ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJO DINÁMICO DE LA PRODUCCIÓN DE ...ºdez.2016.pdf · Q.F. M.Sc. Ph.D....

ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJO

DINÁMICO DE LA PRODUCCIÓN DE

1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE

Clostridium sp

Luis Miguel Serrano Bermúdez, Ing. Qco, M.Sc.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Doctorado en Biotecnología

Bogotá, Colombia

2016

ANÁLISIS DE BALANCE DE FLUJO

DINÁMICO DE LA PRODUCCIÓN DE

1,3-PROPANODIOL A PARTIR DE

Clostridium sp

Luis Miguel Serrano Bermúdez, Ing. Qco, M.Sc.

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:

Doctor en Biotecnología

Directora:

Q.F. M.Sc. Ph.D. Dolly Montoya Castaño

Codirector:

I.Q. M.Sc. Ph.D. Andrés Fernando González Barrios

Línea de Investigación:

Microorganismos solventogénicos

Grupo de Investigación:

Bioprocesos y Bioprospeccion

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Doctorado en Biotecnología

Bogotá, Colombia

2016

A mis papás,

quienes con su ejemplo me enseñaron que la

constancia y dedicación permiten alcanzar

cualquier meta.

Gracias

Agradecimientos

A mis papás Miguel Serrano y Olivella Bermúdez por su apoyo incondicional, ya que sin ellos

nada de esto hubiera sido posible.

A mis seres queridos que han estado siempre ahí para ofrecer su apoyo, en especial mis hermanos

Paula y Oscar, mi abuela Nancy, mi tío Fernando, mi prima Sandra, y en especial a Karen. Los

quiero a todos.

A los profesores Dolly Montoya Castaño de la Universidad Nacional y Andrés González Barrios

de la Universidad de los Andes por la acertada dirección durante el desarrollo de este proyecto.

A la Universidad Nacional de Colombia, al Instituto de Biotecnología y al doctorado

interfacultades de Biotecnología en cabeza de la profesora Sonia Ospina, por mi formación como

Doctor en Biotecnología. También a Raquel Noguera por su ayuda durante el doctorado.

A los profesores Carlos Martínez y Rigoberto Ríos por sus valiosos aportes y sugerencias durante

los comités tutoriales.

A los integrantes de los grupos de investigación de Microorganismos Solventogénicos de la

Universidad Nacional y Diseño de Productos y Procesos de la Universidad de los Andes por sus

constantes aportes y acertadas observaciones, en especial Mauricio Bernal, Oscar Aragón, Juan

Pablo Rosas, Natalia Comba y el profesor Gustavo Buitrago de Microorganismos Solventogénicos,

y Carolina Clavijo, Camilo Mora y Sergio Triana de Diseño de Productos y Procesos.

Al Dr. Costas Maranas y a Pennsylvania State University de Estados Unidos por permitirme

realizar mi pasantía en el grupo de investigación Chemical & Biological Systems Optimization

Lab. Así mismo, a Anupam Chowdhury, Chiam Yu Ng, Ratul Chowdhury, Satyakam Dash y Jing

Yi Cai, quienes hicieron de la pasantía una experiencia enriquecedora.

Al grupo de Microbiología Agrícola en cabeza el profesor Daniel Uribe por abrirme las puertas al

Doctorado. De igual forma a Catalina Camelo, Mónica López y Luis Fernando Gómez.

A mis amigos y colegas que de alguna u otra forma contribuyeron en este proceso, en especial a

Daniel Mauricio Ramírez, Natalia Vargas, Rubén Darío Godoy, Ana Isabel Ramos, Camilo

Monroy y Dionisio Malagón.

A Colciencias por su financiación mediante apoyo a estudiantes de doctorado nacionales.

Resumen y Abstract

IX

Resumen

El incremento en el glicerol obtenido como coproducto del biodiesel ha incentivado la producción

de nuevos productos industriales como el 1,3-propanodiol (PDO) mediante transformación

biotecnológica usando bacterias como Clostridium butyricum. Ahora bien, a pesar del creciente

interés de este proceso de bioproducción, el metabolismo de Clostridium butyricum prácticamente

no ha sido modelado. Por lo tanto, fue reconstruido el primer modelo metabólico de escala

genómica (modelo GSM) de una cepa de Clostridium productora de PDO (iCbu641), el cual

contiene 641 genes, 365 enzimas, 891 reacciones y 701 metabolitos. Fue lograda una predicción en

la expresión de enzimas del 83% después de comparación entre datos de proteomica y distribución

de fluxes predichos mediante Análisis de Balance de Flujo (FBA). Las restantes enzimas no

predichas están direccionalmente acopladas al crecimiento de acuerdo a la Búsqueda de Fluxes

Enlazados (FCF) y muchas de ellas están involucradas en procesos que el FBA no puede anticipar,

tales como mecanismos de regulación celular. En adición, durante la validación usando datos de

fermentación en estado estacionario, diferentes estados fenotípicos fueron observados dependiendo

de la concentración de glicerol, los cuales fueron predichos mediante diferentes funciones

objetivo. Posteriormente, fue desarrollada una aproximación dinámica que fue validada

experimentalmente mediante cultivos de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B. Además fue

realizado análisis de sensibilidad detectando que la restricción cinética de consumo de glicerol fue

el principal parámetro que afectó la predicción de PDO producido. Los restantes parámetros

evaluados en el análisis de sensibilidad fueron empleados en el desarrollo de un modelo segregado,

el cual permitió predecir comportamientos poblacionales. Por otra parte, perturbaciones en el

modelo GSM fueron realizadas mediante deleciones de enzimas, sin embargo ninguna mutante

evaluada tuvo incrementos significativos en la producción de PDO, lo cual es debido a que el PDO

es un metabolito primario y su producción también es optimizada por el FBA. Seguidamente,

simulaciones dinámicas adicionales fueron realizadas con el objetivo de predecir cultivos por lote

alimentado, permitiendo mejorar la producción de PDO de 23.5 hasta 66g/L. Finalmente, gracias a

que los valores predichos estuvieron de acuerdo con valores experimentales, es posible sugerir que

el modelo reconstruido puede ser empleado para proponer nuevos escenarios y por tanto reducir

tiempo y costos asociados a la experimentación.

Palabras clave: Clostridium butyricum, 1,3-propanodiol, Modelo metabólico de escala genómica,

función objetivo, modelo segregado, mutantes por knockout.

X Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Título de la tesis o trabajo de investigación

Abstract

The increase of glycerol obtained as a byproduct of biodiesel has encouraged the production of

new industrial products such as 1,3-propanediol (PDO) using biotechnological transformation via

bacteria like Clostridium butyricum. Despite this increasing role as bio-production platforms,

Clostridium butyricum metabolism remains poorly modeled. Herein, it was reconstructed the first

genome-scale metabolic (GSM) model of a PDO producer Clostridium strain (iCbu641), which

contains 641 genes, 365 enzymes, 891 reactions and 701 metabolites. It was found an enzyme

expression prediction near to 83% after comparison between proteomic data and flux distribution

estimated using Flux Balance Analysis (FBA). The remaining unpredicted enzymes are

directionally coupled to growth according to Flux Coupling Finding (FCF) and many of them are

involved in processes that FBA cannot anticipate as cellular regulatory mechanisms. Additionally,

in the validation using steady state fermentation data, different phenotypes states were observed

depending glycerol concentration, which were predicted using different objective functions. Also,

a dynamic approach was developed and validated experimentally through cultures of the native

strain Clostridium sp IBUN 158B. Furthermore, sensitivity analyses were made detecting the

kinetic constraint of glycerol uptake as the main parameter affecting the PDO prediction. The

remaining parameters considered in the sensitivity analysis were employed to develop a segregate

model, which allowed predicting population behavior. Moreover, perturbations in GSM through

enzyme deletions were evaluated, however no significant increase in PDO production was

predicted, which is due PDO is a primary metabolite and its production is optimized by FBA.

Additional dynamic simulations were made in order to predict fedbatch cultures, allowing to

enhance the PDO produced from 23.5 up to 66g/L. Finally, the agreement between predicted and

experimental values allows to propose new scenarios using the model reconstructed and therefore

reducing time and costs associated to experimentation.

Keywords: Clostridium butyricum, 1,3-propanediol, Genome-scale metabolic model, objective

function, segregated model, mutants by knockout.

Contenido

XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................... IX

Abstract ............................................................................................................................. X

Lista de figuras ............................................................................................................... XIII

Lista de tablas ................................................................................................................. XV

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................... XVII

Introducción ...................................................................................................................... 1

1. Capítulo 1: Estado del arte. ..................................................................................... 3 1.1 Producción de biodiesel y glicerol ........................................................................ 3 1.2 Obtención de 1,3-propanodiol .............................................................................. 4

1.2.1 Obtención de 1,3-propanodiol a partir de Clostridium spp............................. 5 1.2.2 Cultivos en condiciones controladas de Clostridium spp en glicerol ............... 8 1.2.2.1 Cultivo por lotes ...................................................................................... 8 1.2.2.2 Cultivo por lote alimentado ..................................................................... 10 1.2.2.3 Otras estrategias de cultivo ..................................................................... 12 1.2.2.4 Mutación e ingeniería genética ................................................................ 12 1.2.3 Predicción de la producción de 1,3-propanodiol mediante Modelos cinéticos. 13

1.3 Modelos metabólicos de escala genómica ............................................................ 15 1.4 Análisis de balance de flujo ............................................................................... 16 1.5 Análisis de balances de flujo dinámico ................................................................ 18 1.6 Perturbaciones en análisis de balances de flujo dinámico ....................................... 21 1.7 Avances del grupo investigación en Microorganismos Solventogénicos del IBUN ... 22 1.8 Planteamiento del problema ............................................................................... 22 1.9 Objetivos......................................................................................................... 23

1.9.1 Objetivo general. ................................................................................... 23 1.9.2 Objetivos específicos. ............................................................................ 23

2. Capítulo 2: Metodología ......................................................................................... 25 2.1 Ajuste del modelo en estado estacionario ............................................................ 25

2.1.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM ............................................. 25 2.1.2 Ajuste de modelos cinéticos empleados como restricciones. ........................ 27 2.1.3 Predicción del crecimiento con FBA ........................................................ 28 2.1.4 Modelado de escenarios con incremento en el rendimiento de PDO ............. 30 2.1.4.1 Predicción de estados fenotípicos de mutantes por knockout........................ 30

XII Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

2.1.4.2 Perturbación en la composición de la biomasa ...........................................32 2.1.4.3 Predicción de estados fenotípicos empleando co-fermentación .....................32

2.2 Desarrollo del modelo en estado dinámico ...........................................................32 2.3 Validación experimental del modelo dinámico desarrollado ...................................35

2.3.1 Mantenimiento de la cepa y medio de cultivo empleado ..............................35 2.3.2 Fermentación en condiciones controladas. .................................................35 2.3.3 Cuantificación de biomasa, sustrato y productos. ........................................37

2.4 Determinación de algunos parámetros de significancia ..........................................37 2.4.1 Desarrollo del análisis de sensibilidad global .............................................37 2.4.2 Desarrollo de aproximación segregada del modelo dinámico .......................40 2.4.3 Predicción dinámica de la producción de PDO para mutantes por knockout ...40 2.4.4 Perturbación en condiciones de cultivo .....................................................41

3. Capítulo 3: Resultados ...........................................................................................45 3.1 Desarrollo modelo en estado estacionario ............................................................45

3.1.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM .............................................45 3.1.2 Modelos cinéticos ajustados ....................................................................46 3.1.3 Predicción de la distribución de fluxes usando glicerol como sustrato ...........48 3.1.4 Predicción de estados fenotípicos empleando otros sustratos ........................50 3.1.5 Modelado de escenarios con incremento del rendimiento de PDO ................52

3.2 Desarrollo y validación de modelo en estado dinámico ..........................................55 3.3 Determinación algunos parámetros de significancia ..............................................62

3.3.1 Análisis de sensibilidad global .................................................................62 3.3.2 Desarrollo de aproximación segregada de modelo dinámico ........................65 3.3.3 Predicción en dinámico de GSM a través de deleción de enzimas .................69 3.3.4 Perturbación en las condiciones de cultivo .................................................71

4. Capítulo 4: Discusión .............................................................................................75 4.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM. .......................................................75 4.2 Predicciones de estados fenotípicos en estado estacionario .....................................77

4.2.1 Predicción del crecimiento en glicerol .......................................................77 4.2.2 Predicción de la expresión de enzimas ......................................................79 4.2.3 Predicción del crecimiento en otros sustratos .............................................82

4.3 Predicciones de estados fenotípicos en estado transiente. .......................................83 4.4 Perturbaciones en el modelo GSM ......................................................................85

4.4.1 Análisis de sensibilidad y desarrollo del modelo segregado .........................85 4.4.2 Predicción de mutantes por knockout ........................................................88 4.4.3 Modificaciones en el medio y modo de cultivo ...........................................90

5. Capítulo 5: Conclusiones y recomendaciones .....................................................93 5.1 Conclusiones ....................................................................................................93 5.2 Recomendaciones .............................................................................................94

A. Anexo: Concentraciones de metabolitos extracelulares de fermentaciones realizadas ....95

B. Anexo: Frecuencias acumuladas de análisis de sensibilidad global MPSA ....................97

Bibliografía .................................................................................................................... 109

Contenido

XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1.1. Transesterificación de triglicérido [1] ................................................................... 3

Figura 1.2. Rutas de síntesis química de 1,3-propanodiol (A) hidroformilación del óxido de

etileno, (B) hidratación de acroleína [6]. ................................................................................ 5

Figura 1.3 Ruta metabólica de la fermentación de glicerol. ...................................................... 7

Figura 1.4. Diagrama de barras y bigotes de (A) Producción (P) de PDO y (B) Productividad

(QPDO) de PDO según diferentes estrategias de cultivo. .......................................................... 11

Figura 1.5 Resumen de los principales pasos a seguir en la solución del FBA [31]. .................. 16

Figura 2.1. Diagrama de flujo de ingeniería reversa para la reconstrucción del modelo GSM [128]

