG2-NO2)

99.4 ± 1.9 -

Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.


139

En la figura 18 se muestra la frecuencia de interacción con aminoácidos en

los complejos PAMP-ligando de los 50 compuestos seleccionados.

Como se puede observar, los aminoácidos TRP13, ASN14, TRP16, ALA17 y

ARG20 están a menos de 4 Å de distancia del ligando en más del 80% de los

complejos predichos por AutoDock. Las moléculas que presentaron mejor energía

de interacción se unen precisamente a esta región del péptido y se observa que,

con mucha frecuencia, los anillos aromáticos presentes en los ligandos se apilan

con los anillos indólicos, predominantemente con el del TRP16. Sin embargo, estas

observaciones son incompletas debido a la rigidez del modelo utilizado. Para

estudiar con más profundidad las interacciones péptido-ligando se han propuesto

estudios de dinámica molecular para algunos de los ligandos mencionados.

Figura 18: Frecuencia de interacción con aminoácidos en los complejos PAMP-ligando

8

30

13

49

41

7

49 49

1

32

48

0

10

20

30

40

50

60

PHE9

ARG

10

LYS1

1

LYS1

2

TRP1

3

ASN

14

LYS1

5

TRP1

6

ALA1

7

LEU

18

SER

19

ARG

20


140


Para poder llevar a cabo los ensayos biológicos, así como los estudios de

afinidad, se solicitaron al NCI los compuestos de la quimioteca seleccionados.

El ensayo de competencia con el anticuerpo monoclonal αPAMP se puso

a punto en nuestro laboratorio. Aunque el ensayo es similar al descrito para la AM,

fue necesario marcar el anticuerpo y determinar las condiciones de trabajo

idóneas, tales como las concentraciones de los anticuerpos, el tipo de placa a

utilizar y los tiempos de medida.

Los 50 compuestos seleccionados se sometieron al ensayo de

competición a una concentración 1 µM. Los registros de absorbancia (%A) para

cada uno de los compuestos ensayados se muestran en la figura 19 y en la tabla

6.

Como se puede observar, más de la mitad de los compuestos son

capaces de disminuir los registros de absorbancia confirmando experimentalmente

las predicciones de AutoDock.

Para posteriores ensayos se seleccionaron los 20 compuestos que

disminuyen la absorbancia más de un 10%. En la tabla 6 el código de estos

compuestos está indicado de color azul.

0

90

USP

1KU

SP3L

USP

1LU

SP3N

USP

2MU

SP1J

USP

2JU

SP2L

USP

2KU

SP3M

USP

2NU

SP3J

USP

1NU

SP1M

3718

8437

1876

3718

7833

5461

1615

2664

516

0391

6411

134

3227

3720

4660

0067

4948

765

9162

3722

9412

8437

4238

411

6654

8787

742

258

1134

9128

2027

1167

0210

6221

2392

226

273

2117

3623

217

6013

6429

9589

1726

1436

1814

5645

232

7705

6325

3627

0718

1267

10 Ac

Compuestos (1uM)

% A

Figura 19: Resultados del ensayo de competición. Registros de absorbancia a 450 nm (%A); los compuestos con código USP pertenecen a nuestra

quimioteca; los que sólo poseen código numérico pertenecen a la colección del NCI. Ac representa el anticuerpo sin marcar (control positivo de inhibición).

Discusión y Resultados

142


Como se ha mencionado en el capítulo I de esta memoria, la SPR constituye

una técnica validada para la detección de interacciones ligando-receptor e incluso en

algunos casos permite cuantificar dicha interacción.

Por este motivo los 20 compuestos seleccionados mediante el ensayo de

competición fueron sometidos a experimentos de SPR en colaboración con la Dra.

Danièle Altschuh, del Laboratorio de Biotecnología de Interacciones Moleculares,

Escuela Superior de Biotecnología de Estrasburgo (Francia).

De los 20 compuestos seleccionados, tres de ellos (USP3M, 343227 y

113491) no fueron evaluados debido a que no se solubilizaron al 100% en DMSO.

Por otro lado, los compuestos 64111, 42258, 211736, 299589 y 327705 dieron respuestas superiores a la respuesta máxima calculada (Rmáx), lo que hace

suponer que existe agregación.

Entre los compuestos que pudieron ser evaluados, tres de ellos dieron una

respuesta positiva inequívoca (USP1K, USP3J y 49487). Los sensorgramas

correspondientes a los compuestos USP1K y 49487 se muestran en la figura 20.


143

Figura 20: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los

compuestos USP1K (a) y 49487 (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).

Los compuestos 56452, USP1L, 116702 y 172614 dieron resultados

positivos, sin embargo, la respuesta no es dosis-depediente y la fiabilidad del

experimento es menor que en los casos anteriores. Un ejemplo se muestra en la

figura 21(a).

Los compuestos USP2M, USP1N, USP3N, 23217, 87877 y 601364 en este

experimento dieron resultados negativos (ejemplo en la figura 21 (b)).

-10

-5

0

5

10

15

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s

RU B la nk S u btra cted S en sorgram s

UR 15

10

5

0

-5

-10

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)

a

-10

-5

0

5

10

15

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s

RU B la nk S u btra cted S en sorgram s

UR 15

10

5

0

-5

-10

-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)

a

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e

Blank Subtracted Sensorgrams

-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

b

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

60

50

40

30

20

10

0

-10

-20

-30

b


144

Figura 21: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los

compuestos 56452 (a) y USP1N (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).

Estos resultados ponen de manifiesto que el protocolo utilizado en este

trabajo, que se basa en un cribado virtual seguido de un ensayo de competición

rápido y sencillo, permite detectar compuestos que se unen al PAMP.

a

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

a

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

a

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

-100 -50 0 50 100 150 200

Tim e s

RU

Res

pons

e


-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

UR

20

15

10

5

0

-5

-10

-15

-20

-10

-5

0

5

10

-100 -50 0 50 100 150 200

Time s

RU

Res

pons

e

Blank Subtracted SensorgramsUR

10

5

0

-5

-10

-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

-10

-5

0

5

10

-100 -50 0 50 100 150 200

Time s

RU

Res

pons

e


10

5

0

-5

-10

-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)

-10

-5

0

5

10

-100 -50 0 50 100 150 200

Time s

RU

Res

pons

e


10

5

0

-5

-10-10

-5

0

5

10

-100 -50 0 50 100 150 200

Time s

RU

Res

pons

e


10

5

0

-5

-10

-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)


145

II. 2. 4. Dinámica Molecular (DM) Los datos descritos anteriormente ponen de manifiesto que, compuestos

como USP1K y USP1N, que poseen estructuras muy similares y sólo se

diferencian en la longitud de la cadena metilénica, se comportan de forma muy

diferente en su interacción con PAMP.

Por un lado, en los experimentos de docking, los complejos poseen

energías muy similares (USP1K: -14.17 kcal mol-1 y USP1N: -11.85 kcal mol-1) y,

como se ha mencionado anteriormente, están próximos al margen de desviación

estándar del método. Sin embargo, tanto en el ensayo de competición como en

SPR, únicamente el compuesto USP1K mostró afinidad por el péptido, mientras

que el compuesto USP1N no presenta afinidad por el PAMP, como se muestra en

la figura 21.

Con la finalidad de profundizar en el modo de unión del compuesto USP1K a nivel atómico y considerar la flexibilidad tanto del ligando como del receptor, se

llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular, tanto para el péptido libre

como para el complejo entre el PAMP y el compuesto USP1K. Por otro lado, y con

el fin de obtener datos termodinámicos comparables, se aplicó el mismo protocolo

para el complejo PAMP-USP1N.

Como punto de partida para las simulaciones de DM se utilizó la primera

de las conformaciones depositadas de la estructura del péptido (código PDB =

2fly)8 y el complejo obtenido a partir de los estudios de docking. Tanto los dos

complejos como el péptido libre fueron neutralizados con cinco iones Cl- y

minimizados en vacío.

