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Tesis de Posgrado

Algunos factores que afectan laAlgunos factores que afectan lafermentación acéticafermentación acética

Carlisle, Roberto Arturo

1950

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Químicade la Universidad de Buenos Aires

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Cita tipo APA:Carlisle, Roberto Arturo. (1950). Algunos factores que afectan la fermentación acética. Facultadde Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_0642_Carlisle.pdf

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HINISTERIO DE EDUCACION

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FISICAS YNATURALES

oOo

AlgunosFactores.que Afectan laFermentación Acética

por

Roberto Arturo Carlisle

¿«Ii/f m2Tesis presentada para Optar

al título de Doctor en química.

Buenos Aires

1950AÑODEL LIBERTADORemm SAN MARTIN

A1 Dr. Alfredo A: Sordelli, cuyadirección, ayuday Juetae críti­cas hicieron posible la realiza­ción de este trabajo, dedico mi ­tesis con todo agradecimientoo

.kfi-Á".7.

..Á.4‘.

CQN'I‘EEHDO

CAPITULOT 'Introducción v objeto

cAPITULo TI. ÑAnïecedenïeobibliográficos ¡La

CAPITULO IITMateriales v métodos quimicos ybacterioló icos.

Caracterïsticas de 1a cepa empleada 10Preparación de los medios empleados 12Métodosde análisis v reactivosb­

Determinación de 1a acidez 15Determinación de Acetaldehido 16ReactiVOs 21

(‘¿LPITU'LO IVinfluencia de diversas tensionesde oxígeno sobre 1a fermentacióndel vino por el Acetobacter ascendens 23

Forma de trabajo 21Experiencias realizadas 29Resumen v comentarios 48

CAPITULO VInfluencia de sustancias químicas sobre1a fermentación del vino por el Aceta­iiasienascaniens o “'"‘ ‘ 5

Ezperiencias con Cianuro de Potasio 50Experiencias con Luminal 51Experiencias con Azul de Metileno 52

CAPITULO VIFormaciÉn v/o acumulación del sldehido

acético durante 1a fermentación conAmapagigr .aacsnaeas

Formade trabajo:Suspensión de bacteriasExperiencias en aireExperiencias en oxigenoExperiencias en anaerobiosis

(¡l (J'l

(noveno: HOÜJ‘I

CAPITULOVI (cont.>Resulta&os

RXDerienCiasEzncrienciasExperlencias

en airean oxígenoen anaerobiosis

CAPITULC VTIResumen V conCIUSiones

Ensavos con cultizib en.pe1ículaEnsavos con suspensión de bacteriasConclusiones

BIBLIOGRAFIA

0004

“1,,

CAPITULO I

lntroducoión Ob eto

siendo la fermentación acéticala base de una gran industria en todo elmundo. cualquier factor que pueda aumen­tar o disminuir su rendimiento ee de graninterés industrial.

Por otra parte el mecanismodela fermentación ac6tica no está aún com­pletamente explicada y todos los datosque puedan acumularse sobre las varia­ciones de la fermentación bajo condicio­nes y atmósferas distintas contribuiráneventualmente a su mejor entendimiento.

Teniendo en cuenta lo expuestoee estudió, mediante la determinación dela acidez roducida. el desarrollo de lafermentaci n acética en atmósferas condistintas proporciones de oxigeno, conmiras a la sibilidad de establecer unaconcentraci n óptima con la cual se po­dria efectuar la fermentación en un sis­tema cerrado de circulación de gases paraevitar las pérdidas de ácido acético porevaporación; eetudidndoee además la in­fluencia de algunas sustancias químicasen diversas concentraciones.

Dado que en el desarrollo deestas experiencias ee comprobóen algu­nos casos la presencia de un olor aromá­tico fuerte que resultó ser debido a la

formación y acumulación de aldehido acé­tico en el medio, se efectuaron expe­riencias con el fin de establecer algunosdatos_cuantitativos sobre la formacióndel acetaldehido (ademasdel ácido acéti­co) bajo diversas condiciones.

Para lograr los propósitosanteriores hubo que cambiar los métodosoriginales de trabajo y durante los en"sayos preliminares se comprobóque lacepa elegida, ¿estabactgg agogggfgg, da­ba lugar en preeenc a e a re a a acumu­lación de aldehido acético con poca for“mación de ácido acético cuando el sube­trato era una solución de alcohol etílicoen agua destilada.

Dado que en ensayos paralelosde fermentación de vino en presencia deaire habia muchaformación de ácido.tambien se trató de hallar a1 factor.existente en el vino, que permite lagïidación del acetaldehido a ácido ace­oo.

En los capitulos que siguen seexponen los resultados de estos ensayoscon 1a esperanza de haber contribuido.aunque en grado menor. al me or conoci­miento de la fermentación ac tica.

000

QÉÏETULO II

AntecedentesBibliográficoe

La fermentación acética del aL¿ohol etílico por lee bacterias acéticaóee un proceso aerobic, aun cuando ee hademostrado que éstas pueden crecer en aaanaerobioeie sobre alcohol etílico, etc”,en presencia de colorantes reduciblee,que en ese caso actúan comoaceptores dchidrógeno en lugar del oxigeno atmosféri­co.

La presencia del acetaldehidocomointermediario en la formación delácido acético a partir del alcohol etilico fué demostrado por vez primera porHover en 1899:

. Esta afirmación fue luego con:firmada por Neuberg & Nord en 1919 medinate 1a fijación del acetaldehido con eul'fito de Calcio durante la fermentaciónpor Acetobacter. «19.999.989. Asstpbacterascendqney mqtgbaqtpcpestaurímk

Bajo condicionea.anaerobiaeNeuberg & Windiech demostraron que algu­nas cepas (Acetobacterraecendene, Aceta­bacter pasteurianum y ¿cetobacter xylinum“podian promover 1a diemutación del ace"taldehido en solución diluida (0,2%) encantidades equimolecularee de ácido acé­tico y alcohol etílico:

-4­

OH° ————-n- - c1 oucuïcfH+Hao °H5 \“

'°“ + c.“ —>cm-c’o +cH¿iiiC’U'cïa“ e“- ‘“ “OH 5 x'H

v presentaron la teoria de que durantele. fermentación aceticc el alcohol eeoxidado aerobicamente a ccetcldehido. elcual luego entre una reacción de Canniza­ro dando¿cido acético y alcohol etíliconuevamenteon le. siguiente fome:­

Etau Etcu Etcu Etcu ¡ace¡ev/e 30% 85* ¿ ¡2.5% ¿JS/3

°'°x\«9” a?" 4/ "te,«yí*’\"Ioo"/..R‘ÏSOY. HRKÏ. Rjyhexx,“Mi 4% "N

RCN“?- “Wav. “muuuy. muy)!(BtephenaonJl. - Bccterial Metaboliem)

Wielcnd 6.-Bertho demostraronen 1928 que el alcohol y el acetaldehidopodian oxidaree a ácido acético con oxí­geno molecular en presencia de una. cue­pensión de Acetobactercg-leapenae. lle-v¿ando a la. conclusión de que. dada 18velocidad de reacción de la dimtaciónen comparación con la de la oxidación1e1 eoetaldehido a ácido acético, aquellatendria poca influencia. en le formacióndel ¡cido acético.

Posteriormente Berthc. tra-Jaim­

do con Acetobacter ascendens, Acetobacteraceti. Acetobecter orleanense y Acetobac­{3r“ñasteuriannm confirmó al trabajo ante'rior,

Por otra pazte estos autoresy Molinari dumostraron la presencia dereacciones dc dismutación,semejantes elos observados por Neubexg & Windisch,cuando las bacterias actuaban en anaero­biosie sobre divsrme sldehidos.. .

En 1930 Simon afirmo ue lasvelocidades relativas de regcci n de ladismutacibn y de la oxidacibn dependende la reacción del medio. En nHácido ladismutación ee encuentra en un mínimo yen la zona alcalina se produce alcoholy ácido a partir del acetaldehido en un8 - 10%del rendimiento teórico,

Basándoseen trabajos realizados con Acetobacter ascendens. Janke &Fropacsy (l) afinnaron que la zona de pFóptimo para cad' enzima es la siguiente ­

Cultivos Gu1t1xoeovenes Vielha

Alcohol deshidrogenasa 5,57-6¿0 5,93-5,7Aldehido deshidrogenasa 5,9 -6,5 6,3 ¿,0Aldehido mutasa óptimo 8;4‘

y que por lo tanto hay acumulación deacetaldehido on cultivos JÓVenesa valo­res de pH inferiores a 6,

SegúnButlin (1) seria probable

-6­

que en la acetificación normal el acetal­dehido es deshidrogenado a ácido acético.actuando el oxigeno comoaceptor de hi­drógeno; y que cuando la situación es fa­vorable puede haber alguna dismutacióndel aldehido.

Vieland á Bertha afirman queotras sustancias tales comola quinonay el azul de metileno pueden actuar comoaocptores de hidrógeno. Señalan además 1

gue el efecto inhibidor del acido cianhierico es menor en los casos en que laquinona actúa comoaceptor en lugar deloxigeno.

nn 1932 nosel, trabajando consoluciones alcohólicas con asparaginacomofuente de nitrógeno halló que elácido formado era más asimilable que elalcohol. y que cuando en el medio coexis­ten el alcohol y el ácido las bacteriasacéticae tienden a usar este antes deaquel. La presencia de azúcares evitabael consumodel ácido.

SemínDratvina las bacteriasacéticas tendrian cada una un limite depH por encima del cual 1a bacteria sobre­oxida al ácido acético si ya se ha consu­mido todo el alcohol; Sus investigacio­nes se realizaron con dos cepas distinta:el Bacterium ramon: y el Bapterivm viniacetati. bailando que este limite era depH 3,1 para.el B¿_rapgens (que sobre-oxi­da con facilidad) y 4,5 para el segundo.

Violand.&Pistor hallaron que

1-7..

soluciones diluidas (0,11 - 0,67 M) dealcohol etílico se deshidrogenaban por elAcetobacter peroxydans en oxigeno a pH4,5 a 7 dando acetaldehido y un poco deácido acético.

Influencia del agregado de sustanciasQuimicas sobre la fermentación

Muchoshan sido los trabajosefectuados con el agregado de diversassustancias durante la fermentación acéti­ca para estudiar su influencia sobre éstaEs de hacer notar que la mayoria de lasexperiencias han sido efectuadas en elmanómetrode Warburg o aparatos similaresy eran de muycorta duración.