....................................................................................................................................... 26

Figura 2.2. Montaje cultivo Clostridium sp IBUN 158B en reactor BIOSTAT A. .................... 36

Figura 3.1 Distribución de reacciones citosólicas del modelo GSM reconstruido de acuerdo a ruta

funcional. ......................................................................................................................... 46

Figura 3.2 Ajuste modelo cinético de tipo alostérico de máximo flux de secreción de ácido acético

en función del flux de consumo de glicerol. .......................................................................... 47

Figura 3.3 Ajuste cinética de flux de consumo de glicerol en función de glicerol extracelular. ... 47

Figura 3.4. Análisis de robustez en función del flux de consumo de glicerol. ........................... 49

Figura 3.5. Comparación fluxes predichos y proteoma experimental....................................... 50

Figura 3.6. Coeficientes de correlación de Pearson de rendimientos de biomasa y PDO en función

de precursores de biomasa. ................................................................................................. 54

Figura 3.7. Rendimientos de PDO usando glucosa y glicerol como sustratos. .......................... 55

Figura 3.8. Comparación glicerol y PDO extracelulares predichos con DFBA por aproximación

DA empleando diferentes polinomios ortogonales y tamaño de paso 0.20h. ............................. 56

Figura 3.9. Comparación PDO extracelular predichos con DFBA por aproximación DA

empleando diferentes tamaños de paso y polinomio ortogonal de Legendre. ............................. 56

Figura 3.10. Perfiles de consumo de glicerol y producción de PDO predichos por DFBA

empleando aproximaciones SOA, DOA y DA. ..................................................................... 57

Figura 3.11. Tiempo empleado en desarrollo de DFBA por aproximaciones SOA, DOA y DA. . 57

Figura 3.12 Comparación perfiles biomasa, glicerol, PDO, ácido acético, ácido butírico y ácido

láctico experimentales (puntos) y predichos con DFBA por aproximación DA (líneas) de

Clostridium sp IBUN 158B cultivado en glicerol con concentración inicial ~38g/L. .................. 58




XIV Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Figura 3.14. Comparación perfiles biomasa, glicerol, PDO, ácido acético, ácido butírico y ácido






Figura 3.16. Comparación flux predicho con DFBA por aproximación DA y nivel de expresión de

enzima en proteoma de C. butyricum DSM 10702 [26] de las 107 enzimas predichas. ............... 62

Figura 3.17. Comparación perfil PDO experimental y 2280 predichos aleatoriamente usando

método de Monte Carlo en DFBA por aproximación DA. ....................................................... 63

Figura 3.18 Resultados de análisis de sensibilidad globales del modelo dinámico desarrollado. .. 64

Figura 3.19. Perfiles de Coeficientes Pearson de análisis de sensibilidad global PRCC de los 4

parámetros de entrada de mayor significancia en la formación de PDO. ................................... 65

Figura 3.20. Comparación perfil PDO experimental y predichos aleatoriamente usando método de

Monte Carlo en DFBA por aproximación DA. ...................................................................... 66

Figura 3.21. Perfiles desviaciones estándar relativas de formación de PDO predicho considerando

sólo variación de: precursores (negro), macromoléculas (rojo), cinética muerte celular (amarillo),

cinética ácido acético (verde), todos los anteriores de manera simultánea (azul). ....................... 67

Figura 3.22. Efecto de la desviación estándar relativa de la composición de precursores y

macromoléculas en modelo segregado. ................................................................................. 67

Figura 3.23. Comparación perfiles PDO experimental y predichos aleatoriamente por modelo

segregado usando método de Monte Carlo en DFBA por aproximación DA ............................. 68

Figura 3.24. Comparación perfil PDO experimental y predichos para 41 mutantes por knockout

simple de enzimas usando aproximación D-ROOM. .............................................................. 69

Figura 3.25. Predicción de valores máximos de PDO y Productividad QPDO normalizados de 435

mutantes por knockout doble de enzimas evaluadas empleando aproximación D-ROOM. ........... 70

Figura 3.26. Superficies de respuesta de rendimiento (YPDO/S) y productividad (QPDO) de PDO de

acuerdo a las concentraciones iniciales de biomasa (X0) y glicerol (S0) predichos mediante DFBA

por aproximación DA......................................................................................................... 71

Figura 3.27. Predicciones de lote alimentado con flujo alimentación contante. ......................... 72

Figura 3.28. Predicciones de lote alimentado con flujo alimentación enlazado al control de pH .. 73

Figura 3.29. Comparación de perfiles predichos de cultivos por lote y lote alimentado. ............. 74

Figura 4.1. Comparación de fluxes predichos de formación de PDO (verde), ácidos acético (azul)

y butírico (rojo) en función de glicerol extracelular. ............................................................... 85

Figura 4.2. Comparación valores PDO experimentales y predichos por modelo estructurado-

segregado. ........................................................................................................................ 87

Figura 4.3. Superficie de respuesta máximo valor predicho por FBA de YPDO/S en función de flux

de consumo glicerol y rendimiento YX/S................................................................................ 89

Figura 4.4. Comparación de valores predichos mediante DFBA y diferentes cepas de Clostridium.

....................................................................................................................................... 91

Contenido

XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1.1. Producción mundial de aceite vegetal y porcentaje empleado de este en el proceso de

transesterificación y sus productos formados (biodiesel y glicerol) entre 2005 y 2012, datos en

millones de toneladas [2, 64] ................................................................................................ 3

Tabla 1.2. Producción de glicerol según fuentes entre 1992 y 2010 a nivel mundial, cifras en miles

de toneladas de glicerol [1] .................................................................................................. 4

Tabla 1.3 Rendimientos teóricos máximos de biomasa y productos1 de C. butyricum a diferentes

condiciones asumiendo YX/ATP = 8.5 g/mol [21] ...................................................................... 6

Tabla 1.4 Resumen producción PDO, rendimiento YPDO/S y productividad QPDO de cultivos por

lotes reportados en la literatura según cepa, concentración inicial glicerol (So) y tipo de glicerol ... 8


lote alimentado reportados en la literatura según cepa, concentración inicial glicerol (So) y tipo de

glicerol ............................................................................................................................ 10

Tabla 1.6. Parámetros de modelos cinéticos ajustados producción de PDO empleando Clostridium

spp reportado en la literatura. ............................................................................................. 14

Tabla 1.7. Modelos metabólicos de escala genómica reportados para cepas de Clostridium ....... 15

Tabla 2.1. Resumen parámetros cinéticos empleados como restricciones en modelos FBA y DFBA

con glicerol como única fuente de carbono ........................................................................... 28

Tabla 2.2. Criterio de clasificación de acoplamiento de las reacciones al crecimiento según FCF

[198] ............................................................................................................................... 29

Tabla 2.3 puntos de colocación xa para diferentes polinomios ortogonales con 6 puntos de

colocación ........................................................................................................................ 33

Tabla 2.4. Condiciones iniciales (z0) empleadas en el desarrollo de DFBA según condición de

limitación o exceso de glicerol para cultivo por lote. ............................................................. 35

Tabla 2.5. Composición medio industrial para cultivo de Clostridium en Glicerol [15, 16] ........ 36

Tabla 2.6. Relaciones de detección en cromatografía líquida ................................................. 37

Tabla 2.7. Parámetros evaluados en análisis de sensibilidad global de DFBA. ......................... 38

Tabla 3.1 Características principales de modelo iCbu641. ..................................................... 46

Tabla 3.2. Valores ajustados de parámetros cinéticos empleados como restricciones en modelos

FBA y DFBA con glicerol como única fuente de carbono. ..................................................... 48

Tabla 3.3. Comparación de rendimientos experimentales y predichos (mol/mol) de Clostridium

butyricum W5 cultivado en glucosa [146] ............................................................................. 50

XVI Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Tabla 3.4. Comparación de rendimientos experimentales y simulados (mol/mol) de Clostridium

butyricum TM-9A cultivado en diferentes carbohidratos [199] ................................................ 51

Tabla 3.5. Comparación rendimientos experimentales y predichos de cepas nativa y mutante de

Clostridium butyricum W5 cultivadas en glucosa [206] .......................................................... 52

Tabla 3.6. Comparación rendimientos experimental y predichos de cepas nativa y mutantes de

Clostridium sp. IBUN 158B cultivadas en glicerol [17]. ......................................................... 53

Tabla 4.1. Comparación entre enzimas no predichas por FBA y enzimas equivalentes............... 81

Contenido

XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición

a Coeficiente empírico para inhibición por sustrato Tabla 1.6

AAc* Constante de inhibición por ácido acético g/L o mM Tabla 1.6

ABu* Constante de inhibición por ácido butírico g/L o mM Tabla 1.6

�̂� Restricción cinética Ecuación 1.8

𝑐𝑗 Peso reacción j en velocidad específica de

crecimiento

Ecuación 1.8

b Coeficiente empírico para inhibición por producto Tabla 1.6

𝑏𝑗 variable binaria de la reacción j Ecuación 2.8

𝐷𝐾−𝑆 Valor crítico Estadístico de Kolmogorov–Smirnov Ecuación 2.15

F Flujo alimentación de sustrato en cultivo por lote

alimentado

L/h

G Número total de intervalos Ecuación 1.8

K Total de predicciones Ecuación 2.14

K1 Constante de formación de PDO asociada al

crecimiento

mmol/g· Tabla 1.6

K2 Constante de formación de PDO no asociada al

crecimiento

mmol/g·h Tabla 1.6

𝑘𝑑 Constante de muerte celular h-1

Ecuación 1.8

KI Constante de inhibición por sustrato g/L o mM

Ks Constante de afinidad por sustrato g/L o mM Tabla 1.6

K-S Estadístico Kolmogorov–Smirnov

L Función instantánea aproximación DOA Ecuación 1.8

𝑙𝑏 termino b del polinomio interpolador de Lagrange Ecuación 2.10

M Número total de metabolitos Ecuación 1.7

ms Coeficiente mantenimiento basado en sustrato h-1

Tabla 1.6

N Número total de reacciones Ecuación 1.7

P Orden de polinomio ortogonal Ecuación 2.10

PDO* Constante de inhibición por PDO g/L o mM Tabla 1.6

QPDO Productividad PDO producido g/L·h o mM/h

𝑟𝑋𝑌 Coeficiente de correlación de Pearson Ecuación 2.9

S Glicerol g/L o mM

S* Constante de inhibición por sustrato g/L o mM Tabla 1.6

Sij Coeficiente estequiométrico de metabolito i en

reacción j

Ecuación 1.7

t Tiempo h

V Volumen de reactor L

XVIII Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Símbolo Término Unidad SI Definición

vj Flux de la reacción j mmol/g·h Ecuación 1.7

X Biomasa g/L Ecuación 1.8

X Definición general de variable independiente Ecuación 2.9

xa Punto de colocación para polinomio ortogonal Ecuación 2.10

Y Definición general de variable dependiente Ecuación 2.9

yb Punto de intercepción polinomio ortogonal Ecuación 2.10

YPDO/S Rendimiento conversión glicerol a PDO g/g o mol/mol

YX/S Rendimiento conversión glicerol a biomasa g/g o mol/mol

Z Función objetivo Ecuación 1.7

𝑧𝑖 Concentración extracelular metabolito i mM Ecuación 1.8

Símbolos con letras griegas Símbolo Término Unidad SI Definición

α

Flujo alimentación constante cultivo por lote

alimentado

L/h Ecuación 2.18

β

Flujo alimentación proporcional al control de pH en

cultivo por lote alimentado

% Ecuación 2.18

휀 Rango de tolerancia absoluto Ecuación 2.8

𝛿 Rango de tolerancia relativo Ecuación 2.8

𝛿 Función delta de Dirac Ecuación 1.8

∆𝐺 Energía libre de Gibbs J/mol Ecuación 4.1

𝜎 Desviación estándar Ecuación 2.9

𝜙 Función terminal aproximación DOA Ecuación 1.8

𝜇 Velocidad específica de crecimiento h-1

𝑤 Peso en función objetivo Ecuación 2.6

Subíndices Subíndice Término

0 inicial

∞ Infinito

a Punto de colocación

A.Ac Ácido acético

b Punto de interpolación

f o final Final

g intervalo de tiempo g

Gly Glicerol

i Metabolito i

inst Instantánea

j Reacción j

k Predicción k

l Límite inferior

max Máximo

min Mínimo

u Límite superior

Contenido

XIX

Superíndices Superíndice Término

exc Exceso de glicerol

lim Limitación de glicerol

min Mínimo

max Máximo

Abreviaturas Abreviatura Término

3-HPA 3-hidroxipropionaldehido

ACP Acyl carrier Protein (Proteína transportadora de acilos)

DA Direct Approach (Aproximación directa)

DER Desviación estándar relativa

DFBA Dynamic Flux Balance Analysis (Análisis de balance de flujo dinámico)

DOA Dynamic Optimization Approach (Aproximación de optimización dinámica)

EMS Etil-metil-sulfonato

FAST Fourier Amplitude Sensitivity Test (Prueba de sensibilidad de amplitud de Fourier)

FBA Flux Balance Analysis (Análisis de balance de flujo)

FCF Flux Coupling Finder (Búsqueda de fluxes enlazados)

FVA Flux Variability Analysis (Análisis de Variabilidad de Fluxes)

GAM Growth-associated maintenance (Mantenimiento Asociado al Crecimiento)

GSM Genome-Scale Metabolic (Metabólico de Escala Genómica)

LP Linear Programming (Programación lineal)

MFA Metabolic Flux Analysis (Análisis Metabólico de Flujo)

MIP Mixed Integer Programming (Programación de enteros mixtos)

MPSA Multi-parametric sensitivity analysis (Análisis de sensibilidad Multi-Paramétrico)

NGAM Non-Growth-associated maintenance (Mantenimiento no asociado al crecimiento)

NLP Nonlinear Programming (Programación no lineal)

NTG N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina

ODE Ordinary differential equation (Ecuación diferencial ordinaria)

PBM Population Balance Model (Modelo de balance de poblacional)

PDO 1,3-Propanodiol

PhPP Phenotypic phase plane (Plano de fases fenotípico)

