ALUMNO :

MATRICULA : 91333127

TELEFONO :

LCENCIATURA :

DIVISION :

5633-57-74

Ingeniería Bioquímica Industrial

Ciencias Biológicas y de la Salud

ktapalapa UNIDAD.

TRIMESTRE LECTIVO. 00-1

NOMBRE DEL PROYECTO : AISLAMIENTO Y CARACTERIZAC ON DE I kS PRINCIPALES ENZIMAS WOGENAS QUE INTERVIE EN Eh EL MECANISMO DE MAWRACION-PUTREFACCION i LA CAPNE.

TITüLO DEL TRABAJO Mgdiünrirnto de la hid proteína de pescado en un

ores inhibitoriw.

LUGAR DE REALIi4CION : Planta Piloto No 4

13 de Noviembre de 1997

21deonerode2000

FECHA DE INICIO :

FECHA DE TERMINACION : - _u_--

. _ - . - 2

CLAVE DE REGISTRO. i IBI 06297

. - 4:

r . I - , / .- I c

1)

3

53

3

3)

a 3

1,

NOMBRE DE LOS ASESORES

DRA. LlLlA ARELY PRADO BARRAGÁN PROFESOR TITULAR C. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA.

DR. SERGIO HUERTA OCHOA. PROFESOR TITULAR C. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA.

FIRMAS

c JORGE CESAR GALVAN VkQUEZ. ALUMNO.

DRA LlLlA ARELY -00 B A W N . PROFESOR TITULAR C.

DR. SER010 HUERTA OCHOA. PROFESOR TITULAR C.

a

w . , ’ *

1,

Casa abierta al befnpo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA CIENCIAS BlOLOGlCAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE ElOTECNOLOGtA 3 1 de enero de 2000.

DR JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA PRESIDENTE, CONSEJO DIVISIONAL C.B.S. P R E S E N T E

Por este conducto le informamos a Usted que el alumno Jorge Cesar ,Gaixáq Vázqem, Matricula No. 91333127 de la licenciatura de hg. Bioquímica industrial. concluyó satisfactoriamente el trabajo denominado ‘MODELAMIENTO BE LA HIDIIÓLISIS E f f i % N f & ” B S . C a RúiW%h D# PESCADO EN

como fecha de inicio el 13 de noviembre de 1997 y fecha propuesta de terminación del 13 de noviembre de 1999.

üN REACTOR €NZXMATlCO BE MEMBRANA SUdTO A FA€TOlUS~INH1aITORKB”. El cual tuvo

Asimismo, le notificamos que el motivo por el que la entrega del informe final del Servicio Social. no fue concluido en la fecha sefíalada, sino hasta 21 de enero del año en curso se debió fundamentalmente a que el interesado labora en el sector industrial y de manera conjunta realizaba el proyecto terminal de su licenciatura, lo cual le impedía llevar una secuencia en la continuidad de la escritura del proyecto.

Sin otro motivo por el momento aprovechamos la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

Dra. Li~3/Arcty Prado Barragán Profesor titulir B Dcpa-tamento de Biotecaología

UNIDAD IZTAPALAPA

ATENTAMENTE ‘Casa abierta al tiempo”

Br Profesoi titular C Departamento de Biotecnología

RESUMEN

ALUMNO : MATRICULA : 91333127 LlCENClATURA : Ingenietia Bqulmica Industred

PROYECTO : AiSlAMENiO Y CARACTERIUCION DE Us PRiNCIP#LES ENZYUS

Jaoa cewn Gelven vdzqrnr

EXOGENAS QUE INTERWENEN EN EL MEcLi#(8uo PuiREFACClON M LA CARNE.

REGISTRO : IBI al3297

ACESORES : 0nUiaAf.lyRaQBarragBn. PmlaorTMrC. D.partanentodeBiotscrobgia

Dr. S ~ I O Huerta ochos PrdesofTmilirC. CbpmtunentodeBjotecndogia

PMbíaiJrso-

INDICE

1.

2.

3. 4. 5. 6.

7. 8. 9.

IfltIUduCaón I .I Modelamiento matemático 1.2 Reactores I .3 Proceso de membrana I .4 HiMsis prOteiCa 1.5 Enzimas 1.6 Inhibiaón enzimatica objetivos generales y específicos 2.1 Objetivogeneral 2.2 Objetivos especificos Metodología utilizada Actividades realizadas Oqetivos y metas alcanzados Resultados 6.1 Esquema 6.2 Fadores del sistema

6.2. I F&-S ConOadOS 6.2.2 FadüWSdesconoci 'dos 6.2.3 Factores flexibies del sistema

6.3 Balance general del sistema 6.3.1 B a l m de ftujos 6.3.2 ~alance de sustrato 6.3.3 Balance de producto

Balances en el punto de mezcla 6.5.1 Balance de flujos 6.5.2 Balance de sustrato

6.6 Balances en el ultrafiltro 6.6. I Balance de flujos 6 6.2 Balance de sustrato

6.7 Balana, general de sustrato 6.8 Teoría de ultrafiltración 6.9 Inhibición competitiva 6.10 Inhibición no Competitiva 6.11 Inhibición por sustrato Discusiones y recomendaames conclusiones Bibñograiía

6.4 Consideraciones 6.5

1 1 1 2 5 7 10 14 14 14 15 I S . 15 16 16 17 17 17 18 18 18 18 18 19 19 20 20 20 20 21 22 24 26 29 32 36 37 39

a

1. INTRODUCCION

1.1 Modeiamiento matemático

Un modelamiento es la elaboración de una descripción o representación

matemática de un proceso o sistema, este modelo se utiliza para estudiar el

comportamiento del proceso o sistema, o para controlarlo variando las condiciones del mismo. El desarrollar un método de estructuración y adisis de procesos, siempre que sea posible por medio de modelos matemáticos, permite un an&i#s

riguroso así como obtener Criterios de decisión metódicos y completos (1).