La influencia del cianuro depotasio sobre el crecimiento y respira­ción de diversas cepas fué estudiada porQueré, Cozic y Wieland & Pistor, y susconclusiones se resumen en el cuadro dela página 8.

Tambiense han efectuado traba­Jos sobre la acción de diVersas sustan­cias tales comolos derivados haIOgenadosdel ácido acético y sus ésteres (Queré (DQueró (2), Cozic); esencias de mostaza,canela, clavo de olor, etc°,(Blum &Fa­bian, Queré (2)); y diversos productosQuimicos y metales (Tanaka, Queré (2),Rozenblatt & Mordkovich, ToEic, Bertrand& Sazerac, Mulder y Wieland & Pistor).

InvestigadorQueró(1)Quel-6(2)Gozic'tl)Violent!a:

yPieter

mi

_Ae.geeti-.6cepasAgüero­

Bacteria39mm-distintasmas

501

Respiraciónn/1ooon/ao.ooo11/260")u/wno

nCrecimiento-N/60.000-¡(/8000 1(°)SalvoelAe.zylinum,conelquenoeeinhibeelconsumo

deoxigenocon"concentraciones,altasdecianuro.

. _a_

Tanaka afirma en eu trabajo queel berbital y el fanobarbital tuvieronpoca o ningun; inJiueneia sobre la fer­mentación. '

Mulder señala que el Acetobac­ter aceti requiere la presencia del co­bre para su crecimiento y Bertrand & Sa­zerac obeervaron un máximoen 1a activa­ción de la fermentación acética por salesde mangnneeocon 1 parte de In en.40.000de medio.

Btokee &Lareen.obeervzn unamejora en el crecimiento del Acetobectersungvúans mediante el agregado de ciati­ne o metianina, y Prechel recomienda elagregado de 0.0262 de cietinm a los me­dioe de crecimiento.

Underkofler, Bantz & Petersony Lenny&Streighthoff hallaron que elAcetobacter euDOzydaneno requiere ribo­{lavine pues lo puede sintetizar. peroen cambio si requiere el ácido pentotóni­co o uno de sus componentes. Por otraparte Knrabinoe ¿:Dicken demostraron queel ácido nicotinico era esencial para elcrecimiento de esta bacteria.

La necesidad de Vitamina B (ode agua de levadura) para las becte aeacéticae empleadas en la fermentación deleorbitol fue demoetradepor Pelei.

OOO

,10­

CAPITULO TIT

Materiales y Métodos Químicos vBacteriológicos a

Caracteristicas de la Cepa Impleada

En 108 ensayos efectuados seempleó una cepa clasificada como¿92397bac as por Porcel & Porcel9no habi ndose efectuado ensayos de identificación para confirmaresta clasifi­cación.

Esta cepa, designada con elN°119, fue gentilmente suministrada porel Inn. AgrónomoSe Soriano, v su elec­ción se debe a ciertas ventajas que ofre"ce para este trabajo, a saberzna.- No forma ácido a partir de las eus­

tancias hidrocarbonadas (Henneberg.Hermann & Neuschel. Porcel & Porcel).

b,- Resistencia a altas concentracionesde alcohol (12%) v de ¿cido (9°!)°

co- No sobre-ozida en presencia de grancantidad de ácido.

d Para los primeros traba os ofrecíala comodidadde una pel cula lo sufi­cientemente estable comopara podercambiar el liquido sobre el cual flo­taba.

El Acetopagtgr,agcendens fuéaislado por Henneberg en 1898 desde vina­gres turbios, siendo una caracteristica

-11­

de esta copa snturbisr el medio.

Forma una película delgada Yascendente, llegando a subir hasta apro­ximadamente 10 cms. por las paredes delrecipiente.

En sl vino ss presenta comope­queñasbacterias, ya sssnsislsdss o uni“das de a pares on una tipica formación dee alargado.

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Acetobactsr ascendsns (Hsnnsberg).1500 A

nn otros medios, tales comoagus de levadura glucosads, agus ds 1e­vndura y macerado de maiz y sobre a rde estos dos medios se forman, ads s dslas formasanteriores. otras de involu­ción sn forma ds claves, con ramifica­ciones, de largos filamentos y formas

que se aproximan a cocos.

El tamaño de las células norma­les varía entre 1,8 a 24, . No con móvi­lea v no ae colorean con iodo. Los cul“tivos Jóvenes con Gramnegativos. Butemperatura óptima ee de 31°C, la máximade 44°C y la minima dc 10°C.

Preggración de loa Medios empleados

Conel objeto de facilitar laexposición del trabajo efectuado ae deta­lla a continuación la forma en que eeprepararon loa divereoe medios empleadospara cultivar lae bacteriae o para efec­tuar loa ensayos de fermentación.

1.- __de levadura Elucoeada. Se auto­l zan gramos e ev ura prensa­da durante 48 horae a 60°C. Luego ee agrcgan 1000 ml. de agua corriente, ee filtrapor papel, se lleva a ya? y deapuee deagregar 2%de glucosa y 0,025! de cieti­na (según indica Preonel) ae eeterilizaa 110°c durante 30 minutos.

2.- A de a de levadura lucoaada.Ec prepara agregando EZ¡e agar aImedioanterior.

3.- Vino clarete paateurizado. R1vinoce Danteuriza mediante calentamiento

en estufa de 80°C durante 30 minutos.enfriándolo despues. Las caracteristicasde este medio son:

Alcohol: 8,3! Acidez: aprox. 0,8 mlpH : 3,5 de NaOH N/IO

por m1.

“13.

4,“ Agar de agua de levadura glucogggg 1maoe o e ma z, e prepara mez­claáao cantidades I les de agar de aguade levadura glucoe y de macerado demaiz.

a) Se autoliza levadura prensa"da durante 48 horas a 50°C y luego se ladiluye con igual volumende agua corrien­te. Se filtra por papel, se lleVa a pH'Lse agrega 21 de glucosa y 6%de agar yse esteriliaa a 120°c durante 20 minutos.

b) Se colocan 700 gr. de maizcon l lt. de agua corriente a macerar conlo ml. de cloroformo (para evitar el de­sarrollo de microbios) durante 4 6 5 diasen estufa.de 50°C. Cada 24 horas se cam­bia el maiz y se lleVa el liquido nueva­mente a l.lt. con agua. A1 terminar 1amaceraciónse filtra el liquido resultan­te por papel y luego se eeteriliza porfiltro Seitz. Antes de emolearse se col}ca durante 48 horas a 37°C o 24 horas a60°C para eliminar el cloroformo.

Se mezclan cantidades igualesde a) y de b) dentro de un recipienteestéril, cuidando que la temperatura delagar no pase de °c para evitar 1a coa­gulación del macerado de maiz.

5.- Vino tinto 2 tes' A corrienteI rte: Píateurïíïd,a Se diluye el

vino en Ïas proporciones indicadas y selo pasteuriza mediante inmersión del re­cipiente en agua hirviente durante 10 mi­nutos, seguido por enfriamiento rápido.

Caracteristicas del medio:­

91‘­

Alcohol: 7,3% Acidez total: 4.6220DH : 4.6 (en tartárico)Cenizas: 2,69’itAcidez volat: 0,6610

(en acético)60- AsUni

acuosa ester zsds. de les siguientessales: 8/1“

3043.7520 0,93romegdaïgo 2,86cn: 2,98c1gca 0,33

019; g'gigc(so. ¿A19134820 .80 .4! 0,022

11,7

7.a Solución B. Unasoluciónacuosa ee r zado.de las siguientessales:

P04HI2(:1ng 0:246so .vngo. 0.715so ‘ 0,314Tartrato a. x 2.51

. , 'pcg. 2) hasta. sequedaden n­cio (30’--40°C). se extrse s1 residuo conuna cantide de alcohol etílico 95!igual s1 az del volumen del vino que se

'evspóróy se esteriliza por filtro Bsitz.A1 agregar un 8‘ de esta solu­

ción a1 agua. se tiene una solución de al­cohol al 8%que tiene además las sustan­cias eztraidae en la mismaconcentrucióncon que se encuentran en e1 vino.

-15­

9.w ino calentado- Se emplearon doeratamïenïoe distintos en el calenta­

miento del vino.

a) Se hierve el Medio N°3 du­rante 30 minutoe, ee lleva a eu volumeninicial ocn agua y luego ee eeterilizaen autoclave a 120°C durante 20 minutos,Una vez frio ee agrega 8%de alcohol. Elliquido resultante tiene un pHde 2,2 yuna acidez equiValente a 9,04 to de ácidotartárico.

b) Se cierra el Medio N°3 en­ampollae de vidrio y ee calientan a 120°Cdurante 20 minutos en autoolave. nlpHfinal es 3,6 y la acidez correspondea 4,64 xo de ácido tartárico.

loa-.Aggg‘ge levadura 1:1. Se autolizalevadura preneífla durante 48 horas

a 60°C y luego ee diluye con igual volu­mende agua corriente. Despuesde filtarpor papel ee neutraliza y ee eeterilizaa llO°C durante 30 minutos.

nom

_!Étodoe de Análisis ljReactivoeDeterminación de la acidez.- En loe pri­

meros enea­yes la acidez ee determinó sobre l ml.de medio filtrado por algodón para sepa­rar los restos de pelicula y diluido conagua caliente exenta de anhídrido carbónrco.

Enpleando como indicador a lafenolrtaleina ee titula con hidróxido desodio N/lC. El viraje de la fenolftnlei­na está precedido por 61 de las materias

-16­

tolerantes del vino, lo cual permite unatitulación rápida hasta este punto.

En las experiencias en las cua­les se determinó además el contenido deacetaldehido se tituló la acidez directa”mente sobre la muestra a destilarse paraaquella determinación, tal comose detallaa continuación. En estos casos se calcu16 la acidez total considerándola comosifuera debida exclusivamente a ácido acetico.

Determinación de Acetaldehido.- Para la-'-'-:447 determi"nación de la formación o consumode alienhido acético durante el proceso de fer­mentación se empleó una modificación delmétodo de Tomada, reducida a semi-micrométodo debido a la pequeña cantidad desubstrato disponible.

Este metodose vale de la titu­lación iodimétrica a pH8 del sulfito combinsdo al aldehido pues a este pH 1a com­binación bisulfitica está ligeramentedi­sociads,

Durante los primeros ensayosdel macro-método, modificado por Jaulmese Espezel, se pudo observar que cn eldestilada de vino existia cierta sustan­cia o sustancias que reducian al iodo apH7-8, pero no en la zona ácida. intro­duciendo asi un error pues el método sevale de 1a estabilidad de la combinaciónbisulfitica en medioácido para destruirlas sustancias que puedaninterferir.