PRCC Partial rank correlation coefficient (Rango Parcial de Coeficiente de Correlación)

PtdEtn fosfatidiletanolamina

PtdGly Fosfatidilglicerol

PtdMen fosfatidil N-metiletanolamina

RCM Reinforced Clostridial Medium (medio reforzado para Clostridium)

rFBA Regulatory Flux Balance analysis (Análisis de balance de flujo regulatorio)

ROOM Regulatory On/Off Minimization (Minimización de Regulación on/off)

SEC Suma de errores cuadrados

SOA Static Optimization Approach (Aproximación de Optimización Estática)

TIC Total ion Current (Ion Total Actual)

XX Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Introducción

El aumento en la producción industrial de biodiesel ha provocado un incremento proporcional en la

producción de glicerol, lo cual ha ocasionado su sobreproducción y por lo tanto ha reducido la

viabilidad económica de la industria del biodiesel [1, 2]. Esto ha incidido en la investigación del

glicerol como fuente de carbono [3-5], y en la producción de compuestos tales como el 1,3-

Propanodiol (PDO), el cual sirve como precursor de polímeros como poliésteres o poliuretanos, en

especial politrimetilentereftalato (PTT) [6, 7]. El PDO puede ser obtenido a partir de cultivos de

bacterias como Clostridium butyricum o Klebsiella pneumoniae [3, 7], siendo las bacterias del

género Clostridium una alternativa atractiva dado que son más seguras y tienen mayores

rendimientos de producción que Klebsiella pneumoniae [8]. Sin embargo la producción industrial

de PDO es aún limitada dado sus rendimientos insuficientes, representando un obstáculo en la

competitividad del proceso [9-11]. Por consiguiente, estrategias como cultivo por lote alimentado y

modificaciones genéticas aleatorias han sido desarrolladas para mejorar la producción de PDO [10,

12, 13]. El grupo de investigación Microorganismos Solventogénicos de la Universidad Nacional

no es ajeno a estas estrategias de mejora que permitan una producción industrial eficiente de PDO

[14-19]. No obstante, un entendimiento detallado de las rutas metabólicas de Clostridium

butyricum podrían beneficiar en la transformación de glicerol a PDO.

Estudios del metabolismo anaeróbico de Clostridium butyricum usando glicerol como fuente de

carbono han estado enfocados en su metabolismo central, el cual está compuesto por las rutas

oxidativa y reductiva [20]. La ruta oxidativa está principalmente relacionada en la producción de

ATP y equivalentes reducidos (NADH), mientras que coproductos como ácido acético y ácido

butírico son formados. Por otro lado, la ruta reductiva forma el PDO y simultáneamente regenera

los equivalentes reducidos de NADH a NAD [7, 9, 21]. En complemento Bizukojc et al. [22]

reportan el modelo metabólico más detallado de una cepa de Clostridium productora de PDO, el

cual está compuesto por 77 reacciones y 69 metabolitos. Dicho modelo, adicional a las rutas

oxidativa y reductiva, incluye reacciones simplificadas de síntesis de aminoácidos,

macromoléculas y biomasa. Por lo tanto, Clostridium butyricum carece de modelos metabólicos

basados en información obtenida a partir de la anotación de su genoma, también conocidos como

modelos Metabólicos de Escala Genómica (GSM por sus siglas en inglés: Genome-Scale

Metabolic model) [23-25].

En relación a la validación experimental de la expresión de enzimas incluidas en esta red

metabólica, se destaca el estudio de proteómica de la cepa nativa colombiana Clostridium sp.

IBUN 158B cultivada en glicerol [19]. En este proteoma fueron detectadas 21 enzimas clasificadas

como: una de la ruta reductiva (PDO deshidrogenasa), tres de la ruta oxidativa, once de la síntesis

de carbohidratos, cuatro de la síntesis de aminoácidos y dos de la síntesis de nucleótidos. De forma

similar, Gungormusler-Yilmaz et al. [26], usando proteómica detectaron experimentalmente 409

enzimas expresadas en el cultivo en glicerol de Clostridium butyricum 5521 (286 no redundantes).

Sin embargo, a pesar de dicha información experimental y de la disponibilidad de herramientas

computaciones, la predicción de la producción de PDO por una cepa de Clostridium basada en su

comportamiento metabólico es aún limitada.

2 Introducción

Una de las herramientas computaciones más empleadas es el Análisis de Balance de Flujo (FBA

por sus siglas en inglés: Flux Balance Analysis). Bajo la suposición de estado estacionario en

condiciones de cultivo definidas, el FBA permite predecir el estado fenotípico de un

microorganismo basado en su modelo metabólico ya sea de escala genómica o no [27-31]. Ahora

bien, dado que un modelo GSM expresado como una matriz estequiométrica es un sistema

indeterminado, esto es posee más reacciones que metabolitos, tiene infinitas soluciones, haciendo

necesario el uso de una función objetivo que permita predecir el estado fenotípico del

microorganismo. Lo anterior convierte el FBA en un proceso de optimización en el cual las

restricciones son las condiciones de cultivo, los balances de materia y las factibilidades

termodinámicas [28, 31-34].

En general, las predicciones con modelos GSM asumen la maximización del rendimiento de

biomasa como la mejor función objetivo, lo cual se basa en la suposición que la célula ha

evolucionado para seleccionar las rutas más eficientes con el fin de obtener los mejores

rendimientos [35]. No obstante, las predicciones considerando maximización de biomasa no

siempre capturan la fisiología celular, por lo cual han sido desarrollado estudios con funciones

objetivo alternas [34, 36-39]. Estos estudios incluyen minimización del error por optimización

binivel [36, 40, 41], selección de función objetivo por inferencia Bayesiana [37], o por

minimización de la distancia euclidiana [38], y combinación lineal de funciones objetivo por

compartimentos en eucariotas [34, 42]. Entre los resultados más destacados se encontró que la

célula no maximiza el rendimiento de biomasa en escenarios como exceso de sustrato, y por

consiguiente una sola función objetivo es incapaz de predecir todos los escenarios evaluados [34,

38, 39, 43-45].

Ahora bien, el FBA no predice procesos de producción dinámicos tales como cultivos por lote o

lote alimentado y por consiguiente no relaciona el comportamiento metabólico con el ambiente en

el reactor. Es por lo anterior que ha sido desarrollada la aproximación Análisis de Balance de Flujo

Dinámico (DFBA, por sus siglas en inglés: Dynamic Flux Balance Analysis) [30, 46]. El DFBA ha

predicho de manera adecuada cultivos de microorganismos como S. cerevisiae, E. coli, cocultivos

de S. cerevisiae y E. coli, sin embargo no ha sido realizada ninguna predicción de la producción de

PDO [47-53]. Así mismo, los estudios en los cuales son considerados perturbaciones a modelos

DFBA se enfocan en cultivos por lote alimentado, mientras que estrategias como análisis de

sensibilidad son limitados a otros procesos dinámicos como quorum sensing [54-57]. Lo anterior

hace que la evaluación de perturbaciones en la aproximación DFBA sea pobre en comparación a la

aproximación estacionaria FBA, en la cual se ha evaluado mutantes por knockout, además de

estudios como análisis de precios sombra o planos de fases fenotípicos [29, 58].

Considerando lo anterior, el propósito del presente estudio fue construir el primer modelo

metabólico de escala genómica de una cepa de Clostridium butyricum productora de 1,3-

propanodiol, el cual pudiera ser empleado posteriormente en el Análisis de Balance de Flujo junto

con una función objetivo adecuada que permitiera predecir diferentes estados fenotípicos tanto en

estado estacionario como en estado dinámico de dicha bacteria cultivada en glicerol y otros

sustratos. Finalmente, se buscó evaluar el efecto de perturbaciones en el modelo GSM construido,

también en estado estacionario y en estado dinámico, en función de anticipar mejoras en el

rendimiento, producción y/o productividad de PDO. Lo anterior permitiría dar continuidad al

trabajo realizado por el grupo de Solventogénicos perteneciente al Instituto de Biotecnología de la

Universidad Nacional de Colombia, el cual tiene un gran avance en esta fermentación, tanto en el

área básica como en el área ingenieril, y cuyo objetivo a largo plazo es la construcción de una

planta productora de PDO a escala piloto en asociación con la empresa productora de biodiesel,

Ecodiesel S.A.

1. Capítulo 1: Estado del arte.

1.1 Producción de biodiesel y glicerol

La elaboración del biodiesel involucra la transesterificación de un triglicérido de origen animal,

vegetal o microbiano con un alcohol, preferiblemente de bajo peso molecular, como el metanol.

Durante la transesterificación, por cada 100 kg de biodiesel generados también se producen

aproximadamente 10.8 kg de glicerol, como se ilustra en la Figura 1.1 [1, 59-63].

Figura 1.1. Transesterificación de triglicérido [1]

La producción mundial de aceite vegetal y el porcentaje de éste empleado en la producción de

biodiesel entre 2005 y 2012, se presentan en la Tabla 1.1. En la Tabla 1.1 también se puede

observar la producción tanto del biodiesel como del glicerol a partir del proceso de

transesterificación durante el mismo periodo de tiempo. Donde se destaca la marcada tendencia de

crecimiento en la producción de biodiesel y por ende de glicerol [2, 64].

Tabla 1.1. Producción mundial de aceite vegetal y porcentaje empleado de este en el proceso de

transesterificación y sus productos formados (biodiesel y glicerol) entre 2005 y 2012, datos en

millones de toneladas [2, 64]

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Producción de aceite 118.6 128.7 132.2 134.1 140.2 149.5 154.8 160.8

Fracción de aceite empleado

en biodiesel 3.1% 5.0% 6.9% 10.0% 11.4% 11.8% 14.0% 13.7%

Producción de biodiesel 3.6 6.4 9.1 13.4 15.9 17.6 21.7 22.0

Producción de glicerol 0.4 0.7 1.0 1.4 1.7 1.9 2.3 2.4

4 Análisis de balance de flujo dinámico de la producción de 1,3-propanodiol a partir de

Clostridium sp

Colombia no ha sido ajena a esta tendencia mundial y el documento COMPES 3510 publicado en

el 2008 señala las ventajas, oportunidades y lineamientos para la producción sostenible de

biocombustibles en el país, entre ellos biodiesel a partir de palma africana. En adición, mediante

Resolución 18 1120 del 2010, Decreto 4892 de 2011 y Resolución 91 664 de 2012 se determinó

por regiones, el uso de diesel mezclado con biodiesel en por lo menos un 8% (B8) como

combustible en motores diesel en 27 de los 32 departamentos del territorio nacional [65]. Es por lo

anterior que Colombia cuenta con cinco plantas industriales en funcionamiento para la producción

de biodiesel, las cuales emplearon el 40% del aceite producido durante el 2015 para generar 513

mil toneladas de biodiesel, cerca de 3 veces la producción del 2009, año en que inició la

producción industrial del biodiesel [65].

Ahora bien, como subproducto de la producción mundial de biodiesel, fue obtenido en el 2012

cerca de 2.4 millones de toneladas de glicerol, Tabla 1.1, de las cuales 53 mil toneladas fueron

obtenidas en Colombia [1, 2, 65]. Sin embargo, como se observa en la Tabla 1.2, existen otros

procesos de producción del glicerol, como la saponificación de aceites para la obtención de jabón o

métodos de síntesis química [1]. Lo anterior, junto con una demanda mundial estimada en 2.0

millones de toneladas para el 2012 [66], ocasionó una sobreoferta para dicho año cercana a 1.0

millón de toneladas [1, 2] llevando a la postre al cierre de plantas de producción sintética

pertenecientes a Dow Chemicals y Procter and Gamble Chemicals [1, 6].

Tabla 1.2. Producción de glicerol según fuentes entre 1992 y 2010 a nivel mundial, cifras en miles

de toneladas de glicerol [1]

Fuente 1992 1995 1999 2003 2005 2006 2008 2010

Jabones 208 208 198 188 167 146 125 83

Ácidos grasos 271 292 313 333 396 438 479 521

Biodiesel 0 42 42 188 394 689 1448 1866

Alcoholes grasos 83 104 125 104 125 167 250 250

Sintético 83 83 63 63 21 0 0 0

Otros 0 0 42 63 42 0 21 21

Total 645 729 783 939 1145 1440 2323 2741

La sobreoferta de glicerol representa una oportunidad para la producción de compuestos de mayor

valor agregado de interés en el mercado, ya sea por síntesis química como químicos oxigenados

(aditivos de biodiesel), hidrógeno, gas de síntesis u otros químicos por conversión catalítica

convencional o por procesos biotecnológicos como son: 1,3-propanodiol (PDO), ácido cítrico,

hidrógeno, polihidroxialcanoatos (PHAs), ácido docosahexaenoico (DHA), lípidos, entre otros,

como lo resumen Yang et al. [67] y Almeida et al. [3]. Ahora bien, dado que las impurezas

presentes en el glicerol crudo pueden envenenar los catalizadores requeridos en la conversión

química, los procesos biotecnológicos resultan ventajosos, ya que dichas impurezas no

necesariamente pueden reducir sus rendimientos [67].

1.2 Obtención de 1,3-propanodiol

El 1,3-propanodiol (PDO) es un compuesto con un gran número de aplicaciones comerciales, tales

como monómero en la producción de poliuretanos, poliéteres, poliésteres, producción de productos

cosméticos, médicos, lubricantes, además puede ser usado como adhesivo, solvente,

anticongelante, entre otras aplicaciones. Uno de los polímeros más estudiados obtenidos a partir de

Capítulo 1:

Estado del Arte

5

PDO es el politrimetilentereftalato (PTT). El PTT cuenta con mayor resistencia al lavado o mayor

elasticidad que otros poliésteres, asemejándolo al nylon, sin embargo cuenta con una mayor

biodegradabilidad. Lo anterior hace del PTT un producto con gran potencial industrial en

aplicaciones como la producción de alfombras, textiles, películas y fibras [5-7, 68, 69]. Este gran

número de aplicaciones ha permitido especular que el PDO podría pasar de ser un specialty a un

commodity, pues su mercado para el 2014 fue alrededor de 310 millones de dólares equivalentes a

cerca de 140 mil toneladas, mientras que para el 2021 se estima será de 621 millones de dólares o

280 mil toneladas [3, 70-72].