A continuación, con el módulo xleap de AMBER, se construyó una caja de

agua y, una vez inmersos en ella, los complejos se volvieron a minimizar. Los

parámetros para los compuestos USP1K y USP1N se derivaron por analogía de

trabajos previos realizados con compuestos de la misma serie.6 Se aplicaron

condiciones de límite periódico y las interacciones electrostáticas fueron tratadas

con el método Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 con un espaciado de malla de 1


146

Å. La distancia de corte (cut off) para las interacciones entre los átomos fue de 8

Å. El algoritmo SHAKE203 fue aplicado a todos los enlaces con hidrógenos con un

intervalo de integración de 1.0 fs.

Tanto los complejos como el péptido libre se sometieron a un proceso de

equilibrado en varias etapas, que se detallan en la parte experimental y finalmente

a la dinámica de producción durante 9 ns a 300 K. Las simulaciones de dinámica molecular proporcionan coordenadas

respecto al tiempo, permitiendo un análisis detallado de la evolución

conformacional del sistema. La representación de la desviación cuadrática media

(RMSD) de las estructuras respecto a la inicial en función del tiempo da

información acerca de la estabilidad del complejo dinámico. Valores elevados de

RMSD indican un alto grado de desviación respecto de la estructura original. Este

valor fue monitorizado para los átomos principales del esqueleto de la proteína

(Cα, C, N) a lo largo del tiempo de simulación. En la figura 22 se recogen los

valores de RMSD para el complejo PAMP-USP1K y el péptido libre.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500

Tiempo (ps)

RM

SD (A

)

Figura 22: RMSD (Å) del complejo PAMP-USP1K (verde) y del PAMP libre (rojo).

En los dos casos, la representación de los valores de RMSD muestra un

movimiento considerable del esqueleto del péptido, estabilizándose en los últimos

2.5 ns de la simulación. Los valores oscilan dentro de un rango que, en el caso del


147

complejo, no supera los 2 Å. Esta desviación de la conformación original, que se

evidencia en la gráfica, se debe a que tanto en la simulación del péptido libre,

como en la del complejo, la hélice del PAMP se pliega sobre sí misma a lo largo

del tiempo de la simulación. En la figura 23 se muestra cómo la hélice del péptido

en el complejo se pliega en forma de U a lo largo de la trayectoria, reforzando de

esa forma la interacción con el compuesto USP1K.


148

t=0 ns

t=2 ns

t=3 ns

t=4 ns

t=5 ns

t=6 ns

t=7 ns

t=8 ns

t=9 ns

Figura 23: Evolución de la estructura del complejo PAMP-USP1K a lo largo del

tiempo de simulación.


149

De acuerdo con estos resultados, podríamos considerar que, a partir de

los 6.5 ns de simulación, el sistema se encuentra próximo al equilibrio. Por lo

tanto, éste es el periodo donde hemos de realizar todos los análisis posteriores.

Una estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns se muestra en la figura 24.

Figura 24: Estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns de simulación del complejo

PAMP-USP1K.

En esta estructura se observa claramente el plegamiento y una posible

interacción entre los anillos aromáticos del ligando y las argininas de los extremos

del péptido (ARG2 y ARG20). Este tipo de interacción podría corresponder a

interacciones catión-π. También podrían existir interacciones de apilamiento entre

el TRP13 y uno de los anillos aromáticos de USP1K. Para analizar en detalle las

ARG2

ARG20

PHE9

TRP13

MT2

TL2

MT1TL1

TRP16

ARG2

ARG20

PHE9

TRP13

MT2

TL2

MT1TL1

TRP16


150

interacciones presentes entre el compuesto USP1K y el PAMP a lo largo de la

DM, es útil nombrar los diferentes fragmentos que forman parte de la estructura

(figura 25).

O

NN

N

O NN

N

MT1

TL1

MT2

TL2

TR1 TR2

CD5

Figura 25: Nombres asignados a cada uno de los fragmentos del compuesto USP1K.

Las interacciones catión-π están consideradas entre las más importantes

en sistemas biológicos para el reconocimiento molecular.235-237 Para la arginina, la

aproximación del grupo guanidinio a la nube de electrones π ha sido caracterizada

por dos ángulos α y β representados en la figura 26.238 Según este esquema, α es

el ángulo formado entre el plano del anillo y un vector que conecta su centroide

con el Cζ de la arginina, y β es el ángulo que forman el plano del grupo guanidinio

y el vector que une el Cζ con el centroide del anillo aromático. En estos sistemas

son posibles dos geometrías límites: una en donde el anillo aromático y el catión

plano se apilan colocándose paralelos, y otra en la que el guanidinio se coloca

perpendicular al anillo bencénico. Si bien los cálculos en fase gaseosa indican que

la geometría perpendicular es más favorable desde el punto de vista

termodinámico, esta preferencia se invierte completamente en simulaciones en

presencia explícita de disolvente. Esto podría deberse a que en posición paralela

la guanidina puede establecer enlaces de hidrógeno más fácilmente, por ejemplo

con el agua.


151

Por otro lado Gallivan y Dougherty encontraron que un 99% de las

interacciones significativas catión-π ocurren a distancias que no exceden los 6

Å.239 Estas distancias se representan en la figura 26.

CNH2

HN

H2N

R

β1

α1

d1

C

TL1

CNH2

HN

H2N

R

β2

α2

d2

C

MT2Figura 26: Estructura de las interacciones catión-π donde se indican las distancias y

ángulos que las definen.

Este tipo de interacción se observa desde el comienzo de la simulación

entre MT2 y la ARG20 y, más adelante, entre MT1 o TL1 y la ARG2. La figura 27 muestra una monitorización de las distancias d1 y d2 a lo largo

del tiempo de simulación. En ella se puede observar cómo se mantiene constante

la distancia d2 con valores entre los 3 y 6 Å. La inspección visual de la estructura a

lo largo de la simulación también revela el hecho de que el grupo guanidinio de la

ARG20 se coloca paralelo al anillo MT2.


152

0

5

10

15

20

25

30

35

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000

tiempo (ps)

dist

anci

a (A

)

Figura 27: Monitorización a lo largo del tiempo de simulación de las distancias d1 (ARG2-

MT1: verde; ARG2-TL1: azul) y d2 (ARG20-MT2: naranja) del complejo USP1K -PAMP.

Para confirmar estas observaciones se midió la evolución de los ángulos α

y β a lo largo de la trayectoria. En la figura 28 se puede observar que los ángulos

se mantienen alrededor de los 90º, permitiendo que los planos del grupo

guanidinio de la ARG20 y el anillo bencénico se mantengan prácticamente

paralelos y superpuestos todo el tiempo. Este comportamiento revela la estabilidad

de la interacción ARG20-MT2 que puede justificarse considerando que el anillo

MT2 está unido a un átomo de oxígeno electrodonador.


153

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

050

010

0015

0020

0025

0030

0035

0040

0045

0050

0055

0060

0065

0070

0075

0080

0085

00

tiempo (ps)

Áng

ulo

(º)

Figura 28: Monitorización de los valores de α (azul) y β (verde) en la interacción ARG20-

MT2 a lo largo del tiempo de simulación del complejo USP1K -PAMP.

Cuando el péptido se empieza a plegar y el complejo se estabiliza (últimos

2.5 ns), aparece una nueva interacción catión-π entre la ARG2 y los anillos TL1 y

MT1 de USP1K que se alternan durante la simulación. En la figura 27 se puede

observar claramente como los dos grupos se van acercando hasta lograr una

distancia compatible con este tipo de interacción. En el último tramo de la

dinámica puede observarse como las distancias se compensan, de modo que el

guanidinio puede interaccionar con MT1 y a continuación con TL1. También en

este caso se estudió la evolución de los ángulos en el tiempo. Los datos se

recogen en la figura 29.


