AMG_Curs_8

8/17/2019 AMG_Curs_8

1/29

ALIMENTE MODIFICATE GENETIC SI CU DESTINATII SPECIALE

CURS 8

ALIMENTATIA IN CAZULDEREGLARILOR METABOLICE

Capitolul 3:

04. 05.2016

8/17/2019 AMG_Curs_8

2/29

In

acest

capitol

vorbim

despre

…

1. Dereglari ale metabolismuluiaminoacizilor si proteinelor:

fenilcetonuria, dereglari alemetabolismului tirozinei, celiachia.

Erori innascute de metabolism

8/17/2019 AMG_Curs_8

3/29

DEREGLARI ALE METABOLISMULUI

AMINOACIZILOR SAU PROTEINELOR

8/17/2019 AMG_Curs_8

4/29

fenilalanin- hidroxolaza

Metabolismul fenilalaninei

- in conditii normale:Transformare biochimica dependenta de cofactorul

5,6,7,8-tetrahidrobiopterina

8/17/2019 AMG_Curs_8

5/29

CH2 CH

NH3

COO

Phe

transaminareCH2 C COO

fenil-piruvat

O

N A D H

, H N A

D

CH2 CH

OH

COO

fenil-lactat

CH2

fenil-acetat

COO

CO2

Datorita deficientei in enzima fenilalanin-hidroxilaza , Phe nu este convertita la Tyr

in organism se acumuleaza cantitati mari de Phe,care sufera transformarile:

Metaboliti eliminati prin urina

miros caracteristic

8/17/2019 AMG_Curs_8

6/29

Solutii:

• Folosirea de hidrolizate proteice enzimatice din care sa se elimine prin metodecromatografice fenilalanina, pastrandu-se toti ceilalti aminoacizi esentiali si

neesentiali

Hidrolizate din proteine lactate, carnate, vegetale (soia)

• Folosirea de plasteine (oligopeptide) cu continut redus de Phe sau lipsite de Phe .

Etape:

cu aceeasi enzima, la pH diferit

- Hidroliza enzimatica a proteinei de start pana la peptide cu M=1500 – 2000;

- Separarea Phe , partial sau total, prin adsorbtie pe coloane (Sephadex G-15);

- concentrarea hidrolizatului pana la 30-50% (masa/volum);

- plasteinizarea (resinteza enzimatica);

- separarea plasteinelor si uscarea lor prin atomizare sau liofilizare.

8/17/2019 AMG_Curs_8

7/29

Alimente destinate persoanelor cuerori innascute de metabolism

• Tipul I: produse destinate copiilor mici afectati de dereglari ale metabolismului

unor aminoacizi; au in compozitie aminoacizi sau proteine, vitamine si minerale,

in dozele recomandate varstei, cu exceptia aminoacidului sau aminoacizilor ce nu

pot fi metabolizati de catre pacient.

• Tipul II: produse destinate copiilor mari si adultilor, care contin cantitatile

necesare de aminoacizi sau proteine, vitamine si minerale; toate sunt lipsite sau

contin cantitati limitate din aminoacidul/aminoacizii al caror metabolism este

perturbat.

• Tipul III: amestecuri de aminoacizi din care lipsesc aminoacizii ce nu pot fi

metabolizati, suplimentate cu intreaga cantitate de vitamine si minerale, dar

lipsite sau continand cantitati mici de glucide.

• Tipul IV: produse care constau din module nutritionale echilibrate, ce contin

amestecuri complete de vitamine si minerale, dar care nu contin, dupa caz,

proteine sau aminoacizi (afectiuni ale metabolismului proteic sau intolerante

proteice), glucide (erori innascute ale metabolismului glucidic sau intolerante la

diverse glucide) ori lipide (dereglari ale metabolismului lipidic sau intolerante).

8/17/2019 AMG_Curs_8

8/29

DIETOTERAPIE

Pt. tratamentul acestei boli se utilizeaza, de regula, asa-numita “ proteina PKU ”.

Proteina PKU se poate obtine prin mai multe tehnici:

• a) realizarea unei mixturi de aminoacizi din care lipseste Phe. Aceasta mixtura,

considerata produs de baza, se poate combina cu alti nutrienti, absolut necesari,

obtinandu-se formule farmaceutice sau se poate introduce in alimente gatapreparate, neproteice, sau cu continut minim de proteine, fabricate industrial sau

preparate casnic.