La producción industrial del PDO puede ser lograda mediante síntesis química a partir de la

hidroformilación del óxido de etileno o por hidratación de acroleína, procesos patentados por Shell

en 1993 y Degussa en 1989, respectivamente, Figura 1.2 [7, 73]. Sin embargo estas rutas de

síntesis deben ser realizadas a altas temperaturas y presiones, además los catalizadores y reactivos

empleados son costosos [6]. La producción del PDO también puede ser llevada a cabo

biotecnológicamente a temperaturas y presiones normales, y pueden ser empleadas materias primas

renovables, haciendo ambientalmente más amigable esta ruta y de interés para su aplicación

industrial [6, 7, 9].

Figura 1.2. Rutas de síntesis química de 1,3-propanodiol (A) hidroformilación del óxido de

etileno, (B) hidratación de acroleína [6].

La producción biotecnológica del PDO a partir de glicerol puede ser llevada a cabo por bacterias

de géneros como Clostridium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Ilyobacter y Citrobacter [3,

7, 70]. Sin embargo, su uso industrial ha sido limitado debido a que muchas de estas bacterias son

patógenas y requieren de nutrientes suplementarios. Además, los costos de los procesos de

separación y purificación son altos debido al gran carácter hidrófilo del PDO, lo cual demanda un

alto consumo energético para poder separarlo del agua. Lo anterior se ve exacerbado debido a las

bajas concentraciones del PDO al finalizar la fermentación, entre 50 y 100 g/L, su alto punto de

ebullición, 214°C a 1 atm, y la presencia en el medio de sales y macromoléculas, como proteínas,

polisacáridos y ácidos nucleicos [74, 75]. Es por lo anterior que Zeng [76] estimó que para una

planta productora de PDO con capacidad de 8200 toneladas el año, anexada a una planta de

biodiesel, el costo de producción sería alrededor de 1330 dólares la tonelada, es decir cerca del

60% del valor de venta, razón por la cual también han sido estudiados métodos alternativos de

purificación de PDO que permitan reducir los costos totales de producción [75, 77, 78].

1.2.1 Obtención de 1,3-propanodiol a partir de Clostridium spp

Los microorganismos del género Clostridium productores de PDO de manera natural son C.

butyricum, C. diolis, C. pasterianum y C. beijerinckii, las cuales son bacterias Gram positivas,

heterotróficas, relativamente grandes y generadoras de endoesporas. También son clasificados

como seguros, tiene menores requerimientos nutricionales y sus rendimientos son mayores, en


Clostridium sp

comparación con otras bacterias productoras como Klebsiella pneumoniae, haciéndolos adecuados

para uso industrial, sin embargo son anaerobios estrictos, lo cual representa una dificultad

operacional [8-10, 19]. La fermentación de glicerol empleando Clostridium spp. también puede

llegar a producir ácido láctico, ácido butírico, ácido acético, n-butanol, etanol, hidrógeno y dióxido

de carbono dependiendo de la cepa y las condiciones de cultivo [68]. La Figura 1.3 muestra la ruta

metabólica de la fermentación anaeróbica de Clostridium butyricum empleando glicerol, la

asimilación de éste ocurre mediante dos rutas metabólicas enlazadas para mantener el balance

redox: la ruta oxidativa y la ruta reductiva. La ruta oxidativa está principalmente relacionada en la

producción de ATP y equivalentes reducidos (NADH), mientras que coproductos como ácido

acético y ácido butírico son formados. Por otro lado, la ruta reductiva forma el PDO y

simultáneamente regenera los equivalentes reducidos de NADH a NAD [7, 9, 21].

En relación a la validación experimental de la expresión de enzimas involucradas en esta red

metabólica, se destaca el estudio de proteómica de la cepa nativa colombiana Clostridium sp.

IBUN 158B cultivada en glicerol como fuente de carbono [19]. En este proteoma fueron detectadas

21 enzimas clasificadas como: una de la ruta reductiva (PDO deshidrogenasa), tres de la ruta

oxidativa, once de la síntesis de carbohidratos, cuatro de la síntesis de aminoácidos y dos de la

síntesis de nucleótidos. De forma similar, Gungormusler-Yilmaz et al. [26], usando proteómica

detectaron experimentalmente 286 enzimas no redundantes expresadas en el cultivo en glicerol de

Clostridium butyricum 5521.

Ahora bien, el rendimiento máximo teórico de PDO que puede ser alcanzado, está estrechamente

relacionado con la ruta en la rama oxidativa que tome la bacteria durante el cultivo para obtener la

energía y la eficiencia de la célula para convertir dicha energía en biomasa [21]. En la Tabla 1.3

son resumidos los valores máximos de conversión de los principales productos de la fermentación

de glicerol empleando C. butyricum, los cuales fueron obtenidos por Zeng [21] mediante balances

estequiométricos considerando diferentes escenarios. Dichos escenarios son: limitación de glicerol,

es decir máxima formación de H2 en la ruta oxidativa (casos 1 y 2), exceso de glicerol, es decir sin

formación de H2 en la ruta oxidativa (casos 3 y 4); obtención de ATP empleando exclusivamente la

ruta del ácido acético (casos 1 y 3) o la ruta del ácido butírico (casos 2 y 4). Se observa que la ruta

del ácido butírico es más eficiente en la obtención de energía y biomasa, mientras que la ruta del

ácido acético lo es en la producción de PDO [11, 21, 70].

Tabla 1.3 Rendimientos teóricos máximos de biomasa y productos1 de C. butyricum a diferentes

condiciones asumiendo YX/ATP = 8.5 g/mol [21]

Condición YPDO/S

(g/g)

YAAc/S

(g/g)

YABu/S

(g/g)

YX/S

(g/mol)

YATP/S

(mol/mol)

Caso 1: sin formación de butirato, y

con máxima formación de H2 0.533 0.189 0.0 4.93 0.580

Caso 2: sin formación de acetato,

y con máxima formación de H2 0.413 0.0 0.205 5.46 0.642

Caso 3: sin formación de butirato, y

sin formación de H2 0.599 0.146 0.0 3.82 0.450

Caso 4: sin formación de acetato, y sin

formación de H2 0.537 0.0 0.143 3.82 0.450

1 PDO: 1,3-propanodiol, AAc: ácido acético, ABu: ácido butírico, S: glicerol, X: biomasa

Capítulo 1:

Estado del Arte

7

Figura 1.3 Ruta metabólica de la fermentación de glicerol.

(1)Hidrogenasa, (2)Ferredoxina-NAD reductasa, (3)NADH-ferredoxina reductasa, (4)Glicerol

deshidrogenasa, (5)DHA-kinasa, (6)PDO deshidrogenasa, (7)Glicerol deshidratasa,

(8)Fosfotransacetilasa, (9)Acetato kinasa, (10)Fosfotransbutirilasa, (11)Butirato kinasa,

(12)Piruvato-ferredoxina oxidoreductasa, (13)Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa [79, 80].


Clostridium sp

1.2.2 Cultivos en condiciones controladas de Clostridium spp en glicerol

Ahora bien, como es mostrado en la Tabla 1.3, la formación de PDO está estrechamente

relacionada con las condiciones de cultivo, por tal motivo diferentes investigaciones han sido

realizadas para optimizar las variables concentración final de PDO, rendimiento YPDO/S (relación

entre PDO producido y glicerol consumido), y productividad QPDO (concentración final de PDO

por unidad de tiempo). Dichas variables están directamente relacionadas con los costos asociados a

las etapas de separación, materias primas y la etapa de cultivo, respectivamente. Las diferentes

estrategias estudiadas van desde optimización del medio de cultivo hasta mejoras genéticas, las

cuales han permitido aumentar la tolerancia del microorganismo al glicerol y al PDO, disminuir la

formación de coproductos no deseados, aumentar el rendimiento YPDO/S y disminuir el tiempo de

cultivo [81]. A continuación se resumen los resultados más destacados de la fermentación

anaeróbica del glicerol empleando varias de estas estrategias en diferentes cepas de Clostridium.

Destaca que en muchas de las investigaciones realizadas es empleado el glicerol crudo proveniente

de la producción de biodiesel. En algunos casos dicho glicerol ha tenido efecto negativo en el

crecimiento, producción y/o productividad de PDO debido a la presencia de contaminantes como

metanol, sales y ácidos grasos [11, 82]. Por lo anterior, diferentes estudios han demostrado el

efecto positivo de pre-tratar este glicerol crudo para eliminar impurezas [82-85]. Ahora bien, en

otros casos el empleo de glicerol crudo no incide en la producción de PDO, como lo demostraron

González-Pajuelo et al. [86] al comparar cultivos en glicerol comercial y glicerol crudo al 92% y

65%, y Chatzifragkou et al. [87] empleando glicerol comercial y glicerol crudo al 81%.

1.2.2.1 Cultivo por lotes

Es la estrategia más común de cultivo, por consiguiente la más estudiada. En la Tabla 1.4 se

resumen algunos resultados destacados del cultivo por lotes con diferentes cepas de Clostridium

para la obtención de PDO empleando ya sea glicerol puro o crudo. Destacan las especies silvestres

C. butyricum y C. diolis como las más estudiadas, gracias a sus mayores rendimientos YPDO/S, los

cuales oscilan entre 0.50 y 0.59 g/g, es decir cercanos al máximo teórico. En el cultivo por lotes no

hay entradas o salidas de flujos durante la fermentación, por lo cual la máxima producción de PDO

está limitada por el efecto inhibitorio tanto del glicerol como del PDO en el microorganismo. Por

lo tanto, concentraciones altas de glicerol pueden reducir el consumo de éste, aumentar tiempos de

fermentación y disminuir productividades [88, 89]. Las concentraciones de PDO obtenidas van

desde los 11 g/L hasta 65.4 g/L con un valor promedio de 32.7 g/L y mediana 32 g/L, como es

mostrado en el diagrama de barras y bigotes de producción de PDO de la Figura 1.4.A. En el caso

de las productividades, éstas oscilan entre 0.41 y 1.93 g/L·h con media y mediana de 1.03 g/L·h y

1.07 g/L·h, Figura 1.4.B.


lotes reportados en la literatura según cepa, concentración inicial glicerol (So) y tipo de glicerol

# Cepa Obser-

vaciones

Tipo

glicerol

So

(g/L) t (h)

PDO

(g/L)

YPDO/S

(g/g)

QPDO (g/L·h)

Ref

1 C. butyricum DSM 5431 Puro NR1 29 56.0 0.51 1.93 [90]

2 C. butyricum VPI 3266 Puro NR1 48 35.0 0.54 0.72 [91]

3 C. butyricum E5 Crudo 53.0 24 27.0 0.51 1.13 [92]

4 C. butyricum CNCM 1211 Crudo 112.0 105 64.0 0.57 0.61 [93]

5 C. butyricum CNCM 1211 Crudo 121.0 40 65.4 0.54 1.67 [94]

Capítulo 1:

Estado del Arte

9

Tabla 1.4: (Continuación)

1 N.R. No registra información.

2 C. diolis DSM15410

previamente reportada como C. butyricum DSM5431

# Cepa Obser-

vaciones

Tipo

glicerol

So

(g/L) t (h)

PDO

(g/L)

YPDO/S

(g/g)

QPDO (g/L·h)

Ref

6 C. butyricum F2b

Crudo 40.0 26 21.8 0.55 0.84 [88]

7 Crudo 90.0 35 47.1 0.52 1.35 [89]

8

C. butyricum DSM 5431

Puro 50.0 14 25.6 0.51 1.83

[83] 9 Crudo 50.0 22 25.0 0.50 1.14

10 Glicerol

pretratado Crudo 50.0 14 26.0 0.52 1.86

11 Clostridium sp IBUN

158B Crudo 40.0 48 19.6 0.55 0.41 [16]

12

C. butyricum VPI 1718

Puro 25.0 NR1 13.8 0.55 N.R.

[87] 13

Crudo

81% 25.0 NR

1 13.7 0.55 N.R.

14

C. butyricum VPI 1718

Cultivo en

1L con N2

Crudo

81% 61.0 53 35.1 0.58 0.66

[95]

15 Cultivo en

1L sin N2

Crudo

81% 61.0 61 25.1 0.54 0.41

16 Cultivo en

3L con N2

Crudo

81% 61.0 54 33.6 0.55 0.62

17 Cultivo en

3L sin N2

Crudo

81% 61.0 52 32.1 0.55 0.62

18 C. pasteurianum

DSMZ 525

Puro 103.0 45 18.5 0.18 0.41

[84] 19

Glicerol

pretratado

Crudo

85% 111.0 43 15.5 0.14 0.36

20 C. pasteurianum DSMZ

525 mutante MNO6

Mutación

por EMS

Crudo

85% 122.0 75 25.3 0.21 0.34 [69]

21 C. diolis DSM154102 Puro 54.2 36 26.0 0.50 0.72 [96]

22 C. diolis DSM154102 Puro 54.2 36 25.8 0.54 0.72 [97]

23 C. butyricum NRRL B-

23495 Crudo 55.0 38 32.3 0.59 0.85 [98]

24

C. butyricum DS19

Puro 70.0 30 38.6 0.55 1.29

[99] 25

Crudo

83% 70.0 30 32.2 0.46 1.07

26 Clostridium sp IBUN

158B Puro 40 23 11 0.65 0.48 [19]

27

C. butyricum DSP1

Reactor

6.6L Crudo 70 33 37.6 0.53 1.12

[100] 28 Reactor

42L Crudo 70 32 36.4 0.52 1.13

29 Reactor

150L Crudo 70 28 37.2 0.53 1.33


Clostridium sp

1.2.2.2 Cultivo por lote alimentado

En un biorreactor de lote alimentado, al haber ingreso de sustrato fresco es posible mantener la

concentración de glicerol por debajo de la inhibición, facilitando una mayor producción de PDO,

lo que supone ser una mejor estrategia de obtención de PDO. Algunas formas de alimentación han

sido evaluadas para aumentar la productividad, como intermitente, pulsos a condiciones no

estériles y enlazado a la alimentación del álcali, donde la mejora más significativa ha sido lograda

al enlazar la alimentación con el control de pH [11]. En la Tabla 1.5 son mostrados algunos

resultados de cultivos de lote alimentado, la mayoría emplea las especies C. butyricum y C. diolis.