Puesto que ensayos en blancodemostraron que esta sustancia no era el

-17­

aoetaldehido ni el alcohol se decidióeliminarlo. directamente deepuee de reci­bido el destilado en el buffer de ¡fl 7con solución de bisulfito, mediante elagregado de un pe ueño exceso de iodoaproximadamente R 5. volviendo luego aagregar solución de bieulfito de sodiopara luego dejar reposar po:- lo menos 30minutos para asegurarse la formación com­pleta del compuestobisuli’itieo.

La determinación consta dscuatro etapas:­a) Deetilación -=desde una solución de

ácido fosfórioó, recogiendo en solu­ción buffer de pH7 con bieulfito desodio.Oxidaoión con solución de iodo y agre­gado posterior de bieulfito de sodio.

c) Repoeo - a m 7 para que se forme lacombinaciónbienlfitios entre el alde­hido y el bisulfito de sodio.Titulación. Previa destrucción delexceso de bisulfito de sodio en medioácido, se descompone la combinaciónbisulfítios a ¡a 8 y se titula al'Iizádsulfitodesprendido con solución deo. '

bV

dV

a) DestilaciOn.- Se empleóun aparatode destilación con 1a..

caracteristicas que indica le Figura llpag.18).

La mestre extraido esterilmen­te desde el frasco de fermentación ee pa­sa a un tubo de ensayo. desde el cual s‘toma la cantidad requerida con pipeta dedoble aforo. Para contenidos de scetsl­debido hasta 2%0se toman 5 m1. de muestra

315711111.,1

-19­

de 2%0 a 440 se toma 2 m1. y para concen"tracionss superiores a 4%0se destila lrúde muestra convenientemente diluido.

La cantidad correspondiente secoloca en el tubo de destilación y previoagregado de solución alcoholica de fenol­ftaleina se titula con hidróxido de sodioN710 cuando hay poca formación de ácidoy con hidróxido de sodio B71 en los casosde muchaacetificación (pues sino el vo­lumena destilar sobre- sa la capacidaddel tubo de destilación hasta color rojode fenolftaleina.

A la muestra neutralizada se leagrega lvo de piedra ez y 6 a 6 go­tas de cido fosfórico 851) y IUBEOsela destila a casi sequedad, recogiendo eldestilado en un frasco Brlenmeyer, deaproximadamente 150 m1. de capacidad ycon tapón esmerilado, en el cual hay 10ml. de solución Buffer de pH 7 (ReactivoN°l pag.21) y 3 ml. de solución de bisul­fito de sodio (Reactivo N°2, pag.21).Cuandohay gran cantidad de ácido en elliquido que se destila se agrega al Buf­fer una cantidad de hidróxido de sodioigual a la acidez volátil de 1a muestra.

Una-vez que se ha terminado ladestilación se lava el interior del re­frigerante con unos pocos mililitros deagua destilada, recOgiándolos en el Brlcrmeyer. ­

b) Oxidación con ioflo.- Se agrega solu­ción de iodo

aproximadamenteN/5 hasta color amarillo,agregando luego de 3 a 5 m1. de solución

.3:-1x“..ij ¿5...?‘.—

-20­

de bisulfito de sodio (de acuerdo con lacantidad de acetaldehido que se encuentrepresente y en forma de que haya un buenexceso a1 finalizar el periodo de reposo)

c) Repasou- Se tapa el nrlenmeyer, eeanita vistu-oeamente y se de)!

reposar para que ee forme el compuestobisulfítico. Janke Jnkropacsy (2) reco­miendan 20 minutos de reposo, pero seadoptó el sistema de dejar por lo menos30 minutos. Debido a las exigencias deltrabajo en muchas ocasiones se dejó snreposo hasta el dia siguiente.d) Titulación.- Completadoel periodo

de reposo se agregan 20m1. de a a destilada y 2 m1. de solu­ción de cido clorhídrico (Reactivo N°3.pan.21), agregando luego rapidamente unasolución de iodo aproximadamente N/5 has­ta color amarillo para destruir el excesods bisulfito (en medio ácido 1a combina­ción bieulfitica ee muyestable).

Previo agregado de almidón so­luble se elimina el exceso de iodo conuna solución de tiosulfato de sodio n/io.

Empleando la misma solución deiodo que se ha de emplear en la titula­

wcidndel bisulfito liberado (N7206N/ïOO), se lleva el color de 1a solucióna un azul pálido y luego se agrega unexceso (más o menos 10 gr.) de bicarbo­nato de sodio sólido, cuidando que 1aefervescencia producida no ocasiona pér­didas de liquido.

En el caso de ha er al idoen la muestra, desaparecerkrel cgïgr.

“21.-.

azul e inmediatamente se agrega soluciónde iodo N/100 ó N/2O en forma de que sia?pre haya un pequeño exceso de iodo en elliquido. El punto final se toma cuandoel color violeta azulado persiste durantemedio minuto.

El cálculo de acetaldehido sehace en consideración de que l ml. desolución de iodo N/lOOequivale a0,00022 gr. de acetaldehido y que 1 ml.de solución de iodo 8/20 equivale por consiguiente a 0,0011 gr. de acetaldehido.

Reactivos.- nn las determinaciones ante­riores se emplearonlos si­

guientes reactivos:­l.- Solución Buffer pH 7: 3,36 gr de

2K y 7,45 gr. de P04HN32.2H20en un litro de agua destilada.

2.- Solución de bisulfito de sodio: Seprepara disolviendo 18,9 gr de sul­fito de sodio anhidro ó 37,8 gr desulfito de sodio con siete molécu­las de agua en un litro de aguadestilada con 150 m1. de ácido sul­fúrico normal.

3.- Solución de ácido clorhídrico: Sedisuelven 250 m1. de ácido clorhi­drico concentrado en un litro deagua destilada.

4.- Solución de hidróxido de sodio N710.

5.- Solución de hidróxido de sodio N71

6.- Solución de iodo aproximadamente N/5

-22­

7.- Solución de iodo N/20.

8.- Solución de iodo N/100, preparada enel momentode usar mediante diluciónde la solución de iodo N/ZO.

9.- Solución de tiosulfato de sodio apro­ximadamente N/lO.

10.- Solución de almidón soluble 0,2%.11.- Solución alcohólica de fenolftaleina.

12.- Acido foefórico (85%)13.- Bicarbonato de sodio.

oOo

CAPITULO IV

Influencia de Diversas Tensiones ¿eOxígeno sobre la Formentación delVino gpr el Acetobacter aecendens

Con el objeto de tratar de es"tablecer la concentración óptima de oxí­geno para la fermentación acética se es»tudió el efecto de dívernas mezclas deoxígeno con anhídrido carbónico o nitró­geno sobre 1a formación de ácido acético!

Se empleó para este fin 1a cepade «¿sgtp_bactqr___a.g9.er_1.d9ng(N°119) euminie Itrada por Inga Agr nomoSo Soriano ycuyas características ee detallan en 1apágina 10,

La cena se conservó en estríasde agar de agua de levadura glucosada co;cistina (Medio N°2, pasala) Y medianterepíques sucesivos ae emplearon bacteriade 48 horas para que el estado del matenrial empleadofuera uniforme. según elmétodo empleado por Tdeic & Walker.

Antes de iniciar las experienvcias se enaayarondiversos substratoscomo ser agua de IeVadura qlucoeada concistina (Medio N°1,-pag012) con 2%dealcohol etílico: cerveze:'y vino claratzpaeteurizado (Medio N°3, pagolz). obtenniéndose 103 mejores resultados con elvino pasteurizado. puesto que en losotros medios no se forma bien la pelícv­la característica, y por esta razón tocasestas experiencias se realizaron sobreeste substrato.

:orma d: TrabajoCun emplearon Cos métodos ¿e

siembra“ En el grimero (Sistema A) Éflota un ansn ¿e películfi ¿ebro 50 r1ee vino ppgtuurizudo contenidos en HÏErlenmeyer de 120 m1n de Capacidad, yse incvïa a RBHÓO°C‘ La Delícula que 93siembra fic obtiene desde tubos de e35y7¿con vino que se siembran 4 díag antespor suspensión de un ansn de bacteriasdesde agar de levadura flacosuda can cintina k.

«D

e con esta forma dela no crece bí:n en ÍQsenmrar la pelícu

c 9, se grocedío de la sdos los :so igviaute forma para lograr una mayor un fatflí1

dad entre los diversos ensayos (SistemaB):

Wufrascos Erlenmeyer ect4ri­les de 150 m1: (los que se emslearonfueron todos cc la misma forma, marcaFeng, gara tenor la mismarelación desuperficie a volumen) se colocan 16 mi“de vino, cantidad ‘lr agenns c192 .Jfondo, y dentro ¿e ¿SÉOSse suïyansa lïeno de bacfarias (°)

A los cuntro días de ¿Aión a 23«30°C casi todos 105 Erl

e una buena Película BSCBH(VJÏCrgc136€? CZSÍ hasta el tapóü ¿e

¡.43

“35”

Se desechan los frascos que notienen pelicula o en los cuales no estabien formada. y a los restantes se lesquita cuidadosamente todo el liquido conuns pipeta esteril, tratando en lo posi­ble de no dañar la pelicula. A continua­ción se introducen 50 6 75 ml. de vinopor debajo de la pelicula en forma deque ¿sta flote sobre ellos.

Desde este momentoel frascodebe manipularse con sumo cuidado, puestoque la pelicula se rompecon facilidad.

Cuandola siembra se efectúapor el sistema A se procede inmediatamenrte a cambiar el tapón de algodón por unode caucho con tubos de vidrio (previamen«te esterilizsdo) comoindica la Figura 2(pag.26) Y se hace pasar la mezcla gaseo­sa correspondiente.

Cuando se emplea el sistema Bde siembre el cambio de tapones se efec­túa despues de introducir el nuevo subs­rato.

En el caso de estudiar la fer­mentación en aire se deja el tapón deal ón, puesto que ensayos con circula­ci n forzada de aire dieron los mismosresultados que con.tap6n de algodón.

En algunos casos se efectuó lafermentación en frascos Brlenmerer de 1litro de capacidad y con 300 ml: de vino,sembrando en estos casos por el sistemaB sobre añ ml. de vino.