• b) eliminarea, prin diferite procedee (cel mai adesea biotehnologice), a Phe din

proteina naturala a unor materiale proteice.

• c) adaugarea in dieta a unor preparate continand aminoacizi care aucapacitatea de a reduce nivelul Phe din sange sau lichidul cefalorahidian.

• d) indepartarea, prin inginerie genetica, a Phe din structura primara a unor

proteine si inlocuirea ei cu un alt aminoacid. De cele mai multe ori, acest

procedeu permite chiar cresterea calitatii nutritionale a proteinei originale, prin

inlocuirea Phe cu aminoacidul care limita, initial, valoarea biologica a proteinei.

8/17/2019 AMG_Curs_8

9/29

Realizarea mixturilor de aminoacizidin care lipseste Phe

Prima terapie care a folosit mixturile de aminoacizi din care lipsea Phe s-a

realizat in 1953 (Bickel si colab.)

Dezavantaj: mixturile de aminoacizi liberi au gust amar si pot produce diaree

osmotica. Gustul si mirosul unor asemenea formule nutritive, solubilitatea

limitata a unor aminoacizi si stabilitatea termica nesatisfacatoare (la coaceresi gatit) complica utilizarea acestui tip de formule nutritive. Ulterior, s-a

constatat ca acetilarea si esterificarea maresc semnificativ gustul placut si

solubilitatea unor aminoacizi (ex. N-Ac-Tyr).

Etape tehnologice:

Realizarea a 4 solutii stoc:

1. Vitamine hidrosolubile (complexul B, niacina, acid folic, biotina, acid

pantotenic, colina si inozitol);

2. Vit. C (acid ascorbic);

3. Un amestec de minim 2 surse de lipide, suplimentat cu vitamine liposolubile

(A, D, E, K) si palmitat de retinol.

4. O pasta fluida alcatuita din maltodextrine si minerale.Separat se realizeaza amestecul de aminoacizi, din care lipseste Phe.

8/17/2019 AMG_Curs_8

10/29

Instalatie pentru obtinerea mixturii deaminoacizi

8/17/2019 AMG_Curs_8

11/29

Eliminarea Phe din materiale proteice

Deoarece mixturile de aminoacizi indeparteaza bolnavul de senzatia unei dietenormale, a aparut necesitatea indepartarii Phe din materialele proteice

disponibile, daca nu total, cel putin intr-o proportie cat mai mare.

Se recomada ca aportul de azot proteic sa provina dintr-un hidrolizat enzimatic

care sa contina oligopeptide, preferabil di- si tripeptide, compusi care au

demonstrat ca se absorb in organism mai bine decat aminoacizii liberi.

8/17/2019 AMG_Curs_8

12/29

Variante tehnologice

1. Proteina este mai intai descompusa, prin hidroliza acida, in aminoacizii

constituenti, dupa care Phe este indepartata din amestec cu ajutorul carbunelui

activ.

Inconveniente: randament mic (max. 50%), deoarece se adsorb pe carbunele

activ si alti aminoacizi.

Aminoacizii hidrofobi sunt adesea retinuti aproape integral pe carbune ei

trebuie adaugati ulterior in produs. In plus, carbunele activ folosit drept

adsorbant nu poate fi regenerat metoda este f. scumpa.

2. Indepartarea Phe cu ajutorul rasinei Amberlite XAD-4 din hidrolizatul acid

de cazeina.

Prin aceasta metoda se reduce procentul de Phe din amestecul de aminoacizi de

la 3.42% la 1.35%, cantitate inca prea mare pentru ca produsul sa poata fi

utilizat ca sursa de azot proteic de catre pacientii cu PKU.

8/17/2019 AMG_Curs_8

13/29

Instalatie pentru obtinerea hidrolizatului acidlipsit de fenilalanina

8/17/2019 AMG_Curs_8

14/29


3. Indepartarea Phe dintr-un hidrolizat proteic acid cu ajutorul unei rasini

puternic schimbatoare de anioni.

Inconvenient: Rasinile puternic schimbatoare de anioni necesita utilizarea

solutiilor tampon varianta tehnologica nu poate fi extinsa la scara

industriala.

4. Materia prima este constituita din lapte praf degresat sau cazeinat, care se

supune hidrolizei enzimatice, mai intai cu o proteaza produsa de o tulpina de

Aspergillus oryzae, apoi cu papaina.