Una premsa fundamental en todo análisis de procsaos, es que el proceso global se

puede descomponer en subastemas diferentes y que existen relaciones enúe éstos, de tal f m a que arando se integran en un todo pueden simular el proceso. El

dividir el proceso en partes para el anátisis, tiene su justificación en el hecho de que

el proceso puede resultar tan complejo que no sea posible conocedo y desaiirlo

con propwidad de acuerdo a un todo Así mediante una adecuada manipulacih y

4uste de los subsistemas se intenta obtener una representación correcta del

proceso total, basada en principios relativamente sencillos y ConoUdos de las partes

(1 )

1.2 h8aofes

poGtanosd.iínir un reiwior cano una 'Cya-w.gpia", donde io que sntre ssoo~vierie

en otra 'cosa', a través de una nwcaón promovida por 'aigo'. En el caso de un

reactor enrim8tic0, la aja r»grin seríe un tanque agitado, lo que e m w i a un wstrato, el cuai se convertirb por medio de una reacción en un producto, siendo esta roBQcj6n promovida por una enrime (2).

Una keve cl8súiceCrán de trpas da r.pDtoT88 nos permite describir tres modelos idaale9, los aralesson los maraprgunrdos a los reactores reales.

s

En primer iugar esia el reactor intermitente, el cual tiene una composición uniforme

en cualquier posición del reactor, pero por supuesto la composición cambia con el

tiempo.

El reactor de flujo pistón, en el cual el fluido pasa a través del reactor sin mezclarse

el fluido enirante anterior con el postaior y sin adelantamientos, como si el fluido se

moviera en una fila única a través del reactor.

Por ultimo, el reactor de tanque continuo agitado o flujo mezclado, mantiene una

composición del medio, igual en cualquier posiá6n dentro del reactor y a la salida.

Esto es un cultivo en el que se introduce continuamente medio fresco a una

velocidad uniforme, el volumen del cultivo se mantiene constante por extracción

también uniforme de ese cultbo. Idealmente el mezclado debe ser perfecto, es decir

que cuando una gota del medio entre al rector, instantáneamente deberá quedar

uniformemente distribuida en el cultivo (3).

1.3 Reactor de membrana

Un reactor con membrana, es un reactor con VI sistema acoplado el cual involucra

un proceso de separación mecánico. Esta separación se da en soluciones o

suspenciones de partículas que van desde 0.2 hasta 10,ooO nm, dependiendo del

sistema de membrana que se utilice.

El sistema de membrana acoplado a un reactor, permite tener en el sistema un

proceso de recirculación, esta recirculación puede ayudar a un control del grado de

hidrólisis deseado, a un mejor aprovechamiento del sustrato, y a un proceso continuo si es que se desea.

2

Actualmente existen vanos procesos que emplean una membrana para lograr una

separación dada. Estos procesos se pueden caracterizar en forma general en base

a:

La fuerza impulsora del proceso

El tipo de membrana que emplean

El rango de tamaño de partícula que retienen sus membranas

De acuerdo al tipo de fuerza impulsora los principales procesos de membrana se

pueden clasificar de la siguiente forma :

Gradmte de presión

Ultrafdtreción

Midtltración

Osmosis Inversa

G r a d i i e de concentración

Diálisis

Al igusl gue culydo hebbmJs de tlaiZ5ks enZi&ica, ahora en el proa580 de niarmbrwie tenemos que plantear y sekcaonar el método mbs adeouedo para

realizado. La tearía especieilizade dice que el gradienie de concmtr& que Uaüza la dibiisis como hierza impulsora le resta ventajas de rapidez de seperación. Y por

acUBÍcJ0 ai tamall0 de partícuia que daeemos sepam, pues reüenen un tameA0 de

partíada muy grade o muy pequei\l> tIñpec2ivamente para una seporación de

proteinas. De esta forma tenemos ta uhf&rción como el prowso adearsdo de

s e p a r d n para pohsaceridos, proteínas, virus o doides.

otra psrte 19r técnba de miemWac& . ytrsrnooisinvrwsanosonlasadsaiadasd3

La ultrafiltrpaón es una optmdón que empise membranas especiales en difcKentes

tiposde armgiospera sepersr m en sotwcióndeotras mspequelias,

por medio de un gradiente de presión, las macromoleculas que pueden ser

3

separadas por ultrafiltración tienen tamafios que oscilan entre los 2 y los 1 ,o00 nm, dependiendo cid peso molecular de corte o diámetro de carte de la membrana, el cual es el peso molecular del soluto, que dependiendo de varios fadores es retenido en un 90 % por la membrana (4).

La teoría de la ufbafiltración está orientada a tratar de predecir el flux en un sistema

dado en función de los parámetros de oparación cano son presión, temperatura, concentración de la solución y velocidad tangencial.

El principal parámetro de disefio para un sistema de ultrafiltracih para concentrar una solución, es el área necesaria para lograr una concentración determinada en un

tiempo dado. La predicción del flux o la interpretación y extrapolación correcta de

las mediciones experimentales de este, se enfocan a resolver este problema de

diseiio (4).

La ultrafiltración puede ser utilizada en la etapa de purificación de caldos biológicos

como es el caso de microorganismos, dispersiones coloidales de arcillas ó

macromoléculas, mezclas de proteínas, polimeros, almidones y partículas de látex.

En este proceso los caldos sujetos a purificación contienen al soluto de interés en

forma más concentrada y pura que el caldo original, debido a esto, los volúmenes a

tratar son menores que los correspondientes a las principales etapas del proceso

(4).

En el caso específico de una mezcla de proteínas de diferente peso molecular, la

ultrafiltración puede utilizarse para separar la enzima de un caldo de cultivo,

recuperándola para reuülizaria. El diámetro de corte de peso molecular de la

membrana se define para este caso en particular como el peso molecular de

proteínas globulares, las cuales son retenidas en un 90 % de la membrana (5).

En todo sistema de filtración se producen gradientes de concentración de los

solutos en la proximidad de la membrana, causados por las diferentes velocidades

4

8

&

8

8

&

8

8

8

8

8

8 D D 8

D 8

D B B D D b

de transporte de cada uno de ellos. Este es CQnOddO como "Polerización de

la Concentración" .Esta polarización proáuce una mayor concmtmción de solutos

en la proximidad de la membrana, lo cual por un lado puede incrementar el flux de

soluto y por otro disminuir el flux del solvente debido a un aumento de la resistencia

ai flujo producida por esta barrera de concentración Así mismo, puede ocasionar

una resistencia adicional debido a que puede estimular la interdón del sduío con

la membrana, si el soluto se incrusta en los poros de esta.

En los sistemas de uitrañitmcih el tlux de solvente a través de la membrana se incrementa signrficetivamente utilizando tbjo cruzado o tangencia1 en lugar del flujo

convencionel. En los sistemas de fiujo <xuzacIo la alimentacibn fluye en forma

paralela a la membrana minimizando el efecto de la polarización de la

concentración, ya que el esfuerzo cortante del fluido estimula el desplazamiento de las partículas de la Supemcie de la membrana.

