UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATAFACULTAD DE CIENCIAS EXACTASDEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLOGICASCATEDRA DE ANALISIS CLINICOS I (HEMATOLOGIA)

METODOS DEL LABORATORIO HEMATOLOGICO

SEGUNDA PARTE

Docentes Dra. Nilda E. Fink Dra. María Elena ChiesaDra. Alejandra Fernández AlbertiBioq. Fernando VentimigliaBioq. Mariana GonzálezBioq. José Luis Casali

La Plata, 2005

CONTENIDO

Página

Recuento de leucocitos

Determinación de la fórmula leucocitaria: recuento diferencial de leucocitos

Electroforesis de las proteínas séricas en acetato de celulosa

Células LE

Diagnóstico de mononucleosis infecciosa

Citoquímica1. Reacción de Pas (hidratos de carbono)2. Peroxidasas3. Sudan Black B (lípidos)

Hemostasia1. Recuento de plaquetas (método manual)2. Tiempo de sangría3. Tiempo de coagulación4. Retracción del coágulo

Determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada

Determinación del tiempo de protrombina o tiempo de Quick en una etapa

Determinación de fibrinógeno

3

5

8

12

14

16161718

1919202223

25

27

30

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RECUENTO DE LEUCOCITOS

Método manual

1) Agregar 20 l de sangre a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solución de Türk. Esta solución contiene acido acético al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de espátula de azul de metileno.

2) Homogeneizar la mezcla.

3) Cargar las cámaras de recuento, procediendo tal como se realizó para el caso del recuento de hematíes.

4) Ubicar el reticulado de la cámara con bajo aumento, constatar la ausencia de burbujas y que la distribución sea regular.

5) Aplicando mayor aumento se procede al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cámara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre sí en más del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cámara.

1 2

3 4

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilución 1:10. Si por el contrario el número resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

Recuadro central

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6) Cálculo:

m x 10 x d= N° de leucocitos/ mm

n

Donde: m=número de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilución utilizada

Valores de referencia

Adultos 4.000 - 11.000 / mm3

Recién nacidos 10.000 - 25.000 / mm3

Niños de 1 año 6.000 - 18.000 / mm3

Niños de 4 a 7 años 6.000 - 15.000 / mm3

Niños de 8 a 12 años 4.500 - 13.000 / mm3

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DETERMINACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA:RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

1) OBTENCIÓN DEL FROTIS DE SANGRE Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequeña de sangre (1-2 mm) recién obtenida, ya se trate de punción digital, o del talón (en pediatría) o de la última gota de sangre extraída con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfología de las células.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ángulos (extensor), se realiza la extensión de la gota de sangre: conservando un ángulo menor de 45 respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rápidamente. Así se obtiene una fina película de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rápidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las células.

Un extendido así obtenido poseerá tres áreas de diferente espesor y con distribución también distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la región inmediata al punto de partida de la extensión (cabeza). En ella hay siempre un aumento del número de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensión (cola) y en ésta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Región central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las células.

2) COLORACIÓN DEL FROTIS DE SANGRE

La coloración se realiza por el método de May Grünwald-Giemsa.

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Fundamento

Prácticamente todos los métodos empleados para teñir las células de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.

Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carácter básico fijan en mayor medida la eosina (colorante ácido), mientras que las que poseen propiedades ácidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante básico). Esto explica que ciertas estructuras basófilas presentes en el núcleo (nucléolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidófilos como la hemoglobina adquieren color rosado.

De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmáticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrófilos, en los que la granulación específica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultáneamente, resultando en un color pardo; eosinófilos, en los que la granulación específica contiene sustancias de intenso carácter básico que fijan fundamentalmente los colorantes ácidos, dando un color rojo-naranja; y los basófilos, cuya granulación específica posee sustancias de carácter ácido, que fijan colorantes básicos dando un color azul oscuro. Reactivos Solución May Grünwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solución Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluoresceína).

Método

Cubrir el frotis de sangre seco con solución May Grünwald. Dejar 3 minutos. A continuación, agregar buffer fosfato pH 6.8 en proporción igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivén. Dejar 5 minutos. Volcar y cubrir el preparado con una solución de Giemsa, obtenida a razón de dos gotas del colorante por ml de agua. Dejar 10 minutos. Lavar con agua , limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodón y secar al aire.

3) REALIZACIÓN DE LA FÓRMULA LEUCOCITARIA RELATIVA

Sobre el frotis coloreado se coloca una gota de aceite de inmersión y se observa al microscopio. Puede utilizarse un aumento de 100X.

La clasificación de las células se puede realizar analizando las que se encuentran en una trayectoria que se hace comenzando en uno de los bordes, desplazando 4 a 5 campos microscópicos siguiendo de forma paralela al borde, iniciando a continuación una recorrida transversal hasta llegar al otro borde. Allí se comienza de nuevo: 4 a 5 campos microscópicos y otra incursión hasta el borde opuesto. Se clasifican como mínimo 100 leucocitos.

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Fórmula leucocitaria normal de un adulto

CayadosNeutrófilosEosinófilosBasófilosLinfocitosMonocitos

0-1%55-70%1-4%0-1%

20-40%4-8%

No hay variación de la fórmula según el sexo, pero sí según la edad. Nacimiento: 70% de neutrófilos. Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos. Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrófilos3-4 años: 50% de linfocitos

y 50% de neutrófilos. 10-12 años: valores de referencia del adulto.

Descripción de cada uno de los elementos que componenuna fórmula normal

1. Neutrófilo: Núcleo lobulado ( 2-5 lóbulos). Los lóbulos están unidos entre sí por filamentos cromatínicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una célula terminal. Mide aproximadamente 12 m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulación fina específica de color pardo rojiza.

2. Neutrófilos en cayado: Sólo se diferencia del anterior por su núcleo no lobulado en forma de C y, a veces de S . No hay una zona muy delgada de material nuclear que permita diferenciar dos lóbulos.

3. Eosinófilo: Mide aproximadamente 13 m. El núcleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo. El citoplasma es abundante y está cubierto de granulaciones esféricas de mayor tamaño que las del neutrófilo y que se colorean de anaranjado.

4. Basófilos: Mide aproximadamente 10 m. El núcleo está irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relación al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamaño pudiendo quedar superpuestas al núcleo, cubriéndolo parcialmente.

5. Linfocitos: Es una célula generalmente pequeña (7 m), pero puede llegar hasta 12 m. La forma más pequeña posee sólo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son células más grandes y con citoplasma más abundante. El núcleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.

6. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamaño (18-24 m). El núcleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporción núcleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tiñe de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

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ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS SERICASEN ACETATO DE CELULOSA

El suero humano contiene numerosas proteínas que cumplen diferentes funciones. La electroforesis es una técnica simple para separarlas en fracciones (Fig. 1).

