HPLC 6 10/96 1

ANÁLISISCUALITATIVO vs. CUANTITATIVO

1. CUALITATIVO - ¿qué está presente?

• Cromatografía - compare tR 's

• Espectroscopía - MS, IR, UV

2. CUANTITATIVO - ¿Cuánto está presente?

• Altura de pico

• Área de pico

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Cafeína

TeofilinaTeobromina

"X"

1. Estándar

2. Desconocido

tR(theophylline) = tR(“X”), entonces, se sugiere que “X” es teofilina.Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS

ANÁLISIS CUALITATIVO

HPLC 6 10/96 3

HPLC 5 10/96 34

ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas

Sistema de datos

Espectro de masasMuestra concentrada

AlVacío

Solvente

Muestra

Efluente LC

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EXACTITUD-META ANALÍTICA• Error absoluto:

Diferencia entre valor medido y el valor verdadero.

• Error relativo (%) :(Error / Valor Verdadero) x 100 = % Error

• Ejemplo:Peso verdadero 50.0 gPeso medido 48.0 gError absoluto 2.0 g% Error ( 2 / 50 ) x 100 = 4 %

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PRECISIÓN1. Mide reproducibilidad

2. Depende de la técnica

HPLC 6 10/96 6

MEDIDA DE LA PRECISIÓN:DESVIACIÓN ESTÁNDAR

S.D. x x

2

n 1

RSD S.D.

x 100Desviación estándar relativa =

Chemist X Chemist YData Statistics Data Statistics10.0 n = 5 10.2 n = 512.0 = 10.0 10.6 = 10.0 9.0 = 1.58 9.8 = 0.4811.0 RSD = 15.8% 10.1 RSD = 4.8% 8.0 9.3

x x

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COMPONENTES DE EXACTITUD

CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD

1. Esencial calibración con estándares

2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para un procedimiento analítico exacto

HPLC 6 10/96 8

PROCESO CUANTITATIVO HPLC1. Muestreo

2. Preparación de la muestra

3. Cromatografía

4. Integración

5. Cálculos

HPLC 6 10/96 9

1. Objetivo – tomar una pequeña muestra representativa de una población grande

2. Problemas

• Contaminación

• La muestra no es representativa

MUESTREO

HPLC 6 10/96 10

PREPARACIÓN DE MUESTRA

MolerDisolver Filtrar Extraer

Diluir Concentrar Derivatizar

2. Problemas•Pérdida de muestra•Contaminación

1. Procedimiento

HPLC 6 10/96 11

CROMATOGRAFÍA

Macintosh

Reservorio de solventes

Bomba

Medidor de presión

Inyector

ColumnaDetector

Desecho

Registrador

Sistema dedatos o integrador

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CONVERSIÓN DIGITAL–ALTURA DE PICO

hh

h

D

A

B

C

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INTEGRACIÓN – ÁREA DE PICO

Area

Más difícil que medir altura de pico, pero está menos influenciado por cambios en la temperatura de la columna o el flujo.

HPLC 6 10/96 14

INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO

DETECTOR A / DCONVERTIDOR

MICROPROCESADOR IMPRESORA

REGISTRADOR CINTA

sjhd kahd kjhd kjhd kjhd kjhsd kjhsd kjhs kjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs aljd lkjsd lkjsd lkjsd lkjs dljad ljadlj sljd aljd lkjsd iou fijgf oujfjd iuzdshda,adh fiehkjhd audddehfjsiu dSj.jfldu oejalkjd lkjs dlkj djs 2163216 321 6312

HPLC 6 10/96 15

SISTEMAS DE DATOS

INTEGRADOR. Fácil de usar

. Precio moderado

COMPUTADORA . Flexible/poderosa

. Más caras

1.235

1.235

1.235

1.235

1.235

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VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES1. Sensibilidad

2. Intervalo dinámico3. Exactitud/precisión

4. Corrección de línea base5. Identificación de pico (Computadora)

6. Automatización total (Computadora)

• Programación de temperatura

• Integra, cuantifica

• Auto-calibra

• Introducción de la muestra

• Registro impreso

• Regeneración de la columna

• Repetición del programa

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LIMITACIONES DE INTEGRADORES

1. Costo de capital

2. Se requiere entrenamiento

3. Picos no resueltos - bajaexactitud

4. Sobreconfianza

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CÁLCULOS:NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE

1. Cálculos

2. Procedimiento usualmente no válido• Asume que todos los picos responden igual• Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra

Área = 150A 300

B 600C

wgt %A Area A

Total Area100

150150 300 600

100 14.3%

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CÁLCULOS: FACTOR DE RESPUESTA

A

B

C

Peso = 10 g 10 g 10 g

Área = 150 300 600

Los factores de respuesta difieren

HPLC 6 10/96 20

CÁLCULOS DEL FACTOR DE RESPUESTA

Área (Cuentas)

300

200

100

Peso (g)

CB

AA

5 10

W FR Cuentas de área [g]B. 30

A. 15

C. 60

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CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON CORRECCIÓN DE ÁREA

Area RF Corrected AreaA 150 15 10B 300 30 10C 600 60 10

wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3%

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CÁLCULOS:ESTÁNDAR EXTERNO

Área

Peso (g)

Desconocido

1. Desarrolla una curva de calibración con estándares, y compara con el desconocido

2. Requiere de una inyección reproducible

3. Es más empleado en LC que en GC

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SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO

Requisitos:1. Estándar puro2 Picos bien resueltos3. Nunca presente en la

muestra4. En el mismo nivel de

concentración

Muestra sola

Muestra + ISTD

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CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (1)

1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de interés.

2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos, graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de analito y estándar interno.

IS = EST. INTERNOA = ANALITO A

AA

IS IS IS

Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

Muestra 1Muestra 2Muestra 3

Área A / Área IS

Peso A / Peso IS

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CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (2)

Desconocido X

1. Añada con precisión el IS a la muestra desconocida2. Cromatografíe la mezcla3. Calcule la relación de áreas4. Determine la relación de pesos de la curva de

calibración5. Encuentre el peso del analito

Peso A / Peso IS

Área A / Área IS

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ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC

Component TrueWeight %

MeasuredWeight %

RelativeError (%)

Et Paraben 11.66 11.54 1.0Pr Paraben 16.94 16.91 0.2Bu Paraben 33.14 33.17 0.1