El tm ino hk%Jisis se refiere a una reacción en la que interviene a$ua y un

cablizador con el oójetivo de "partir" ulwl mokula orghica, una repreeeniación

generaldeestetipodereaccioneooerialesigiriente: -5

R-X + Hfl --% R-OH + X-H

' e í a a una reacción química, la cual se Waría a

8 ácidas o ak;aiünas para p m v e r la reacción. -rcrprescntaaón caboencondiaione

. .

Exlatr,adomasdb,eJ@a cual 88 tendríía una emima como catelizedo r.

8 química, q-a reac&tn de hidróhsis enzidica en la

a rn

a

a

Y

8

D

8

B’ m

B B B

Cuando se plantea el desarrollo de un proceso, se adquiere de inmediato la

responsabilidad de seleccionar las técnicas y tecnologías más adecuadas para

realizarlo, este caso, hablando de la hidrólisis proteica no es la excepción, pues se

puede y se debe escoger entre los dos tipos de hidrólisis.

Las ventqas de la hidrólisis enzimática se manifiestan de manera importante en un

proceso de hidrólisis proteica, ya que el nitrógeno contenido en los alimentos se

en- en su mayor parte en las proteínas. Las proteínas para ser aprovechadas

a m o fuente de nitrógeno primero deben ser hidrdizadas por enzimas a

polipeptidos, después a peptidos y finalmente a aminoácidos, teniendo siempre una

gran espeaficidad del producto al que se desea llegar, lo cual no siempre es posible con medios químicos. Además, los productos de recuperación por hidrólisis

d e s t i s para la industria farmadutica o alimentaria deben cumplir con un alto

grado de pureza, lo cual pude lograrse satisfactoriamente por medio de una

hidrólisis emimática o.

otra de las ventajas que la hdrólisis enzimática presenta sobre la hidrólisis química,

es el permitir mantener un control sobre el grado de hidrólisis de les moléculas a las

que se desea llegar. En muchos casos, se busca una mejora en las proteínas

alimenticias mediante el uso de una proteólisis limitada o masiva mediante

proteasas, ejemplos de esto son el ablandamiento de la carne utilizando papaina, la

preCipitaaón de caseínas por quimiosina o proteasas de hongos, la mejora de la

textura de quesos por proteasas bacterianas o de hongos, el evitar la turbidez de la

cerveza con papaina o proteasas microbianas y finalmente la preparación de

hidrdizados proteicos solubles a basa de proteínas y de pescado como se pretende

utilizar en este modelamiento. Otro ejemplo de la utilización de la pmteólisis parcial

es la mejora de las propiedades emulsificantes y espumantes de proteínas

desnaturalizadas por calor, estos efectos provienen del aumento de la solubilidad del hibdiredo, que facilita la difusión y extensión de las interfaces aceite/agua y

aire/agm (8).

6

por último, pero no por ello menos importante, en muchos casos la recuperación y

purificación posterior a la hidrólisis resulta difícil y costosa para procesos de

hidrólisk quimica, to cual en términos económicos resulta como un factor

determinante en relación de la viabilidad de un proyecto.

1.5 EMmwr

Una eriijme es una proteína sintetizada por una célula viva, esta enzima cataliza o

acelera ww reaxión termodinámicamente posible (9).

Las erpimas poseen tres cgraderís5ieas que las hacen notables sobre otros

cateliwdorea: el poder cateütico, su eep&&¡dad y la capacidad para regular su

a d i W CatalEtiCa por UM variedad de compuestos naturales. Cuando se

comparan las velocidades de catafisis mire una reacción catalizada por una enzima

y otra con un catelizador químico, la primera se lleva a cabo más rápidamente y a

temperaturas m8s bajas. Como consecuencia de su naturaleza proteica la actividad

7

Las enzima8 son los catalizadores que emplean los seres vivos en una mayoría de

r e w s , es por esto que es de gran importancia conocer cuales son las leyes

que rigan la ant5tica de estos biocatalizadores y que variables afectan la velocidad

de r d h , pues este conocimiento permite predecir, diseñar y operar procesos

enzimáticos, lo cual provee de justificación y objetivo al presente trabajo (3).

Cuando una mdecula de susirato se acerca lo suficiente a una enzima, este

suotfato es m i d o y atraído por diferentes grupos de la enzima. Las cadenas

ssltentes de amino&cidos de la enzima, lo atraen al mismo tiempo que otros grupos

pueden atraer otra porción de esta misma molécula provocando una reacción A lo

anterior se le denomina reacuón enzimática, ya que los sitios reactivos de una

enzima (llarnodos sitios activos) catalizan una reacción, un sitio activo de una

enzima 89 el iugar de la enzima donde se realiza una reacción mediante la cual una

mo[ecukr es wnvertida en otra (e).

7

catalítica de las enzimas depende del pH y de la temperatura de reacción. La

eficiencia catalíüca de las &mas es muy alta a temperaturas que resultan bajas

comparadas con las requeridas por un catalizador químico. Esto significa que es

posible tratar o modifica con enzimas los alimentos con temperaturas moderadas

sin que los productos alimentarios experimenten grandes cambios.

La seguida característica importante de la actividad enzimática es la espeaficidad

de las reaccjOnes catalizadas por enzimas. Muchas enzimas son espeaficas tanto

en la nahraleza del sustrato que utilizan como en la reacción que catalizan. Esta

eqxmíiadad enzimática permite modificar selectivamente componentes

individuales sin afectar a otros. La tercera caraderistica importante de

las enzimas es que su actividad catalítica puede ser regulada por pequeños iones u

otras mdearlas (10).

Existe una gran variedad de enzimas, y cada una de ellas cataliza una reacción

especifica, la primera clasificación marca los principales grupos de enzimas:

1. Clxkkxn?áuctasass: catalizan reacciones de óxido reducción

2. Transtbrasas catalizan reacciones de transferencia de grupo

3. Hidrdasas: catalizan reacciones hidroliticas

4. LnBsas: catalizan reacciones de eliminación, en las cuales se forma un

doble enlace

5. Isomerasas catalizan reacciones de isomerización

6. f&asas: catalizan reacciones en las wales dos moléculas son unidas con un gasto energético

Las hidrolasas son enzimas que catalizan reacciones en las cuales participa agua

en el rompimiento de los enlaces covalentes de los compuestos, con la adición de

los elementos del agua a los participantes de estos enlaces (11).