En condiciones similares de cultivo y cepa se ha demostrado en efecto conseguir mejoras en la

obtención de PDO comparado con cultivos por lotes. Las mejoras en producción y productividad

van desde 63.3% y 24.4%, respectivamente, en el caso de la cepa colombiana Clostridium sp

IBUN 158B, referencia 11 de la Tabla 1.4 y referencia 13 de la Tabla 1.5 [15, 16], hasta 137% y

42% para la cepa C. diolis DSM15410, referencia 22 de la Tabla 1.4 y referencia 19 de la Tabla 1.5

[97]. En general las medias de producción y productividad de PDO están en 58.2g/L y 1.6g/L·h,

respectivamente, Figura 1.4, es decir valores más altos en comparación con el cultivo por lotes, lo

cual resulta ventajoso en los procesos de purificación [9, 75].


lote alimentado reportados en la literatura según cepa, concentración inicial glicerol (So) y tipo de

glicerol

# Cepa Obser-

vaciones

Tipo

glicerol t (h)

PDO

(g/L)

YPDO/S

(g/g)

QPDO

(g/L·h) Ref

1 C. butyricum

DSM 5431 Puro 21 58.0 0.60 2.70 [101]

2 C. butyricum DSM 5431 Puro 21 47.0 0.57 2.24 [90]

3 C. butyricum

VPI 3266 Puro 72 65.0 0.57 0.90 [91]

4 C. butyricum DSM 5431 Puro 72 44.8 0.51 0.62

[102] 5


mutante 2/2

Mutación por

NTG Puro 85 70.5 0.54 0.83

6 C. butyricum

E5

Crudo 48 58.4 0.53 1.22 [92]

7 Puro 48 65.6 0.54 1.37

8 C. butyricum DSM 5431 Alimentación

enlazada con

control pH

Puro 20 47.5 0.51 2.38

[103] 9


mutante 2/2 Puro 38 70.3 0.57 1.85

10 C. butyricum

VPI 32661

Puro 72 65.0 0.57 0.90

[12]

11 C. acetobutylicum DG1 con

plásmido pSPD5

Mutante

dirigida Puro 47.5 83.9 0.51 1.77

12 Clostridium sp IBUN 158B

Puro 55 46.0 0.48 0.84 [15]

13 Crudo 62 32.0 0.49 0.51

14 C. diolis DSM154102 Puro 22 47.4 0.48 2.15

[13] 15

C. diolis DSM154102 mutante

PSM7

Mutación por

NTG Puro 27 56.7 0.51 2.10


2 mutante

GSHM 4

Mutación por

barajado Puro 31 84.7 0.52 2.73

Capítulo 1:

Estado del Arte

11

Tabla 1.5: (Continuación)

1 Misma referencia 3.


previamente reportada como C. butyricum DSM5431

PDO (g/L)

0 20 40 60 80 100

Lote

Lote Alimentado

QPDO

(g/L/h)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

A B

Figura 1.4. Diagrama de barras y bigotes de (A) Producción (P) de PDO y (B) Productividad

(QPDO) de PDO según diferentes estrategias de cultivo.

Datos a partir de información presentada en las Tabla 1.4 y Tabla 1.5. Puntos rojos corresponden a

cepas mutantes. (Fuente: Autor).

# Cepa Observa-

ciones

Tipo

glicerol t (h)

PDO

(g/L)

YPDO/S

(g/g)

QPDO

(g/L·h) Ref.

17 C. butyricum

VPI 1718

Cultivo en

1L con N2

Crudo

81% 100 70.8 0.55 0.71

[95]

18 Cultivo en

1L sin N2

Crudo

81% 90 30.5 0.44 0.34

19 C. diolis DSM154102 Puro 60 61.2 0.55 1.02 [97]

20

C. butyricum

AKR102a

Cultivo en

1 L Puro 28 93.7 0.52 3.35

[10] 21 Cultivo en

1 L Crudo 33 76.2 0.51 2.31

22 Cultivo en

200 L Crudo 30 61.5 0.53 2.05

23 C. diolis DSM154102 Puro 47 63.5 NR 1.35 [104]

24

C. butyricum M01

Glicerol sin

pretratar Crudo 18 40.8 0.54 2.27

[85]

25 Glicerol

pretratado Crudo 15.5 59.3 0.55 3.18

26 C. butyricum VPI 1718 Crudo 76 46.5 0.46 0.62 [105]

27 C. butyricum DSP1 Crudo 71.0 0.54 NR [100]


Clostridium sp

1.2.2.3 Otras estrategias de cultivo

Adicional al cultivo por lote y lote alimentado, también han sido exploradas otras estrategias como

cultivo continuo [12, 86-89, 106-110], continuo en dos etapas [88], continuo con inmovilización de

células [110-112], continuo con recirculación [113] y lote repetido [105, 114], sin embargo

ninguno de estas estrategias han permitido obtener resultados comparables a los reportados en

cultivos por lote alimentado.

Por otro lado, también ha sido estudiado el efecto del tipo de reactor y la escala de éste. Por un

lado, Günzel et al. [101] estudiaron efecto de biorreactores de tanque agitado y airlift de

volúmenes entre 2 L y 2 m³ en la producción de PDO en cultivos por lotes, demostrando no existir

diferencias por el tipo de biorreactor y su escala. Resultados similares fueron obtenidos por

Szymanowska P. & Białas [100]. En contraste, Wilkens et al. [10] reportan una reducción del PDO

producido al aumentar la escala, sin embargo no son mantenidas las condiciones de cultivo al

escalar. Así mismo, ha sido demostrada la necesidad de suministrar N2 con el fin de mantener la

anaerobiosis a pequeñas escalas, es decir reactores menores a 1 L, mientras que a escalas mayores

dicho gas no fue necesario [84, 95, 115].

1.2.2.4 Mutación e ingeniería genética

La limitación en la producción de PDO durante la fermentación empleando cepas de Clostridium

ocasionada por la inhibición tanto del sustrato como de los productos ha llevado a la

implementación de mejoras genéticas, ya sean aleatorias mediante mutaciones o dirigidas mediante

ingeniería genética. Estas modificaciones en el genoma han permitido, además de una mayor

tolerancia del microorganismo al sustrato y al producto, una sobreexpresión de las enzimas

involucradas en la producción del PDO [12, 13, 69, 102, 116].

Las mutaciones químicas de cepas de Clostridium han sido realizadas de manera aleatoria por

agentes como N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina (NTG) y etil-metil-sulfonato (EMS), los cuales

se caracterizan por actuar de manera aleatoria e inducir sustituciones o eliminaciones de bases [69].

Abbad-Andaloussi et al. [102] obtuvieron por exposición a NTG mutantes resistentes a altas

concentraciones de glicerol y PDO de la cepa C. butyricum DSM 5431. Las cepas mutantes

obtenidas mejoraron hasta en un 57% la producción y un 42% productividad de PDO, Tabla 1.5

referencias 4 y 5. Por otro lado, Abbad-Andaloussi et al. [117], mediante mutación aleatoria de la

cepa C. butyricum E5 empleando también NTG, no obtuvieron mejoras en la producción de PDO a

pesar de lograr mayor tolerancia al glicerol por parte de la mutante. Así mismo, Jensen et al. [69]

empleando EMS mutaron la cepa C. pasteurianum DSMZ 525, la cual aumentó la producción de

PDO de 15.5 a 25.3 g/L, Tabla 1.4 referencias 19 y 20. En adición, Otte et al. [13] reportan la

producción más alta de PDO de una cepa mutante, quienes al usar NTG y posteriormente barajado

genómico incrementaron la producción de PDO hasta un 78.7% de la cepa C. diolis DSM 15410,

Tabla 1.5 referencias 14 a 16.

En las anteriores mutantes, al ser obtenidas mediante procesos aleatorios no es posible establecer

de manera fácil qué genes fueron modificados, representando una limitación para determinar que

proteínas fueron alteradas. En contraste, González-Pajuelo et al. [12] reportan la primera mutante

obtenida por ingeniería genética de una cepa de Clostridium productora de PDO. Durante la

mutación, fue insertado el plásmido pSPD5 en una cepa de C. acetobutylicum, sin embargo ésta no

es productora natural de PDO. Dicha cepa fue seleccionada debido a que los intentos por insertar

tal plásmido en C. butyricum fueron infructuosos, la cual sí es productora natural de PDO. La cepa

mutante obtenida a partir de C. acetobutylicum, además de mantener su tolerancia al glicerol crudo,

Capítulo 1:

Estado del Arte

13

incrementó la producción de PDO de 65 a 84 g/L en comparación con la cepa nativa C. butyricum,

Tabla 1.5 referencias 10 y 11. La Figura 1.4 destaca en rojo los resultados obtenidos con las

diferentes cepas mutantes con mejoras en la producción de PDO.

Finalmente, Montoya Solano [17] también insertó los genes encargados de la producción de PDO

en la cepa Clostridium sp IBUN 158B, permitiendo así una sobreexpresión de estas enzimas. La

cepa mutante obtuvo una mayor producción y productividad de PDO en relación a la cepa nativa.

Así mismo, Montoya Solano [17] logró crear mutantes por knockout de la misma cepa, inactivando

la producción de hidrógeno, ácido láctico y ácido butírico, cuyas rutas son competidoras de la

producción de PDO, dado que igualmente consumen NADH. Sin embargo, ninguna de estas

mutantes por knockout tuvo una mejora significativa en la producción, rendimiento o productividad

de PDO. No obstante, las fermentaciones con las diferentes mutantes obtenidas por Montoya

Solano [17] no fueron realizadas a condiciones controladas y por tanto no se logró el consumo total

del glicerol.

1.2.3 Predicción de la producción de 1,3-propanodiol mediante Modelos

cinéticos.

Los modelos cinéticos son desarrollos matemáticos que permiten predecir el avance de una

reacción, como consumo de un sustrato, producción de biomasa o un metabolito dado. Los

modelos se hacen más precisos cuando consideran la mayor cantidad de factores posibles como

concentración de sustratos, productos, inhibidores, temperatura, pH, tasa de dilución, etc. Los

modelos cinéticos son útiles dado que proporcionan información necesaria para el análisis, diseño

y operación del proceso fermentativo seleccionado [118, 119]. Los modelos pueden ser

clasificados según la homogeneidad del cultivo celular, siendo un modelo no segregado aquel que

supone todas las células son idénticas, mientras que un modelo segregado considera que las células

son diferentes entre sí en características como edad, tamaño o composición, por lo tanto requiere

modelos de distribución. Así mismo, los modelos cinéticos pueden ser no estructurados o

estructurados, donde los no estructurados consideran la célula como una caja negra, en contraste lo

modelos estructurados consideran el comportamiento intracelular. La anterior clasificación permite

concluir que los modelos más simples son los no segregados- no estructurados como Monod,

mientras que los más complejos son los segregados-estructurados [120].

En el caso de la producción de PDO se han desarrollado modelos cinéticos empleando especies de

Clostridium como modelo biológico, sin embargo estos no son abundantes, dado que sólo existen

cinco modelos cinéticos diferentes [21, 96, 97, 104, 121-124]. Otros artículos reportan actividades

enzimáticas a diferentes condiciones [9, 12, 102, 116, 125], y balances de carbono y electrones [21,

79, 108, 126, 127], pero dichos reportes son insuficientes para predecir el proceso fermentativo. El

primer modelo cinético para la producción de PDO a partir de Clostridium butyricum fue reportado

por Zeng et al. [121], el cual incluye el efecto inhibitorio tanto del sustrato glicerol (S) como de los

productos ácido acético (AAc), ácido butírico (ABu), 1,3-propanodiol (PDO) y del pH, el cual es

mostrado en la Ecuación 1.1, la Tabla 1.6 muestra los parámetros cinéticos del modelo ajustado.

µ =µ𝑚𝑎𝑥

(1 +𝐻+

𝐾𝐻+𝐾𝑂𝐻𝐻+

) (

𝑆

𝐾𝑠 + 𝑆)(1 −

𝑆

𝑆∗) (1 −

𝐴𝐴𝑐

𝐴𝐴𝑐∗) (1 −

𝐴𝐵𝑢

𝐴𝐵𝑢∗) (1 −

𝑃𝐷𝑂

𝑃𝐷𝑂∗)

1.1

Papanikolaou & Aggelis [122], ajustaron un modelo cinético tipo Contois compuesto, Ecuaciones

1.2 y 1.3, las cuales incluyen la concentración de biomasa (X) y el rendimiento PDO-biomasa


Clostridium sp

(YPDO/X) y predicen la tasa de crecimiento (µ) y la productividad de PDO (QPDO) para una

concentración de glicerol (S) dada en un cultivo continuo. Finalmente, Kaur et al. [97] ajustaron un

modelo cinético similar al propuesto por Zeng et al. [121], el cual es mostrado en las Ecuaciones

1.4, 1.5 y 1.6, que corresponden a tasa de producción de biomasa, consumo de sustrato y

formación de PDO, respectivamente.

Tabla 1.6. Parámetros de modelos cinéticos ajustados producción de PDO empleando Clostridium

spp reportado en la literatura.

Parámetro cinético Zeng et al. [121] Papanikolaou & Aggelis

[122] Kaur et al. [97]

Producción de biomasa

µmax (h-1

) 0,80 0.527 ± 0.085 0,65

KH (M) 6,23x10-6

N.A. N.A.

KOH (M) 9,24x10-9

N.A. N.A.

Ks (g/L) 0,005 35.627 ± 9.751 g/g 12,8

S* (g/L) 181,7 N.A. 98,3

PDO* (g/L) 71,1 N.A. 65,2

AAc* (g/L) 0,46 N.A. N.A.

