Trabajo Práctico Nº4

Aislamiento de Microorganismos

Diversidad Metabólica

Objetivo del Trabajo Práctico

Aislamiento de microorganismos partir de distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra y yogurt)

1)Enriquecimiento-Selección2)Selección-Diferenciación3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de Gram y Pruebas Bioquímicas)

Microorganismos a aislar:

• Enterobacterias (agua)• Pseudomonas spp. (agua)• Staphylococcus spp. (ricota)• Bacillus spp. (arroz)• Lactobacillus spp. (yogurt)• Azotobacter spp. (tierra)

Medios de Cultivo: características generales

•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas, vitaminas)

•Disponibilidad de oxígeno

•pH

•Humedad

•Temperatura

•Esterilidad

• Medios Definidos o Complejos

• Medios Mínimos (definidos) o Ricos (complejos).

•Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos.

Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:

Componente Gramos/litroGlucosa 5 Fuente de C y

energíaNa2HPO4 6 Buffer, fuente de P

KH2PO4 3 Buffer, fuente de P

NH4Cl 1 Fuente de N

NaCl 0.5 Fuente de Na

MgSO4•7H2O 0.12 Fuente de Mg

CaCl2•2H2O 0.01 Fuente de Ca

•Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc).

Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:

Componente Gramos/litroExtracto de carne

5 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C.

Peptona 6 Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C.

Glucosa 5 Fuente de C y energía.

Na2HPO4•12H2O 4 Buffer y fuente de P.

FeSO4•7H2O 0.3 Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe y S.

Indicador Sulfito de Bismuto

8 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Verde Brillante 0.025 Inhibe el crecimiento de Gram positivos

Ágar 20

Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos.

•Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la caseína.

•Peptona de carne: degradación pancreática de la carne.

•Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.

•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de crecimiento.

•Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura autolizada. Alto contenido de vitaminas.

•Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.

•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos.

Por ej: Luria-Bertani (LB):

Componente Gramos/litro

Triptona 10 Aminoácidos, carbono, energía, macro y micronutrientes.

Extracto de Levadura

5 Vitaminas, macro y micronutrientes.

NaCl 10 Balance osmótico.

•Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés.

•Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos.

•Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa).

•Medio Selectivo y Diferencial.

1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento.

2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.

3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial). Obtención de colonias aisladas.

4. Tinción de Gram

5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.

Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):

Enterobacterias γ-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patógenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,

Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas. Oxidasa negativos

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.

Peptona de Caseína Lactosa Bilis de Buey Púrpura de Bromocresol pH= 7,4±0,2

Incubar por 48 hs a 37ºC

Si hay fermentación de lactosa:

Sólo ácido Coliformes, sin E. coliGas + ácido E.coli (junto a otras coliformes)

Crecimiento en Caldo Mac Conkey

Cambio de color a amarillo

Formación de Gas

Escherichia coli (lactosa +)

Bueno Sí Sí

Enterobacter cloacae (lactosa +)

Bueno Sí Sí

Klebsiella pneumoniae (lactosa +)

Bueno Sí Sí

Proteus mirabilis Bueno No No

Pseudomonas aeruginosa

Malo

Staphylococcus aureus

Malo

Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.

•Peptona de Caseína •Peptona de Carne •Cloruro de Sodio •Lactosa •Sales biliares •Cristal violeta•Rojo NeutropH= 7,1±0,1Incubar por 24 hs a 37ºC

Apariencia de las colonias

Microorganismo

Grandes, rojas, con halo

Escherichia coli (lactosa +)

Grandes, rosadas, mucoides

Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa +)

Incoloras, transparentes

Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp.

Pequeñas, opacas, aisladas

Enterococci, Staphylococci

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

Escherichia coli Salmonella typhimurium

Ágar Mac Conkey

Lactosa + Lactosa -

2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patógenas).