Dentro de bs hidrolasas existe un grupo de enzimas proteoliticas o proteasas,

dentro de este grupo están induidas las proteinasas y las peptidasas. La hidrólisis

de proteínas a peptidos está a cargo de las proteinasas, estos peptidos pueden dar

lugar a cierto sabor amargo al producto de esta hidrólisis, wrno parte

complementaria del proceso de hidrólisis (y para eliminar si se desea este sabor amargo) las peptidasas se encargan del mismo proceso pero para polipeptidos y

peptidos hasta aminoácidos 0.

Las enzimas proteolíticas preparadas a partir de microorganismos pueden tener dos

origenes: baderiano o fúngico.

Las enzímas proteolítices de origen bacíen'ano, en su mayoría se preparan a partir

de Bacilkrs sdtüis, aunque existen diferentes bacterias que producen proteasas.

Las proteasas badenanas son utilizadas en la liberación de aceite de hígado de

pescado, en los procesos de ablandamiento de carnes, y en los de maduración y

chfkd6n de bebidas malteadas.

Las proteasas también se producen a partir de hongos, pues aunque los

vew- de a partir de egta fuente tienen a b conterudo de otras

enztmas, se puede tiacm una selección de cepas para obtener altos rendimientos

de proteasa y baja producción de otras enzimas. Además los hongos pueden ser

seleoaormkrs con base a la actrvidad de su8 proteesas en medio ácido o básico.

Las proteasas de origen fungico se emplean en la producción de productos de soja,

como salsas y otros alimentos fermentados orientales, al añadirse a la masa de pan

le aorga coneistñpnaa. También se utilizan en los procesos de elaboración de

cerveza y "ale", para eliminar la turbidez que provocan las proteínas, como agente

de disnrinución de viscosidad de la chra de huevo facilitando la filtración antes de la

dawicsción, para abkndar cames, y como se propone en este traba~o, para

hidrdizar el maten'd proteico de los rasiduos de pescado, facilitando así su

concentración y desecación o.

9

Cuai.idc se hablo le enzimas, se mencionaron sus cara3erísticas de catálisis,

espc c:rfi:idad y cap jadad ai3 regulación, estas características además proveen do

com:ileliiJad, tanto c 1 las enzjmas como al proceso mzimático en si. Así, no es dc?

extriiiíal que mucios parámetro afecten la velocidad de reacción, algunas

sust,iinuas llamadas inhibidores reducen la velocidad de una reacción enzimática al

prodi.icir la inhibiciori de dicha reacción (2).

Exis:w ?res tipos dc inhibicih: competitiva, no comp13ttitiva, y por sustrato (2).

Exis:w #aportes dl : que algunas enzimas proteolí1:icas SE, enaientran sujetas a

efecios inhibitorios ,JOT sustancias presentes en huevo, hariria de trigo, semillas de

maí:, I.., qermen ._ de tri 30, soja papa, secreciones pancreáticaa, y algunos órganos de

bovi'io Mas es1 ecíficamente las metaloprotensas (una dasificación de

endri(x!;tidasas), si )n inhibidas por agentes fuertemente quelantes como el EDTA.

Estcir, crfactos inhib,torios, al ser originados por una sustancia ajena a la reacción

print:ipai son ciasifi ados como competitivos y no competitivos (12, 13).

La iiihh :ión compí titiva y la no competitiva , se pueden ver como una inhibición

que w Dresenta a causa de la presencia de una sustancia extraña, Cuando la

presiiirma de la si stancia provoca la detención de la reacción enzima-sustrato

entoi-ici?; se denom na como un inhibidor (I). Se tiene inhibición competitiva cuando

el inhibidor I, y el s istrato S, atacan el mismo sitio en la enzima. Se tiene inhibición

no c:txyetitiva cuendo I ataca un sitio diferente de la eiizima, pero al hacerlo

detiwx! a acción d : S en la reacción, de forma sencilla se puede explicar que al X

estar 5:hre la supeificie de E, S no puede entrar o salir. Fig 'I.

INHlBlClON INHlBlClON NO COMPETITIVA COMPETITIVA

Fig. 1

Un twWo cirhtico de estos tipos de inhibición, nos permite tener una descripción

matemOtiEe de la velocidad con que Ocurren estas reacciones.

Inhñbicicln C0II)petM

Con S e I compitiendo por el mismo lugar en la enzima se tiene.

S+E&X-% P + E

k4

I + F a Y ks

kz

Donds

11

De acuerdo a un desamoiio semejante at que se sigue para la ecuación de

Michaelis-Menten, se obtiene la f m u l a para la velocidad de reacción para el caso

de inhibición competitiva.

Inhibición no competitiva

En este caso S ataca un sitio de la enzima, I ataca otro, pero al hacerlo detiene la

acción de S :

ki k S + E e X + P + E kz

I + X b Z %- Donde

K , =- k* + k 3 Constante de Michaelis-Menten k,

K, =- k5 Constante de inhibicih k,

Constante de inhibición k K =7

I2 '6

k, , k,, k3, k,, k5,k6, k, Constantes cinéticas para cada una de las reacciones

correspondientes.

AI igual que en el caso anterior, de acuerdo a un desarrollo semejante al que se

sigue para la ecuación de Michaelis-Menten, se obtiene la formula para la velocidad

de reacción

12

Para stmplificpr, se cOnsidOTO qua K, = K,2, de esta forma t e r n s para el a s o

de inhibición 110 competitiva:

s, Y,

Y = (I+$) K M +SI 1

Estudios de reaiperación de probina ds slesechos de pollo y pescado por medios enzimaticos, rgportan efedos en el grado de hidr6lisis de proteína de acuerdo a la

relación entre el substrato y la sdwidin Rulier en la que se suspende este substrato,

esto nos indica que la concentración de subsaato a la que ocurre la reacción

enzimOtica, provoca cierta tendencia a mejorar o dificultar la rsacción, pudiendo

estar un efedo de mbibicibn por substrato (14, 15)

- La inhibiaón por substrato, se presmta porque en algunas ocasiones el excaso de \

substrato provoca interferenca en las sitios activos de la enzima y disminuye la

velocidad de reacción (2)

Donde

S + E e X --+ k3 P + E

k4

k S + X I Y

13

B

I

k, k4

K, = - Constante de inhibición

k, , k, , k3, k, , k3 CmStanteS aneticas para cada una de las reacciones

correspondientes.