1Ac1Ag1AtLpAlbAT3LpC1q, C1r,C1s, C3, C4, C5C1Inh

Alfa1-antiquimotripsinaAlfa1-glicoproteína ácidaAlfa1-antitripsinaAlfalipoproteínaAlbúminaAntitrombina IIIBetalipoproteínaComponente del complemento C1q ... C5

Inhibidor de C1

CerCRPFBFibrHptHpxIgA, IgD,IgE, IgG,IgMPlPreA

CeruloplasminaProteína C reactivaFactor BFibrinógenoHaptoglobinaHemopexinaInmunoglobulinas A ... M

PlasminógenoPrealbúmina

Figura 1. Electroforesis de proteínas plasmáticas en acetato de celulosa: se observan cinco fracciones cada una compuesta por muchas proteínas individuales. Las más

importantes se muestran en la figura.

Se utiliza la electroforesis de zona en la cual se emplea un soporte inerte: acetato de celulosa o agarosa; las proteínas que son anfóteras adquieren una carga neta negativa en el buffer de pH 8,6 (barbital) que se usa en la corrida, por lo tanto migran hacia el ánodo. El buffer empleado no desnaturaliza ni precipita a las proteínas y su fuerza iónica está entre 0,05 y 1,5 mol/l. A medida que aumenta la fuerza iónica la migración se hace más lenta.

El soporte que utilizamos en el trabajo práctico separa las moléculas por su carga molecular neta y se obtiene un patrón de 5 bandas para un suero normal.

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La proporción de las distintas fracciones proteicas varía en algunas enfermedades y además se puede observar la aparición de bandas diferentes de las normales como en el mieloma.

CONSERVACIÓN DE LAS TIRAS

Las tiras de acetato de celulosa se conservan en un recipiente tapado en metanol 40%. Es importante no permitir que las tiras se sequen porque pierden las dimensiones y características del gel.

RECONOCIMIENTO DE LA SUPERFICIE PENETRABLE POR LAS PROTEÍNAS

Sólo una cara es penetrable por las proteínas y se reconoce fácilmente por que es más opaca, después de secarse entre dos hojas de papel de filtro. Las tiras tienen un ángulo achaflanado. La superficie penetrable puede reconocerse. Por ejemplo, poniendo la tira con el ángulo achaflanado abajo y a la derecha.

BUFFERS

N° 1 Veronal sódico 0,04M (dietilbarbiturato de sodio 8,24 g/litro) pH=8,6.N° 2 Veronal sódico 5,15 g + EDTA sal tetrasódica 2,60 g/litro. pH=8,6.

SOLUCIÓN COLORANTE

Ponceau S: 0,5 g en 100 ml de ácido tricloroacético 5% (dosis para 20 tiras).

DESHIDRATANTE

Metanol puro.

SOLUCIÓN TRANSPARENTIZADORA

85 ml de metanol + 14 ml de ácido acético + 1 ml de glicerol

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SOLUCIÓN DISOLVENTE PARA CUANTIFICAR LAS FRACCIONES PROTEICAS

Acido acético 80%.

PROCEDIMIENTO PARA LA ELECTROFORESIS

1. Sumergir las tiras en el tampón por lo menos 10 minutos (como máximo una noche).

2. Eliminar el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro.

3. Extender las tiras sobre el puente de la cámara electroforética. La superficie penetrable tiene que estar dirigida hacia arriba; además las tiras deben quedar bien planas. Conviene hacerlo rápidamente para evitar la evaporación.

4. Condiciones de migración: sobre puente de 8,5 cm para micro o semimicroelectoforesis.

5. Voltaje fijo: 200 V tampón n° 1 o n° 2.

Microelectroforesis

Microaplicación de 0,5 l/5mm a 3 cm del borde catódico.

Tiempo: 20 minutos (longitud de la migración 25 mm) (error admitido sobre tiempo: -1+5 minutos)

Semimicroelectroforesis

Semimicroaplicación 1,5 l/9 mm a 2cm del borde catódico.

Tiempo: 30 minutos (longitud de la migración 35 mm) error admitido sobre tiempo: -1+8 min).

1. Coloración: 5 minutos.

2. Decoloración: con solución decolorante cambiar 3- 4 veces hasta que el fondo de la tira esté blanco con agitación.

3. Determinación cuantitativa:

A) Disolución. Cortar las fracciones coloreadas e introducirlas en tubos de ensayo preparados en serie de 5. Agregar la solución disolvente y agitar (para las fracciones obtenidas de tiras 2,5 x 17 cm usar 3 ml de solución). Leer el colorímetro a 520 nm para el colorante Ponceau S.

B) Transparentizado de las tiras de acetato de celulosa. Se sumergen las tiras decoloradas en metanol puro anhidro durante 30 segundos como mínimo, en cubeta seca, y a continuación en la solución transparentizadora durante 1 minuto como mínimo. Luego se colocan sobre una placa de vidrio, eliminando las

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burbujas de aire y se calienta preferentemente debajo de lámpara infrarroja o sobre un baño seco a 60°C durante unos minutos, a unos 5-10 cm de distancia, hasta transparencia completa. Conviene hacerlo rápidamente para evitar que las tiras transparentizadas se sequen al aire Luego se invierte la placa de vidrio sobre papel de filtro, dejando enfriar durante 20 minutos como mínimo. Se puede separar la tira de acetato de celulosa de la placa de vidrio conservándola en sobre de plástico o entre papeles pudiéndose efectuar después la lectura en el densitómetro.

Los perfiles que se obtienen en la densitometría son los siguientes:

Figura 2. Electroforesis de proteínas séricas: correlación clinicopatológica.

VALORES DE REFERENCIA

Proteínas Valores relativos (%)* Valores absolutos (g/dl)Albúmina12

52-652,5-5

7,0-13,08,0-14,012,0-22,0

3,2-5,60,1-0,40,4-1,20,5-1,10,5-1,6

* % del total de proteínas

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CELULAS LE

INTRODUCCIÓN

El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad de base autoinmune, en la que están afectados numerosos tejidos y órganos como articulaciones, piel, sistema nervioso, riñón, corazón, pulmón, sangre, hígado, bazo y ojos.

PRINCIPIO

Las células LE son polimorfonucleares que han fagocitado material nuclear alterado proveniente de la destrucción del núcleo de otros leucocitos por el llamado factor LE (factor nuclear). Este factor (IgG anti-ADN) se fija a la superficie del núcleo y determina alteraciones de la cromatina. El material nuclear alterado recubierto de anticuerpos y complemento es fagocitado por los polimorfonucleares neutrófilos.

Figura 3.

MÉTODO

4. Extraer 10 ml de sangre y dejarla coagular en un tubo de ensayo durante 2 horas a 37°C.

5. Centrifugar 10 minutos a 3500 rpm.6. Eliminar el suero y depositar el coágulo sobre un tamiz de malla fina (gasa).7. Aplastar el coágulo contra el tamiz, recogiendo el producto resultante en un tubo de

ensayo.8. Llenar mediante una pipeta de Pasteur un tubo de Wintrobe, con el material

obtenido de la destrucción del coágulo.9. Centrifugar durante 20 minutos a 5000 rpm.10. Eliminar el sobrenadante y recoger con una pipeta Pasteur los leucocitos situados en

la interfase suero/hematíes.11. Efectuar dos frotis con este material.12. Teñir con el método de May Grunwald-Giemsa y observar mediante el objetivo de

inmersión.