154

(a)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000

tiempo (ps)

Ángu

lo (º

)

(b)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000

tiempo (ps)

Áng

ulo

(º)

Figura 29: Monitorización de los valores de α y β a lo largo del tiempo de simulación. (a) ángulo

α: ARG2-TL1 (azul) y ARG2-MT1 (rojo); (b) ángulo β: ARG2-TL1 (azul) y ARG2-MT1 y (rojo).

La medida de los ángulos fluctúa mucho más a lo largo de los últimos 2.5

ns y esto corrobora la alternancia entre la interacción del guanidinio con MT1 y

TL1 en la interacción catión-π. Este hecho se puede observar mucho más

claramente en una animación.


155

Otra de las interacciones que se puede observar es el enlace de hidrógeno

que se establece entre los nitrógenos pertenecientes a uno de los triazoles de

USP1K (aceptores) y el hidrógeno del guanidinio de la ARG20 (figura 30)

Figura 30: Detalle de la estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns de simulación

del complejo PAMP-USP1K. La línea segmentada amarilla representa el enlace de H entre

N3 de la ARG 20 y los nitrógenos N1 y N2 del triazol (TR2) del ligando.

Jeffrey240 clasifica los enlaces de hidrógeno con distancias donador-

aceptor de 2.2 a 2.5 Å como “fuertes, predominantemente covalentes”, los de 2.5 a

3.2 Å como “moderados, principalmente electrostáticos” y los de 3.2 a 4.0 Å como

“débiles electrostáticos”. En este caso se evaluaron las distancias entre donador y

aceptor en nuestro complejo, considerando que tanto N1 como N2 en el triazol

podrían actuar como átomos aceptores mientras que N3 (en el grupo guanidinio)

actúa como donador, obteniéndose unos valores medios de 3.77 Å y 3.31 Å para

N1-N3 y N2-N3 respectivamente (figura 31). De acuerdo con la clasificación anterior,


156

se trataría de un enlace de H “débil electrostático” que involucra dos átomos

aceptores, enlaces que se denominan “tricéntricos”.

0

2

4

6

8

10

12

050

010

0015

0020

0025

0030

0035

0040

0045

0050

0055

0060

0065

0070

0075

0080

0085

0090

00

tiempo (ps)

dist

anci

a (A

)

Figura 31: Monitorización de las distancias aceptor-donador de enlaces de hidrógeno: N1-

N3 (rojo); N2-N3 (azul) a lo largo del tiempo de simulación.

También es importante el ángulo formado entre los tres átomos

implicados, donador-H-aceptor, y típicamente se encuentra entre 130º y 180º.240

Estos ángulos también fueron monitorizados obteniéndose un valor medio de 158º

para el ángulo N3-H-N1 y de 148º para el ángulo N3-H-N2, que coinciden con los se

encuentran típicamente para estas interacciones.

Como se mencionó antes, el enlace de hidrógeno favorece el hecho de

que el anillo MT2 y el guanidinio se orienten de forma paralela, ya que en esta

disposición no sólo se establece una interacción catión-π con el guanidinio, sino

que además éste es capaz de actuar como donador de enlace de H.

A lo largo de la simulación se observó un tercer tipo de interacción que,

como las anteriores, proporciona mayor estabilidad a la unión péptido-ligando. Se


157

trata de una interacción de apilamiento π-π entre residuos aromáticos, donde los

anillos tienden a apilarse como monedas. La interacción es consecuencia del

solapamiento de los orbitales en sistemas π conjugados y se fortalece cuanto

mayor sea el número de electrones π del sistema.

En el caso del complejo PAMP-USP1K, este comportamiento se observa

entre el anillo indólico del TRP13 y el anillo TL2 del ligando, y entre el fenilo de la

PHE9 y el anillo TL1 de USP1K. La figura 32 muestra la distancia entre los centros

de masa de los anillos aromáticos implicados a lo largo del tiempo de simulación.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

050

010

0015

0020

0025

0030

0035

0040

0045

0050

0055

0060

0065

0070

0075

0080

0085

0090

00

tiempo (ps)

dist

anci

a (A

)

Figura 32: Monitorización de las distancias entre los centros de masa de anillos aromáticos:

TL1-PHE9 (rojo); TL2-TRP13 (azul) a lo largo del tiempo de simulación.

Como se puede observar, en el último tramo de la simulación las

distancias se mantienen en rangos aceptables para el apilamiento paralelo, tanto

entre TL1 y PHE9, como entre TL2 y TRP13.


158

II. 2. 4. 1. Cálculo de la afinidad de unión (MM-GBSA y MM-PBSA)

Para estudiar de forma teórica las diferencias de afinidad al PAMP que

exhiben los compuestos USP1K y USP1N y estimar la entalpías de unión, se

aplicaron las técnicas MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson Boltzmann

Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born Surface

Area).211, 241 Estos métodos proporcionan una combinación de modelos para poder

determinar la energía de unión (∆Gbind).

∆Gbind = ∆Hbind – T∆Sbind

∆Hbind = ∆GMM + ∆Gsolv

∆GMM = ∆GvdW + ∆Gelec + ∆GINT

∆Gsolv = ∆Gsolv pol + ∆Gsolv np

∆Gsolv np = γ SASA + β

La energía interna del complejo (∆GINT), los cambios en las interacciones

de van der Waals (∆GvdW) y electrostáticas (∆Gelec) se pueden evaluar mediante

métodos de mecánica molecular. La energía libre de solvatación (∆Gsolv) se calcula

sumando la contribución electrostática (∆Gsolv pol) a la contribución no polar (∆Gsolv

np). La energía libre electrostática de solvatación (∆Gsolv pol) se puede obtener por el

método Poisson-Boltzmann (PB) o por el método generalizado de Born (GB). La

energía libre hidrofóbica (∆Gsolv np) es una función lineal de la superficie accesible

al disolvente (SASA), donde γ es la tensión superficial y β el término

independiente.

También se puede estimar el cambio de la entropía durante la asociación

del péptido al ligando, T∆Sbind, mediante el módulo de AMBER NMODE.

La contribución entálpica proporciona una medida de la fuerza de las

interacciones entre el péptido y el ligando (enlaces de hidrógeno, interacciones de

van der Waals), en relación con aquellas con el disolvente. La contribución

entrópica, por otra parte, se relaciona con el cambio en la entropía del disolvente


159

que surge del repliegue de grupos hidrofóbicos a consecuencia de la unión y la

pérdida de libertad conformacional del soluto (traslacional, vibracional y

rotacional).242

Como cabría esperar para dos compuestos de estructura tan parecida, los

valores T∆Sbind para ambos complejos son muy similares y contribuyen a la

inestabilización del sistema (tabla 7). Sin embargo, la diferencia importante se

observa en los valores de ∆Hbind.

En las figuras 33, 34 y en la tabla 7, se representa la evolución de la

energía de unión y algunos de sus principales componentes a lo largo del tiempo

de simulación para los complejos PAMP-USP1K y PAMP-USP1N. Como puede

observarse en la figura para ambos complejos, los valores de energía calculados

por los dos métodos disponibles (PB y GB) son similares.

La contribución entálpica del complejo PAMP-USP1K calculada por ambos

métodos posee valores negativos, mientras que para el complejo PAMP-USP1N

se obtienen valores positivos. Estos resultados están de acuerdo con los datos

experimentales que demuestran que USP1K se une al PAMP y mientras que

USP1N no se une.

Además, es importante destacar que una de las principales diferencias en

la contribución energética se aprecia en la energía electrostática (∆Gelec). Estos

datos reflejan la importancia, en el caso del complejo PAMP-USP1K, de las

interacciones de tipo electrostático anteriormente descritas (catión-π, π-π y enlace

de hidrógeno) que no están presentes en el complejo PAMP-USP1N.


160

(b)

-60-50-40-30-20-10

0102030405060

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

tiempo (ps)

Ener

gía

(kca

l mol

-1)

Figura 33: Evolución de la energía libre de unión a lo largo del tiempo y sus principales

componentes, para el complejo PAMP-USP1K. (a) ∆Hbind PB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec PB,

azul; ∆GvdW PB, fucsia. (b) ∆Hbind GB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec GB, azul; ∆GvdW GB, fucsia.