Una vez mas de acuerdo a un desarrollo semejante al que se sigue para 18

ecuación de Michaeiis-Menten, se tiene la fUmula para la velocidad de reacción

para el caso de inhibición por sustrato.

2. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS

2.1 objetivo general

Modelamiento de la hidrólisis enzimática de proteína de pescado en un reactor

enzimático de membrana sujeto a factores inhibitorios.

2.2 Objetivos espedíicos

1. Realizar el balance de masa del sistema

2. Establecimiento de la unética de hidr6lisis sujeta a diferentes factores inhibitorios

3. Definición del sistema matemático de resolución

4. Análisis de sensibilidad paramétrica

5. Simulaciones anéticas bajo condiciones de operación

O Concentración de susirato

O Concentracidn de inhibidor

I

14

3. METODOLOGIA UTILIZADA

El sistema se resolvió a traves de balances de masa en los diferentes puntos dave

del sistema, como el reactor, ultrafiltro, punto de mezcla y el mismo sisferna global.

El software utilizado fue Microsoft Word para PC, versión 98, 1998 y Microsoft Excel para PC, versión 98, 1998. Se utilizo una computadora PC con procesador Pentium.

Se realizaron simulaciones de operacih así como análisis de sensibilidad, para

esto se utilizaron datos teóricos y experimentales (4.16).

4. ACTIVIDADES REALIZADAS

Se realizó una revisión bibliogr8fca referente a las ctdtices de los diferentes tipos

de nhibición y sobre la teoría de ultraf~ltraaón, despues se realizaron balances de

materia, y posteriormente se llevó a cabo un modelamiento consistente en.

definición de sistemas matemáticos, anáiisis de sensibilidad, así como simulaciones

de operación, todo esto dentro de un marco teórico de respuasta. Finalmente se

realizó el presente reporte final, dentro del cual se pretende mostrar los resultados

obtenidos.

5. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS -i

Los obptivos tanto el general como los específicos, f w o n -0s. Se logró el

m a m dola enzimtWa&ie proteína de RQscado en un reador

enzimáti de membrana sujeto a factores inhibitorios. Este modelamiento se

realizó a través de los baiences de masa del sistema, del establecimiento de la

cinética de hiWisis sujeta a diferentes factores inhibitwiw, de la definición del

sistema matemeti de reQduabn . , Y W prrrpmetrica con

simulaciones cineticas.

15

6. RESULTADOS

El resultado final de los balances realizados se presenta a continuación,

presentandose primero una parte COmÚn para los tres tipos de inhbicibn de una

moción enzimática (puntos 1 al 8). posteriormente, para cada uno de estos tipos

de inhibiaón se presentan un balance particular (puntos 9 , l O y 1 I), el cual al unirlo

a la primera parte nos da el resultado total para el sistema correspondiente a cada

caso de inhibición.

Rl Esquema

I I r I I -I ------ I

I I I

PI. Cn. Fm I

I I

R W C O r I I I Ua.Nb0 I I Rodudo - I -1 I I

L------- I L - - - _. - I - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ - - - _ _ - _ _ _ - - - I

F = FlW Subindices Volúmenes de contml S = Concentración de sustrato O : Entrada de la alimentadón al sistema Sistema P = Concentración de producto 1 : Salida del raador o entrada al ultnifih. Reactor VR = Vdumen úoI del reactor R : Recirwlaaón o s a l ¡ ¡ del ultrafiltro. Ultrafiltro

Punto de Mezda M : Entrada al reactor F : Final o salida del ultrafiltro.

16

LOS factores que intervienen en el sistema son los valores de las concentraciones de swatmato y pradudo, así como los diferentes flujos que están presentes en los di voiíunecres de control, y los valores del volumen del reactor y el área de ultrdiitreción.

6.2.1 F m COWLWOS

Estos fadores son lo9 que tienen valores conocidos, y constantes durante todo el proceso.

Po.- Producto en la corriente de entrada SF.- Sustrato en la corriente de salida PR.- Producto en la comente de recirculación Pu.- Producto en la corriente de entrada al reactor

p ~ a explicada mas adelarte.

trpbpjo Pa sf, PR, y PM son consideFados igual a cero c o m ~ será

6.2.2 F.ctoni,

En este caso referimos factores con valores demmwiidss, *debido a que estos están en función del proceso, y para conocerlos es rme%smo ’ rcNdver arl bcdence genmd del sistema.

b

b

b

b

b

b

b

b

b

SI.- Susírato an ei reactor SR.- W a t o 8n la aoniente de recirculación %I.- Sustrato en la Comwíe de entrrnda ai reactor PI.- plodudo en el reactor PF.- Producto en la corriente de salida F0.- Flujo de la Comente de entrada FI .- Flujo de fa axrimte CM reactor al ultrafiltro FR.- Fb~o de la mmnte sk, reciraikón Fu.- Fly0 ~n ler FF.- F h j O drk drsawe

de enkeda al reactor

Estos son los fadores que deben para poder conocer a deW8 todo el sistema, las concentfaa ‘ones de producto y sustfaio son las mismas en el reactor y en el flujo Fl.

17

.:, 3 K',tlñ ,. , gtineral del si? i .?Mia

;:.l;3:

:.t'

!pmtral m s I:M? Tit)? plantear las primeras condcioneia del sistema, a ::I t h s pode-i. :I! ..txener las sduciones para cad8 volumen de w:i!trol.