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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La prueba es positiva cuando se observan leucocitos en cuyo citoplasma se hallan núcleos fagocitados de otras células con aspecto desestructurado y parcial o totalmente hialinizados.

Esta prueba es específica, pero no tiene gran sensibilidad por cuanto es negativa en el 30% de los pacientes de lupus. La corticoterapia, que a menudo se aplica prontamente a estos enfermos, inhibe la formación de las células LE. Por lo tanto en la actualidad no tiene tanto valor diagnóstico y es necesario utilizar otras pruebas.

También se puede observar la formación de células LE en otras enfermedades autoinmunes y muchas veces difíciles de distinguir clínicamente del lupus, como en colagenopatías y artritis reumatoidea. Por ello en la actualidad la determinación clásica de las células LE ha sido desplazada por otras pruebas cada vez mas sensibles y específicas, entre las que se destacan los anticuerpos antinucleres.

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DIAGNOSTICO DE MONONUCLEOSIS INFECCIOSA

MonoslidePrueba de aglutinación en placa, con neutralización según

Davidsohn, para el diagnóstico de mononucleosis infecciosa

SIGNIFICACION CLINICALa mononucleosis infecciosa es una enfermedad benigna producida por el virus de Epstein-Barr (EBV) que se caracteriza en su aspecto clínico por la aparición de fiebre irregular durante una o dos semanas, dolor e hinchazón de los ganglios cervicales e irritación faríngea; con un cuadro hematológico bastante característico debido a la gran proliferación de células linfoides atípicas.Paul y Bunnell observaron que el suero de estos pacientes generalmente contiene un alto título de anticuerpos heterófilos, capaces de aglutinar glóbulos rojos de carnero o de caballo. Estos anticuerpos no son privativos de la mononucleosis, ya que en el suero de individuos sanos pueden existir aglutininas anti-carnero con títulos de 1/28 y hasta 1/56, observándose títulos de 1/112 o más en diversas infecciones y luego de estimulaciones antigénicas como transfusiones sanguíneas. Tales hechos indican que la evidencia de altos títulos de anticuerpos heterófilos sólo tiene valor presuntivo en el diagnóstico de esta enfermedad.Davidsohn introdujo la adsorción diferencial con extracto de riñón de cobayo (capaz de adsorber los anticuerpos heterófilos no-mononucleosis infecciosa o anticuerpos de Forssman), aumentando así la sensibilidad y especificidad de la prueba y permitiendo confirmar los resultados de la Paul-Bunnell, que por su rapidez y practicidad siguió empleándose como prueba de screening o selección.No obstante, existe cierto porcentaje de pacientes (aproximadamente el 10%) con mononucleosis infecciosa que poseen bajos títulos de anticuerpos heterófilos, razón por la cual los resultados de estas pruebas únicamente son considerados significativos, desde el punto de vista diagnóstico, cuando se relacionan con los datos hematológicos y las manifestaciones clínicas del paciente.

FUNDAMENTOS DEL METODOLos anticuerpos heterófilos asociados a la mononucleosis infecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eritrocitos de caballo, neutralizándose simultáneamente los anticuerpos no asociados a mononucleosis (anticuerpos Forssman) con extracto de riñón de cobayo. La aglutinación se visualiza macroscópicamente.

REACTIVOS PROVISTOSReactivo: suspensión de eritrocitos de caballo y extracto de riñón de cobayo.Control Positivo: dilución de suero positivo, inactivado. Equivalente a 2-3 (+).Control Negativo: dilución de suero negativo, inactivado.

REACTIVO NO PROVISTOSolución fisiológica.

INSTRUCCIONES PARA SU USOReactivo: vaciar la pipeta del gotero y agitar vigorosamente antes de usar, verificando que no queden eritrocitos adheridos al fondo del frasco.Control Positivo: listo para usar.Control Negativo: listo para usar.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso "in vitro".Los controles han sido examinados para HIV y HBV encontrándose no reactivos. No obstante, deben ser empleados como si se tratara de material infectivo.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivo y Controles provistos: estables en refrigerador (2-10°C) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.

MUESTRASueroa) Recolección: obtener suero de la manera usual.b) Aditivos: no se requieren.c) Sustancias interferentes conocidas: se ha descripto un inhibidor termolábil de la reacción que produce resultados falsos negativos. Para eliminar esta interferencia es necesario inactivar el suero. Además, la hemólisis también interfiere. Inactivación: colocar el suero a 56°C durante 15 minutos, inmediatamente antes de usar.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarse en el momento puede conservarse en refrigerador (2-10°C) hasta 48 horas o en congelador durante 3 meses, a partir del momento de su recolección.

MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- Placa de vidrio2- No provisto- Palillo o varilla de vidrio- Cronómetro- Material volumétrico adecuado para efectuar mediciones y diluciones de las muestras

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- Lámpara o fuente de luz horizontal

PROCEDIMIENTOLlevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar.I) PRUEBA CUALITATIVAColocar una gota (50 ul) de Muestra inactivada en uno de los círculos de la placa limpia y seca. Agregar una gota (50 ul) de reactivo homogeneizado. Mezclar con palillo de madera hasta obtener una suspensión uniforme en toda la superficie del círculo. Inmediatamente, disparar un cronómetro y observar microscópicamente el resultado dentro de los dos minutos.Para una correcta visualización de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondo negro y ligeramente por encima de un haz luminoso horizontal (ej.: lámpara de microscopía).

II) PRUEBA CUANTITATIVALos sueros positivos, según la prueba anterior, pueden titularse efectuando diluciones seriadas:1) Colocar en una serie de tubos 200 ul de solución fisiológica.2) Agregar al primer tubo 200 ul de la Muestra inactivada y mezclar. Transferir 200 ul de esta dilución al segundo tubo y mezclar, continuando de esta forma las diluciones hasta el último tubo. Las diluciones así obtenidas equivalen a 1:2; 1:4; 1:8; 1:16, etc.3) Tomar una gota de cada dilución y ensayar según I).

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSNegativo: suspensión homogénea.Positivo: aglutinación que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 (+).Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos heterófilos asociados a la mononucleosis infecciosa. Título: se expresa como la inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente.

METODO DE CONTROL DE CALIDADComo punto de referencia de las reacciones positivas y negativas de Monoslide, es conveniente procesar simultáneamente el Control Positivo y Control Negativo provistos, que se utilizan de la misma manera que la muestra.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.

PERFORMANCESensibilidad: en la técnica original de Davidsohn se emplean eritrocitos frescos (nativos) que dan lugar a reacciones inespecíficas, por lo que la hemaglutinación sólo se considera como reacción positiva para mononucleosis infecciosa en diluciones mayores de 1/14. La sensibilidad de los eritrocitos estabilizados que provee Monoslide ha sido regulada para proporcionar igual reactividad con suero inactivado sin diluir.

PRESENTACIONEquipo para 100 determinaciones (Cód. 1593151).