ABu* (g/L) 9,9 N.A. N.A.

a N.A. N.A. 1,12

b N.A. N.A. 1,0

Consumo sustrato

YX/S (g/g) N.A. N.A. 0,067

ms (h-1

) N.A. N.A. 0,23

Producción de PDO

YPDO/X (g/g) N.A. 17.14 ± 1.44 N.A.

K1 N.A. N.A. 7,3

K2 N.A. N.A. 0,15

YPDO/S (g/g) N.A. N.A. 0,502

Ajuste de modelo

R² N.A. < 70% >95%

Desviación modelo 18% N.A. N.A.

N.A. No Aplica.

µ = µ𝑚𝑎𝑥 ∗𝑆

𝐾𝑠∗𝑋+𝑆 1.2

𝑄𝑃𝐷𝑂 = µ ∗ 𝑋 ∗ 𝑌𝑃𝐷𝑂/𝑋 1.3

µ =1

𝑋∗𝑑𝑋

𝑑𝑡= µ𝑚𝑎𝑥

𝑆

𝐾𝑠 + 𝑆(1 − (

𝑆

𝑆∗)𝑎

)(1 − (𝑃𝐷𝑂

𝑃𝐷𝑂∗)𝑏

) 1.4

𝑟𝑆 =1

𝑋∗𝑑𝑆

𝑑𝑡= −(

1

𝑌𝑋/𝑆 ∗ µ + 𝑚𝑠) 1.5

𝑟𝑃𝐷𝑂 =1

𝑋∗𝑑 𝑃𝐷𝑂

𝑑𝑡= 𝐾1 ∗ µ + 𝐾2 1.6

Es de resaltar que los modelos obtenidos por Zeng et al. [121] y Papanikolaou & Aggelis [122]

fueron obtenidos a partir de un gran número de cultivos continuos a condiciones diferentes, 55 y

19, respectivamente, y el error en el ajuste del modelo puede ser debido principalmente a la

simplicidad de dichos modelos. En el caso del modelo reportado por Kaur et al. [97], fue obtenido

Capítulo 1:

Estado del Arte

15

a partir de datos experimentales de un solo cultivo por lote y el modelo ajustado fue comparado

con dichos datos experimentales y un cultivo de lote alimentado a condiciones similares, lo cual

explica el buen ajuste de éste, sin embargo no garantiza una predicción acertada a condiciones de

fermentación diferentes. Por otro lado, Silva et al. [123], también intentan ajustar un modelo

cinético, pero mencionan que el modelo ajustado no es riguroso, dado la falta de los valores de

biomasa. Finalmente, Zhu et al. [124] ajustan un modelo cinético similar al empleado por Zeng et

al. [121], aunque calculan los parámetros cinéticos para cada condición de cultivo, haciéndolo un

modelo de pobre capacidad predictiva. Por lo cual se puede concluir que los pocos modelos que

han sido ajustados empleando especies de Clostridium aún son insuficientes para predecir de

manera acertada la obtención de PDO.

Debido a que los anteriores modelos cinéticos tienen en común que son modelos no segregados-no

estructurados, es decir que no tienen en consideración las reacciones que ocurren dentro de la

célula, y como se observa en la Figura 1.3 y la Tabla 1.3, estas reacciones afectan la producción de

PDO según condiciones de medio de cultivo [21], surge como hipótesis que es posible establecer

un modelo que incluya la red metabólica para predecir la producción de PDO a partir de una cepa

de Clostridium.

1.3 Modelos metabólicos de escala genómica

Gracias a los adelantos en biología molecular, se ha avanzado de igual manera en la reconstrucción

de redes metabólicas cada vez más detalladas a partir de datos genómicos [30, 33]. Dichas redes

son conocidas como modelos Metabólicos de Escala Genómica (modelo GSM, por sus siglas en

inglés: Genome-Scale Metabolic model) [23-25]. La elaboración del modelo GSM de un

organismo puede ser dividida en las siguientes etapas: (i) construcción de las rutas metabólicas y

reacciones de transporte en membrana basada en la anotación genómica, homología de enzimas y

observaciones experimentales, para lo cual se emplea bases de datos como KEGG, TCD o

TransportDB, SEED entre otros. (ii) Desarrollo de ecuaciones de constituyentes de biomasa basado

en datos fisiológicos o a partir de comparación con especies similares. (iii) Identificación de rutas

incompletas y reacciones de transportes de metabolitos faltantes a través métodos

semiautomatizados como ingeniería reversa [128] o métodos automatizados como GapFind y

GapFill [129]. Ahora bien, los reportes de modelos GSM de especies solventogénicas de

Clostridium son limitados, los cuales son resumidos en la Tabla 1.7. Destaca el desarrollo de

modelos cada vez más detallados de la bacteria C. acetobutylicum.

Tabla 1.7. Modelos metabólicos de escala genómica reportados para cepas de Clostridium

Especie Tamaño genoma Reacciones Metabolitos Referencia

C. acetobutylicum 4,1 Mpb 552 422 [128]





C. beijerinckii 6,0 Mpb 938 821 [134]

C. cellulolyticum 4,1 Mpb 621 603 [131]

C. ljungdahlii 4,6 Mpb 785 698 [135]

C. thermocellum 3,8 Mpb 577 525 [136]


Clostridium sp

En contraste, Rafieenia & Chaganti [137] reportan para C. butyricum el uso de un modelo

metabólico compuesto de 42 reacciones y 40 metabolitos, sin embargo no es incluida la producción

de PDO. Por otro lado, Bizukojc et al. [22] reportan el modelo metabólico más detallado de una

cepa de C. butyricum productora de PDO, el cual está compuesto de 77 reacciones y 69

metabolitos. Este último modelo, adicional a las rutas oxidativa y reductiva, incluye reacciones

simplificadas de síntesis de aminoácidos, macromoléculas y biomasa. Ahora bien, las anteriores

redes no son modelos GSM, por lo tanto Clostridium butyricum carece de modelos metabólicos de

escala genómica.

1.4 Análisis de balance de flujo

Junto a la reconstrucción de modelos GSM, también se han desarrollado herramientas

computacionales que permiten predecir comportamientos metabólicos. Una de las herramientas

más empleadas es el Análisis de Balance de Flujo (FBA por sus siglas en inglés: Flux Balance

Analysis). Bajo la suposición de estado estacionario de unas condiciones de cultivo definidas, el

FBA permite predecir el estado fenotípico de un microorganismo basado en su modelo GSM [27-

31]. En el desarrollo del FBA, el modelo GSM es expresado en forma de matriz estequiométrica,

donde las N reacciones corresponden a las variables y los M metabolitos son las ecuaciones. Ahora

bien, dado que usualmente el número de reacciones es mayor al de metabolitos, como se evidencia

en la Tabla 1.7, el modelo GSM es un sistema indeterminado y por tanto con infinitas soluciones.

Lo anterior convierte el FBA en un proceso de optimización que necesita de una función objetivo Z

para predecir el estado fenotípico del microorganismo, mientras que las restricciones son las

condiciones de cultivo, los balances de materia y las factibilidades termodinámicas, como lo

sintetiza la Figura 1.5 y se expresa matemáticamente en la Ecuación 1.7 [28, 31-34].

Figura 1.5 Resumen de los principales pasos a seguir en la solución del FBA [31].

Capítulo 1:

Estado del Arte

17

𝑀𝑎𝑥/𝑀𝑖𝑛 𝑍 = 𝑓(𝑣𝑗)

𝑆𝑢𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑎:

{

∑ 𝑆𝑖𝑗𝑣𝑗

𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀

𝑣𝑗𝑚𝑖𝑛 ≤ 𝑣𝑗 ≤ 𝑣𝑗

𝑚𝑎𝑥 , ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁}

1.7

Dónde:

M es el número total de metabolitos

N el número total de reacciones

Z es la función objetivo como puede ser la maximización de biomasa.

Sij es el coeficiente estequiométrico del metabolito i en la reacción j

vj es el flux de la reacción j (expresado en mmol/g h).

vjmin

y vjmax

son los valores mínimo y máximo posibles de la reacción vj y están dados por la

termodinámica de las reacciones, las cuales pueden ser reversibles o irreversibles.

o Para las reacciones irreversibles usualmente: vjmin

= 0 y vjmax

= 1000 mmol/g·h.

o Para las reacciones reversibles usualmente: vjmin

= -1000 mmol/g h y vjmax

= 1000 mmol/g·h.

En general, las predicciones empleando FBA y modelos GSM asumen la maximización del

rendimiento de biomasa como la mejor función objetivo, lo cual es basado en la suposición que la

célula ha evolucionado para seleccionar las rutas más eficientes con el fin de obtener los mejores

rendimientos [35]. No obstante, las predicciones con maximización de biomasa no siempre

capturan la fisiología celular y funciones objetivo alternas como maximización de ATP o

minimización del potencial redox han sido desarrolladas [34, 36-39]. Los estudios de selección de

función objetivo incluyen minimización del error por optimización binivel [36, 40, 41], selección

de función objetivo por inferencia Bayesiana [37], o por minimización de la distancia euclidiana

[38], y combinación lineal de funciones objetivo por compartimentos en eucariotas [34, 42]. Entre

los resultados más destacados se encontró que la célula no maximiza el rendimiento de biomasa en

escenarios como exceso de sustrato, y por consiguiente una sola función objetivo es incapaz de

predecir todos los escenarios evaluados [34, 38, 39, 43-45].

Ahora bien, el empleo del FBA no es el único método disponible para la cuantificación de fluxes

intracelulares, dado que también existe el Análisis Metabólico de Flujo (MFA, por sus siglas en

inglés: Metabolic Flux Analysis). El MFA igualmente emplea el balance de materia representado

con una matriz estequiométrica, pero adicional incluye información experimental de fluxes

extracelulares o intracelulares obtenidos in vivo, lo que hace del MFA un método más confiable

que el FBA en la cuantificación del vector de fluxes, y por ende ampliamente empleado en una

gran variedad de modelos biológicos [138, 139].

Brevemente, los fluxes extracelulares son obtenidos por balances de materia macroscópicos

mientras que los fluxes intracelulares son obtenidos mediante marcado isotópico empleando

Carbono 13 (13

C). El 13

C -MFA consiste en emplear un sustrato con átomos marcados, el cual es

consumido por la célula y de esta manera dichos átomos marcados son integrados a la red

metabólica, permitiendo una posterior cuantificación de fluxes intracelulares empleando técnicas

analíticas como cromatografía de gases- espectroscopía de masas [140, 141]. Es por esto que la

calidad del 13

C -MFA depende de la estructura del modelo de la red metabólica, el tipo de sustrato


Clostridium sp

marcado, la forma en que se mide los compuestos marcados, el número de experimentos a realizar

y la precisión en los valores de fluxes medidos [142].

Sin embargo, algunas desventajas del 13

C -MFA son: primero no puede ser empleado en estado

transitorio, y aunque ha habido intentos, las mediciones pueden ser imprecisas dado los tiempos

necesarios en el muestreo. El segundo problema es que no puede ser empleado en redes

metabólicas de gran escala, más de 300 reacciones, por lo cual es usado principalmente en

metabolismos centrales. Tercero, los métodos analíticos de medición pueden llegar a ser altamente

costosos y requerir instrumentación de alta resolución. Cuarto, la inclusión de un nutriente

adicional puede complicar la medición del metabolito marcado. Quinto, en el caso del estudio de

células eucariotas, dada la compartimentalización ocasionada por los organelos puede conllevar a

limitaciones difusionales y por lo tanto requerir métodos adecuados de muestreo y extracción de

los organelos [140, 141].

Tanto el FBA como el MFA han sido empleados de una manera muy limitada en cultivos

anaeróbicos de Clostridium spp, y ha sido principalmente empleado en la fermentación de azúcares

como la glucosa para la obtención de hidrógeno y los solventes acetona, butanol y etanol [137,

143-146]. Para la producción de PDO empleando Clostridium sólo Bizukojc et al. [22] reportan el

uso del FBA, quienes emplean una red simplificada previamente mencionada, debido a que no hay

disponibilidad de modelos GSM para especies de Clostridium productoras de PDO, sin embargo

logran predecir con relativa buena precisión los fluxes de la mayoría de los compuestos

extracelulares, a excepción del hidrógeno.

Los anteriores reportes enfocan el uso del FBA en estado estacionario de cultivos en continuo o en

fase exponencial de cultivos por lotes para comparar velocidades de reacciones intracelulares a

diferentes diluciones, pH, concentraciones de sustrato y cepas, sin embargo no llevan a cabo

ningún tipo de modelamiento. En el caso del cultivo de Klebsiella pneumoniae para la obtención

de PDO, el número de reportes de aplicación de FBA o MFA es mayor, aunque todos ellos también

están enfocados a estudios comparativos y además usan redes metabólicas simplificadas [147-153].

1.5 Análisis de balances de flujo dinámico

Debido a que el FBA no permite predecir interacciones entre las reacciones intracelulares con el

ambiente extracelular además del comportamiento en el tiempo, su aplicación es limitada en

cultivos por lotes y lote alimentado, los cuales son los más empleados en procesos industriales. Lo

anterior ha llevado al desarrollado del Análisis de Balance de Flujo Dinámico (DFBA, por sus

siglas en inglés: Dynamic Flux Balance Analysis) en busca de solucionar dichas dificultades [30,

32, 44, 46, 49]. Mahadevan et al. [30], empleando una red metabólica simplificada de E. coli

sentaron las bases para el empleo del DFBA a partir de balances de materia en estado transitorio y

optimización dinámica con Programación No Lineal (NLP por sus siglas en inglés: Nonlinear

Programming), la cual es presentada en la Ecuación 1.8.