3: C 3 a 1, <:E deflUjOS

,4 =umulación = Entrada - salida .. :,I . wioc; una acmx I -+ciÓn de flujo igual a cero, de exa f m a s3 obticine:

Entrada = Salida

Fo = FF ' IC tanto:

a , ( I 'irración = Enmada - salida - Con nimo

8.3.1

. 1 I l i t ' I !ación = Enhaah - salida f Prtd I zión

Se desea una acumulación de producto en el sistema igual a cero, por lo tanto todo el producto del sistema saldrá en la comente final o de salida Además se considera que la entrada de producto es cero:

p, = O 6.3.3

6.4 Consideraciones

Y = ywsl Ecuación de Michdis-Menien 6.4.1 Kbi +SI

y21 Ecuación para inhibición competitiva 6.4.2 ~

K,, (I + NI) + S, Y =

-- y- s, (’ + Eaieición pata inhibición no competitiva 6.4.3

Y = Ecuación para inhibición por substraío 6.4.4 K, + S, + S,’N

R = 5 = 5 Tasa de Recirculación 6.4.5 FF F,

_- 6.4.6

6.4.7

19

6.5.1 Balance de Flujos

F, + FR = Fu

Sustituyendo por 6.4.6

Fo +R& = Fu

~ , ( i + R)= F~

6.5.2 Balance de Sustrato

FOSO + FRSR = FuSu

Sustituyendo por 6.4.6

FOSO i RFoSR = FuSu

Sustituyendo pw 6.5.1.3

&So + WJR = Fo(l + R)SM

.A

6.6 Balances en el ultrafiltro

6.5.1.1

6.5.1.2

6.5.1.3

6.5.2.1

6.5.2.2

6.5.2.3

6.5.2.4

6.5.2.5

Acumulacion = Entra& - Salida - Connrnio

Debido a que en este punto solo se realiza un proceso de separacih mecánico, no existe consumo de sustrato y la acumulación es cero, por lo tanto

Entra& = Salida

6.6.1 Balance de Flujos F, =Ffl+FF 6.6.1.1

20

F' - , - c;, +E;

Sustituyendo por 6.4.6

E;=F,+RF,

F; =E,(l+R)

4 F, = __ 1+R

6.8.2 -me de Sustrato &SI = FRSR + FFSF

De 6.3.2 se sabe que S, = O , por lo tanto.

&SI = FRSR

Sustituyendo por 6.6 1 1

+ F F ) = FRsR

Del balence global se sabe que FF = Fo , por io tanto

AI sustituir erta eamción en la $OUPOión 6.5.2.5 tenemos

6.6.1 2

6.6.1.3

6.6.1.4

6.6.1.5

6.6.2.1

6.6.2.2

6.6.2.3

6.6.2.4

- 6.6.2.5

6.6.2.6

6.6.2.7

6.6.2.8

6.5.2.5

21

-=S, l+R

So + SI(] + R) l + R

-=Su

6.7 Balance geneml de swtraío

La fracción de conversión en el reactor se define como:

SI = Su(1- X)

Sustituyendo por 6.5.2.5

Sustituyendo por 6.6.2.8

So + Sl(l + R) 'I=( i + R

SI(-) = So +S,(l+R) 1-x

l + R I-X SI( ~ - (1 .+ R)) = So

6.6.2.9

6.6.2.10

6.7.1

6.7.2

6.7.3

6.7.4

6.7.5

6.7.6

6.7.7

22

sll = (I + R(&)

AI sustituir esta ecuación en la ecuación 6.6.2.10 tenemos

So + S,(i + R) 1+R

s, =

SO sM = ( I+R)x

6.7 8

6.7.9

6.7.10

6.7.1 1

6.6.2.10

6.7.12

I

6.7.13

6.7.14

6.7.15

6.7.16

23

6.8 Teorla de ultrafiltración

6.7.17

La ecuación de flux del Modelo de polarización en pellcula y capa de gel ~8 define como :

donde:

J : Flux de permeado Ce : Concentración de soluto (sustrato SI) en la alimentaci6n del ultrafiltro. & : Concentraci6n de límite (constante) Ks : Coeficiente de transferencia de masa

Los úitimos dos valores son constantes para una solución en particular, para poder resolver el sistema y aplicarlo hay que encontrar estos valores de acuerdo a experimentos de ultrafiltraci6n, se recomienda un experimento parecido al reportado por Tejeda (1 995).

Una vez realizados estos experimentos encontramos el valor del flux para una concentración determinada, y tenemos que

Flujo .I =-- 6.8.2 1

Area

El área de la formula es el área de la membrana del ultrafiltro, por lo tanto :

Flujo = FF = J*AREA 6.0.3

FF = ARE4(Ks In 2) 6.8.4

24

EI valor de CB en igual al de SI, expresados ambos en cwicentración de masa en volumen (g/L por ejemplo).

C, = S, 6 8 5

Ya que tenemos que F, = FF tenemos que :

Fo= A+&?)

De la ecuación 6.7.2 se tiene que S, = (1 - X)SM , sustituyendo obtenemos :

Sustituyendo por 6.6.1.7

6.8.6

6.8.7

6.8.8

6.8.9

6.8.7

Sustituyendo por 6.6.2.14

F, = A R E A ( i + R k s h " s, 1 6.8.7

- '((1 + R)X]

6.8.8

26

6.9 inhibición competitiva

üe acuerdo un balance de susirato en el reactor, y a la ecuación para la veloudatj de reacción para el caso de inhibici6n competitiva, se obtiene:

Acumuloch= Entr.ada-Saliab-C~n~~mo

cis dt

V-=F,S,, -F,Sl -V 6.9 ’

Al estar en estado estacionario :

cis - = o dt

Por lo tanto :

6.9 ;I O=F,S,, -F,S,-V

Al considerar F,, = F, , y dividiendo entre V

4 o = -(&YM - SI)- - V 6.9 3

-(s, 4 -SI)= V 6.9.4

Sustituyendo por 6.7.2

6.9.5 -(s, 6 - s, (1 - x)) = V

- (S,X)=- 4 V 6.9.6

Sustituyendo por 6.7.1 1

6.9.7

Sustituyendo por 6.7.17

- 6.9.8

7

6.9.9

6.9.1 O

Sustituyendo por 6.8.8

mtreelvdumendeun Con esta eweaón m 8 C t c T y e l h a wia m ~ ~ ~ ó n de substrato i n b l y la fmcckh de 8 qu se descw, así como una tasa de recirculación propuesta.

I

27

EI siguiente ejemplo ilustra el uso de esta ecuación, para encontrar la relación entre el Mea de ultrafiltración y el volumen del reactor, proponiendo valores teóricos de las siguientes variables, y manteniendo rangos variables de conversión (X), y recirculación (R)

Vmu= 0.2 mgiml'min K 1 ~ 0 . 0 0 8 6 mglmi -5 mglml Ks= 0.0334 ml/cm2'min Cg=m mgiml

I= 2 mgimi Ki=O.5 mgiml

r~ 0.35 ?