Con 50 m1. y 75 m1. en frascos

-27­

de 150 m1. 1a capa de liquido ee de apro­ximadamente 2 eme..y 3 emea respectiva­mente; con 300 m1. de medio en frasco de1 litro el espesor de la cepa liquida esde aproximadamente 3.5 eme.

Para asegurar la constancia de1a composición del ambiente geeeoeo sehace pesar constantemente a 1a mezcle_deRaeee a traves de loe frascos a razón de3 e 4 burbujae por minuto.

La muestra ee retira quitandoel tapón de caucho del tubo central, se­cando el taponcito de algodón medianteun hilo al cual está atado, flameandopreviamente el tubo y aacando 2 m1. conuna pipeta eeteril, flameando nuevementey reponiendo los doe tapones. Finalmen­te ee hace pesar por un reto una corrien­te fuerte de mezcla gaseosa para desalo­Jar al aire que pudiera haber entrado alfrasco. Durante todo este proceso elfrasco ee mantiene en posición verticalpara no dañar 1a película.

Los dos mililitroe retiradosee filtran por un pequeño embudocon a1­godón pere eliminar los reetoe de pelicu­la y del filtrado ee retira 1 ml. conpiïgta de doble aforo para determinar euac ez.

La provisión de le mezcla gasa:ea ee aseguraba mediante presión hidrau­lica ejercida en una damajuana de Veintelitroe mediante un eifón desde otra dema­íuena superior comoindice 1a Figura 3paz- 28)­

Pera cargar 1a damajunnan con

Figura 3

con la mezcla deseada se la llena com­pletamente con agua v luego, pasando elfrasco A a un nivel inferior. se haceentrar uno de los componentes de lamezcla en ls cantidad deseada (efectuan­do la lectura con las superficies liqui­das a un mismonivel).

nn la misma forme se carga elotro componente y luego mediante le co­locación de la damajuena A sobre la Bse tiene la mezcla gaseosa con una pre­eión que depende de ls diferencia denivel.

nxveriencias Realizadas

Se efectuaron experienciae_enaire y con oxigeno puro. Además seemoleeron mezclas de oxigeno y anhidridocarbónico con las siguientes concentra­ciones de oxigeno: 751, 501, 25%v 101v una mezcla de 281 de oxígeno con 75%de nitrógeno. _- ,

Les experiencias se siguierondurante periodos de 15 e 45 dias a 28930°C. sacando muestras-c intervalosconvenientes.

Los datos consignados en lestablas y gráficos que siguen se refierena mililitros de solución de hidróxido desodio N710requeridos para neutralizara la fenolftaleina un mililitro del me­dio fermentado.

Experiencias en Aire.- En el Gráfico I"4' (pags. 31 v 32)se presentan los resultados de las ex­periencias N°1' BP, 6' y 6' en lascuales se emple el Sistema A de siembrasobre 50 m1. de vino. La película as­cendente apareció a1_3er y 4o. dia.

En el Gráfico II (pags.33 y 3Qse encuentran los datos referentes a lasexperiencias N°3, 11, 32 y 42 que-seefectuarOn todos con pelicula pre-forma­da (Sistema B).

Las experiencias N°3 v 42se efectuaron sobre 50 m1. de medio, elN°11 sobre 75 m1. y el N°32 sobre 300 ml

Reforma de las curv’as sontodas semejantes, mostrando un periodoinicial de poca acetifieación seguidapor otro en el cual hay mucha formaciónde ácido. En los casos en que se empleapelicula pre-formada con poco liquidoel primer periodo se reduce hasta desa­parecer (Inp- N°3 y 42. Gráfico II).

El segundo periodo dura apro­ximadamente 6 dias (desde el comienzode 1a gran aeetificaeión) y despues deestos 1a formación de ácido es pequeña.A partir del dia 25 el frasco N°3 teniamuypoco líquido, lo cual quizás explica1a fuerte aeidifícación obserVada.

En la mayoria de los casos1a acidificación practicamente se hacompletado a1 10° dia, no observándoseeasos de sobre-oxidación. Las excepcio­nes son las experiencias con mavor volu­meny espesor de la capa liquida, en las

(sigue pag.35)

Grách I_——.

Ex eri229122.22181224_Eiggh:__gig_9maD a . lil 2|! i 6!

o 0,9 0 0,7 0,71 - - 0,74 0,722 0,9 0,9 - ­5 1,5 0,91 ¡3,74 x5,054 x - x - 8,18 8,155 5,8 2,07 11,15 9,528 9,85 ¿,95 12,08 10,787 12,05 , 12,18 11,18 - - 2,3 11,889 14,8 11,1 - ­

,10 15,8 12,5 12,5 11,88,11 15,7 14,05 - ­¿12 15,8 14,4 - ­518 15,9 14,8- —- ­14 - — 12,5 11,815 - - É2,6 11,8218 15,95 15,15 e ­17 18,22 15,2 12,8 12 0518 18,5 15,45 12,89 12,0519 18,4 15,53 12,72 12,0520 18,5 15,53 12,87 12,221 18,85 15,8122 - ­28 18,93 18,8124 ¿7,2 18,58

.o“v

9.

X Día en que apareció 18. películaaeoeniente.¡.

a;mani¡818“¡Yt”"G0:33“

69.13349'’

-35­

cuales las curvas de scetificación seencuentran desplazadas.

. Se obeervnn datos de acidezequivalentes a ácido acético en concen­traciones de 7 a laz.

En el Gráficonxgeriencias en Oxigeno.­' III (pags. 36

y 37) se anotah los resultados de lasexperiencias N°l', 2', 3" Y 4", que eranensayos preliminares efectuados por siambra directa (Sistema A).

En estos ensaybs ee nota unadisminución notable en la formación deácido acético y un atraso en laformaciónde la pel cula caracteristica,que recien aparece al 14° y 17° dia.

La forma de las curvas tambienes muydistinta a la de las curVas enaire._ Se nota desde ya 1a formaciónde un olor aromático (debido a aldshidoy ácido acético), aun ue en distintostiempos de fermenteci n. Estas cuatroexperiencias se efectuaron con 50 ml.de vino.

En experiencias posteriorescon película pre-formada se confirmó1a disminución del renáimiento en ácidoacético y la presencia del olor mencio­nado. En el Gráfico IV (pags.38 y 59)se presentan los resultados de las ox­pcricncias N°7 v 8 (con 50 mlo de vinoïi ¿e ¿as N°ló v 51 (con 300 m1. de vinol

¡Rx-per111.142; efectusdgt s en.

-36­

¿192m3 9131.0195A3|!

Gráfico III

M”

57538

9.99.235.690.4..369¿5z.511OOO1111122¿“4556678

..|\P

555285555559,99,134=78047..738879.6580.00.11111222455568122

. x111.

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01234567890123466789%12ü4ü

1111111111222

x 31a en que apareció 1a pblículaascendente

Olor aromático

Gráfico IV

mpggieg 015;; en . ígeno.Siemb_13__sisteqfi IE.1

o 0,8 '-o,e- 0.3- 0,81 1,19 1,4 - ­2, - 1,85 - ­3 J cn — ‘

4 1,68 2,2 - ­5 1,68 2,27 1,2 1,0

g 1,93 2,5 - ­9 c12,13. °2,—5:5 1,4 1,2

11 2,13 3,0 '12 - - - 1,213 - U In ­14 2,82 4,0 c11,4, ..15 - .. .. _16 - - ‘. ­17 3,65 4,64 - 1,:5ía ' ' " ' 59 5 11 5 15 1,4 '20 "L - ' - ­21 - ­22 - ­25 o . 924 _ 11825 _ ..26 _27 4 1'45 _g 2.55!3° Ï.31 ­

4 32 _33 ­34 _

35 , 4,15° Olor aromático .

vino en oxígeno (sin bacterias) mostraramque no hubo fariación de aciflaz ni aparioción del olor a acetaldehido mientras durraton las experiencias-(30 y 35 dias)

'ggz_ggígeno y 752 Anhidrido Carbónico ­Si bien las curvas tienen forma semejan'te a las de las experiencias en aireiloe ¡aloree de acidez alcanzados soninferiores a los obtenidos en aireBe tarda más en alcanzar 1a meseta de 1acurva.

Las experiencias N°12 v 15 enel Gráfico V (pags° 42 y 43) se efectua“ron con pelicula preformada (sistema B)sobre 75 m1a de vinoo

La acidez a partir del 25° diase mantiene en los alrecedoree del 6%de acido acético,

Un hecho notable ee que losemedios estaban aún claros en el 35° día.a diferencia de lo que comunmenteocurreen le fermentación con Acequacter ae­

__ce.ndens" '

25Z_0xigeno y 75%Nitfógeno - Las expe­- rienciae

N°33 y 34 en el Gráfico V (pags.42 y 45)dan curvas muy semejantes en su formaa las obtenidas con 25%Oxígeno y 75%Anhidrido carbónico si bien los valoresfineïne de acidez de estes dos experien­cias son algo distintas.

Las experiencias se efectuaroncon 50 m1. de medio con película pre­fürmada (Sistema B), V, como las expe­

"41

riencias consideradas anteriormente, tam­poco dieron olor a acetaldehido,

50%My 50°7-Anhidrido Carbónico ._.-Las.' ex­.periencias con partes iguales de oxigenoy anhídrido carbónico evidencias mayorinhibición de 1a acetificación y acumu­lación de acetaldehido, que dió lugara un fuerte olor a1 18° y 23er. iia.

‘ Las curvas N°1 y 2 del GráficoV (pags. 42 v 43) se refieren a ensayoscon 50 mln de vino y se asemejan muchoen forma y valores generales a algunasde las experiencias en oxigeno puroo

12% organo y 25%Anhidrido Carbónico.­En el Gráfico VI (pags. 44 y 45) se pre“sentan los resultados de las experienciasN° 4, 6, 6, 9 y 15: las primeras tresmencionadas habiendo sido efectuadas so;

Ego ÏO m1° de medio y las restantes sotrem .

Comopodrá observarse los vamlores de acidez son bajos. con eICepciónde 1a experiencia N°15 que alcanza unaacidez de 5,4% de ácido acético al cabode 24 dias.

Todos dieron olor fuerte aacetaldehido.