Hidrolizatul obtinut este amestecat cu carbune activ (raport masic carbune

activ: proteina = 3:1) se indeparteaza 92% din cantitatea de Phe, la un

randament in proteina de 50%.

5. Hidroliza acida este inlocuita de o hidroliza enzimatica, cu scopul indepartarii

aminoacizilor aromatici C-terminali in forma libera.

Inconvenient: Phe nu se elimina complet (chiar si la utilizarea a 425% C activ

fata de materialul proteic), iar pierderile tehnologice sunt de aprox. 50%.

8/17/2019 AMG_Curs_8

15/29

Instalatie pentru hidroliza enzimatica aproteinelor si retinerea Phe pe carbune activ

8/17/2019 AMG_Curs_8

16/29


6. Pt. imbunatatirea gustului si conferirea unor calitati cat mai apropiate de ale

unei proteine native, la inceputul anilor ’70 au demarat cercetarile privind

producerea proteinei PKU prin metode enzimatice.

Una dintre aceste metode, in doua etape, utilizeaza pepsina pt. hidroliza

proteinei din zer, a.i. Phe sa se regaseasca la capatul C-terminal al peptidei. Mai

departe, Phe este indepartata ca aminoacid liber prin actiunea unei

carboxipeptidaze sau a unui preparat comercial cu activitate carboxipeptidazica.

7. Hidroliza proteinei are loc intr-o singura etapa, cu ajutorul unei enzime care

poseda atat activitate endopeptidazica, cat si exopeptidazica, Phe fiind separata

din amestecul rezultat prin cromatografie in faza de gel.

Inconvenient: Aceste metode nu sunt satisfacatoare din punctul de

vedere al utilizarii lor la nivel industrial, productivitatea fiind mica, iar

produsul proteic obtinut, prea scump si lipsit de un gust acceptabil.

8/17/2019 AMG_Curs_8

17/29

8. Etapa 1: Material proteic: orice sursa de proteine: zer (35-85% proteine),cazeina sau concentrat proteic de soia (52% proteine). Continutul proteic almateriei prime influenteaza continutul proteic al produsului preferabil ca

m.p. sa contina min. 70% proteine.

In prima etapa a procesului, proteina de start este hidrolizata in proportie de

30-60% cu ajutorul unei enzime proteolitice ( pancreatina, 3% fata de proteina).

Phe este eliberata ca aminoacid liber in proportie de 70-90% (aprox. 3.6-3.8%

din hidrolizatul proteic obtinut este Phe).

Dupa hidroliza enzimatica, hidrolizatul proteic este ultrafiltrat (pt.

indepartarea proteinei nehidrolizate si a fragmentelor peptidice cu masamoleculara mare), iar permeatul este recuperat si concentrat prin evaporare

pana la s.u. 50%. Ulterior, acesta se poate utiliza ca atare, sau se usuca prin

pulverizare.

Inainte de tratarea cu rasina adsorbanta pt. indepartarea Phe, concentratul sau

pudra de proteina hidrolizata se disperseaza in apa fierbinte pana la 20-30%s.u.


Varianta tehnologica optima

8/17/2019 AMG_Curs_8

18/29


Tratamentul cu rasina adsorbanta poate fi realizat la pH diferit, in functie de

continutul in Phe urmarit al produsului. Astfel,

• la pH 6.5-7 continut max. de Phe de 0.5%;

• la pH 3-4 continut max. de Phe de 0.1%; in plus, profilul aminoacizilor in

produsul final este mai echilibrat decat in cazul variantei tehnologice in care se

foloseste o solutie neutra. Trebuie apreciat si nivelul ridicat de Tyr obtinut prinfolosirea solutiei acide (deoarece adaugarea ulterioara a acestui aminoacid in

produsul final este dificila, datorita solubilitatii sale reduse).

Atentie! Este necesara indepartarea sarii rezultate in urma neutralizariisolutiei acide.

Etapa 2: Hidrolizatul proteic este trecut pe o coloana umpluta cu rasinaadsorbanta, la o viteza de curgere liniara de 0.1-1.3 m/h. Procesul de retentie

necesita un anumit timp de reactie minim, determinat empiric ca fiind suficient

atunci cand vit. de curgere liniara nu depaseste 1.3 m/h. Adsorbtia se

imbunatateste la viteze de curgere mai mici, in schimb creste timpul necesar

procesului costuri de productie mai mari.