(a)

-60-50-40-30-20-10

0102030405060

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

tiempo (ps)

Ener

gía

(kca

l mol

-1)


161

(a)

-100

-50

0

50

100150

200

250

300

350

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

tiempo (ps)

Ener

gía

(kca

l mol

-1)

(b)

-100-50

050

100150200250300350

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

tiempo (ps)

Ener

gía

(kca

l mol

-1)

Figura 34: Evolución de la energía libre de unión a lo largo del tiempo y sus principales

componentes, para el complejo PAMP-USP1N. (a) ∆Hbind PB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec

PB, azul; ∆GvdW PB, fucsia. (b) ∆Hbind GB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec GB, azul; ∆GvdW GB,

fucsia.


162

Energía (kcal mol-1) PAMP-USP1K PAMP-USP1N ∆Gelec -10.78 (6.89) 245.81 (6.72) ∆GvdW -36.32 (4.38) -21.53 (3.39) ∆GINT 1.84 (0.59) 7.26 (2.71) ∆GMM -45.26 (8.48) 231.55 (8.13)

∆Gsolv np (PB) -4.08 (0.33) -3.33 (0.29) ∆Gsolv pol (PB) 32.72 (6.01) 53.22 (5.55) ∆Gsolv (PB) 28.63 (5.92) 49.89 (5.55) ∆Hbind (PB) -16.63 (5.86) 281.44 (5.79) ∆Gsolv np (GB) -5.88 (0.48) -4.80 (0.42) ∆Gsolv pol (GB) 25.35 (5.63) 46.33 (5.25) ∆Gsolv (GB) 19.47 (5.61) 41.52 (5.31) ∆Hbind (GB) -25.79 (4.46) 273.07 (5.19)

T∆S -22.43 (2.28) -23.38 (3.09) Tabla 7: Energías promedio en kcal mol-1 con su correspondiente desviación estándar

entre paréntesis. ∆Gelec, energía electrostática calculada con el campo de fuerzas;

∆GvdW, energía de van der Waals calculada con el campo de fuerzas; ∆GINT, energía

interna (enlace, ángulos y diedro); ∆GMM, energía total en fase gaseosa; ∆Gsolv np, contribución no polar a la energía libre de solvatación; ∆Gsolv pol, contribución polar a la

energía libre de solvatación; ∆Gsolv, energía libre de solvatación; ∆Hbind, contribución

entálpica a la energía libre de unión y T∆S, contribución entrópica a la energía libre de

unión.

Si bien la pérdida de entropía es similar para ambos complejos, es

evidente que la magnitud relativa de su contribución a la energía total de unión

(∆Gbind) es diferente. En el caso del complejo PAMP-USP1N la contribución

entrópica desfavorable se ve reforzada por la entálpica, lo que conduce a un

resultado que indica una asociación desfavorable (∆GbindPB = 258.06 kcal mol-1 y

∆GbindGB = 249.69 kcal mol-1). Sin embargo, en el caso del complejo PAMP-

USP1K, la contribución entálpica favorable y el cambio de entropía desfavorable

se oponen. Según el método de cálculo aplicado en el cálculo de la entalpía,

∆Gbind es igual a 5.8 kcal mol-1 (PB) ó -3.36 kcal mol-1 (GB).


163

Aunque no es correcto pretender que los valores de las energías halladas

coincidan con valores determinados experimentalmente, a pesar de la diferencia

registrada entre los métodos y considerando los errores, sí se puede concluir que

la tendencia que indican las energías de binding se correlaciona con los hechos

experimentales.

Además de la energía total del sistema, los cálculos computacionales nos

permiten descomponer las energías libres en contribuciones individuales y

determinar cuál es la aportación que hacen los distintos residuos o constituyentes

del complejo a la energía final de unión. Nos interesó particularmente la

interacción catión-π que se establece entre los grupos guanidinios de las ARG 2 y

20 y los anillos aromáticos del compuesto USP1K.

En la tabla 8 se muestran los resultados de las energías medias, a lo largo

de toda la simulación, para las interacciones entre los guanidinios de las argininas

y los sistemas aromáticos de USP1K.

De acuerdo con estos resultados, estas interacciones realizan una

contribución entálpica a la energía libre de unión total favorable en todos los

casos. Es interesante destacar en este sentido, que ninguna de las interacciones

de los anillos aromáticos TL1 y MT1 con ARG2, realiza un aporte a la energía total

más favorable que la otra, lo cual concuerda con la alternancia de los anillos a lo

largo de la simulación. En cambio, sí puede decirse que la contribución de la

interacción de MT2 con ARG20 a la estabilidad del complejo es mucho más

importante en términos termodinámicos.


164

Energía (kcal mol-1) ARG2_MT1 ARG2_TL1 ARG20_MT2

∆Gelec 0.57 (0.16) -0.29 (0.10) -0.68 (0.96)

∆GvdW -0.02 (0.02) 0.00 (0.00) -0.33 (0.25)

∆GMM 0.55 (0.15) -0.29 (0.10) -1.02 (1.09)

∆Gsolv np (GB) 0.00 (0.00) 0.00 (0.00) -0.29 (0.24)

∆Gsolv pol (GB) -0.56 (0.16) 0.29 (0.10) 0.62 (0.68)

∆Gsolv (GB) -0.57 (0.16) 0.29 (0.10) 0.33 (0.70)

∆Hbind (GB) -0.01 (0.03) -0.01 (0.00) -0.69 (0.60) Tabla 8: Energías promedio en kcal mol-1 con su correspondiente desviación estándar

entre paréntesis. ∆Gelec, energía electrostática; ∆GvdW, energía de van der Waals; ∆GMM,

energía total en fase gaseosa; ∆Gsolv np, contribución no polar a la energía libre de

solvatación; ∆Gsolv pol, contribución polar a la energía libre de solvatación; ∆Gsolv, energía

libre de solvatación y ∆Hbind, contribución entálpica a la energía libre de unión.

También se estudió la contribución media que hacen cada uno de los

residuos a la entalpía de unión (∆Hbind) en los 2.5 ns finales de la simulación,

periodo donde se alcanza la estabilización del complejo. Los resultados se

muestran en la figura 35.


165

-4

-3

-2

-1

0

1

2

ALA1

ARG

2

LEU

3

ASP4

VAL5

ALA6

SER

7

GLU

8

PHE9

ARG

10

LYS1

1

LYS1

2

TRP1

3

ASN

14

LYS1

5

TRP1

6

ALA1

7

LEU

18

SER

19

ARG

20

Residuos

∆H

unió

n (kc

al m

ol -1

)

Figura 35: Contribución media a la entalpía de unión (∆Hbind) correspondiente a cada residuo en los

últimos 2.5 ns de simulación.

De acuerdo con los resultados obtenidos los residuos que realizan una

contribución favorable a la energía de unión y por lo tanto, a la estabilización del

complejo son ARG2, VAL5, ALA6, PHE9, TRP13, TRP16, ALA17 y ARG20.

Estos resultados confirman las interacciones que se mencionaron antes:

ARG2 y ARG20 implicados en interacciones catión-π, ARG20 formando un enlace

por puente de H y por tanto, contribuyendo en mayor medida a la estabilización del

sistema, y finalmente TRP13 y PHE9 en interacciones de apilamiento. Por otra

parte, se han puesto de manifiesto otras, de naturaleza hidrofóbica, entre la

cadena de 5 carbonos del compuesto USP1K (CD5) y los residuos VAL5, ALA6,

TRP16 y ALA17. Como era de esperar, la contribución de la ARG20 es muy superior a la de

ARG2 porque además de la interacción catión-π, existe un enlace por puente de

hidrógeno.

Para evaluar con más detalle esta contribución, se realizó una

descomposición en las diferentes fracciones de energía que corresponden a la

interacción de la ARG20 con el ligando USP1K, que se muestra en la tabla 9.