10% Oxígeno v 90% Anhidrido Carbónico.—

Las curvas N°27 y 28 del Gráfico VII (pag46 y 47) muestran que si bien en unprincipio la menorconcentración de oxi­geno ejerce un efecto retardador de laacetificación, al final de algún tiempo

(Sigue pag.48)

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Gráfico VI

Experiencia! con 75%02 ¡ 25%002.­9 15 Í

Día l 4.**_É “¿,6 ­o 0.7 0’33 1,04 0.8 0,751 1,19 1.5 1'29 - '2 1'29 1,9 2,03 :145 '3 1,447 2,15 3907 ” lll4 - n - '5 1,49 2,35 4.21 - '6 1.53 2945 - - 1'3v 1,73 2,7 4.45 1.75 '­8 1,83 ' ' 4,65 ' '9 1988 2985 497 - 1’9

10 2,08 ' .418 lla '11 - ¡- - "12 2,33 ‘3,25 5,0 ' i13 - I- - '14 2,67 3,42 5,0 ' 4.9515 - - - 2-05 "16 .391? 307 592 - ­1-7 - - - 2o? "18 ' ' ' - ­19 4.02 4,3 ' ' ’m ¿,2 4,4 ­21 - °8,222 - ­

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° Olor aromático

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hay formación de cierta cantidad de áci­do acético" Las experiencias se efectua­ron sobre 50 ml” de vino y con peliculapre-formada. no se observó olor a acotardebido.

_gesumen v Comentarios

Se observó que el desenvolvi­miento de la fermentación acético en las ‘distintas mezclas gaseosas empleadas noera en ningún caso tan bueno como en elaire.

Una mezcla de 25% de oxígeno y75%de nitrógeno presenta una curva deacidificación de la forma eral de lasobservndas en aire. pero a con estapequeña cantidad adicional de oxigeno elrendimiento era menor y se tarda más enllegar al máximode acidez.

Con oxigeno puro hay poca pro­ducción de ácido y acumulación de acetal'dehido; y las curvas muestran una pen­diente continua sin las inflexiones ca­racteristicas de la curvas de fermenta­ción en aire.

En mezclas de oxígeno v anhi­drido carbónico se observa tambien quecuando la concentración de oxigeno es'mavora la del aire la acetificación esmenor, dependiendo la forma eneral delas curvas de la concentraci n de oxige­no empleada.

Las experiencias con 25%deoxigeno y 75%de anhídrido carbónico dancurvas v valores semejantes a las expe­riencias en que se empleó el nitrógeno

m4g­

Dara diluir a1 oxigeno.Con mavor proporción de oxige­

no (601 v 75%) las curvas en general tie­nen una forma parecida a las de experien­cias efectuadas en ambiente de oxígenoy se nota ademásun olor a acetalóehidoque indica que este se ha acumulado enel medio.

Con menor proporción de oxige­no (10%) se obserVa Una disminución delrendimiento v un periodo inicial de pocaacetificación que es mayor que 1a quese observa en el aire. presentando sineMbargolas mismas inflexiones en lascurvas.

El método empleados padeceprincipalmente de dos inconvenientes:1° 1a larga duración de cada experiencia7 2° le dificultad de mantener 1a cons­tancia de todas las posibles variablesdurante este periodo.

Ademásdebe tenerse en cuentala pérdida de tiempo por las experienciasque, una vez iniciadas, no fermentan-enforma alguna al substrato a pesar de‘tener una buena pelicula formada.

Por estas razones se trató desimplificar y acortar el métodoen formade obtener datos reproducibloe sin granperdida de tiempo (ya sea por la duracnfizdel ensavo o va sea por incenvenientesdebidos a que las bacterias no fermenta­ran bien).

Para evitar estos incunvenien­tes v además para determinar la formaciónde acetaldehido en el medio se empleó unatarde el método descripto en el CapcVI.

000

. 50­

QÉÏEÏULO'VZ'IInfluencia de Sustancias Quimicassobre la Fermentación del Vino

por el Acetobacter ascendens

Se efectuaron ensayos concianuro de potasio, luminal y azul demetileno para determinar sus efectos so­bre la formación de ácido durante la fer­mentación acética.

Las peliculas se preparan porel sistema B de siembra en 1a misma for­ma que en los ensavos con mezclas gaseo­sas (pag. 24 y 25), introduciendo en ee­te caso 25 6 50 mlo de vino agregados dela cantidad correspondiente del reactivoen consideración. Los frascos se incu­baron a 28*30°C con tapón de algodóno

Experiencias con Cianuro de Potasiq_Se efectuaron dos series de

ensayos en triplicado, el primero duran­te 18 dias v el segundo durante 27 dias.

Para la primera serie se prepa­raron soluciones estériles de cianuro depotasio en vino con las siguiente concen=traciones: n 50, M/lOO,M/soo, n/1.ooo,M/5.000 v M10.000. introduciendo 50 ml.de cada una de ellas bajo tres peliculasde 4 dias sobre vino. Al final de 18dias de incubación las concentracionessuperiores a u/5.ooo no habian variadode acidez, no obstante seguir intacta lapelicula de bacterias“

Los valores de acidez de losfrascos que tenian vino con cianuro de

.5L .-.

potasio M/5.000 (Experiencias NÏ72J75 y74) v vino con cianuro de potasioEVIOLrD(Experiencias N°76, 77 y 78) se presen­tan a continuación:

05K M/5«090 7.9NEHE¿29199Q,Exp. 72 ; 733 7d 761 77 i 7asu... _ M-“ . ,...r._....-_.ï.._fi a 1...... .4.-. .e.0-t_...._.._Dia :- ;

o 0.8 0,8 20,8 0,8 «0,8 ¿0,82 19:5¿1,4 ¿0,9 1,0 0,9 .o,97 16,7 6,411.1 1,05 0,9 0,9

12 17y5 7,1 13.8 5,15 1,85 55,518 17,5 7,25;14,1 s14¿5,1_ 5,92

En una experiencia posteriorse trató de definir aún más el limitesobre el cual no se produce acidezo Enensayos por triplicado se emplearon so­luciones de cianuro de potasio en vinoen concentraciones de: H/IGOOO,u/2.ooo.M/5,000 v M/4u000, sin observarse acidezen ninguna experiencia a1 cabo de 27diaso En 1a mayoria de los casos aún seconservaba 1a pelicula intactae

Experiencias con Luminal

En dos ensayos por duplicadose introdujeron 25m1"de soluciones deLuminal(ácido fenil-etil-barbitúrico)en vino con concentraciones de H/SO.¡7100, H/1.000, M/10.000 y M/100.000,por debajo de peliculas crecidas sobrev no.

En el primer ensayó no se ob­servó acidez en ninguno de los frascosal cabo de 17 dias, habiéndose sedimenetado 1a elícula. En el se dun solo rasca de los des qggntgnïgfiayo

.Luminal H/IWOOOdió una acidez equivalente a 13.1 m1. de hidróxido de sodio N/ïïnor mililitro de medio, no observándoseacidez a mayor ni menor concentracion,Con excepción de esta experiencia, ïciaalas peliculas se habian dosintegrado vaedimentadoa

Las tentativas de aeguir culti°vando la bacteria que parecía haberae'acostumbrado al Luminal no tnyieron oxi‘to.

Experiencias con Azul de MetilengwSe efectuaron ensayos con el

agregado de 0.05% de Azul de Metileno avino que luego Be fermentó en aire y enoxigeno. Los reeultadoa obtenidos se

presentan en 31 Gráfico VTII (page 53 y54 r

Las experiencias N°18 Y 29 aeefectuaron en aire con 50 m1 de mediosembrados mediante el sistema B, Y laexperiencia N°50 se refiere a 1a fermen"tación de 300 m1o en ambiente de oxígeno(Siembra B)°

Refiriondo los resultaóos alos obtenidos en aire sin agregado deAzul de Metileno se observa que en uncaso se ha disminuido el rendimiento yen ambosse ha alargado el periodo ini­cial de poca acetifícaoión

El agregado de Azul de :etilen:no ha afectado mayormente 1a fermentaciónen ambiente de oxígeno, en comparacióncon experiencias sin este agregmio, ob­gïrvandoae el olor a acetaldehido al 36°a.

00 1

M53,

Gráfico VIIImaiz...Oxigeno0,8

0,8

0,9

' 0.918 14,0 - ­19 - _ ­20 - 9,4 ­21 14.35 w ­

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-55­

CAPITULO VI

Formación y/o Acumulación del AldehidoAcótico durante la Fermentación

con Acetobacter ascendens

ComoVa se ha señalado en uncapítulo anterior, se observó en algunoscasos de fermentación del vino por el¿getobacter ascendens en atmósferas ri­cas en oxígeno Ia formación de un fuer­te olor aromático despues de algunos diesde fermentación.

Este aroma resultó ser debido,c0m0ya se dijo, a los olores combinadosde acetaldehido y ácido acético en bajaconcentración.

Con el propósito de seguir elcurso de 1a formación del acetaldehidodurante la fermentación se intentó enun principio continuar con el tipo deexperiencias empleadashasta entonces,pero usando mavores cantidades de mediopara poder sacar mayor volumen de mues­tra para 1a determinación del aldehidoacético. Debidoa las dificultades ha­lladas en formar la pelicula y conservar1a intacta una vez formada en mayor su­perficie y volumende liquido, hubo queabandonar esta forma de trabajo.

Se intentó comosolución de e­mergencia la aplicación de una técnicasemejante a la de las bacterias quies”centes, gracias a la posibilidad de ob­tener facilmente masas relativamentegrandes de bacterias de la especie con­siderada.

Esto no fué factible con el

¿1 o:

agar de agua de levaduva glucosada ¿oncietinawemplegdo.en las experiencias ana ¿aterioreb, pero siguiendo las augerunbiasdel . An Sordelli se ensayo un mediomaple do por él para el cultivo de ba te=rias láctieas. obteniéndose un crecimien­to asombrosocon varias cepas distintasde bacterias acéticas que se enaayaronsobre este medico

Este meïio'de bultivo ed una'mezcla de partes iguales de macerado demaiz y agua de levadura concentrada, alcual además se le hizo un agregado deglucosa. La preparación de este mediose encuentra detallada bajo el N°4 enla página 13

Con suspensiones concentradasde bacterias provenientes del medio anto—rior se sembraron variOB frascos con 10ml. de vino diluido (MedioN°5, paguls),logtándose la formación de 40 a 60 grs“de acido acético por litro en dos diasde fermentación en aire a 30°C.

Puesto a punto la determinaciándel aoetaldehido (pag.16) y establecidala forma de traba o que ae-detalla másadelante, se trat de hallar un mediomás Sencillo qu»;-a}. 'nsloías decir. aifuera posible un Neiio sintético).. Elprimer ensayo de esta naturaleza fué conuna solución acuosa de alcohol etílicoal 8%, observándOSe que en este substra‘to las bacterias daban pOCaacidez yacumulaban gran cantidad de acetaldehido.