8/17/2019 AMG_Curs_8

19/29


Coloana cu rasina astfel tratata este eluata cu apa, la aceeasi viteza de curgere

cu care a fost trimis hidrolizatul proteic pe coloana. Proteina PKU este eluata

din coloana inainte de Phe si de peptidele care contin Phe.

Daca este cazul, sarurile (de ex. NaCl) sunt indepartate din fractiunea libera dePhe prin electrodializa.

In final, aceasta fractiune proteica este concentrata pana la 70-80% s.u. La

nevoie, concentratul proteic se usuca prin pulverizare.

Randamentul in proteina al metodei este de 45-65%, in functie de

caracteristicile produsului final.

Avantajul metodei consta in faptul ca rasina adsorbanta folosita poate fi

regenerata cu sol. de NaOH 4%, dupa care poate fi imediat reutilizata.


8/17/2019 AMG_Curs_8

20/29

Instalatie pentru hidroliza enzimatica a materialuluiproteic si indepartarea fenilalaninei

cu rasina adsorbanta

8/17/2019 AMG_Curs_8

21/29

Caracteristicile produsului final

Gradul de indepartare al Phe din materialul proteic este de 92-100%. Prin

aceasta metoda se obtine o proteina PKU cu un continut de Phe mai mic decat

acela al produselor obtinute prin metode mai vechi, bazate tot pe hidroliza

proteinei (gradul de indepartare al Phe 90-95%).Profilul de aminoacizi al produsului proteic lipsit de Phe astfel obtinut este

corespunzator in ceea ce priveste continutul in aminoacizi esentiali. Este

necesara doar adaugarea unor cantitati suplimentare de Tyr si Met.

Produsul este bogat in di- si tripeptide cu valoare nutritiva ridicata si contine

aproximativ 25% aminoacizi liberi.

Gustul preparatului este mult mai placut comparativ cu cel al altor produse

similare. In plus, pudra este usor solubila in apa fierbinte.

8/17/2019 AMG_Curs_8

22/29

Mai mult…

S-a sugerat gasirea unor metode prin care Phe sa fie eliminata din creier sau prin care

deficientele in aminoacizi cerebrali sa poata fi corectate. In plus, tratamentul de

restrictionare a Phe in hrana devine tot mai greu de realizat pe masura inaintarii in

varsta a pacientilor.

Solutia este administrarea unui amestec de Val + Ile + Leu (VIL), alaturi de o dieta

saraca in Phe.

Pt. copiii mici, doza VIL este aprox. egala cu nivelul acestor aminoacizi din ratia

zilnica de substitut proteic sarac in Phe (se dubleaza aportul de aminoacizi cu catena

ramificata). Suplimentul VIL se adauga direct in formula proteica cu continut scazut

de Phe, fiind administrat in timpul meselor si inainte de culcare.

Pt. sugari, dozele VIL s-au ales tinand cont de concentratia acestor aminoacizi in

laptele matern (aprox. de 2 ori mai mari decat necesarul). Raportul V:I:L = variabil

(de la 1:1:1.5 la 1.5:1:2).

Concentratia de Phe plasmatica se poate realiza si prin aport suplimentar de Thr. S-a

realizat astfel un preparat de uz nutraceutic care contine min. 8g Thr la 100 gaminoacizi.

8/17/2019 AMG_Curs_8

23/29

Solutii alternative

Cea mai noua posibilitate de a realiza o proteina lipsita de Phe este modificarea

genetica a proteinelor. Se rezolva astfel si problema palatabilitatii si cea a prelucrarii,

deoarece se obtine o proteina intacta (nehidrolizata), dar lipsita de Phe, fara miros

sau gust neplacut.

Aceasta proteina este, cel mai adesea, o proteina vegetala care a fost modificata (dar

nu prin hidroliza), in vederea eliminarii Phe.

Termenul “ proteina intacta” este folosit pt. desemnarea unei proteine naturale/native

nehidrolizate. Proteinele naturale, modificate genetic, se pot folosi ca suplimente in

formule nutritive sau combinate cu produse alimentare cu continut proteic scazut,

putand fi prelucrate in mod similar alimentelor traditionale.

Avantaje: pastrarea majoritatii proprietatilor fizice ale proteinei de origine

(solubilitate, gust si miros aproape nesesizabile), ceea ce permite utilizarea lor in

amestec cu diferite lichide sau alimente traditionale si prelucrari termice (fierbere,

coacere) confera produsului o superioritate neta comparativ cu formulele

clasice, care contin aminoacizi in stare cristalina, hidrolizate proteice sau polipeptide

sintetice.