•Peptona de Carne •Hidrógenofosfato dipotásico•Lactosa•Sacarosa•Eosina Amarillenta•Azul de MetilenopH=7,0±0,2

Incubar por 24 hs a 37ºC

Apariencia de las colonias

Microorganismo

Transparentes, de color ámbar

Salmonella spp., Shigella spp.

Verdosas con brillo metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida

Escherichia coli (lactosa +, sacarosa +)

Más grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisáceo a la luz transmitida

Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa+, sacarosa-)

Aislamiento de Enterobacterias (agua)

Escherichia coli Enterobacter spp.

Ágar EMB

Lactosa + Lactosa +

Pseudomonas spp. γ-Proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares Producen pigmentos No fermentadores Oxidasa positivos Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)

1. Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC: enriquecimiento y selección.

2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa

• Peptona de Gelatina• MgCl2• Cetrimida• Glicerina• SO4K2

Incubar por 48 hs a 37ºC.Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus spp.

• Cocos Gram positivos• Anaerobios facultativos• Fermentan glucosa (ac. láctico)• Asociados a piel y mucosas• Patógenos (S. aureus)• Resisten altas concentraciones salinas

Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)

1. Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura ambiente)

2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo para Estafilococos patógenos.

• Infusión de cerebro• Infusión de corazón• Proteosa peptona• D(+) Glucosa• NaCl (7.5% final)• Hidrógenofosfato disódicopH=7,4±0,2

Incubar por 48 hs a 37ºC

Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida

Aislamiento de Staphylococcus aureus3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite

distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).

• Peptona de carne• Extracto de carne• NaCl 7.5%• D(-)Manitol• Rojo fenolpH=7,4±0,2

Incubar por 48 hs a 37ºC

3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.Incubar por 48 hs a 37ºC

Apariencia de las colonias Microorganismo

Con halo amarillo, luminoso; crecimiento intenso

Manitol-positivos: S. aureus

Sin cambio de color; poco crecimiento

Manitol-negativos: S. epidermidis y otros.

1. S. aureus2. S. epidermidis3. Micrococcus luteus

Bacillus spp.• Bacilos Gram positivos• Forman endosporas• Generalmente móviles con flagelos peritricos• Aerobios (facultativos)• B. cereus (alimentos)• B. anthracis

Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)

1. Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección.2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.3. Incubar por 48 hs a 37ºC.4. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y

diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)

• Peptona de carne• Extracto de carne• D(-)Manitol• NaCl• Rojo Fenol• Emulsión de yema de huevo/Polimixina B

Incubar por 48 hs a37ºC.

Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado blanco (Manitol – y lecitinasa +).

Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

Lactobacillus spp.• Bacilos o cocobacilos Gram positivos• Fermentadores lácticos• Aerobios facultativos o microaerófilos

Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)

1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo.Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso. pH = 5.7. Incubación en microaerobiosis.

Ágar MRS-Lactobacillus casei

2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato y pH = 5.5 que inhiben flora acompañante.Incubación en microaerobiosis.

Azotobacter spp.• Bacilos o cocos Gram negativos• Habitan en el suelo y en el agua• Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3)• Vida libre• Forman quistes (similar a endosporas)

Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable).

Crecimiento a 28ºC.

Microorganismo Enriquecimiento-Selección

Selección-Diferenciación

Agua Enterobacterias Caldo Mc Conkey

Ágar Mc Conkey y ágar EMB

Agua Pseudomonas Caldo M9-42ºC Ágar CetrimidaRicota Staphylococcus Caldo cerebro-

corazón con 7.5% NaCl

Ágar manitol salado rojo fenol y ágar azida

Arroz Bacillus 80ºC y caldo nutritivo

Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo y PmB.

Yogurt Lactobacillus Ágar MRSMicroaerobiosis

Ágar Rogosa Microaerobiosis

Tierra Azotobacter Caldo Fred& Waskman-28ºC

Ágar Fred & Waskman-28ºC