En experiencias subsiguientesse trató_de hallar la razón de este fenóvmenC‘ además de estufliav 1a formación

.e 5-7.

y acumulacxón del aldehldo acético en elvino durante la fermentación en atmósfe­ra de oxígeno puro Y en anaerobioa1e,

Forma de Trabajo'

Suaveneión de bacterias v Se siembran"" unas gotas desuspensión concentrada de Acetgpggte:¿esenqene sobre el Medlo N°4 en frascoschafñe'aco4tados (ee emplearonbotellasvacías de "Gin"). v se las distribuvesobre toda'la superficie del agar mediante un .rozo de varllla de vidrio esterilque ae introduce dentro de los frascos.

Despues de incubar durante 24horas a 30°Cse vuelve a hacer correr lavarilla sobre 1a superficie y el frascose coloca nuevamente en estufa a 30°Chasta el día siguiente,

completadae las 48 horas deincubación, se controla la pureza delcultiva y luego se introduce unos 5 am1“de agua esteril Haciendo deelizarla varilla que está dentro del frasco sesuspende el cultivo, luego se retir? 1&_emulsión con una pipeta esteri} V180 PPea a un tubo de centrífuga esteri­

Eeta operación ee Tïglf? ?u“ma5 veces hasta que 38 haya ¿etlrauu ¿m.YÚTParte del cultivo ¿81 1’99°3.,-Lïpr¡Suspensiónresultante se ¿entri“Ï“T517Ï¿a que las bacterias esyén_b1?3 123;;¿‘¿351 luego‘se decanta e; Liguï 2 }_¿’;nadante Se suspenden Las santig-:e ¿gü¿Hua esiaril agregada a cada tutrífuga, se centrifllga nue'tzamen'tey Bedecanta el líquido sobrenagantn.

p

Se reunen los sedimentos de los tubosde centrífuga suspendiéndoloe en unos10 mlo de agua esteril.

Empleando 1a escala nefelomé­trica de MacFarland (según indica Kolmer& Boerner) se hace un cálculo de 1a con­centración de bacterias por mililitrode suspensión y se agrega 1a cantidadnecesaria de la suspensión para que losliquidos que se ensayan tengan una con­centración de aproximadamente 3.000 mie­llones de bacterias por mililitro.

Cuandose usa una superf ciede agar de aproximadamente 180 cms seobtienen unos 10 m1. de suspensión con35.000 a 75.000 millones de bacteriaspor mililitro.Experiencias en Aizg.- Las experiencias

' en presencia deaire se efectuaron en dos formas: contapón de algodón y con tapón de cauchocon tubo capilar.

Los tapones de algodón se em­plearon principalmente cuando el subs­trato era vino . en 01 cual ha? 9068formación de acetaldehido y gran canti­dad de ácido acético (que ataca a1 cau­cho). Para loe otros medios (v tambienen algunos casos con vino) se empleó untapón de caucho con tubos de vidrio comoindica la Figura N°4a (pas.59). 31 tubogrande solo se destapa cuando se saca1a muestra o para agregar el medio a1iniciar 1a experiencia; el tubo pequeño(B) se conecta mediante un tubito de cau­

(°) Tambien se usó el ta pó de algodónggátgïgofigíos en que e? substrato

¿3'11 -r

cho a un tubo de vidrio estirado a capl‘lar (C). cuyo objeto era permitir la en"trada de aire pero impedir en lo posiblela pérdida de acetaldehido que es muyvolátil.

El tapón de caucho y‘el frascoErlenmeVer (con tapón de algodón) ec es“terilizan por separado y solo ee cambianlos tapones cuando el frasco está frioy eecov El Erlenmeyer tiene 150 m1. decapacidad‘

Exgerienciae en Oxigenov- Para estos en­sayos Je empleó

el mismodispositivo que para el aire.con 1a diferencia de que el tubo chico(B) se conecta a un tubo de oxigeno ytodo el tapón se cubre con cera para e­vitar pérdidas° El tubo de gomaque vala cilindro de oxígeno lleva un tubo enT que conecta a un tubo de vidrio con elextremo sumergido en agua (como indicala Fig.4b, pag.59) para evitar preeionesdentro de los frascos mayores a 2 o 3 cmde agua.

Antes de introducir el medioee hace pasar una corriente de oxigenoa travee del frasco durante varias horas(quitando el tapón del tubo A) v tambienpor unos minutos luego de haber introdurcido el medio“ Una vez introducida 1amuestra se cierra la llave de entradadel gas.

Para retirar la muestra sehomogeiniza el medio por agitación, seempuja el tubo A hacia abajo hasta quetoque 1a superficie del liquido, se lodestapa y mediante presión de oxigeno sehace subir el liquido"

551,

Una vez retirada la muestra con una pipe­ta estéril se vuelve a subir el tubo A,se hace bajar el liquido que quede en ély se hace pasar oxigeno durante unos mirnutos para desalojar el aire que puedahaber entrado, cuidando que no fueraexcesiva la corriente en el caso en quehabía acetaldehido en el medioo

Sacando la muestra en 1a formadescripta se evita que el aire pueda en­trar al frasco propiamente dicho y porlo tanto no ee necesario pasar gran can“tidad de oxigeno, que en el caso de me­dios de cultivo con acetaldehido arras­trarian a este.Experiencias en Anaerobiosis - Los meu“m diossepreparan con agua recien esterilizada yenfriada haciendo pasar nitrózeno naraiïpedir la disolución del oxí¿eno dela re.

Los agregados de alcohol, ace?aldehido y suspensión bacteriana se efec­túan con la mayor velocidad posible yluego se pasa el medio sembrado a e­ringas hipodérmicas de 10 6 6 m1° e ca­pacidad (de acuerdo al volumen que serequiera para dos determinaciones delcontenido de acetaldehido).

Se cargan las jeringas sin queentre aire y se sella el orificio y laJunta del émbolocon el pistón con cera.

Con el vino se lo empleó talcual sin tratamiento con nitrógeno, esdecir. estaba saturado con oxigeno a lapresión de la atmósfera. 7

Para retirar la muestra se a i­ta el contenido, se funden los sellos ge

cera con calor suave y ee expulsa 1acantidad necesaria, volviendo luego aeellar los puntos indicados.no­

Todos los experimentos fueronllevados a cabo teniendo presente lassiguientes normas:

La determinación de aoetaldeehido y ácido acético se efectúa en elpunto cero (antes de agregar las bactoerias al medio), a las 24 horae y a las48 horas de eedbradasr En algunos casosse hicieron determinaciones a1 3er., 4o50°, 60v y 1504 dia.

Las experiencias se efectuaronpor lo menos por duplicado. Be preparatodo el medio y se le agrega la suspen­sión de bacterias antes de destribuireeentre los frascos correspondientes, ase­gurandoasi igualdad entre ellos.

Comoel método de determina“ción del acetaldehido ee relativamentelargo, las experiencias se efectuaronen lotes de 10 a 12 frascos para dartiempo a analizarlos todos cada-dia.Cuando ee cnsayaban nuevos medios oagregados se incluía ademas por lo me­nos una fermentación en aire sobre vinoy otro sobre alcohol etílico a1 BZen.agua destilada para ase ree de que 1asuspensión empleada ten a un comporta­miento normal sobre estos mediosv

A cada lote se le designó conunn letra y a cada experiencia o frascocon esta letra seguida por un número. Enesta forma todas las experiencias con lamisma letra han sido efectuadas al mismotiempo y con 1a misma suspensión.

.63"

Cada frasco Erlenmeyer de 160ml. lleva 13 ml. de medio, cantidad suwficiente comopara retirar dos veces u­nos 6 ml. esterilmente y luego sacar deestos 5 ml. de muestra con pi eta de do»ble a oro. Esta cantidad de lïquido for­maba una capa de aproximadamente 0,6 cmde espesor en el fondo del Brlenmeyer,

Se efectuaron experiencias enAire, Oxigeno puro y en Anaerobiosiscon Vino diluido 2:1 (Medio N°5), consolución de alcohol etílico al 8%enagua destilada y con soluciones de acetaldehido en las dos anteriores y en aguadestilada. Ademásse efectuaron expemriencias en aire con una diversidad desubetratos, que se detallan másadelanta

ResultadosSe considerarán por separado

los resultados obtenidos bajo las trescondiciones, ee decir. en aire, en oxi­geno y en anserobiosie.

EXperiencias en Aire (°).- Se efectuaron' sobre Vino

diluido, solución de alcohol en agus,y soluciones de scetaldehido en las dasanteriores y en agua destilada.

(°) De estas experiencias las d la se—'rie A ee efect ron con tapgg ds go­maiy ggn Roque sgkrg-pres cnn egíeggn lgsrgïcggg as. ¿gqáñanfioñkluego este s stema nor emor de queuna perdida en el frasco pormitieesque todo el ambiente se cargara deoxigenou Las determinaciones detiempo 0 se efectuaron en este casodespues de agrezada 1a suspensión r:'knn+nrínn

-54­

Vino 2:1 nasteuriZado (Medio N°5).- Lasex­

periencias con vino en aire se efectua­ron con tapón de alROdón y con tapón decaucho con tubo capilar (Fig.4a).

En laa experiencias en que seempleó tapón de algodón ee observó unabuena acetificación al segundodia (50­60 {Ode ácido acético) manteniéndOSe ba-­Joe los valores de acetaldehido (menosde 0.1 zo) v en algunos casos desapare­ciendo completamente del medio (Tabla Ipag. 65).

Al emplear el tubo capilar,ein embargo, ee observan Valores másaltos de aldehido acético a la vez queee nota una inhibición parcial de laacetificación. Aai es que al segundodia de fermentación ae obtienen valoresde ácido acético que varian entre 10 v29 %omientras que-la concentración deacetaldehido llega en algunos casos has­ta 0.5 fio. Be durante estas experienciasque ae producen los únicos casos dereducción del tenor de ácido acético,tal comosi se tratara de sobre-oxida'ción, observados durante 1a fermentacióncon vino.