Ingineria genetica

8/17/2019 AMG_Curs_8

24/29

Obtinerea proteinei PKU prin inginerie genetica

Metoda consta in modificarea secventei aminoacizilor din proteina naturala, in

scopul reducerii sau eliminarii Phe din structura proteica primara.

Numeroase surse proteice sunt incomplete dpdv nutritional (din compozitia lor

lipsesc unul sau mai multi aminoacizi esentiali) avantajul metodei: imbunatatirea

calitatii nutritive a proteinelor native. Este posibila crearea unei proteine care sa

contina toti aminoacizii, cu exceptia Phe.

In terapia PKU se prefera utilizarea proteinelor total lipsite de Phe, dar se pot utiliza

si proteinele naturale modificate care contin 1-3 resturi de Phe.

8/17/2019 AMG_Curs_8

25/29


Etape:- Identificare genei care codifica o proteina nativa cu un continut relativ scazut

de Phe;

- modificarea secventei de baze azotate din codonii Phe;

- expresia genei modificate;- izolarea proteinei a carei expresie genetica a fost modificata.

Phe este codificat in ADN de tripletele TTT si TTC. Eliminarea acestor 2 codoni din

fragmentul de gena va conduce la o gena modificata, capabila sa determine

biosinteza unei proteine lipsite de Phe.

8/17/2019 AMG_Curs_8

26/29


Tehnici de modificare a genelor care codifica Phe:

- Eliminarea secventelor nucleotidice care codifica Phe:

a) cu ajutorul unor endonucleaze de restrictie se rupe gena structurala in

anumite locuri, rezultand numeroase fragmente de acid nucleic al genei. Se

indeparteaza fragmentele care codifica Phe, restul fragmentelor ramase se pot

reasambla proteina intacta modificata lipsita de Phe.

b) prin digestie cu o endonucleaza, urmata de tratamentul cu o exonucleazasi apoi reasamblarea fragmentelor de ADN ramase.

- Modificarea secventelor nucleotidice care codifica Phe: mutageneza localizata.

ARN

8/17/2019 AMG_Curs_8

27/29

ARN

8/17/2019 AMG_Curs_8

28/29

Obtinerea proteinei PKU prin mutageneza localizata

Metoda implica o modificare minora a genelor structurale care codifica proteinele

naturale proteinele rezultate vor pastra majoritatea proprietatilor fizice ale

proteinei initiale (inclusiv dimensiunile, solubilitatea). Codonii Phe pot fi inlocuiti cu

codoni ai altor aminoacizi nepolari asemanatori (de ex. codoni pentru Ile)

pastrarea proprietatilor fizice ale proteinei de plecare.

Este de preferat ca MG sa se aplice proteinelor care sunt in mod natural sarace in Phe

(sub 12 resturi de Phe, preferabil maxim 7).

Ex.: proteinele vegetale de rezerva (proteinele care se acumuleaza in cantitati mari

in procesul de formare a semintelor si sunt rapid hidrolizate in cursul germinarii)

• sunt prezente in celulele veg. in

conc. mare si intr-o forma stabila;

• genele care le codifica au fost completcaracterizate pentru porumb, fasole,

mazare, orez, floarea-soarelui,

bumbac, sorg, soia si arahide.

8/17/2019 AMG_Curs_8

29/29

Aplicatie:

Zeina reprezinta 60% din totalul proteinelor din endospermul semintelor de porumb.

• dpdv al masei moleculare: gama-zeine (16 si 27 kDa);

alfa-zeine (22kDa);

beta-zeine (19 kDa).• sunt solubile in alcool si se pot purifica prin extractie

cu o solutie alcoolica in prezenta unui agent reducator

(2-mercaptoetanol) sau cu sol bisulfit de Na 0.3M in

izopropanol 10%.

•

Modificarea zeinei din porumb

• Contine 2 resturi de Phe;• Aminoacizi limitanti Lys si Trp

simultan cu indepartarea Phe se poate imbogati

proteina in Lys si Trp (prin inlocuirea codonilor

Phe cu codonii caracteristici Lys si Trp) creste

valoarea biologica a proteinei initiale

AMG_Curs_8

Documents

Transcript of AMG_Curs_8