BIBLIOGRAFIA- Wintrobe, M. M. - "Hematología Clínica" - Pág. 924 (Ed. 1969) - Intermédica.- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Slaby, R. - Am. J. Clin. Path. 49/1:3 (1968).- Lee, C. L.; Davidsohn, I.; Panczyszyn, O. - Am. J. Clin. Path. 49/1:12 (1968).- Sinay, H. S.; Schoen, I.; Miyahira, T. - Am. J. Clin. Path. 50/1:75 (1968).- Hoagland. R. J. - "Infectious mononucleosis" - Ed. 1967 - Grune-Stratton.- Marletta, J.; Cravero, J.; Fay, O.; Rey. J. - Paraná (1977).

Wiener lab.2000 Rosario - ArgentinaElaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1287/77 - 3389/95

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CITOQUIMICA

La citoquímica constituye, en la práctica hematológica, un complemento indispensable del estudio de la morfología mediante la microscopía óptica convencional. Su finalidad es estudiar la presencia de ciertos componentes bioquímicos (enzimas o sustancias diversas) en el interior de las células sanguíneas tanto del pool medular como de células circulantes en sangre periférica.

1) REACCION DE PAS ( HIDRATOS DE CARBONO)

Fundamento

La oxidación por ácido peryódico rompe la unión 1:2 glicol de la glucosa o de un derivado amino o alquilo sustituto. Por este mecanismo da origen a funciones aldehido revelables por el reactivo de Schiff.

Reactivos

1. Solución fijadora: Metanol

2. Solución de ácido peryódico ( conservar en la heladera):

Acido peryódico 1 gH2O 100 ml

3. Reactivo de Schiff ( conservar en heladera y oscuridad)

Fucsina básica 1gMetabisulfito de Na 1,9 gHCl 1 N 4 mlH2O destilada 100 ml

Calentar el agua destilada, agregar la fucsina. Calentar, sin hervir, agitar. Enfriar a 50 C, agregar todas las drogas y agitar. Dejar 24 hs. en heladera, en frasco color caramelo. Decolorar con carbón activado y filtrar. Es conveniente preparalo 3 o 4 días antes de usarlo.

4. Contracoloración

Azul de Metileno 1gH2O destilada 100 ml

Procedimiento

1. Fijar con metanol 10 min.2. Lavar con H2O de la canilla.3. Agregar el ácido peryodico (oxidante) 30 min.4. Lavar con H2O de la canilla.

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5. Cubrir con reactivo de Schiff, durante 60 min.6. Lavar con H2O de la canilla, tres veces.7. Contracolorear con azul de metileno, durante 5 min.8. Lava con H2O de la canilla y dejar secar.

Resultado

Positivo: núcleos verdes, citoplasma rojo brillante.

2. PEROXIDASAS

Fundamento

Método de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la enzima desprenden oxígeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un óxido intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro.

Reactivos

1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad)

Bencidina 300 mgSolución saturada de nitroprusiato de Na 1 mlAlcohol etílico absoluto 99 ml

2. H2O2

H2O2 (30 vol.) 2 gotasH2O destilada 10 ml

Preparar en el momento.

Procedimiento

1. Cubrir con el colorante durante 5 minutos (en esta etapa se fija y se impregna con bencidina).

2. Sin volcar, se agregan 10 gotas de la solución de H2O2 . Dejar 5 min. 3. Lavar con H2O de la canilla.4. Contracolorear con Giemsa 1/10, durante 20 minutos.

Resultados

Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas células que poseen la enzima.

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3. SUDAN BLACK B (LÍPIDOS)

Fundamento

Schaeffer y Fisher, autores del procedimiento, diagnosticaron que el Sudan agota parcialmente su efecto colorante en la peroxidasa del rábano que actúa en forma competitiva respecto de la leucocitaria. Este hecho demostraría que mientras la tinción de grasas comunes obedece simplemente al fenómeno físico de difusión en un mejor solvente, para las grasas leucocitarias se necesitaría el blanco de las peroxidasas sobre el que actuaría el Sudan Black por mecanismo químico.

Reactivos

1. Fijador: formol al 37 %.

2. Solución de Sudan Black B

Sudan Black B 300 mgEtanol absoluto 100 ml

3. Buffer

16 g de fenol en 30 ml de etanol 300 mg de Na2PO4H.12H2O en 100 ml de agua destilada. El buffer se obtiene agregando la solución a) sobre la b).

4. Solución de trabajo (conservar en frío en frasco oscuro): Agregar 4 partes de buffer a 6 partes de solución de Sudan Balck B. Filtrar antes de usar.

Procedimiento

1. Fijar los preparados con vapores de formol durante 5 a 10 minutos (en ambiente cerrado por ejemplo caja de Petri).

2. Lava bien con H2O de la canilla.3. Sumergir (cubrir ) durante 1 hora en la solución de trabajo.4. Lavar con etanol 70% ( 2 lavados ) durantes 5 minutos en total.5. Contracolorear con Hematoxilina o Giemsa (1/10) 10 minutos.6. Enjuagar con H2O.

Resultado

Positivo: citoplasma cubierto de gránulos color negro.

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HEMOSTASIA

1. RECUENTO DE PLAQUETAS (METODO MANUAL)

Fundamento

El recuento de plaquetas se efectúa en sangre obtenida de punción venosa anticoagulada con EDTA, y sometida a hemólisis por acción de una solución hipotónica de oxalato de amonio en agua destilada.

Materiales y reactivos

Tubos plásticos. Cápsula de Petri. Algodón. Anticoagulante EDTA (0,342 mol/L). Diluyente: Oxalato de amonio 1% en agua destilada.

Procedimiento

1. Se obtiene sangre por punción venosa en anticoagulante EDTA (0,342 mol/L), en tubos plásticos.

2. Se homogeiniza bien la muestra y se toman 100 l que se colocan en otro tubo plástico que contenga 1,9 ml de oxalato de amonio 1%.

3. Incubar 10-15 min. para provocar la hemólisis.4. Cargar la cámara de Neubauer con el hemolizado y dejar que sedimenten las

plaquetas en ambiente húmedo: se recomienda colocar la cámara dentro de una cápsula de Petri conteniendo un trozo de algodón humedecido.

5. Incubar 10-15 min en atmósfera húmeda.6. Efectuar el recuento en microscopio en el reticulado central de la cámara (dividido

en 400 cuadrados pequeños comprendidos en 1 mm2). El recuento de plaquetas se realiza en el cuadrado central (al igual que el recuento de hematíes), se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadraditos, como se muestra a continuación (Fig. 4).

Figura 4. Recuadro central

La superficie de este cuadrado central es de 1 mm2 y la cámara tiene una profundidad de 0,1 mm.

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7. Contar los 4 cuadrados de los extremos y el cuadrado central (por ende, serán 5 cuadrados con 16 cuadraditos c/u, o sea 80 cuadraditos).

8. Cálculo: sumar las plaquetas contadas en los 5 cuadrados y multiplicar por 1000 para obtener el número de plaquetas por mm3. El factor 1000 surge del producto:

20 x 400= 1000/mm3

80 x 0,1 mm3

Donde 20 es el factor de dilución, 400 son los cuadraditos totales y 80 los cuadraditos contados. El volumen total del cuadrante es de 0,1 mm3.