La optimización presentada en la Ecuación 1.8 es conocida como Aproximación de Optimización

Dinámica (DOA por sus siglas en inglés: Dynamic Optimization Approach), la cual puede ser

solucionada parametrizando las ecuaciones diferenciales (ODE por sus siglas en inglés Ordinary

differential equation) mediante el uso del método de colocación ortogonal de elementos finitos,

haciéndolo un método altamente complejo de emplear en redes metabólicas relativamente grandes

[30]. Por lo anterior, el uso de DOA para la solución del DFBA es muy limitada, dado que sólo

existen 6 reportes, los cuales han empleado como modelos biológicos E. coli, células del

Capítulo 1:

Estado del Arte

19

miocardio, cloroplastos de plantas C3 y la cianobacteria Synechocystis sp [30, 50, 154-157]. Ahora

bien, como se observa en la Ecuación 1.8, el proceso de optimización es realizado una sola vez en

todo el intervalo de tiempo, donde no sólo se maximiza la biomasa al final de la fermentación

(función 𝜙), sino que también optimiza la biomasa producida en cada intervalo G (función 𝐿). Sin

embargo, ha sido encontrado que el empleo de sólo la función instantánea permite obtener

resultados más representativos a los valores experimentales. Lo anterior ha permitido sugerir que

los microorganismos no tienen capacidad para predecir situaciones futuras y así re-direccionar los

fluxes de tal forma que la biomasa sea la máxima al final de la fermentación [30]. Dado esto, sería

posible simplificar la función objetivo de la Ecuación 1.8 según se muestra en la Ecuación 1.9.

𝑀𝑎𝑥 �̂�𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 ∙ 𝜙(𝑧, 𝑣, 𝑋)|𝑡=𝑡𝑓 + �̂�𝑖𝑛𝑠𝑡 ∙ ∑∫ [𝐿(𝑧, 𝑣, 𝑋(𝑡)) ∙ 𝛿(𝑡 − 𝑡𝑔)]𝑡𝑓

0

𝐺

𝑔=0

𝑑𝑡


{

𝑑𝑧𝑖

𝑑𝑡= − ∑ 𝑆𝑖𝑗

𝑁𝐼𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐

𝑗=1

∙ 𝑣𝑗 ∙ 𝑋 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑑𝑋

𝑑𝑡= (𝜇 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋

∑ 𝑆𝑖𝑗 ∙ 𝑣𝑗

𝑁

𝑗 =1

= 0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀

𝜇 = ∑ 𝑐𝑗 ∙ 𝑣𝑗

𝑁

𝑗 =1

𝑣𝑗𝑚𝑖𝑛 < 𝑣𝑗 < 𝑣𝑗

𝑚𝑎𝑥 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

�̂�(𝑣, 𝑧) ≤ 0

𝑧𝑖(𝑡) ≥ 0 𝑧𝑖(𝑡0) = 𝑧𝑖,0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑋(𝑡) ≥ 0 𝑋(𝑡0) = 𝑋0

𝑡𝑔 = 𝑡0 + 𝑔 ∙ 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺

}

∀ 𝑡𝑔 ∈ [𝑡0, 𝑡𝑓]

1.8

Dónde:

zi es la concentración extracelular del metabolito i, mientras que zi,0 es la concentración en el

instante inicial (expresadas en mmol/L o mM)

X es la concentración de biomasa, mientras que X0 es la concentración en el instante inicial

(expresado en g/L)

𝜇 y 𝑘𝑑 son la velocidad específica de crecimiento y la constante de muerte, respectivamente

(expresadas en h-1

)

𝑐𝑗 es el peso de la reacción j en la velocidad de crecimiento, siendo 1 para la reacción de

biomasa y cero para todas las demás reacciones.


Clostridium sp

�̂�(𝑣, 𝑧) es el vector de restricciones no lineales que sean consideradas, tales como cinéticas de

consumo de sustratos entre otras.

t0 y tf son los tiempo inicial y final, respectivamente (h)

𝜙(𝑧, 𝑣, 𝑋)|𝑡=𝑡𝑓 es la función terminal que define el valor de la función objetivo en el punto

final.

𝐿(𝑧, 𝑣, 𝑋(𝑡)) es la función instantánea que suministra el valor de la función objetivo en un

tiempo 𝑡𝑗.

𝛿(𝑡 − 𝑡𝑔) es la función delta de Dirac.

𝐺 es el número de intervalos en que es discretizado el tiempo de la simulación.

�̂�𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 , �̂�𝑖𝑛𝑠𝑡 son los pesos asociados con la función terminal e instantánea, respectivamente.

𝑀𝑎𝑥 ∑∫ [𝐿(𝑧, 𝑣, 𝑋(𝑡)) ∙ 𝛿(𝑡 − 𝑡𝑔)]𝑡𝑓

0

𝐺

𝑔=0

𝑑𝑡 1.9

Como alternativa al uso del DOA, Mahadevan et al. [30] también propusieron la Aproximación de

Optimización Estática (SOA por sus siglas en inglés: Static Optimization Approach). En la

aproximación SOA es dividido el tiempo de cultivo en varios intervalos y es resuelto el sistema en

cada intervalo, como es mostrado en la Ecuación 1.10. Es decir que la solución SOA hace la

suposición de pseudo estado estacionario en cada intervalo de tiempo y por tanto las ecuaciones

diferenciales son linealizadas. No obstante, demostraron que su precisión es menor, pero gracias a

su mayor simplicidad en comparación con la solución DOA, su aplicación en modelos de DFBA es

mayor.

𝑀𝑎𝑥 𝜇 = ∑ 𝑐𝑗 ∙ 𝑣𝑗(𝑡)

𝑁

𝑗 =1


{

𝑧𝑖(𝑡 + ∆𝑡) = 𝑧𝑖(𝑡) − ∑ 𝑆𝑖𝑗


𝑗=1

∙ 𝑣𝑗(𝑡) ∙ 𝑋(𝑡) ∙ ∆𝑡

∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑋(𝑡 + ∆𝑡) = 𝑋(𝑡) + (𝜇 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋(𝑡) ∙ ∆𝑡


𝑁

𝑗 =1

= 0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀

𝑣𝑗𝑚𝑖𝑛 < 𝑣𝑗(𝑡) < 𝑣𝑗

𝑚𝑎𝑥 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

�̂� (𝑧𝑖(𝑡), 𝑣𝑗(𝑡)) ≤ 0


𝑋(𝑡) ≥ 0 𝑋(𝑡0) = 𝑋0

∆𝑡 = 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺

}

∀ 𝑡𝑔 ∈ [𝑡0, 𝑡𝑓]

1.10

Capítulo 1:

Estado del Arte

21

Finalmente, como alternativa a las aproximaciones SOA y DOA, Hjersted & Henson [158]

propusieron la aproximación directa (DA por sus siglas en inglés: Direct Approach), la cual se

caracteriza por resolver las ecuaciones diferenciales en cada intervalo de tiempo. Lo que permite

conservar dichas ecuaciones diferenciales mediante el uso métodos como colocación ortogonal, ya

mencionado en la aproximación DOA. Sin embargo, DA cuenta con la ventaja de no hacer una

sola optimización en todo el tiempo de fermentación, sino una por cada intervalo de tiempo, lo cual

reduce considerablemente la capacidad de cómputo y el tiempo de simulación.

Ahora bien, los reportes de uso de DFBA son limitados, aunque se destacan por modelar con

bastante precisión cultivos por lote y lote alimentado. Los primeros estudios fueron realizados por

Varma & Palsson [159] y Mahadevan et al. [30]. Posteriormente los reportes anuales han

aumentado aproximadamente de manera lineal, donde la mayoría emplean como modelo biológico

S. cerevisiae [32, 46-49, 55, 158, 160-166], E. coli [30, 50, 51, 159, 167-172], y cocultivos de S.

cerevisiae y E. coli [52, 53, 173, 174], otros modelos estudiados son células CHO, Shewanella

oneidensis, Lactococcus lactis, Clorella sp [54, 157, 175-177]. En contraste, al emplear como

modelo biológico Clostridium sólo existe un reporte, en el cual se lleva a cabo el cocultivo de C.

acetobutylicum y C. cellulolyticum para convertir la celulosa en butanol [131]. Por lo tanto, es

posible concluir que no existen reportes del empleo de DFBA para predecir la conversión de

glicerol a PDO empleando cepas de Clostridium.

1.6 Perturbaciones en análisis de balances de flujo dinámico

La implementación de herramientas computacionales cada vez más robustas ha permitido el

desarrollo de diferentes tipos de modelos biológicos cada vez más complejos, que buscan desde

entender hasta predecir diferente tipos de comportamientos biológicos como redes de

señalamiento, quorum sensing, modelos cinéticos estructurados, modelos de crecimiento, etc [57,

178]. Sin embargo, dichos modelos presentan retos en común como la selección adecuada de los

valores de los parámetros a emplear o la capacidad de respuesta a perturbaciones en éste [179]. Es

por lo anterior que diferentes métodos de análisis de sensibilidad han sido desarrollados en dichos

modelos biológicos, no obstante, ninguno de ellos está enfocado en predicciones dinámicas de

modelos GSM [57, 178, 180-187].

El análisis de sensibilidad puede ser desarrollado por dos aproximaciones: análisis local y análisis

global. En el caso del análisis local, sólo un parámetro de entrada es variado en un rango

determinado y se evalúa la respuesta de un parámetro de salida. Sin embargo este tipo de

aproximación no es recomendado en sistemas biológicos dado que existe incertidumbre en el valor

que se escoja de los parámetros de entrada que se mantienen constantes [57]. Es por tal motivo que

en modelos biológicos es más adecuado el análisis global, en el cual todos los parámetros de

entrada son evaluados en rangos definidos de manera simultánea. Entre los métodos de análisis de

sensibilidad global están: Análisis de sensibilidad Multi-Paramétrico (MPSA por sus siglas en

inglés: Multi-parametric sensitivity analysis), Análisis Rango Parcial de Coeficiente de

Correlación (PRCC por sus siglas en inglés: Partial rank correlation coefficient), Método de

Morris, Método de Sobol o Prueba de sensibilidad de amplitud de Fourier (FAST, por sus siglas en

inglés: Fourier Amplitude sensitivity test) [57, 188]. Métodos como MPSA o PRPP requieren de un

bajo costo computacional, pero están restringidos a modelos monotónicos, en contraste métodos

como Sobol o FAST son altamente demandantes de cómputo y sólo son recomendados en modelos

biológicos de pequeña escala [57]. Sin embargo, se ha demostrado una alta correlación en los

resultados entre métodos de baja demanda como PRPP y alta demanda como Sobol y FAST [183].


Clostridium sp

Por otro lado, modelos GSM usados en la predicción del crecimiento y formación de un metabolito

de interés suelen ser perturbados metabólicamente en estado estacionario para predecir mutantes

por deleción que permitan mejorar los rendimientos de dicho metabolito [58]. Lo anterior puede

ser extrapolado en modelos dinámicos y predecir no sólo rendimientos sino también tiempos de

cultivo y concentraciones finales. Otros tipo de perturbaciones pueden ser realizadas durante una

fermentación usando FBA dinámico, como es el caso de predicción de cultivos por lote alimentado

[54-56].

1.7 Avances del grupo investigación en Microorganismos

Solventogénicos del IBUN

El grupo de Microorganismos Solventogénicos perteneciente al Instituto de Biotecnología de la

Universidad Nacional de Colombia inició investigación en solventes obtenidos a partir de cepas de

Clostridium con el aislamiento de cepas promisorias en 1995 [14], a las cuales se les ha hecho gran

número de estudios bioquímicos y moleculares [189-193], posteriormente fueron seleccionadas las

cepas Clostridium sp IBUN 13A y Clostridium sp IBUN 158B como las más aptas para la

producción de PDO [15, 194]. Entre los últimos estudios para la obtención de PDO destaca la

optimización del medio de cultivo [16] y análisis de proteómica para identificar la producción de

enzimas en dos fases de crecimiento [19], obtención de mutantes tanto por sobreexpresión como

por knockout [17], y secuenciación y anotación del genoma [18].

En adición, el grupo de investigación contó con una alianza con Ecodiesel Colombia S.A. y tuvo

un proyecto aprobado en la convocatoria 562 de Colciencias llamado “Programa estratégico para la

biotransformación sostenible de glicerina cruda en 1,3-Propanodiol y prospectiva para el

desarrollar una biorefinería en Ecodiesel Colombia S.A.”, donde uno de los objetivos fue el diseño

de un proceso técnicamente eficiente para la producción y purificación biotecnológica de PDO a

nivel de planta piloto. Por lo cual, entre otras cosas, el grupo de investigación esperaba modelar el

proceso de fermentación, objetivo de gran interés para Ecodiesel. Mientras que otro objetivo del

proyecto estaba más encaminado en la línea básica y por ende de mayor interés académico que

industrial, en el cual se esperaba reconstruir la red metabólica, realizar los análisis de balances de

flujo, realizar estudio de transcriptómica y proponer mutantes sobreproductoras.

1.8 Planteamiento del problema

Dentro del macroproyecto “Programa estratégico para la biotransformación sostenible de glicerina

cruda en 1,3-Propanodiol y prospectiva para el desarrollar una biorefinería en Ecodiesel Colombia

S.A.” se esperaba modelar el proceso de fermentación, sin embargo, los modelos reportados para la

obtención de PDO son limitados y poco precisos dado que son modelos no estructurados y no

involucran la red metabólica, la cual ha demostrado incidir en los rendimientos según las

condiciones de la fermentación [9, 97, 121, 122].

Por otro lado, como herramienta útil para predecir el comportamiento de la red metabólica está el

FBA, cuya aplicación en la obtención de PDO, ya sea empleando Clostridium butyricum o

Klebsiella pneumoniae, está limitada a estudios comparativos, los cuales emplean redes

metabólicas simplificadas, incluso algunas sólo incluyen la ruta catabólica de la célula, pero

ningún modelo GSM [22, 147-153]. En contraste, el empleo de la aproximación dinámica del FBA

no tiene reportes en la literatura para la producción de PDO, a pesar que ha mostrado predecir con

Capítulo 1:

Estado del Arte

23

bastante precisión modelos biológicos como S. cerevisiae y E. coli, células CHO, Shewanella

oneidensis, Lactococcus lactis, entre otros.