I

w i 4 0.25 1 9 I i o.2o 1

1 0 ! 3 0.10 ;

i ' 0.15 1 2

W --.... . ~

a

k. --.h 0.05 j

0.00 O 0.2 0.4 0.6 0.8 1

CONVERSON X

En el caso particular de una conversión de 0.2, para una tasa de recirculacián de 5 se tiene una relación áreaivolumen igual a 0.26276, as¡ teniendo un área de ultrafiltraaón de 120 un2, tendríamos un reactor de 457 mL.

Un análisis de sensibilidad parametria muestra los siguientes resultados al incrementar las variables en un 10 %, de acuerdo a las siguiente formula :

AV V Sensibilidad = - AP P

-

-

28

donde

Variable P Sensibilidad ' vmax 1 O00

Km 0.01 3 so 0.702 Ks 0.909 cg O 207

I 0.010 Ki 0.010

V = Variable de respuesta. es este caso AreaNolumen P = Variable de estudio de sensibilidad

Q.WocrMbici6n no competitiva

De acuerdo un bekKtce de sustrato en el reactor, y a la ecuación para la velocidad de reección Pam d a 8 0 de inhibición no competitiva, se obtiene:

Acumulación = F a t r d - salida - Consumo

6.10.1 -*

6.1Q.2

6.10.3

29

SI Y,

- 4 (s, -. s, ) = (I+$] V KM +SI

6.10.4

Sustituyendo por 6.7.2

6.10.5

6.10.6

Sustituyendo por 6.7.11

1+-

K’f +( ( l+R)X)

6.10.7 -(S,X)=- 4 K, V S A - X )

Sustituyendo por 6.7.17

F V

1 - --

6.10.8

6.10.9

6.10.10

Sustituyendo por 6.8.8

a o V - A J K M +[ (l+R)X

J

Con esta ecumón podemos encontrar la relación adecwda entre el volumen de un reactor y el áma de una txmcmír&ón de Mbrtrodo inicial y la , as¡ como una tasa de recirculación propuesta.

a el uso de esta ecuación, para encontrar la reiación entre y el vdumen del reactor, proponiendo valores teóricos de

las sgumtes variables, y menteni8ndo rangos variabk de conversión (X), y recirculación (R)

aa6n para un de Ndróiisis q

VqmE- 0.2 mg/ml"min Km= 0.0086 mglml s o 0 5 mglml K.rr 0.0334 ml/cm2'min

t 2 mglml Kisi 0.5 mümg

-300 *mi

31

0.08 -

3 0.06 I 3 !

5 . 8 0.04

z i 0 ~

I a

i

3 0.02

+R=lO R=20

O O 0.2 0.4 O .6 0.8 1

CONVERSON X

En el caso particular de una conversión de 0.2, para una tasa de recirculaci6n de 5 se time una relación áreahrolumen igual a 0.05309, así teniendo un área de ultrafinración de 120 un2, tendríamos un reactor de 2,260 mL.

Un análisis de sensibilidad parametrica muestra los siguientes resultados al incrementar las variables en un 10 %.

6.11 Inhibición por sustrato

De acuerdo un balance de sustrato en el reactor, y a la ecuación para la velocidad de reacción para el caso de inhibición por sustrato, se obtiene:

Acumulación = E n í r h - Salida - Consumo

32

AI estar en estado estacionario

Por lo tanto :

O = F,S, -&SI -V- Y,& " 2 4 KM +SI +- KI

AI considerar F, = 4 , y dividiendo entre V o= -(s, 4 -SI)- Y ,SI

V S 2

Kl K, +SI +'

tl.1 1 .I

6.11.2 .-

6.11.3

6.11.4 -(s, 4 -SI)=- /,SI

V SI ?.

KI K , +SI +-

Sustituyendo por 6.7.2

6.1 1.5 1̂ -(sM 4 -S,(l-x))= Y-S,

V SI KI

K, +SI +-

6.11.6 -(s,x)= 4 Y-SI V K, +SI +- 4'

Kl

Sustituyendo por 6.7. I 1

6.1 1.7

33

Sustituyendo por 6.7.17

I - - F -

F 1 - Y-(@+)] -- V So(I-X) SJl-X) 1

KM +( ( I+R)X)+[$z$E) K,

6.11.8

6.11.9

6.11.10

Sustituyendo por 6.8.8

6.11.11 - - V

6.11.12

Con esta ecuación podemos encontrar la relación adecuada entre el volumen de un reactor y el área de uitrafiitración para un sistema, con una concentración de substrato inicial y la fracción de hidrólisis que se desea, así corno una tasa de recirculación propuesta.

El siguiente ejemplo ilustra el uso de esta ecuación, para encontrar la relación entre el Area de ultrafiltración y el volumen del reador, proponiendo valores teóricos de

34

las siguientes variables, y manteniendo rangos variables de conversión (X), y recirculación (R)

Vmax= 0.2 mglrnl'min Km= 0.0086 mglml so= 5 mg/mi Ks= 0.0334 ml/cm2'min Cg=300 mglml Ki-0.5 mllmg

0 1 4 -

0 1 2 I

ii 3 0 1 -

d 2 o.o8 4 3 z 0.06 ~

0 o w 4 0 0 4 : a

0.02 i 1 x R=50

0 - O 0.2 0.4 O .6 0.8 1

CONVERSION X

En el 61180 partiaiierde una c0nwMn de 0.2, para una Wiadereciradación de 5 0.0347, asi tsrysndo un Brea de de 3,4(36ml.

Un an&isis de sensibilidad ica muestra los siguientes resultados al ñcrementer las variables en un 1 O %.

I

35

7. DISCUSIONES Y RECOMENDACIONES

Debido a que la representación global del Proceso real es una aimlach, ,,, natural que se espere una cierta diferencia entre la operación real y la previsb pen

el proceso, aunque esta diferencia puede disminuirse en la medida que la

experiencia nos otorgue criterios que permitan corregir Y mejorar el modelo,

forma que mantengamos y aumentemos su utilidad práctica.

Se remienda para utilizar las ecuaciones desarrolladas antenomiente, realizar 10s

experimentos cinéticos necesarios, para en caso de inhibición, identificar de que

tipo se irata, así axno encontrar los parbmetro cinéticos necesarios para poder

resolver las ecuaciones particulares de cada caso. Así mismo los experimentos de

ultrafiltraaón que permitan encontrar los parámetros especificos de esta operación

unitaria para el sistema.