Observaciones

Actualmente, en muchos laboratorios, los recuentos de plaquetas se realizan en forma automatizada en contadores hematológicos o en contadores específicos, habiéndose logrado un alto nivel de precisión (incluso en trombocitopenias). El recuento manual suele efectuarse para la comprobación de la cifra de plaquetas en trombocitopenias muy graves y en el caso de plaquetas gigantes en las que el recuento automático no es fiable.

2. TIEMPO DE SANGRIA

2.1 METODO DE IVY

Fundamento

Esta prueba valora la capacidad hemostática global in vivo y consiste en medir el tiempo transcurrido desde la realización de una pequeña incisión cutánea hasta que cesa la hemorragia. La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tapón hemostático eficaz y, por ende, representa una valoración global y simultánea de la función plaquetaria (número, adhesión, agregación y degranulación plaquetaria) y de la función vascular. Respecto al factor vascular, la prueba depende de la integridad de la pared vascular y de su capacidad constrictora.

El método original del corte en el lóbulo de la oreja, introducido por Duke en 1910, es poco sensible y menos reproducible, por lo que no es aconsejable continuar utilizándolo hoy en día. En 1935, Ivy introdujo la aplicación de un manguito de presión en el brazo y la práctica de la incisión en la cara anterior del antebrazo. Este método, con la modificación introducida por Borchgrevink, que sustituye la punción con lanceta por un corte realizado con hoja de bisturí, ha demostrado una alta sensibilidad. Por último, la introducción de plantillas o dispositivos automáticos para la realización de la incisión ha venido a uniformar y aumentar la reproducibilidad.

Materiales y reactivos

Dispositivos automáticos para la realización de la incisión: Simplate y Simplate II (Organon Teknika) y Surgicutt (Ortho Diagnostics).

Cronómetro.

Procedimiento

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1. Es aconsejable colocar un esfigmomanómetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mm de Hg, manteniéndolo a esta presión a lo largo de toda la prueba.

2. Se extrae el dispositivo automático de su reservorio estéril y se sitúa en la parte superior de la cara anterior del antebrazo (previamente desinfectada), en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, a unos 3 cm por debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo.

3. Se presiona el disparador del dispositivo y al mismo tiempo se pone en marcha el cronómetro (el corte tendrá un largo y profundidad predeterminados: 1 cm x 1 mm).

4. La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión, anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba. Cuando el tiempo se alarga más de 20 minutos puede detenerse la prueba aplicando una compresa con material hemostático.

Valores de referencia

Hasta 6-8 minutos. Los tiempos superiores a 10 minutos son claramente patológicos.

2.2 METODO DE DUKE

Fundamento

El método original de Duke es, como dijimos antes, poco sensible y menos reproducible, pero se continua aplicando.

Procedimiento

1. Se practica una incisión de 2 mm de longitud en el lóbulo de la oreja utilizando una lanceta con tope, descartable.

2. La sangre que brota espontáneamente se va secando cada 30 segundos, sin tocar la incisión, anotándose el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba.

Valores de referencia

Inferior a 5 minutos.

Interpretación de resultados

La prueba se prolonga por reducción del número de plaquetas o por alteraciones funcionales plaquetarias o plasmáticas (enfermedad de von Willebrand) relacionadas con los procesos de adhesión, agregación o degranulación plaquetarias.

Está alterado en trombocitopenias, trombopatías, trombastenias y déficit de fibrinógeno. Se observan tiempos prolongados en uremias, mielomas, macroglobulinemias y después de la ingesta de ácido acetilsalicílico.

En la enfermedad de von Willebrand generalmente es alargado, pero si es normal no invalida el diagnóstico de dicha enfermedad.

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3. TIEMPO DE COAGULACION

Fundamento

El tiempo de coagulación de sangre total es una de las pruebas llamadas globales y abarca la activación intrínseca de la protrombina y el fibrinógeno.

La sangre, al ser extraída sin mayor contaminación con tromboplastina tisular, es capaz de coagular cuando se la deposita en un tubo de vidrio. El tiempo que tarda este proceso está en relación con el sistema de procoagulantes e inhibidores fisiológicos o adquiridos, que influyen en la formación de dicho coágulo.

Este tiempo de coagulación in vitro reflejará mejor la eficacia del sistema in vivo, cuanto menos se modifique esta sangre (contacto con el vidrio, burbujas de aire, detergentes, etc.).

Materiales y reactivos

Tubos de vidrio, perfectamente limpios.Baño a 37C.Cronómetro.

Procedimiento

1. Obtener 3 ml de sangre por punción venosa, de primera intención y con jeringa plástica.

2. Disparar el cronómetro en el instante en que la sangre venosa se introduce en la jeringa.

3. Desconectar la aguja y vaciar ordenadamente 1 ml de sangre en el primero de los tres tubos de vidrio perfectamente limpios, previamente colocados en gradilla de baño a 37C.

4. Inclinar el primer tubo cada 30 seg. por la misma cara hasta que la sangre se coagule (deja de escurrirse por las paredes del tubo).

5. De inmediato, inclinar el segundo tubo hasta que se coagule; luego, proceder de la misma forma con el tercer tubo.

6. Se toma como tiempo de coagulación el valor obtenido en el tercer tubo.

Interpretación de resultados

Valores de referencia a 37C: 7-15 min.

El rango normal debe establecerse en cada laboratorio, con un grupo suficiente de controles (20 como mínimo). Conviene repetir un paciente normal semanalmente, para determinar cualquier variabilidad de los valores previamente obtenidos.

Se considera alargado un tiempo de coagulación que difiere en más de 2 min del límite superior del rango normal, establecido en cada laboratorio (media + 2 SD).

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Se trata de un método poco sensible, pues se prolonga sólo en aquellos casos de déficit graves. Un tiempo de coagulación normal no descarta la existencia de un trastorno de la coagulación, pero un tiempo prolongado es siempre índice de un defecto severo de la misma, que puede deberse a una deficiencia de cualquiera de los factores que intervienen en la formación del coágulo de fibrina, con excepción de una deficiencia pura de los factores VII y XIII; pero el método es mucho más sensible a los defectos de los factores que intervienen en la activación por contacto y en la formación del activador intrínseco de la protrombina.

4. RETRACCION DEL COAGULO

Fundamento

La retracción del coágulo depende de la actividad trombodinámica de las plaquetas, por lo que se require un número mínimo de plaquetas normales y adecuados niveles de Ca++.

Procedimiento

1. Los tres tubos utilizados para determinar el tiempo de coagulación deben dejarse en baño a 37C durante por lo menos 3 Hs. Al cabo de este tiempo, observaremos la mejor retracción de los tres tubos, graduando de acuerdo a la magnitud de la retracción por apreciación visual del tamaño del coágulo retraído y el suero libre en:

a) Normal o completab) Incompletac) No retraed) Hiperretráctil

Interpretación de resultados

Esta prueba depende del número de plaquetas, su actividad funcional y de la concentración de fibrinógeno, aunque no se relacione muy bien con el número de plaquetas (en ciertas condiciones da normal aún con 30.000/mm3). Un aumento importante de fibrinógeno reducirá la retracción por efecto de volumen, mientras que lo opuesto ocurre en casos de hipofibrinogenemia.