_ Asi, durante la experienciaB? al rimer dia ee tiene una acidez de9,75 o que baja a 1,6210 al cuarto día,y en la experiencia 08 la acidez baja de9,85 xo a 6,35 (o de ácido acético entreel primer 7 segundo dia,Solución de alcohol al 81.- La acidez

producidaen-la solución en agua destilada de al­

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cohol etílico es baja, con un máximode6,43 %ode ácido acético en las experiencias con tubo de algodón y de 5,86 %oen las experiencias con tubo capilar.En la mayoria de los casos,.sin embargo,1a acidez oscila alrededor.dé 320 deácido acético a1 segundo dia de fermen­tación (Tabla II, pag. 67). '

_En cambio se nota que la prosducción de aCetaldehido durante estasexperiencias.es muchomayor que en lasefectuadas con vino, dando valores-dehasta 4,4 Ze en las experiencias efec­tuadas con tubo capilar.

Las experiencias con tapón dealgodón ponen en evidencia la pérdida 'de acetaldehido por reutilizaciónr Esede hacerse notar que es posible que enalgunos casos tambien los caoilares nohavan evitado por completo la pérdidade acetaldehido. "

Soluciones de Acetaldehido.- Las expe­rienciasse efectuaron con tres liquidos de difaurante composición: 1° en solución-deagua destilada, 2° en agua destilada conalcohol 8%, 3° en vino diluido 2:1 conagua (Medio N°5). Ver Tabla III página68.

1° Soluciones en agua destilada.- Se e­fectuaron experiencias con soluciones

acuosas con aproximadamente 0,1 v'a fiode acetaldehido. observándose la desapa­rición de éste a 1a vez que aumenta le­vemente la acidez.

2° Soluciones en agua con alcohol.- Seprepararon soluciones de_accta1dehido

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-69­

aproximadamente 2%0 v 7%0 en soluciónde agua destilada con 8%de alcohol eti­lico y se fermentaron en la forms nornalcon tubo capilar­

nn las experiencias con 2%0desldehido acético se observa un comporta—miento muy semejante a la observada consolución pura de alcohol. formándoseaproximadamente 1a misma cantidad desldehido que en ésta pero con menor pro­ducción de ácido. es decir, la concentra­ción final de acetaldehido en los doscasos difiere nor 1a cantidad inicial desldshido en el medio. '

Gon 7 (o de acetaldehido haval principio muypoca producción de áci­do y consumo de aldehido, pero a1 sextodía el contenido de acetsldehido ha a1­canzado 8,5% v la acidez tambien hn au­mentado levemente.

3° Solucionns en vino.- En las experien­cias en las cuales se agregó el ¡cet­

sldehido al vino se nose que si bien casino hay aumento de wcidez con 4 go v 7 iode acetaldehido, 1a concentracióh.de 6s­te aumenta levemente s1 segundo dis des­pues de haber bajado s las 24 horas.

Diversos substratos.- Conel deseo deaclarar los fenó­

menos observados en las experienciasdescriptas se efectuaron ensayos con di­ferentes medios para observar el curso de1a fermentación acética sobre ellos.

En todos los casos -e utilizóel tubo capilar, y cuando se agrggó 313°­

-76- I

hol etílico al medio se lo empleaba alI D

Se efectuaron ensayos con via:sometidos a altas temperaturas durantetiempos más o menos largos. y luego seensavo el efecto de dos soluciones desales sobre la fermentación.

La. solución salina A (Medio Wfue preparado al hacerse un error en loscálculos y lleve uns muyalta concentra”ción de sales. Contiene Boi, P043 Cl, HzNa, K, Ca, Fe, Al v En.

La solución salina B (Medio'N°7) se preparó con datos de Sherman, Vi"llavecchia y Háger. Las concentracionesde los aniones y cationes se ajustan alos datos de Sherman para contenido saalino del vino normal, con excepción dela del Cl, 1a cual excede la concentra'ción dada por Sherman. Contiene lossiguientes elementos BOI, ’04; Cl, Ig,I. GaY tertreto,

Luego se ensayó el agregadode diversas sustancias a la soluciónanterior (solución salina B), haciendoa la vez ensayos de control con estasmismassustancias sin las sales de 1asolución salina B.

En la Table IV (pags. 71 y 72)se detallan los resultados de estas ex­perienciae­

e) Conel vino hervido v luego esterili­zado (Medio N°9a) se observs la dese­

parición del poco aláehido contenido yninguna producción de acidez,resultad0

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que quizás sea debido al bajo pHdelmdiotfifi).b) Con el vino esterilizafio solamente

(Medlo N°9b) se observan regultadoaperfectamente comparables con los datosobtenidos con vino an aire con tubO‘ca“pilar (Tabla I, pag°66)u '

a) Con la solución salina A (M3616N°6)loa resultados difieren pocode los

de laa experiencias con solución ¿o 91*cohol en agua destilada; sin ¿leanzarloa altos valores de aoetalúehido quemuestran algunaa de éstas, La acidez semantiane baja (5,5 zo de ácido acético)a

d) Con la solución salina B se encuentraun comportamiento que apenas se ¿ían

tingue de la observada con BOIUCiDnufipuras de alcohol etílico. pues solo seproduce un poco más de acidez.

e) El agregado de 0,? ar 1 de glicerinaa la sólución salina B no hace variar

ente comportamiento, ‘

f) El ensayo efectuado con glicerina0,7 í) agregada al alcohol eL agua

destilada da resultados semejantes e lasde la experiencia con solución Salina.aunque se produce manoa ácido Y un pocomás aldehidoo ‘

g) El agregado de 0.04 gr go de 61930(concentración irlicada pcr Fania cow

mo ekistente en el rana) a 3? (alución asalina B con glichri_a y al 301 hize“aUrmentar 1a producc.ón de acidez a un nivdlcomparabla al observado en la fermenta­

Í

5743

ción del vino con tubo capilar" La proaducción de acetaldehido fue mayor en elvino:

h) En una experiencia semejante con0,023 gr fio de Clan.4H30 (según Kó«

nig) en vez del ClsFe tambien se consiguió buena acetificación (comola delvino) pero observándose además la pro­ducción de una cantidad apreciable deacetaldehido en uno de los casos (Expevriencia E5 con 0,99 %ode acetaldehidoal segundo dia)u

i),j),k) v 1) El agregado de pequeñacantidad (1%) de agua de

levadura concentrada (Medio N°10) v ma­cerado de maiz a soluciones de alcoholen agua y con mezcla salina B dió resuletados en los cuales se observa en gene­ral una pequeña producción de ácido acé­tico y alta producción de acetaldehido,en forma semejante a lo observado consolución acuosa de alcohol etílico.

m) Las experiencias con el extracto so­luble en alcohol de 95° del vino de­

secado al Vacio (Medio N°8), si bienevidencian solo una leve producción yluego disminución del acetaldehido. die­ron muy poca acidezo

n) Con el agregado de este extracto al­coholico del vino a 1a solución sali­

na B se observó 1a producción de grancantidad de ácido (más aún si se consi­dera que la acidez inicial es menor quela del vino) con poca formación de alde­hido, reproduciendo así los resultadosobservados con el vino comosubstrato.

o) El agregado de 2%de vino diluido vv pasteurizado (Medio N05) a una 90*

-75­

lución acuosa de alcohol etílico 'Hvocomoresultado la producción de poca ancidez y poco aldehido.

p) Las experiencias con el extracto a1­cohólico de vino con solución de

fosfato bi- otásico (0,835 10) tambienprodujeron cido acético en buena canti­dad, manteniéndose baja la concentraciónde aldehido. La acetificación fue menorque con vino“

Experiencias en Oxigeno.- Se efectuaronensayos con

Vino diluido 2:1 (Medio N°5), soluciónde alcohol etílico 8%en agua destilada.y con soluciones de acetaldehido en aguadestilada con alcohol.

'Vino 2:1 pasteurizado,- Los datos con­signados en ia

Tabla V (pag. 76) muestran un aumentogeneral en 1a producción de aldehido conrespecto a los datos obtenidos durante1a fermentación del vino en aire. Unaexcepción a lo expuesto son ias-expe­riencías 03 y 04, y cabe hacer notar queestos dos frascos se encontraban comuni­cados por medio de un tubo en T a1 mismotubo de provisión de oxigeno y que a1tubo A del frasco 03 se le observó unarajadura a1 finalizar 1a experiencia,con 1a probabilidad de que haya entradoaire durante el transcurso de ésta, pu”disndo ésta ser la razón de la divergen­cia en este 05.9)

Un ensavo en blanco (17), sinbacterias, casi no muestra variación dsacidez ni del contenido de ¿13 Fido.

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Solución de Alcohol al 8%0”Todas estasexperiencias

(Tabla V) muestran gran producción dealdehido y poca acidezo Las concentrarciones alcanzadas de aldehido en algunoscasos en dos días son e uivalentes a losque se producen en 15 d añ en aire SO“bre e: y; no substrato (3“4 fio)“

Soluciones de Acetalóehidocu Las expo“' riencias se

efectuaron con aldehido acético en unasolución de alcohol etílico 8%en aguadestilada; y en las dos concentracionesempleadas (3%0 v 4%0) han dado gran au“mento de aldehido, llegando a casi 6%0v 8%0respectivamenteo La acidez scmantiene bajaa

El ensayo en blanco sin bacterias (19) evidenc16.una pequeña disminuwción de acetáldehiúo sin aumentode aciadez, Io cual podría ser debido a arras­tre por 1a corriente de oxígeno al intrc=ducir el mediode cultivo y al sacar la‘muestraq

Exgerieneias en Anaerobioeisnm Se efecwtuaroncon vino y solución alcoholica en agua ycon soluciones de acetaldehido en aguadestilada y en vino y agua con alcohol”

Vino 2:1 pasteurizado.- Las experienciasno evidencian

cambios notables de concentración deácido ni aldehido. '

Solución de Alcohol a1 8%," Tampoco seobservan

cambios en estas e"per1enciasq

Soluciones de Acetaldehidoo- Se efectua­ron experrmr

cias con soluciones de acetaldehido en .agua destilada, en agua destilada con 8%de alcohol y en vino diluido 2:1 y pas­teurizado (Tabla VI, pag. 79), observán‘dose en casi todos los casos un consumode aldehido y una leve reducción de laacidez.

Las experiencias en agua y so­lución de alcohol en agua Se efectuaroncon aproximadamente 4 go de aldehido ylas experiencias en vino con aproximada‘mente 2%0de acetaldehido.