Como puede observarse existe cierta similitud de tendencia en las Curvas de las

gráficas de inhibición competitiva y no competitiva, no siendo totalmente así en la

de inhibición por sustrato. Esto puede deberse a que en el caso de la inhibición por

sustrato se involucra un termino Cuadrátiw, el cual hace cambiar el comportamiento

de sus curvas, con respecto a los otros dos tipos de inhibición, en los cuales se

presentan ecuaciones lineales. Así mismo se nota una importante semejanza en los

ordenes de magnitud en los resultados de cada caso especmco, lo cual nos

confirma ia lógica de los resultados obtenidos

36

8 . CONCLUSIONES

AI realizar el modelamiento matemático del sistema, obtenemos como resultados

las ecuaciones 6.9.12, 6.10.12 Y 6.11.12. Estas ecuaciones sirven para calcular la

relación optima entre el volumen de un reactor y el área de ultrafiltración para un

reactor enzimático de membrana, bajo condiciones iniciales propuestas, tales como:

una concentración de substrato inicial y la fracción de hidrólisis que se desea, así

como una tasa de recirculación propuesta. Estas ecuaciones se obtuvieron para las

cinéticas con inhibición competitiva, no competitiva y por sustrato respectivamente.

Los valores encontrados para la relación ár&o/umen, en los ejemplos descritos

antenomente se expresan en unidades de cm2/mL, de acuerdo a las unidades de

las variables presentadas en los ejemplos.

AI realizar un ejercicio para cada caso en particular, donde se propuso una tasa de

recircuiación de 5 y una tasa de conversión de 0.2, buscando encontrar el valor de

la relación Wvolumen, sa obtuvieron resultados muy cercanos en magnitud.

El an8ilieis de sen%ibilidad paramtrica nos muestra las variables que mas

provocan en el resultado final de los balances, siendo diferentes las varWes y sus

magnihrdes para cada uno de los dterentes tipos de inhibición. --.

Para el cgso de inhibición competitiva la variable que mayor impacto cam es la

velocidad máxima de reacción. Y la que menor impacto provoca es la W del inhibidor y la constante de inhibición

En el caso de inhibición no competitiva fue la canstante de inhibición la va’¡atple que

mas impacto tuvo en el análisis de sensibitidad, contrario al caso anterior. La

constante de Michaelis y la concentración de limite fueron las variables que menos

impacto tuvieron, llegando al valor de cero en el análisis de sensibilidad.

37

k?

:I . . : .:i~ ! irih bici511 pcir sustrato los iresultados fueron los mismo que en el

. , , , . : , , ' 3ieiii:'o inc:luso del mismi:' brden los resuibados, la constante de

1 . r , A l .iI c~n!itante de Michaetis fugmn las variables que mayor y menor

I : ' 1 , . :r: iron ̂ espectivamente.

I i,:

.. . , . : rw, Ic:c parámetros que inhyor impacto +wan en la relación !,

2 : : ti ' 11:):

( G I I I ~ ri ( ebei 1 ser obtenidos o calc~l&as m n mayor Cuidado o precisih que

: : : j , . I " ( luir que el modelamier1i:ol del sistema se realizo de manera

! , I C . i i m c:uiiiI )lir todos los objetivos ¡planteados iniuelmente, puesto que el

II 8 , , ., :I riit Fá (lbtener resultados ttQjms con una dara aproximación a

'I I ' : :j pt rirrie itale:;.

I , '

38

9. BlBLlOGRAFlA

1. HIMMELBLAU, D., y KENNETH, B. (1992). Análisis y Simulación de Procesos, Editorial Reverte S.A., 2' Edición, España, pp 1-12.

2. LEVENSPIEL, O. (1986). El Omnilibro de los Reactores Químicos, Editorial Reverte S.A., 1. Edición, Espana, pp. 4.144, 81.1-81.15.

3. QUINTERO, R. (1993). Ingeniería Bioquímica, Editorial Alhambra, 3' reimpresión, México, pp. 233-246.

4. TEJEDA, A,, MONTESINOS, R. y GUZMAN, R. (1995). Bioseparaciones, Editorial Unison, 1' Edición, México, pp. 547-598.

5. GEANKOPLIS, C. (1995). Procesos de Operaciones Unitarias, Editonal C.E.C.S.A., 2' Edición, México, pp. 759-763.

6. MORRISON, R., y BOYD R. (1970). Química Orgánica, Fondo Educaüvo Interamericano, 1' Edición, México, pp. 51 7-51 8.

7. FRAZIER, W. (1976). Microbiología de los Alimentos, Editorial Acribia, 2 Edición, España, pp. 654%.

8. WHITAKER, J. (1972), Principles of enzimology for the food sciences, Marcel Deker inc., 1' Edición, E. U., pp. 415-417.

9. CONN, E., y STUMPF, P. (1982). Bioquímica Fundamental, Editorial Limusa, 3' Edición, México, pp. 205.

lO.CHEFTEL, J.C. y CUQ, J. C. (1989), Proteinas alimentarias, Editorial Acribia S.A. de C.V., 1' Edición, Espana, pp. 326-328.

11. RODRIGUEZ, S. G. (I=), Generalidades En 'Avances en biotecndogia", PRADO, B. L. A., HUERTA, O. S., RODRIGUEZ, S.G. y SAUCEDO, C. G. (ed), Universidad Autónoma Metropolitana, México, pp. 15-17.

12.NAGODAWiTHANA, T., and REED, G. (1993). Enzymes in Food Proocessing, 3' edición, E.U., pp 167-169

13. KASSELL, B. (1970). Proteolitic enzymes. En Methods In €nzimo/ogy (XIX), 853- 871.

14BENJAKUL, S., and MORRISSEY, M. (1997). J. Agric. Food Chem, 45, 3423- 3430.

15.SUROWKA, K., and FIK, M., (1994). J. Sci. Food Agric, 65,289-296. 16.ACEVED0, C. (1998), Recuperación de peptidos a partir de subproductos de

pescado mediante la protedisi6 con- de la enzima fiavourzym, Reporte interno de servicio social, Universidad Autónoma Metropoiitma, MBxico D.F.

17.WANG, D. (1979). Fermentation and Enzime Technology, Editorial Wiby Interscience, 2. Edición, E.U., pp. 341-351.

18.ATKINSON, B. (1985), Reactores Bioquímicos, Editorial Reverte S.A., 1' Edición, España, pp. 204-210.

-

39