166

Residuo ∆Hbind (kcal mol-1) MT1 -0.05 TR1 -0.54 TL1 -0.07 CD5 -1.96 TL2 -0.17 TR2 -4.40 MT2 -0.65

Total -3.22 Tabla 9: Descomposición de la contribución entálpica a la energía libre de unión (∆Hbind)

de la interacción entre el aminoácido ARG20 y el ligando USP1K.

Esta nueva descomposición puso de manifiesto que en la interacción entre

la ARG20 y el ligando, la contribución fundamental se debe al enlace por puente de

hidrógeno, seguida de una interacción hidrofóbica con la cadena alifática y

finalmente por la interacción de tipo catión-π con el anillo aromático MT2.

En resumen, del estudio de dinámica molecular, se puede concluir que los

datos teóricos corroboran los datos experimentales y aportan información

estructural y energética interesante que puede ser utilizada para el diseño racional

de otros compuestos con mayor afinidad por el péptido.

Así, teniendo en cuenta que una de las interacciones más importante es la

establecida entre ARG20 y el anillo de triazol (TR2) junto con el anillo MT2, la

introducción de sustituyentes dadores de electrones en el anillo MT2 podría

contribuir a una estabilización del complejo.

También se ha observado que la longitud de la cadena alifática debe

mantenerse puesto que una distancia mayor impide que se establezcan las

interacciones anteriormente mencionadas.

Por otra parte, los experimentos SPR han puesto de manifiesto que el

compuesto USP3J también es capaz de unirse al PAMP. Es de suponer que esta

estructura interaccione con el péptido de manera similar a como lo hace USP1K.


167

Sin embargo, todas estas suposiciones deberán ser confirmadas cuando se

finalicen los experimentos de RMN que se mencionan más adelante.

II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica

El objetivo final de este trabajo es el diseño de compuestos con actividad

antiangiogénica a través de la modulación negativa de la actividad del PAMP.

Como ya se describió en la introducción de esta memoria, el PAMP ha

mostrado ser un potente agente antiangiogénico que supera incluso la actividad

del VEGF en modelos animales.12

Por ello, todos los compuestos que mostraron afinidad en el ensayo de

competición, se seleccionaron para evaluar su actividad antiangiogénica en el

ensayo de anillos aórticos de embrión de pollo. Este trabajo se llevó a cabo en el

Instituto Cajal (CSIC) y estuvo a cargo del Dr. Alfredo Martínez.

Desafortunadamente ninguno de ellos mostró actividad antiangiogénica

apreciable.

Una posible explicación, es que al unirse al PAMP se comporten como

moduladores positivos de su actividad, es decir que tengan un efecto

proangiogénico. Debido a que el ensayo anterior no es capaz de detectar

compuestos proangiogénicos, aquellos compuestos que se comporten como

moduladores positivos del PAMP no pueden ser identificados con este

experimento. Para explorar esta posibilidad, se proyecta realizar un ensayo de

angiogénesis in vivo, el ensayo in vivo dirigido de angiogénesis (directed in vivo

angiogenesis assay, DIVAA),12, 118 con el fin de establecer de qué manera modulan

la acción del PAMP compuestos como USP1K, USP3J y 49487.

En caso de actuar como moduladores positivos podrían tener diferentes

aplicaciones farmacológicas como potenciales vasodilatadores ó por su acción

proangiogénica. Por ejemplo, en cirugía plástica se han realizado distintos

experimentos con el VEGF, con el fin de mejorar la perfusión tisular.243, 244


168

Por otra parte, la hipoxia e isquemia crónicas estimulan la expresión de

importantes mediadores de la angiogénesis, por lo que actualmente, están en

evaluación en ensayos clínicos nuevas estrategias terapéuticas que involucran la

estimulación de la angiogénesis en el tejido isquémico.245, 246

II. 2. 6. Pruebas antiproliferativas

Como parte de la evaluación biológica de los compuestos también se

realizó el ensayo de proliferación en la línea celular de cáncer de colon Caco-2.

Con este ensayo se pretende evaluar si los compuestos con afinidad por el PAMP

también son capaces de alterar la proliferación celular inhibiendo su crecimiento.

Aunque la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son

independientes, el hecho de que compuestos potencialmente antiangiogénicos

sean capaces también de inhibir el crecimiento celular resulta muy interesante,

puesto que esta complementariedad de funciones aumenta sus posibilidades

como candidatos a fármacos antitumorales.

El ensayo consistió en la incubación de un número determinado de células

por pocillo junto con el compuesto de prueba a dos concentraciones (10 µM y 100

µM). Se sometieron a la prueba los 26 compuestos que presentaron un registro de

absorbancia inferior al 95% en el ensayo de competición con el anticuerpo

monoclonal.

En este ensayo se obtuvieron resultados interesantes para los siguientes

compuestos: 42258, 299589 y USP1K, tal y como se muestra en la figura 36. Para

estos tres compuestos se determinaron los IC50 y se obtuvieron los siguientes

valores: 26.3 µM, 85.5 µM y 101.7 µM para USP1K, 42258 y 299589

respectivamente.

Como se ha mencionado anteriormente, el compuesto USP1K es capaz

de unirse al PAMP. Sin embargo, para 42258 y 299589 los experimentos de SPR

no permitieron sacar conclusiones ya que se produce agregación.


169

Por este motivo, hemos recurrido a la RMN para evaluar la capacidad de

unión, técnica que además nos permite estudiar las interacciones existentes entre

el ligando y el péptido.

0

20

40

60

80

100

120

140

Contro

lUSP1K

USP1LUSP3NUSP2M

USP3M

USP3J

6411

134

3227

4948

7

8787

7

4225

811

3491

1167

0221

1736

2321

760

1364

2995

8917

2614

5645

232

7705

% d

e pr

olife

raci

ón

Figura 36: Porcentaje de crecimiento celular respecto del control (células no tratadas), en la línea de cáncer de colon Caco-2 a las concentraciones de

10 (azul) y 100µM (naranja).


171


En la actualidad, una de las metodologías más empleadas para la

determinación de la estructura tridimensional de macromoléculas en disolución se

basa en la combinación de medidas de RMN y cálculos teóricos de mecánica y

dinámica molecular. Además, mediante esta estrategia no sólo se puede obtener

información estructural, sino también información dinámica, que no pueden aportar

fácilmente otras técnicas.

Para su estudio por RMN, inicialmente se seleccionaron los compuestos

USP1K, USP1N y 42258. De acuerdo con los experimentos de SPR, el compuesto

USP1K es capaz de unirse al PAMP, mientras que el compuesto USP1N no se

une. Por otro lado el compuesto 42258 ha sido seleccionado porque presenta una

interesante actividad antiproliferativa, aunque por SPR no se han obtenido

resultados concluyentes sobre su posible interacción con el PAMP.

Las pruebas fueron realizadas por el Dr. Antonio Pineda en el Centro de

Investigación Príncipe Felipe. Se llevaron a cabo principalmente experimentos

heteronucleares 2D HSQC 15N.

En primer lugar el PAMP marcado con 15N fue expresado con citocromo

b5 en Escherichia coli. El nivel de expresión fue aproximadamente de 10 mg/L de

proteína soluble por cultivo celular. A continuación, el péptido se purificó por

columna de intercambio iónico.

Las figuras 37 y 38 muestran la superposición de tres espectros: en color

negro el espectro del PAMP a 300 K en presencia de un 36% de TFE; en magenta

el espectro obtenido al añadir únicamente DMSO; y en rojo el que se obtiene al

añadir DMSO y los compuestos USP1K (figura 37) y 42258 (figura 38). En ambos

casos se puede observar que existen diferencias entre el desplazamiento

producido por los compuestos y el que se produce en presencia únicamente de

DMSO. Esta diferencia es mayor para el compuesto 42258, pero en ambos casos

los resultados permiten afirmar que existe interacción con el PAMP.


