AISLAMIENTO DE LA SECUENCIA ADNc DE UN...
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AISLAMIENTO DE LA SECUENCIA ADNc DE UN
PÉPTIDO TIPO INSULINA DERIVADO DE LA GLÁNDULA
ANDROGÉNICA (IAG) DE CAMARONES MARINOS DEL
GÉNERO LITOPENAEUS EN COSTA RICA.
1Sancho-Blanco, Carolina.1Umaña-Castro, Rodolfo., 1Solano-González,
Stefany., 2 Rosen, Ohad; 2 Sagi, Amir, 3Alfaro-Montoya, Jorge
Financiamiento por FEES-
2013
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
82 86 90 94 98 2002 2006
Cultivo
Pesca
Producción mundial de camarones
Programas de domesticación y mejoramiento de la
producción
32 %
46 %
50 %
73%
Reproducción controlada
Línea mejorada de
camarones
Cruce
Desove
- Producción de larvas
de ambos sexos
(Laboratorio de post-
larvas)
- Cría y engorde
de PL
- Poblaciones de
individuos ambos
sexos.
Limitante biológica
Dimorfismo sexual regula los rendimientos
productivos de la industria del cultivo mundial.
Inicia en L.vannamei =
10-17g
Creación de poblaciones
monosexuales de hembras
que permitiría producir animales
de mayores tallas
Solución
Glándula Androgénica
Responsable de la diferenciación sexual: Hormona androgénica
tipo insulina
Exclusivo
machos
(2012) Se describe estructura de la glándula
androgénica de varias especies de camarones y
su posible localización.
Ámpula terminal
IAG y abordajes moleculares:
Silenciamiento genético
Conociendo la secuencia de la IAG
Inhibir la expresión de la IAG
Reversión sexual
Lv-IAG
Banzai et al. 2012
Malar-IAG (Macrobrachium lar)
Inhibir la
IAG
Silenciamiento génico: Inhibir expresión IAG Lv-IAG seq.
Complejo
RISC
Dicer
Reconoce ARNm y
busca homólogo
Macho : ZZ o XY ??? Cromosoma sexual homogamético o
heterogamético
Machos (ZZ)
Hembras (ZW)
(IAG+) (IAG-)
Neomacho
ZZ Neohembra
ZW
Hembra (ZW)
Lv-GA+
Neomachos (ZW)
Hembra (ZW)
X
X
Machos (ZZ)
= 100%
(ZW)
25% Machos (ZZ)
50% Hembras (ZW)
25% Hembras
?
WW
Vía práctica para producir hembras
en Litopenaeus
Objetivos
Aislar la secuencia parcial de ADNc que codifica el
péptido específico tipo insulina a partir de la
glándula androgénica de Litopenaeus occidentalis,
Litopenaeus stylirostris y Litopenaeus vannamei,
con el fin de mejorar la producción en estos
peneidos.
Objetivos específicos
Extracción
de ARN
RT-PCR
Determinar
presencia
transcrito
Obtener la
secuencia
de ADNc
Determinar
la identidad
Banzai et al. 2012
Malar-IAG (Macrobrachium lar
Metodología
ANIMALES Y MUESTRAS DE TEJIDOS
Costa central del Pacífico costarricense
Estanques de producción
Ablación bilateral 8 días =20g aprox
Almacenar a -20ºC
Uso inmediato
Extracción de ARN
3 Métodos
Kit Pure Link
(Invitrogen)
SDS-Acetato
de potasio
Fenol-
Cloroformo: A.
isoamílico
Macerados
manualmente
Cordones celulares asociados al
ámpula terminal (CC-AT), ducto
distal (dd), ducto medio (dm) y
hepatopáncreas (hep).
PCR-TRANSCRIPCIÓN REVERSA
Síntesis de la primera hebra (ADNc) usando un cebador OligodT (T(24)VN)
Amplificación IAG-Lv (parcial) = uso cebadores específicos diseñados a partir de JQ670898.1 (GenBank), cebadores degenerados diseñados mediante el software bioinformático Primer3
Control positivo= EFT-2
5´GTCTTCGTGCAGGAGAAACTCG 3´ y 5´CGACGAGGGCACCATCAGTTA 3´. (Manor et al. 2007)
dm: ducto medio
dd: ducto distal
Hep:
hepatopáncreas
Figura 1.Análisis RT-PCR para tejido específico del gen constitutivo factor de
elongación (EFT-2) en Litopenaeus occidentalis utilizando diferentes métodos de
extracción de ARN total. Los carriles 2-4 corresponden a la extracción con Fenol-
Cloroformo-Alcohol isoamílico (PCI) de ducto medio (dm), ducto distal (dd) y
hepatopáncreas (hep). Los carriles 5-7: SDS/Acetato de Potasio (SDS-AcK) de dm,
dd y hep. Los carriles 9-11: Kit comercial PureLink™ (Ambion) de dm, dd y hep.
Carriles 1 y 8: marcador de peso molecular 1Kb, carriles 12-14: sin carga.
Electroforesis de agarosa al 2%, TBE 1X.
Discusión
ARN de alta calidad es esencial para RT-PCR (Umaña et al., 2013).
Efectividad de los métodos de extracción
SDS-AcK= simple, reproducible, económico y no tóxico
PureLink™ (Ambion) mostró amplificaciones con una intensidad superior, para todos los tejidos ensayados, en comparación con los otros métodos de aislamiento de ARN.
Figura 2. Análisis RT-PCR de tejido específico de cordones celulares asociados
al ámpula terminal (CC-AT), de Litopenaeus vannamei. A) Carriles 2-3,
amplificación del ADNc de un fragmento del transcripto codificante para la
hormona tipo insulina de la glándula androgénica (Lv-IAG), carril 4, gen
constitutivo factor de elongación (EFT-2) como control positivo. Electroforesis de
agarosa al 2%., TBE 1X. B) El ARN molde se extrajo a partir de ámpulas
terminales de individuos machos de L. vannamei ablacionados.
Tejido
Cordones
celulares
asociados al
ámpula terminal
(CC-AT) 350 pb
Discusión
El Fragmento obtenido de la IAG 350 pb, resultados concuerda
con los obtenidos por Garza-Torres (2011).
Li y colaboradores (2012) reportaron un fragmento de IAG en
Fenneropenaeus chinensis con un tamaño aproximado de 781
pb.
Mareddy y colaboradores (2011) identificaron en Penaeus
monodon un trascripto parcial codificante de 300pb.
Banzai y colaboradores (2011) En Marsupenaeus japonicus,
aislaron un fragmento de 813pb..
Secuenciación de los amplicones Lv-IAG para definir su identidad
en proceso
IAG de L stylirostris y L. occidentalis
Uso del kit Gene Racer para obtener la secuencia completa en la
tres especies
Conclusiones
Se ensayó diferentes métodos de extracción de ARN total, determinando que el protocolo basando en el kit comercial es el que genera mejores rendimientos, sin embargo, el método inorgánico arroja resultados prometedores.
Se realizó la puesta a punto del ensayo RT-PCR para diferentes tejidos en camarones marinos, empleando cebadores específicos dirigidos a un gen constitutivo y a la IAG
Se aisló una secuencia parcial de ADNc derivada de cordones celulares asociados al ámpula terminal de machos ablacionados, la cual se presume que pertenece al transcripto codificante del péptido específico tipo insulina de la glándula androgénica de Litopenaeus vannamei.
Se inició el proceso de secuenciación del transcripto codificante parcial obtenido de la glándula androgénica de machos de Litopenaeus vannamei ablacionados.