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En la trombastenia de Glanzman (alteración funcional) se observan retracciones incompletas o nulas.

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DETERMINACION DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

APTTestReactivos para la determinación del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada

SIGNIFICACION CLINICAEl tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidotes de la coagulación.Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, o sea los factores VIII, IX, XI y XII.También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno, no siendo así con los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares.La rapidez, sencillez y reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos.

FUNDAMENTOS DEL METODOEl ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado en un baño a 37 oC y en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio.

REACTIVOS PROVISTOSReactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado.Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0,025 mol/l.

REACTIVOS NO PROVISTOSAgua bidestilada o desionizada.

INSTRUCCIONES PARA SU USOCloruro de Calcio: listo para usar.Reactivo APTT, preparación:- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase.- Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor a 37oC.- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.

PRECAUCIONESLos reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Reactivo APTT: una vez reconstituido es estable durante 14 días en refrigerador o 30 días congelado (-20oC). El congelado y descongelado sólo puede realizarse una vez. Por esto se recomienda dividirlo en porciones, de acuerdo a las necesidades de trabajo.

MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de Anticoagulante TP de Wiener lab.). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. Es recomendable efectuar la extracción con jeringas plásticas.b) Aditivos: para obtener el plasma debe emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.c) Sustancias interferentes conocidas:- Las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados.- No debe emplearse EDTA o heparina para obtener plasma. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20oC. Este procedimiento al igual que el descongelado debe realizarse con rapidez (sumergiendo en baño a 37 oC) previo a la determinación. La muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis en tubos plásticos para minimizar los efectos de activación por contacto que pueden ocurrir con los tubos de vidrio.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Tubos de hemólisis.- Pipetas y micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa, para la observación del coágulo.

PROCEDIMIENTOPrecalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37oC.

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En un tubo de hemólisis colocar:Muestra (plasma desconocido o control) 100 ulReactivo APTT (homogeneizado) 100 ulMezclar e incubar de 3 a 5 minutos a 37oC, luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ulDisparar simultáneamente un cronómetro. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido, mantener en el baño unos 25 segundos. Luego sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo. Tomar nota del tiempo de coagulación.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLos resultados pueden expresarse de distinta forma:1) Como tiempo de tromboplastina parcial activada en segundos.2) Como relación entre el tiempo obtenido con el desconocido y el de un plasma control.

METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal - patológico.

VALORES DE REFERENCIAEl intervalo de valores observados en individuos normalesoscila entre 33-48 segundos.Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma control.Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacione los valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma, haciendo constar estos resultados en el informe.

CURVA DE CALIBRACIONEste método es útil como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante.La técnica empleada es la siguiente:1) Preparar una Solución de Trabajo de heparina en solución fisiológica cuya concentración sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.2) Preparar diluciones de esta Solución de Trabajo utilizando un pool de plasmas frescos normales o Plasma Control normal como diluyente. Se deberán obtener diluciones de 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; y 0,1 Unidades/ml.3) Determinar el tiempo de tromboplastina parcial para cada una de estas soluciones así como para el pool de plasmas y graficar en papel semilogarítmico APTT vs. Concentración de heparina.El valor obtenido para el paciente debe correlacionarse con los valores de la gráfica, para obtener la concentración actual de heparina circulante.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas y Estabilidad e instrucciones de almacenamiento en MUESTRA.El mecanismo de la coagulación involucra una serie de reacciones enzimáticas que pueden ser influenciadas por toda condición que afecte a los sistemas enzimáticos en general, razón por la cual se deben observar las mismas precauciones metodológicas.Debe tenerse en cuenta que variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los tiempos de tromboplastina parcial activada, por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.

PERFORMANCEReproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes resultados:

Nivel D.S. C.V.45 seg62 seg

+1,1 seg+1,8 seg

2,5%3,0%

PRESENTACIONEquipo para 150 determinaciones (6 x 2,5 ml) (Cód. 1705002).

BIBLIOGRAFIA- Bell, W.N.; Alton, H.G. - Nature 174:880 (1954).- Dacie, J.B.; Lewis, S.M. - Hematología Práctica – Ediciones Toray, 2º Edición (1970).- Wintrobe, M.M. - Hematología Clínica 3ª Edición Intermédica (1969).- Bragos, I; Rodríguez Pécora, S; Lorenzo, L; Capriotti, G. -“Evaluación de un nuevo Reactivo de Tiempo Parcial deTromboplastina Activada” - 53º Triduo Bioquímico Científico Anual; Bahía Blanca (1988).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.2000 Rosario - ArgentinaElaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. Cétola. Bioquímica. Producto Inscripto M.S. Disp. Nº: 1611/89 - 5184/98

DETERMINACION DEL TIEMPO DE PROTROMBINAO TIEMPO DE QUICK EN UNA ETAPA

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SoluplastinTromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo

de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa

SIGNIFICACION CLINICAEl fenómeno de la coagulación puede desencadenarse por una “vía extrínseca” (lesión tisular) o por una “vía intrínseca” contacto de la sangre con epitelios distintos del vascular normal). La determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca, siendo sensible a: factor II o protrombina, factor V o proacelerina, factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower.Por lo tanto la determinación se aplica a:- estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos;- detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca;- control de la terapéutica con anticoagulantes orales.

FUNDAMENTOS DEL METODOEste ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, colocado a 37oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII).

REACTIVO PROVISTOSoluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo, cloruro de calcio para una concentración final de 0,0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0,1 mol/l.

REACTIVO NO PROVISTOAgua bidestilada o deionizada.

INSTRUCCIONES PARA SU USO- Abrir un vial quitando el precinto metálico y retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material.- Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el envase. Verificar que la temperatura del agua empleada no sea mayor de 37oC.- Tapar y agitar suavemente hasta obtener una suspensión homogénea. Volver a homogeneizar cada vez que se emplee.

PRECAUCIONESEl reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOSoluplastin provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Soluplastin reconstituido: en refrigerador (2-10oC), es estable 5 días a partir del momento de su reconstitución.

MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab., se requerirán 7 gotas para 4,5 ml de sangre). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 0,130 mol/l.c) Sustancias interferentes conocidas:- las contaminaciones, visibles o no, son causa de tiempos falsamente prolongados;- la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados; - hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados.Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:el plasma debe mantenerse en el refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuar el ensayo. En caso de no procesarse dentro de las 4 horas contadas desde la obtención, la muestra se debe congelar (a -20oC); de tal forma, puede conservarse durante un mes. Este último procedimiento debe ser realizado con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37 oC) previo a la determinación.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)- Tubos de hemólisis.- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa para la observación del coágulo.

PROCEDIMIENTO1- Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).2- En un tubo de hemólisis, colocar 0,2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).3- Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0,2 ml de Soluplastin, disparando simultáneamente el cronómetro.