172

Cuando los experimentos se llevaron a cabo con el compuesto USP1N no

se observaron diferencias entre los espectros obtenidos, confirmándose el hecho

de que este compuesto no es capaz de formar un complejo estable con PAMP.

Estos resultados son especialmente interesantes, pues además de

confirmar tanto las predicciones teóricas, como corroborar los resultados de los

experimentos SPR, una vez que se resuelvan los espectros, dispondremos de

información concreta del modo de unión de los ligandos al PAMP, facilitando el

proceso de diseño de nuevos ligandos.

Este estudio se está ampliando al resto de los compuestos seleccionados,

especialmente para aquellos en los que mediante SPR no fue posible obtener

resultados concluyentes.


173

Figura 37: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro HSQC 15N

de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro HSQC 15N de PAMP-

USP1K (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).


174

Figura 38: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro

HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro

HSQC 15N de PAMP- 42258 (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).

II. 3. Conclusiones

Conclusiones

175

II. 3. Conclusiones

Se ha llevado a cabo un cribado virtual de la colección de compuestos del

NCI (NCI Diversity Set) junto con una colección de 60 compuestos de nuestra

quimioteca (en un total de 600 conformaciones distintas).

Se ha puesto a punto un ensayo de competición con el anticuerpo

monoclonal del PAMP. Este ensayo nos ha permitido seleccionar 20 compuestos

de un total de 50, capaces de competir con el anticuerpo monoclonal en su unión

al PAMP, que por lo tanto podrían actuar como moduladores de su acción. De

acuerdo con este procedimiento, el 40% de las predicciones de AutoDock podrían

considerarse correctas.

Las medidas de afinidad determinadas inicialmente para los compuestos

de nuestra quimioteca con la técnica SPR, mostraron que los compuestos USP1K,

USP3J y 49487 son capaces de unirse al péptido.

Mientras que el compuesto USP1K es capaz de unirse al PAMP, el

compuesto de estructura similar USP1N no lo es. Por este motivo, los complejos

péptido-ligando de estos compuestos se sometieron a simulaciones de dinámica

molecular. Un análisis detallado de la simulación del complejo PAMP-USP1K nos

permitió poner de manifiesto algunas interacciones interesantes. Se trata de

interacciones catión-π, interacciones de apilamiento, enlaces por puente de

Conclusiones

176

hidrógeno e interacciones hidrofóbicas que estabilizan la estructura del complejo

formado.

Para los dos complejos objeto de estudio se realizaron cálculos de energía

utilizando los métodos MM/PBSA y MM/GBSA. Se determinaron las energías

teóricas de unión de los complejos, además de las contribuciones energéticas por

residuo, corroborándose por estos métodos los datos experimentales obtenidos.

Por otro lado, se llevaron a cabo pruebas antiproliferativas de los 20

compuestos seleccionados, en la línea celular Caco-2 de cáncer de colon. Aunque

la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son independientes, el hecho de

que compuestos potencialmente antiangiogénicos sean capaces también de inhibir

el crecimiento celular resulta muy interesante, puesto que esta complementariedad

de funciones aumenta sus posibilidades como candidatos a antitumorales. Se

observaron resultados interesantes para los compuestos USP1K, 42258 y 299589.

Hasta ahora, 14 de estos compuestos han sido evaluados como agentes

antiangiogénicos mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo y

desafortunadamente ninguno de los compuestos ha resultado ser antiangiogénico.

Por último, a través de experimentos HSQC 15N, se estudió la interacción

entre dos compuestos y el PAMP. En este estudio, se pudo confirmar ambos

compuestos (42258 y USP1K) se unen al péptido formando complejos estables.

De acuerdo con las pruebas realizadas hasta el momento, se puede

concluir que estos dos compuestos, cuya capacidad para unirse al PAMP ha sido

demostrada experimentalmente con técnicas SPR y HSQC 15N y poseen

interesantes propiedades antiproliferativas, son muy buenos candidatos como

potenciales moduladores de la acción del péptido.

II. 4. Parte Experimental

Parte Experimental

177

II. 4. Parte Experimental II. 4. 1. Cribado Virtual II. 4. 1. 1. Preparación del péptido

Para este estudio se cuenta con una única estructura disponible

determinada usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C cuyo

código PDB es 2fly.8 De las veinte conformaciones depositadas en esta estructura

se seleccionó la primera por no haber diferencias significativas entre ellas.

En primer lugar, se eliminaron los hidrógenos no polares y se asignaron

cargas tipo Kollman UNI a todos los átomos utilizando SYBYL 7.3.

La malla 3D se centró en el residuo TRP16, aminoácido central de la región

elegida, en una caja de dimensiones 45 x 37 x 62 Å y 0.375 Å de espaciado para

los siguientes átomos: C, A (C aromático), N, S, H, F, Cl, Br, I, P y e

(electroestático) usando el programa AutoGrid v.3.

II. 4. 1. 2. NCI Diversity set

El NCI Diversity set es un conjunto reducido de 1990 compuestos

seleccionados de la base de datos 3D original del NCI y preparados para su

utilización con programas de docking en concreto para AutoDock. Se trata de una

lista de compuestos representativa de la diversidad química de una colección

mayor perteneciente al Programa de Desarrollo Terapéutico del Instituto Nacional

Parte Experimental

178

del Cáncer en Estados Unidos. En el esquema 4 se muestra el proceso de

selección que utiliza el NCI para los compuestos que pertenecerán al NCI Diversity

Set.

De los aproximadamente 140.000 compuestos que constituyen la

quimioteca del NCI, se seleccionan 71.756 compuestos que son aquellos de los

que se dispone de más de 1 g. A continuación se realiza la selección mediante el

programa Chem X, que define tres puntos farmacofóricos basados en aceptores ó

dadores de enlace de H, cargas positivas y negativas, sistemas aromáticos,

grupos hidrófobos, ácidos, bases e intervalos de distancia para crear un conjunto

finito de farmacóforos.

Esquema 4: Metodología que utiliza el NCI para seleccionar los integrantes del NCI

Diversity Set

Este proceso genera alrededor de 1.000.000 de farmacóforos para todas

las conformaciones aceptables de cada estructura. Finalmente el NCI Diversity Set

~140.000 compuestos

>1.0 g disponible

71.756 compuestos

3 puntos farmacofóricos(Chem X)

1990 compuestos

NCI Diversity Set

Parte Experimental

179

se construye por comparación de todos los farmacóforos para cada conformación

aceptable, incluyendo la estructura en el conjunto si posee cinco o más

farmacóforos nuevos y adicionalmente, cinco o menos enlaces rotables. Como el

proceso de selección depende del orden, las estructuras para este procedimiento

se consideran al azar.

Este protocolo conduce a 1990 compuestos de los que se construye un

archivo en el formato adecuado (pdbq), accesible en la red para su utilización

directa con el programa AutoDock.247 Esto implica agregar los hidrógenos polares,

asignar tipos de átomos, cargas puntuales tipo Gasteiger y los ángulos diedros

rotables.

Para nuestro estudio, de los 1990 compuestos, se eliminaron aquellos que

poseen en su estructura elementos distintos de C, N, S, H, F, Cl, Br, I y P para

simplificar la parametrización. Tampoco se incluyeron los pertenecientes a la

denominada “problem list” por el NCI, puesto que se conoce que dan problemas

con el programa AutoDock. El número total de compuestos pertenecientes al NCI

diversity set utilizados en este trabajo fue de 1836.

II. 4. 1. 3. Compuestos de nuestra colección

En este trabajo también se estudiaron una serie de compuestos

perteneciente a nuestra colección particular.