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-79-'TABLAí

'L'gperienciaeenA1

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095,300105,30

2,20 2,20

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0,039 0,042

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Resumen y Conclusionesraza/'­

Ensavos con cultivo en pelicula - Estos"” " ensayosfueron realizados con cultivos de Agetoubacterqascendens bien flotados sobre 1asuperficie del medio (Vino pasteurizado)v que tienen la caracteristica particularde la especie que consiste en 1a ascen­sión del cultivo por las paredes del fraeco. Las tentativas de reproducir de ma­nera uniforme el cultivo fueron muynume­rosas, introduciendo despues de cada fra­caso variantes del métodopara lozrar launiformidad buscada. Desgraciadamenteno se pudo obtener con absoluta certezaun cultivo óptimo en todos los casos ylargas series de experiencias, llevadasa cabo en el curso de casi dos años, fra>casaron porque alguno de los grupos nocultivo en forma correcta. De todos mordos se pudieron obtener algunos resultasdos que por su concordancia merecen uncomentario“

a) La acetifïcación en una atmósfera deaire (20,93 í de oxigeno) tiene lugar

regularmente; se inicia bien pronto y'eltenor de ácido acético es alto (9%)a 1aterminación del procesan

b) Sustituyendo 1a atmósfera de aire poruna de oxígeno la acetificación se inr

cia muytardiamente; la curva asciendepoco y los cultivos tienen marcado olora aldehido acéticOe La concentración má­xima de ácido acético es menor que 1a quese obtiene con el aire.

C) Con atmósfera de anhídrido carbónico

,31­

y proporciones variables de oxigeno,aúnen concentración menor que la cel aire,1a ace.if1cación es muylenta y el con­tenido máximode ácido acético es másbajo que en aire.

d) La acción del acido cianhidrico (cmoes muvmarcada v con concentraciones

ya un poco superiores a M/BOOOOha? in­hibición del proceso de acetificaciónsin gue 1a pelicula sufra por 1a accióndel cido cianhidrico.

e) Por acción del Luminal hubo tambieninhibición de la acstificación desde

la concentración u/so hasta M/100.000en un solo caso hubo acetificación (1frasco entre 4) a la concentración de

nooo. El cultivo no pudo ser reco­brado de ese frasco y no se pudieron se­guir las experiencias para comprobarsigíistió una adaptación del sistema enzi­tico.f) R1 azul de metileno retarda la aceti­

ficación en presencia de aire y nomodifica prácticamente los resultadosobservados cuando se tormenta en presen­cia de oxigeno y aparece tambien comoen tal caso el olor del aldehido acético.

Rnsavoscon suspensión de bacterias.­Hariendose podido obtener el cultivo a­bundante de Acetobacterrasgggdeng en unmodio de extracto de levadura y de maizsc iniciaron ensayos con suspensioneslavadas de cultivos obtenidos en mediosólidoo Los cultivos fueron lavados porcentrifugación, con lo cual se puedenconsiderar a las bacterias usadas como

bacterias quiescentes. En resumenloeresultados obtenidos son los siguientes:

a) Una suspensión de bacterias en vino'paateurizado en frascos con libre ac­

ceso de aire a traves de un tapón de al- uu

abdón y con buena sugerficie de aereacnfi1iproduce rapidamente cido acético haSta1a concentración del 60 io en dos diassiendo el tenor de aldehido acético muybajo (alrededor de 0,1 %0).

b) EnsaVOaanálogos en que el acceso delaire tiene lugar por un tubo capilar

muy fino de tal modo que no existe buenaaereación,revelan una roduceión menorde ácido acético (12%0 y una mavor can­tidad de aldehido acético que llega has­ta el O,5_%o. Bate comoortamiento sepuede interpretar admitiendo que el acet­aldehido formado ee acumula dentro delfrasco sin pasar a la atmósfera pues loimpide el tubo capilar y su alta concen­tración inhibe el proceso de acetifica­ción normal .

c) mn suspensión de bacterias en solu­ción de alcohol a1.8% en agua desti­

lada en frascos con tubo capilar ee pro­duce rapidamente una cantidad muy eleva­da de aldehido acético, hasta 4 %o, vla acidez se eleva lentamente y eolollega a1 6 Zo de ácido acético. Pareceque el sistema no tuviera algún elementoesencial para oxidar el aldehido acátdci;y que Be encuentra en el vino. “

d) Si la suspensión de bacterias se'hacaen agua que contiene una prOporción

mediana de acetnldehido comoúnico subc­trato (2 ío), esta ee consumidatranáïor­

,_:I

mándoseen ácido acético. Si el aldehï­do acético es agregado a una solución dealcohol al 8%ocurre por el contrario unincremento muynotable del aldehido acéatico que puede llegar hasta 8 1o;

e) Si a la solución de alcohol en agua ñdestilada se le agrega una mezcla ea­

lina que contiene l\s elementos minera”les del vino sin hierro ni manganeso(804, P04, Cl, ug, K, Ca v tartrato) seobtienen los mismos resultados que conla solución del alcohol en agua.

f) Si a la solución de alcohol en aguase le añade el extracto soluble en

alcohol 95° obtenido del vino desecadoa baja temperatura el proceso de oxidación tampoco cambia con respecto al con”trol de alcohol en agua.

g) Si se añaden a1 alcohol en agua lasmismassales anteriormente citadas y

el extracto alcohólico del vino se rees­tablece 1a acetificacion tal comoocurreen el vino. Igual resultado se obtienesi se reemplazan dichas sales por el.fosfato bipotásico.h) Si a las sales mencionadas se le aña­

de una sal de hierro o de manganesola acetíficación tiene lugar normalmenteI) El ¿greqeïu Jel mefiïo de cultivo (ex­

tracto de levadura y extracto de maiz)al alcohol disuelto en agua deja el promceso de acetificación tal com)ocurre enel alcohol disuelto en agua destiladasin ninguna adición,

J) Los eneavos hechos con atmósfera deoxigeno usando vino comosubstrato

revelan un Lomñortanlento semejante al

obtenido anteriormente con ¿getopacterascendegs crecido en película, es decir,úñá acúmulación relativamente granos dcaldehido acético y una acetificacibn ms­cho menor que la que se obtiene en a1r¿

En solución de alcohol etílico en aguadestilada la producciónde acetaldehiloes aún más notable que la observada enatmósfera de aire, siendo la acetificación comparable a la observada en estecaso. En cuanto al comportamiento de la;mezclas de acetaldehido, alcohol'y¿sgubdestilada se observa una acumulación ma—yor de aldehido que la Vista en casoscon alcOhol en agus o con vino,.Rn-cuan—tota la acetificación es practicamentela misma que 1a obserwaáa con alcoholL

k) Los ensayos hechos en ausencia de.okí'gano (anaerobiosis) utilizando como

substrato tanto el vino pasteurizado co'‘ moalcohol etílico en agua destilada o

soluciones de acetaldehldo en agua, enmezcla hidro-slcohólica o en vino no hanpermitido observar-ningún cambio en 1aroporción inicial de acetaldehido v decido acético, es decir, las bacterias

no han sido capaces de realizar la dis­mutación del tipo de la reacción de Gan­nizzarou ' “

Conclueigggs_

l°n- Se ha comprobadola acetificacióndel vino por Acetobacter ascendenn

(cultivado en película) pudiéndose esta",blecer que dicho proceso ocurre más in*tensamente cuando la tensión de oxígenccorresponde a 1a de este gas en la at­mosfera‘ En atmósfera de oxigeno purola acetificación es muvlenta y se pro­duce en cambio'una cantidad relativamen­te grande de aldehido acético. El anhiwdrido carbónico parecería actuar tambiencomoinhibidor de 1a acetificación. re­tardando el proceso considerablemente,faltaria sin embargomayor experimenta«ción para poder hacer unaafirmación de»finitivag2°.- La acción del ácido cianhidrico se

manifiesta por una inhibición de1a acetificación con Aggtobactggmascen­dans en concentraciones de hasta Í75.000El Luminal inhibe la acetificación hastacon concentración de ¡7100.000. El azulde metileno demorala acetificación enpresencia del aire y no modifica el eur“so lento del proceso en presencia deoxigeno puro, apareciendo tambien unacantidad de acetaldehido comoocurre sinel azul de metileno0

3° Las bacterias (Meighagtxjasgn‘dans) lavadas v agregadas al vino

en suspensión tienen 1a propiedad deacetificar rápidamente en presencia deaire, produciendo poco acetaldehido, Eneste proceso tiene importancia 1a aerea“ción abundante que eliminaría el aldehiado acético impidiendo su acumulación que

parece retardar la acetificación propzawmente dichaa

Si se utiliza comosubstrato para acetiwficar, usando una suspensión de bacteriaga una mezcla de alcohol etílico y anuase produce muy poco ácido y el aldehidwacético se acumula considerablemente, lacetaldehido en aueercia de alcohol esconsumido y se transforma en ácido acé­ticoo

400- Eupleando siempre la suspensión debacterias la adición de sales

(P04HK2,GlgCa,SO¿Mg, SO4K2, Tartrato deal alcohol en agua destilada no modificel curso de la oxidación del alcohol,Mencionado más arriba; formándose pocoácido y muchoacetaldehidoj El agregafde un extracto soluble en alcohol 95°obtenido del vino desecado a baja tempsratura tampoco modifica el comportamien­to mostrado en alcohol acuosan Si encambio se añaden la solución salina, oaún solo PO4HK2,Junto con el extractosoluble en alcohol del vino, el fenómenode acetificación del alcohol disuelto en.agua adquiere las mismascaracterísticasque las observadas con el vino como subentrato” Se pudo comprobar tambien que sise añaden hierro o manganeso a la mezclasalina indicada el alcohol en soluciónacuosa se acetifica de manera normal. esdecir, en forma análoga a la observadaen el vino comosubstrato.

(.

5°,- Las experiencias realizadas en at­mósferaa de oxígeno utilizando_la

suspensión de bacterias lavadae muestranuna acumulación anormal de acetaldehido,

tanto en vino comoen solución de alcoholetílico 8%en agua o en mezclas de alco­hol, agua y acetaldenido En todos loscasos hubo muypequeña acetificacion.

6°?“ Las experiencias hechas en cnaero­hiceia, tambien con suspensión de

bacterias lavadas. usando vino, alcoholetílico acuoso o solución de aldehidoacético en agua, alcohol o vino, comosubstrato no ermitieron comprobarlaformación de cido acetico ni la desapa"rición de acetaldebido, tal comosi noexistiera el proceso de dismutación delaldehido en alcohol y ácido.

Bibliografía.deEn los casos en que no ha srl,

posible cansdtar la. obra original se dála fuente utilizada. para el conocimientode su contenido. Las iniciales C.A. sig?­nifican: ChemicalAbstracta.

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