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4- Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. Previo al tiempo estimado de coagulación, sacar el tubo del baño, inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo.5- Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada plasma (desconocido o control). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%, se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. En caso de emplear un instrumento de medición, deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSLos resultados pueden expresarse de distintas formas:1- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en segundos.2- Porcentaje de Actividad Protrombínica respecto de un plasma normal (100% de actividad): para ello se debe trazar la curva de actividad protrombínica de un pool de plasmas frescos normales.Curva de calibraciónEn tubos de hemólisis, preparar 5 diluciones (cada una por duplicado) de un pool de por lo menos 3 plasmas normales o Plasma Control normal, según:

Diluciones 1:1 1:2 1:3 1:4 1:8Porcentaje de actividad (%) 100 50 33,3 25 12,5Pool plasmas normales (ml) 0,5 0,3 0,3 0,2 0,2Solución fisiológica - 0,3 0,6 0,6 1,4

Determinar el Tiempo de Protrombina para cada dilución, empleando el PROCEDIMIENTO descripto. En un papel milimetrado, graficar los resultados en un sistema de coordenadas. Colocar los Tiempos de Protrombina en segundos sobre el eje de las ordenadas y los Porcentajes de Actividad Protrombínica en el eje de las abscisas. Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibración, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos.

3- Razón Internacional Normatizada (R.I.N.)Para su cálculo, deberá emplearse la tabla de valores adjunta al equipo.

METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal - patológico.

VALORES DE REFERENCIAEl rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila entre:- Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 - 14 seg- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 - 100%Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia. Para pacientes bajo tratamiento con antivitaminas K se ha establecido un rango terapéutico que se puede expresar como:- Porcentaje de Actividad Protrombínica: 25 - 35%

- R.I.N.: 2,4 - 2,5-

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOVer Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.Otras causas de resultados erróneos son:- Extracción defectuosa de sangre venosa.- Las variaciones en la relación anticoagulante/muestra o en la concentración de citrato utilizada afectan los Tiempos de Quick por lo que se recomienda controlar la dosis de anticoagulante empleada al tomar la muestra.- La preincubación en el 2o paso del PROCEDIMIENTO no debe exceder los 10 minutos indicados como límite máximo. Por otra parte, es conveniente que el reactivo reconstituido se retire del refrigerador inmediatamente antes de iniciar la prueba y vuelva a guardarse al finalizarla, ya que la exposición por varias horas a temperatura ambiente en forma reiterada, deteriora el reactivo produciendo el alargamiento de los tiempos de protrombina.

PERFORMANCEa) Reproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día, se obtuvieron los siguientes datos:

X (n=20 D.S. C.V.11,5 seg +0,4 seg 3,5%21,2 seg +0,6 seg 2,8%

b) Comparación con método de referencia: procesando distintas muestras con Soluplastin y con otro método tomado como referencia, se observa:

Reactivo X (n=60) D.S. C.V.Soluplastin 13,2 seg +0,3 seg 2,3%Referencia 12,8 seg +0,3 seg 2,3%

PRESENTACION- Equipo para 100 determinaciones (10 x 2 ml) (Cód. 1705001).- Equipo para 10 x 20 determinaciones (10 x 4 ml) (Cód. 1705005).- Equipo para 320 determinaciones (8 x 8 ml) (Cód. 1705003).

BIBLIOGRAFIA

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- Quick, A.J. - “Fisiología y Patología de la Hemostasis” - Ed. El Ateneo, Buenos Aires (1952).- Araldi, H.T., et al. - “Primer Reactivo Nacional Argentino de Referencia de Tromboplastina de Cerebro Humano” – Acta Bioquím. Clín. Latinoam. XVI/1:131 (1982).- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 28: Normalización de la Vigilancia del Tratamiento Anticoagulante (oral) - Serv. Inf. Tec. Nº 610:49-56 (1977).- Comité de Expertos de la O.M.S. en Patrones Biológicos - Inf. Nº 31: Requerimientos para Tromboplastinas y Plasmas usados en la terapia anticoagulante oral - Serv. Inf. Téc. Nº 658:202-223 (1981).- Suñer Casadevall, F. - “Nuevas Normas Internacionales para la Expresión del Tiempo de Quick” - Análisis Clínicos X/40:240-245 (1985).- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.2000 Rosario - ArgentinaElaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 1589/89 - 255/99

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DETERMINACIÓN DE FIBRINÓGENO

FibrinógenoReactivo para la determinación de fibrinógeno plasmático

SIGNIFICACION CLINICAEl fibrinógeno es una glicoproteína que se halla presente en el plasma y en los gránulos plaquetarios . Es el factor de la coagulación que se encuentra en mayor concentración plasmática (200-500 mg/dl).Cuando se produce un trauma o injuria vascular, la trombita formada escinde al fibrinógeno convirtiéndolo en monómeros de fibrina que polimerizan espontáneamente y luego son estabilizados dando lugar a la malla insoluble de fibrina. Niveles bajos de fibrinógeno pueden encontrarse en desórdenes hereditarios tales como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia, y también en otras circunstancias como enfermedad hepática, coagulación intravascular diseminada, síndromes fibrinolíticos, etc.Niveles elevados pueden encontrarse en diabetes, enfermedad inflamatoria, etc.Actualmente se ha reconocido que niveles altos de fibrinógeno aumentan el riesgo a padecer enfermedad cardiovascular.

FUNDAMENTOS DEL METODOEl ensayo se basa en el método de Clauss, designado como procedimiento de referencia por el NCCLS (Nacional Committee for Clinical Laboratory Standards). Cuando un exceso de trombina se adiciona a un plasma diluido, el tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno plasmático. El tiempo de coagulación obtenido se compara posteriormente con una preparación de fibrinógeno estandarizada.

REACTIVOS PROVISTOSTrombina: viales conteniendo trombina liofilizada. Una vez reconstituida equivale aproximadamente a 100 Unidades NIH de trombina/ml.Buffer Imidazol: solución de imidazol 0,05 M, pH 7,3.Plasma Referencia: vial conteniendo plasma liofilizado. Ver el valor de fibrinógeno asignado en el rótulo.

REACTIVO NO PROVISTOAgua bidestilada o desionizada.

INSTRUCCIONES PARA SU USOTrombina y Plasma Referencia: quitar el precinto metálico y abrir el vial retirando lentamente el tapón de goma para evitar pérdidas del material. Agregar el volumen de agua bidestilada o desionizada indicado en el rótulo. Tapar, dejar reposar 30 minutos y luego mezclar suavemente (sin agitar) hasta obtener disolución completa antes de su uso. Fechar. Se recomienda mantener el reactivo Trombina en el frasco original luego de su reconstitución y durante su uso. Buffer Imidazol: listo para usar. Evitar su contaminación. Mantener en su frasco original bien cerrado.

PRECAUCIONESLos Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". Este producto ha sido preparado a partir de plasmas humanos, los cuales han sido ensayados utilizando los métodos bajo licencia de la FDA. No se ha encontrado reactividad para HBsAg, HCV y HIV. Pero dado que ningún método de ensayo puede asegurar la ausencia absoluta de agentes infecciosos, los plasmas referencia, controles y muestras de pacientes deben manejarse como si se tratara de material potencialmente infeccioso.