Los compuestos que poseen más de cinco enlaces rotables fueron

sometidos inicialmente a una búsqueda conformacional exhaustiva. Para ello se

construyeron las estructuras mediante el programa Macromodel248 y

posteriormente fueron sometidas a un refinamiento de la energía utilizando

mecánica molecular y el campo de fuerzas de AMBER.249

Después del refinamiento inicial, las estructuras se sometieron a una

búsqueda conformacional utilizando el programa Batchmin y el método Monte

Carlo,250 en el que los ángulos de la geometría inicial son relacionados y

modificados al azar. Una vez generada la nueva estructura, el propio método la

Parte Experimental

180

minimiza utilizando el campo de fuerzas seleccionado (en este caso AMBER) y

analiza el valor de su energía, de forma que si este valor es superior a la energía

del confórmero anterior en más de 50 kj (valor elegido) la estructura es rechazada,

si la energía es inferior a este margen, la nueva geometría es aceptada y

almacenada.

El programa continúa buscando hasta un máximo de 100 conformaciones

(valor seleccionado); las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza.

Todos los demás ligandos fueron inicialmente refinados mediante el

programa MOPAC.251

En los casos en que los compuestos contenían grupos ácidos o básicos se

determinó el estado de ionización a pH fisiológico haciendo uso del programa

Marvin.252

La asignación de cargas para todos los compuestos y confórmeros se

realizó mediante el programa SYBYL 7.3 y cargas tipo Gasteiger-Marsili.

Este procedimiento dio lugar a 600 confórmeros correspondientes a 60

estructuras diferentes. Estos 600 confórmeros fueron sometidos al mismo

procedimiento de cribado virtual que los 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set.

II. 4. 1. 4. Cribado virtual

Para la realización del cribado virtual se utilizó la versión 3.0.5 del

programa AutoDock.192 La tabla 10 resume los parámetros utilizados para la

realización del docking de los distintos ligandos, para los que se buscaron en cada

caso 100 posibles soluciones. Este procedimiento consumió aproximadamente

media hora en un PC Xeon con sistema operativo Linux para cada una de las

moléculas objeto de estudio, excepto para las que pertenecían a nuestra

quimioteca, cuya exploración consumió aproximadamente cinco horas por

confórmero, debido a la elevada flexibilidad de los compuestos (ver tabla 6).

Parte Experimental

181

PARÁMETROS VALORES

Parámetros Algoritmo Genético (GA) y Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA)

ga_pop_size Nº de individuos en la población 100

ga_num_evals Nº máximo de evaluaciones de energía 250000

ga_num_generations Nº del máximo de generaciones 27000

ga_elitism Nº individuos máximo que sobrevive a la siguiente

generación 1

ga_mutation_rate Porcentaje de mutación 0.02

ga_crossover_rate Porcentaje de entrecruzamiento 0.80

ga_window_size Nº de generaciones por escoger al peor individuo 10

ga_cauchy_alpha Distribución de Cauchy 0

ga_cauchy_beta Varianza de distribución de Cauchy 1

Parámetros Búsqueda local

sw_max_its Nº de iteraciones búsqueda local 300

sw_max_succ Nº de éxitos consecutivos antes del rho cambiante 4

sw_max_fail Nº de fracasos consecutivos antes del rho cambiante 4

sw_rho Tamaño de espacio de la búsqueda local para probar 1.0

sw_lb_rho Límite más bajo en rho 0.01

ls_search_freq Probabilidad de realizar búsqueda local en un individuo 0.06

Tabla 10: Parámetros utilizados en el estudio de docking

El programa busca hasta un máximo de 100 soluciones (valor

seleccionado), las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza. Para este

estudió se decidió seleccionar los primeros 50 complejos PAMP-ligando de

mínima energía. Estos complejos se analizaron visualmente mediante la utilización

del programa SYBYL 7.3.

Parte Experimental

182


El anticuerpo monoclonal αPAMP fue producido por la compañía Evogenix

(Sydney, Australia).

El anticuerpo fue marcado con peroxidasa y purificado en nuestro

laboratorio utilizando los kits EZ-Link Plus Activated Peroxidase y Freezyme

Conjugate Purification (Cultek SL), respectivamente.

El PAMP que se utilizó es un péptido sintético adquirido en la compañía

Phoenix Pharmaceuticals (Belmont, CA).

Estudiando concentraciones, tiempos y condiciones óptimas para el

ensayo, se puso a punto el siguiente procedimiento basado en experimentos

similares publicados.179

En una placa de 96 pocillos de poliestireno (PS) se colocan 50 µL (2 ng/

µL) de PAMP en tampón fosfato (PBS) y se deja una hora para que el péptido se

adsorba en el fondo de los pocillos. Se dejan en la placa pocillos sin PAMP que

corresponden al blanco. Después de sucesivos lavados y del bloqueo de los

pocillos con albúmina sérica bovina (BSA (1%)-Tween 20 (0.1%) en PBS), se

añaden los compuestos a ensayar a una concentración de 1.0 µM y en los pocillos

de control positivo se añade anticuerpo sin marcar. Después de una hora de

incubación se agrega en todos los pocillos el anticuerpo monoclonal de PAMP

marcado con peroxidasa. Durante una hora el anticuerpo marcado competirá por

la unión al PAMP con los compuestos a ensayar.

Después se retira el excedente de solución mediante lavados adicionales.

La reacción colorimétrica que tiene lugar cuando se agrega el sustrato de la

peroxidasa (dihidrocloruro de o-fenilendiamina), es directamente proporcional a la

unión del anticuerpo marcado con el PAMP e inversamente proporcional a la unión

del compuesto al PAMP. El producto de reacción se cuantifica en un lector de

placas (Spectra Rainbow; Tecan, Raleigh, NC) a 450 nm.

Parte Experimental

183


Las medidas de SPR fueron realizadas bajo la dirección de la Dra.

Laurence Choulier en el Laboratorio de Biotecnología de Interacciones

Moleculares en la Escuela Superior de Biotecnología de Estrasburgo (Francia).

Usando un equipo Biacore T100 (GE Heathcare Biacore, Uppsala, Suecia)

se llevó a cabo un análisis de interacción molecular en tiempo real. Todos los

experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC. En la célula de flujo 2 (Fc 2) de un chip

sensor sCM5 se inmovilizaron 580 unidades de resonancia (RU) de PAMP usando

el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las especificaciones del

fabricante (BIAapplications Handbook). Fc 1 fue tratada igual que Fc 2 pero sin la

inyección de PAMP y se utilizó como referencia. Los estudios se llevaron a cabo

con un flujo de 30 L/min con HBS-DMSO (10mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl,

3.4 mM EDTA, 5% DMSO) como tampón. Las muestras de los compuestos en

concentraciones de entre 10 y 200 µM en HBS-DMSO, se inyectaron durante 1

min. sobre las superficies de referencia y la de PAMP, seguido de una post-

inyección durante 2 min. La regeneración se llevó a cabo con dos inyecciones de

30 s de NaCl 0.5 M, seguidas de 2 min. de estabilización. Típicamente, los 10

primeros ciclos consistieron en inyecciones de HBS-DMSO para asegurar que la

superficie se encontraba totalmente equilibrada. También se inyectó HBS-DMSO

antes de cada nuevo compuesto. Los datos del biosensor fueron analizados

usando el software Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 (GE Healthcare). Como

el DMSO a menudo genera cambios en el índice de refracción mayores a las

señales esperadas de los compuestos, los datos fueron corregidos teniendo en

cuenta las posibles diferencias en el índice de refracción generadas por el DMSO

entre las células de flujo.229

Parte Experimental

184


II. 4. 4. 1. Preparación de los modelos

Para llevar a cabo las simulaciones de DM se eligió el mismo modelo del

PAMP que para el docking y los complejos de mínima energía obtenidos para

PAMP-USP1K y PAMP-USP1N.

Para calcular las cargas de los compuestos USP1K y USP1N y refinar su

geometría se utilizó Gaussian 98.230

Para neutralizar los sistemas se añadieron 5 iones de Cl-. Cada sistema

fue solvatado usando moléculas de agua tipo TIP3P253 en una caja cúbica de al

menos 10 Å de distancia de cualquier átomo del complejo, incluyéndose para este

modelo 7522, 7099 y 17690 moléculas de agua para PAMP, PAMP-USP1K y

PAMP-USP1N respectivamente.