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTOReactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.Trombina reconstituida: estable 5 días refrigerada (2-10oC) o 30 días congelada (-20oC). Para descongelarla, hacerlo rápidamente a 37oC. No volver a congelar. Llevar a temperatura ambiente el reactivo antes de volver a usarlo. Evitar calentamientos prolongados.Plasma Referencia reconstituido: estable durante 8 horas refrigerado (2-10oC).

MUESTRAPlasmaa) Recolección: obtener sangre cuidadosamente, evitando estasis o espuma, y colocarla en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 (ejemplo: 4,5 ml de sangre + 0,5 ml de anticoagulante). Mezclar suavemente. Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos. La extracción se debe efectuar con jeringas plásticas.b) Aditivos: para obtener el plasma puede emplearse Anticoagulante TP de Wiener lab. o citrato de sodio 3,8% o 3,2%. No debe emplearse EDTA o heparina.c) Sustancias interferentes conocidas:- Las muestras ictéricas, lipémicas o hemolizadas pueden dar resultados erróneos.- Niveles elevados de productos de degradación de fibrinógeno o fibrina pueden alargar los tiempos de coagulación especialmente cuando los niveles de fibrinógeno son menores a 150 mg/dl.- Niveles terapéuticos de heparina no interfieren con el ensayo, pero niveles elevados pueden conducir a resultados falsamente disminuidos.Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe conservarse hasta el momento de su análisis en tubos plásticos para minimizar el efecto de activación por contacto que puede ocurrir con los tubos de vidrio. El plasma debe mantenerse en refrigerador (2-10oC) hasta el momento de efectuarse la prueba. Este período no debe prolongarse más de 4 horas. En caso de no poder procesarse en este lapso, el plasma debe congelarse a -20 oC. Este último proceso debe realizarse con rapidez, al igual que el descongelamiento (sumergiendo en baño a 37oC) previo a la determinación.

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MATERIAL REQUERIDO1- Provisto- Hoja de papel doble logarítmico.2- No provisto- Tubos de hemólisis.- Tubos plásticos para preparar las soluciones.- Pipetas y micropipetas para medir los volúmenes indicados.- Baño de agua a 37oC.- Cronómetro.- Fuente luminosa para la observación del coágulo.PROCEDIMIENTOI- CURVA DE CALIBRACION1- Preparar diluciones del Plasma Referencia fibrinógeno 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30, empleando 0,1 ml del Plasma Referencia reconstituido y 0,4; 0,9; 1,4; 1,9 y 2,9 ml de Buffer Imidazol respectivamente. El plasma diluido 1:10 representa el 100% del valor asignado en el envase.2- Precalentar 0,2 ml de cada dilución a 37oC durante 2 minutos.3- Disparar el cronómetro con el agregado de 0,1 ml de Trombina reconstituida (no precalentar el reactivo de Trombina) a las diluciones preincubadas y registrar el tiempo de formación del coágulo.4- Calcular el tiempo promedio de coagulación para cada dilución, por duplicado.5- Construir la curva de calibración de fibrinógeno representando los tiempos de coagulación en función de la concentración de fibrinógeno, sobre el papel log-log. Unir a través de una recta la mayoría de los puntos representados. La recta final debe contener por lo menos 3 puntos consecutivos.

Dilución Búfer Plasma Ref.Concentración fibrinógeno*

Factor dilución

1:51:101:151:201:30

0,80,91,41,92,9

0,20,10,10,10,1

----mg/dl----mg/dl----mg/dl----mg/dl----mg/dl

x 2 =x 1 =

x 0,67 =x 0,5 =x 0,33 =

* concentración de fibrinógeno indicada en el rótulo del Plasma Referencia

El valor de fibrinógeno de cada dilución de la curva se determina multiplicando la concentración de fibrinógeno en el Plasma Referencia por el factor de dilución. Por ejemplo, si en el Plasma Referencia se indica un nivel de fibrinógeno de 260 mg/dl, entonces las diluciones 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 y 1:30 tienen 520, 260, 173, 130 y 87 mg/dl respectivamente.

II- MUESTRAS DE PACIENTES Y CONTROLES1- Preparar diluciones 1:10 de los plasmas de pacientes o plasmas controles en Buffer Imidazol. 2- Precalentar 0,2 ml de cada dilución a 37oC durante 2 minutos.3- Rápidamente adicionar 0,1 ml de Trombina y registrar el tiempo de formación del coágulo.4- Repetir la determinación y promediar el resultado para cada muestra.

CALCULO DE LOS RESULTADOSConocido el tiempo de coagulación del paciente o del control, ingresar este valor a la curva standard e interpolar el valor de fibrinógeno en cada caso.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOSSi el tiempo de coagulación para la muestra es demasiado corto (por ejemplo, menor a 7 segundos) diluir el plasma 1:20 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 2.Si el tiempo de coagulación para la muestra es demasiado largo (por ejemplo, mayor a 35 segundos) diluir el plasma 1:5 con Buffer Imidazol y volver a ensayar. Multiplicar el resultado por 0,5.

METODO DE CONTROL DE CALIDADPlasma Control normal/patológico.

VALORES DE REFERENCIAEl intervalo de valores observados en pacientes normales oscila entre 200 - 400 mg/dl.En general se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos de referencia, dentro de su población de pacientes.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- Se deberá realizar una curva de calibración nueva con cada cambio de lote de reactivo o cualquier cambio de instrumento.- Fallas en la reconstitución de los reactivos pueden ser causa de resultados erróneos.- Recolección de muestra: las muestras y sus diluciones deberán colocarse en tubos de plástico o de vidrio siliconado. Es importante respetar la relación de anticoagulante y sangre como también la concentración de citrato utilizada.- Debe controlarse que el ensayo se realice a 37oC y que los tubos de trabajo estén absolutamente limpios.

PERFORMANCEReproducibilidad: procesando replicados de las mismas muestras en un mismo día se obtuvieron los siguientes resultados:

Nivel D.S. C.V.

12,1 seg20,4 seg

+0,3 seg+0,6 seg

2,7%3,2%

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS

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El reactivo Fibrinógeno se puede usar en forma manual y con métodos de detección mecánicos y foto-ópticos. Para instrumentos semiautomáticos y automáticos se recomienda seguir las instrucciones del aparato.

PRESENTACIONEquipo para 100 determinaciones (Cód. 1705006) conteniendo:- Trombina: 10 x 1 ml- Plasma Referencia: 1 x 1 ml- Buffer Imidazol: 2 x 60 ml

BIBLIOGRAFIA- Clauss, A. - Acta Haematol. 17:237, 1957.- Koepke, J.A. - Am. J. Clin. Pathol. 63:984, 1975.- Collet, J.P. - Blood 82/8:2462, 1993.- Ernest, E. - Ann. Intern. Med. 118/12:956, 1993.- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.

Wiener lab.2000 Rosario - ArgentinaElaborado por:Wiener Laboratorios S.A.I.C.Riobamba 29442000 - Rosario - Argentinahttp://www.wiener-lab.com.arDir. Téc.: Viviana E. CétolaBioquímicaProducto Inscripto M.S.Disp. Nº: 5585/98Cert. Nº: 2925/98

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