II. 4. 4. 2. Simulaciones de DM

Se aplicaron condiciones de límite periódico y las interacciones

electrostáticas fueron tratadas con el método Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 con

un espaciado de malla de 1 Å. La distancia de corte (cut off) para las interacciones

entre los átomos fue de 8 Å. El algoritmo SHAKE203 fue aplicado a todos los

enlaces con hidrógeno con un intervalo de integración de 1.0 fs.

Los complejos y el péptido libre se sometieron a un proceso de equilibrado

previo que consistió en las siguientes etapas: minimización a temperatura

constante (300 K); equilibrado durante 25 ps restringiendo el soluto con aumento

de la temperatura de 100 a 300 K; equilibrado durante 50 ps restringiendo el soluto

a temperatura constante (300 K); minimización a temperatura constante (300 K)

restringiendo el soluto; equilibrado durante 60 ps restringiendo el soluto con

aumento de la temperatura de 100 a 300 K. A continuación se llevaron a cabo 5

minimizaciones consecutivas a temperatura constante (300 K) liberando

paulatinamente las restricciones del soluto desde 25 kcal mol-1 Å-2 a 0 kcal mol-1

Parte Experimental

185

Å-2 seguido de un equilibrado durante 20 ps con aumento de la temperatura de 100

a 300 K sin restricciones del soluto y finalmente la dinámica de producción durante

9 ns a presión y temperatura constantes. Las coordenadas de las trayectorias se

guardaron cada 2 ps.

II. 4. 4. 3. Cálculos MM/PBSA y MM/GBSA

El primer paso de este método consistió en la generación múltiple de

instantáneas a partir de la trayectoria de DM, extrayendo las moléculas de agua y

contraiones. Las instantáneas espaciadas en intervalos de 20 ps se extrajeron de

la DM de producción dando lugar a 450 instantáneas para los 9 ns.

Para evaluar la energía electrostática de solvatación ∆Gsolv, se usó el

módulo PBSA de AMBER y el módulo GBSA de AMBER, con un espaciado de

malla de 2 Å y 1000 iteraciones en ambos casos. La energía de solvatación no

polar ∆Gsolv np se calculó con la superficie accesible al disolvente (SASA) usando el

programa MSMS,254 de acuerdo a la ecuación

∆Gsolv np = γSASA + β

donde la tensión superficial γ y el término independiente β se fijaron en 0.005 kcal

mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1, respectivamente para el cálculo con PB y 0.0072 kcal

mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1, respectivamente para el cálculo con GB.

Finalmente, para evaluar el cambio de entropía en el soluto durante la

asociación al ligando, -T∆S se utilizó el modo NMODE de AMBER.

Previamente a los cálculos de modo normal, el complejo, el receptor y el

ligando se sometieron a una minimización con una constante dieléctrica

dependiente de la distancia ε = 4r y un criterio de convergencia de 10-5 kcal mol-1

Å-1. Debido al alto coste computacional, el cálculo de entropía se realizó

seleccionando instantáneas espaciadas en intervalos de 200 ps de la DM dando

lugar a 45 datos a lo largo de los 9 ns.

Parte Experimental

186

La elección de la constante dieléctrica interna para la evaluación de las

energías de solvatación ha sido objeto de debate. Stoica y cols.255 encontraron

que las entalpías de unión calculadas utilizando una constante dieléctrica de valor

1.0, combinadas con la contribución entrópica, producían en general valores más

cercanos a los experimentales.

II. 4. 4. 4. Requerimientos computacionales

Las simulaciones de DM se llevaron a cabo usando el servicio del Cluster

de Modelización Científica (Universidad de Oviedo), a una velocidad de

aproximadamente 18 horas/ns. Los cálculos de energía libre se llevaron a cabo

utilizando recursos propios. Para una simulación MM/PBSA/GBSA con 450

instantáneas se requirió un tiempo aproximado de 10 horas en un PC Xeon. Los

cálculos de entropía usando el tratamiento NMODE requirieron aproximadamente

un tiempo similar.

II. 4. 5. Angiogénesis: Ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo

Las pruebas de angiogénesis fueron realizadas bajo la dirección del Dr.

Alfredo Martínez en el Departamento de Neuroanatomía y Biología Celular del

Instituto Cajal de Ciencias Neurobiológicas, Consejo Superior de Investigaciones

Científicas (CSIC).

El ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo es un ensayo de

angiogénesis ex vivo. Se preparan anillos aórticos de aproximadamente 0.8 mm

de longitud a partir de 5 arcos aórticos de embriones de pollo de 13 días. El tejido

conjuntivo de la capa adventicia se retira con pinzas cuidadosamente. Cada anillo

aórtico se coloca en el centro de un pocillo, en una placa de 48 pocillos y se cubre

con 10 µL de matrigel. Una vez que el matrigel ha solidificado, se añade a cada

pocillo una solución nutritiva que contiene un compuesto proangiogénico (10 nM

VEGF) y los compuestos a probar a una concentración conocida de 1 µM.

Parte Experimental

187

Las placas se incuban a 37 ºC en una atmósfera que contiene 5 % de CO2

de 24 a 36 horas. Los microvasos que brotan de los anillos aórticos se fotografían

con un microscopio invertido.

II. 4. 6. Pruebas antiproliferativas

Para este ensayos se utilizó la línea celular Caco-2:256 • Características: células de cáncer de colon humano

• Procedencia: Instituto del Frío (CSIC)

Para el cultivo de las Caco-2 se utilizó medio Dulbecco's Modified Eagle's

Medium (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10%, aminoácidos no

esenciales (1%) y una mezcla estreptomicina/penicilina (1%). Las células se

sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 104 células por pocillo.

Se mantuvieron en incubador humidificado a una temperatura de 37 °C con un

5% de CO2 hasta alcanzar el 80% de su confluencia, en torno a los 6 días.

A continuación, las células fueron tratadas durante 20 horas con los

compuestos a ensayar disueltos en DMSO. En todos los casos la cantidad de

DMSO no superó el 0,1% del volumen total de medio (1 mL) y se realizaron

controles a los que únicamente se les agregó un volumen igual de DMSO.

Transcurridas 20 horas de tratamiento, se midió la viabilidad celular

mediante el método de rojo neutro. Tras eliminar el medio se agregaron 0,5 mL de

medio fresco que contiene el rojo neutro y se incubó durante dos horas en

condiciones normales de cultivo. Posteriormente se eliminó el rojo neutro, se lavó

dos veces con PBS para eliminar restos y se extrajo el rojo neutro mediante

solución de extracción (EtOH:H2O:AcOH, 50:49:1). Transcurridos 15 minutos se

tomaron tres alícuotas por pocillo y se midió su absorbancia a 540 nm. Los

resultados se expresan como porcentaje frente a los controles.

Parte Experimental

188


Los experimentos de RMN fueron realizados bajo la dirección del Dr.

Antonio Pineda en el Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia.

Los espectros de RMN se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance

Ultrashield Plus 600, equipado con una criosonda TCI de 5 mm con gradientes en

el eje Z.

Todos los datos se procesaron con el programa Topspin 1.3 (Bruker

GmbH, Karlsruhe, Alemania). Los experimentos heteronucleares 2D 15N HSQC se

adquirieron con anchuras espectrales de 7.5 KHz (dimensión de 1H) y 1.6 KHz

(dimensión de 15N), con 24 acumulaciones y 128 puntos en la dimensión del 15N,

con una duración final de una 1 hora.

Las muestras se prepararon a una concentración aproximada de 50 µM en

10 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 36% TFE y 10% D2O, en un volumen final de

500 µL. Las moléculas orgánicas se disolvieron en DMSO-d6 en concentraciones

desde 12.5 hasta 50 mM. La temperatura de medida fue de 300 K. Una vez

adquirido un experimento de referencia, se añadió en cada caso el volumen de

disolución correspondiente para tener una concentración final de molécula de 500

µM. Con el fin de eliminar el efecto en los desplazamientos químicos del DMSO, la

cantidad final del mismo se igualó en todos los casos.

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