Por lo anterior, ante lo impráctico que resulta proponer un modelo cinético de las reacciones

intracelulares debido a la gran cantidad de reacciones involucradas [161] y que las estrategias

computacionales, las cuales permiten modelar el comportamiento celular, representan una

oportunidad para modelar políticas de operación de fermentaciones por lotes y lote alimentado

[165, 168], surge como hipótesis que es posible desarrollar un modelo de análisis de balance de

flujo dinámico (DFBA) que describa la producción de PDO a partir de glicerol en una cepa de

Clostridium, el cual pueda ser validado experimentalmente.

1.9 Objetivos

1.9.1 Objetivo general.

Desarrollar un modelo dinámico que describa la producción de PDO de una cepa nativa de

Clostridium mediante el desarrollo del análisis de balance de flujo dinámico.

1.9.2 Objetivos específicos.

Determinar in silico la estabilidad de la red metabólica de una cepa nativa de

Clostridium mediante análisis de balance de flujo en estado estacionario.

Deducir un modelo dinámico de balance de flujo que permita predecir la producción

de PDO.

Validar modelo propuesto in silico mediante el uso de datos experimentales obtenidos

de la fermentación de la cepa nativa de Clostridium estudiada.

Realizar análisis de sensibilidad que establezca algunos factores con significancia en la

producción de PDO.


Clostridium sp

2. Capítulo 2: Metodología

2.1 Ajuste del modelo en estado estacionario

2.1.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM

Fue empleada la anotación cruda por RAST de la bacteria colombiana Clostridium sp IBUN 13A

para la reconstrucción del modelo GSM. El genoma crudo se encuentra disponible en el GenBank

con el número de acceso NZ_JZWG00000000.1 [18], tiene un tamaño de 4.6 millones de pares de

bases y fueron detectados en total 4086 genes. Mediante ortología de genes y enzimas fue obtenida

la red cruda de reacciones. Dichas reacciones y sus respectivos metabolitos fueron expresados en

nomenclatura KEGG. Por otro lado, la base de datos de SEED [23] fue empleada para determinar

la direccionalidad o reversibilidad de las reacciones según su energía libre de Gibbs. La base de

datos SEED también fue utilizada para realizar los balances de masas y cargas a pH 7.

Así mismo, fueron empleados los valores de Mantenimiento Asociado al Crecimiento (GAM, por

sus siglas en inglés: Growth-associated maintenance) y Mantenimiento no asociado al crecimiento

(NGAM, por sus siglas en inglés: Non-Growth-associated maintenance) reportados para

Clostridium acetobutylicum ATCC 824, los cuales son 40 mmol·ATP/g y 5 mmol·ATP/g·h,

respectivamente [130]. Igualmente fue empleada la composición de biomasa reportada en el

modelo GSM de C. beijerinckii [134] para la elaboración de reacciones empíricas de formación de

macromoléculas y de biomasa. Sin embargo dicha composición estaba en base másica y por tanto

corregida a base molar con el fin de asegurar la conservación de materia en dichas reacciones.

La estrategia de curación inicial empleada fue ingeniería reversa propuesta por Senger &

Papoutsakis [128], la cual es presentada en la Figura 2.1. Brevemente, la metodología consiste en

realizar el FBA, Ecuación 1.7, maximizando la formación de biomasa, Ecuación 2.1. Dicha

metodología permite identificar errores en la red metabólica mediante activación e inactivación de

reacciones temporales de transporte para cada uno de los constituyentes de la biomasa (ADN,

ARN, proteínas, lípidos, pared celular entre otros) y sus respectivos precursores (por ejemplo para

las proteínas todos los aminoácidos). Dichos errores detectados son corregidos adicionando

manualmente las reacciones faltantes, las cuales son obtenidas a partir de modelos GSM de

referencia. Al finalizar, la red no tendrá inconsistencias si en el desarrollo de un FBA hay un valor

de µ mayor a cero y todas las reacciones de transporte temporales han sido eliminadas nuevamente.

𝑀𝑎𝑥 𝑍 = 𝜇 = ∑ 𝑐𝑗 ∙ 𝑣𝑗

𝑁

𝑗 =1

2.1


Clostridium sp

Figura 2.1. Diagrama de flujo de ingeniería reversa para la reconstrucción del modelo GSM [128]

No obstante, el método de curación de ingeniería reversa sólo detecta el número mínimo de

reacciones necesarias para lograr un crecimiento in silico del microorganismo. Por lo tanto, otros

metabolitos aún pueden permanecer bloqueados por falta de al menos una reacción que no es

esencial para el crecimiento. Por tal motivo fue empleado método automatizado GapFind para la

detección de dichos metabolitos bloqueados y GapFill para su solución mediante la adición

mínima de reacciones [129]. Tanto en el desarrollo de la curación semiautomatizada como

automatizada fueron empleados como bases de datos las reacciones de los modelos GSM de otras

cepas solventogénicas de Clostridium, Tabla 1.7. Lo anterior fue realizado asumiendo homología

entre cepas de un mismo género, por consiguiente en la base de datos no fueron incluidas

reacciones de otros modelos biológicos como E. coli. Asi mismo, fueron empleados datos

experimentales de la fermentación de Clostridium butyricum en glicerol como base de datos de

reacciones de intercambio y transporte de sustratos y productos extracelulares propios de dicha

fermentación [19, 21, 108].

Como última etapa de curación fueron detectados y eliminados los ciclos termodinámicamente

infactibles del modelo GSM de Clostridium sp IBUN 13A siguiendo la metodología propuesta por

Capítulo 2:

Metodología 27

Schellenberger et al. [195]. Esta metodología consiste en la detección de las reacciones con fluxes

máximo y/o mínimo iguales a los límites posibles, es decir 1000 y -1000 mmol/g·h,

respectivamente, según Análisis de Variabilidad de Fluxes (FVA, por sus siglas en inglés: Flux

Variability Analysis), Ecuación 2.2 [58, 196]. Posteriormente dichas reacciones, con sus

respectivos metabolitos, son expresadas de forma matricial y es calculado su espacio nulo, donde

cada ciclo es detectado con sus respectivas reacciones. Los ciclos son resueltos mediante revisión

de la reversibilidad e irreversibilidad de las reacciones involucradas, eliminación de reacciones

repetidas o como última alternativa boqueo de alguna de las reacciones. Finalmente, es repetido el

procedimiento hasta que el espacio nulo sea cero y por lo tanto el modelo GSM reconstruido estará

curado.

𝑀𝑎𝑥 𝑣𝑗 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁


{


𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥 , ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑍 = {𝑍ó𝑝𝑡𝑖𝑚𝑜 𝑠𝑖 𝐹𝐵𝐴 𝑒𝑠 𝐿𝑃

0.95 ∗ 𝑍ó𝑝𝑡𝑖𝑚𝑜 𝑠𝑖 𝐹𝐵𝐴 𝑒𝑠 𝑁𝐿𝑃 }

𝑀𝑖𝑛 𝑣𝑗 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁


{


𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥, ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑍 = {𝑍ó𝑝𝑡𝑖𝑚𝑜 𝑠𝑖 𝐹𝐵𝐴 𝑒𝑠 𝐿𝑃

0.95 ∗ 𝑍ó𝑝𝑡𝑖𝑚𝑜 𝑠𝑖 𝐹𝐵𝐴 𝑒𝑠 𝑁𝐿𝑃 }

2.2

2.1.2 Ajuste de modelos cinéticos empleados como restricciones.

Previo a las predicciones de crecimiento fue ajustada una cinética del máximo flux de secreción del

ácido acético. Lo anterior fue realizado dado que según datos reportados de cultivos continuos en

glicerol de C. butyricum DSM 5431 [108] y C. butyricum F2b [88] es observada una tendencia

alostérica de dicho flux en función del flux de consumo de glicerol. Por lo tanto, para posteriores

predicciones de FBA y DFBA empleando glicerol como única fuente de carbono, fue empleado

dicho ajuste alostérico como restricción cinética, Ecuación 2.3. Los fluxes experimentales de

secreción de otros productos no mostraron una tendencia clara en ambos cultivos de referencia y

por tanto no fueron ajustadas cinéticas de secreción a éstos.

𝑣𝐴.𝐴𝑐.𝑚𝑎𝑥 =

𝑣∞𝑎𝑎 ∙ 𝑣0

𝑎𝑎 ∙ 𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦)

𝑣∞𝑎𝑎 + 𝑣0

𝑎𝑎 ∙ [𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦) − 1]

2.3

Adicional al ajuste cinético presentado en la Ecuación 2.3, fue calculada la constante de muerte

(kd) tanto para exceso como para limitación de glicerol, las cuales fueron estimadas a partir de

cultivos continuos reportados por Solomon et al. [108]. Finalmente, a partir de fermentaciones de

la cepa Clostridium sp IBUN 158B a condición inicial de glicerol de 406.3 y 136.2 mM, presente

investigación, y 540.2 mM [15] fue calculada la cinética de consumo de glicerol en función de la

concentración de glicerol, Ecuación 2.4. Las predicciones de cinética de consumo de glicerol y

constante de muerte fueron empleadas como restricciones sólo en las predicciones dinámicas. La

Tabla 2.1 resume los diferentes parámetros cinéticos ajustados empleando glicerol como única

fuente de carbono. Los diferentes ajustes fueron realizados empleando el software TableCurve

2D® (Systat Software Inc., San Jose, California, USA).


Clostridium sp

𝑣𝐺𝑙𝑦 = (𝑣𝑚𝑎𝑥𝐺𝑙𝑦

∙ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙]

𝑘𝑠𝐺𝑙𝑦

+ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙]) ∙ (1 −

[𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙]

𝑘𝐼𝐺𝑙𝑦 ) 2.4

Tabla 2.1. Resumen parámetros cinéticos empleados como restricciones en modelos FBA y DFBA

con glicerol como única fuente de carbono

Parámetro Descripción Unidades Origen datos

experimentales

𝑣0𝑎𝑎

Flux basal de formación de ácido acético (Flux

consumo de glicerol tiende a cero) mmol/g·h [88, 108]

𝑣∞𝑎𝑎

Flux máximo de formación de ácido acético (flux de

consumo de glicerol tiende a infinito) mmol/g·h [88, 108]

𝑅𝑎𝑎 Tasa de formación de ácido acético en función del

flux de consumo de glicerol. g·h/mmol [88, 108]

𝑘𝑑𝑙𝑖𝑚

Constante de muerte a condiciones de limitación de

glicerol h

-1 [108]

𝑘𝑑𝑒𝑥𝑐

Constante de muerte a condiciones de exceso de

glicerol h

-1 [108]

𝑣𝑚𝑎𝑥𝐺𝑙𝑦

Flux máximo de consumo de glicerol mmol/g·h Este estudio y

[15]


Constante de afinidad del flux consumo de glicerol

a la concentración de glicerol en el medio mM

Este estudio y

[15]

𝑘𝐼𝐺𝑙𝑦

Constante de inhibición del flux consumo de

glicerol por concentración de glicerol en el medio mM

Este estudio y

[15]

2.1.3 Predicción del crecimiento con FBA

La capacidad predictiva del crecimiento y producción de PDO del modelo GSM reconstruido fue

determinada mediante comparación con datos experimentales de cultivos continuos de la cepa C.

butyricum DSM 5431 reportados por Solomon et al. [108]. Dichos datos fueron clasificados por

Solomon et al. según contenido de glicerol como: glicerol en limitación (concentración inferior a

15 g/L o 163 mM) o glicerol en exceso (concentración superior a 15 g/L o 163 mM). Por lo tanto,

adicional a la restricción cinética de la Ecuación 2.3, fue fijado el flux de consumo de glicerol

según valores experimentales.

La predicción de fluxes por FBA fue originalmente realizada maximizando la biomasa, Ecuación

2.1, realizada por Programación Lineal (LP, por sus siglas en inglés: Linear Programming).

También fueron empleadas las funciones objetivo maximización de biomasa mientras minimiza el

uso enzimático y maximización de biomasa mientras minimiza el uso enzimático y la producción

de ATP, Ecuaciones 2.5 y 2.6, respectivamente, las cuales fueron resueltas mediante Programación

No Lineal (NLP, por sus siglas en inglés: Nonlinear Programming). Tanto la optimización LP

como NLP fueron realizadas con el solver CONOPT v3.15N, el cual se caracteriza por desarrollar

sistemas NLP de gran escala, como son los modelos GSM [56, 156, 158, 197]. El programa

empleado fue GAMS (General Algebraic Modeling System, GAMS Development Corp.,

Washington, DC) software V.24.2.2 r44857 para Linux.

Capítulo 2:

Metodología 29

𝑀𝑎𝑥 𝑍 =𝜇

∑ 𝑣𝑗2𝑁

𝑗 =1

2.5

𝑀𝑎𝑥 𝑍 =𝜇

(𝑤 ∙ ∑ 𝑣𝑗2𝑁

𝑗 =1 + (1 − 𝑤) ∙ 𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑2 )

𝑤 ∈ (0,1) 2.6

Dónde:

∑ 𝑣𝑗2𝑁

𝑗 =1 es la suma del cuadrado de todos los fluxes, el cual corresponde al flux intracelular

total y es entendido como la máxima eficiencia enzimática durante el crecimiento.

𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑2 es la suma del cuadrado de todos fluxes de reacciones con factibilidad

termodinámica para producir ATP.

𝑤 es el peso el cual varía entre 0 y 1.

Posteriormente fue realizada la Búsqueda de fluxes enlazados (FCF, por sus siglas en inglés: Flux

Coupling Finder), la cual consiste en determinar si existe acoplamiento de los N fluxes del modelo

a un flux en específico, en este caso la velocidad de crecimiento µ, Ecuación 2.7 [198]. Las

reacciones fueron clasificadas según su acoplamiento al crecimiento como se muestra la Tabla 2.2.

Una vez clasificadas las reacciones, se realizó la correspondiente clasificación de las enzimas

presentes en el modelo. Por consiguiente, una enzima estaba completamente acoplada al

crecimiento si al menos una de las reacciones que cataliza lo estaba. Mientras que una enzima

parcialmente acoplada al crecimiento no cataliza reacciones totalmente acopladas, pero sí al menos

una parcialmente acoplada al crecimiento. Así mismo, una enzima direccionalmente acoplada sólo

cataliza reacciones direccionalmente acopladas al crecimiento y posiblemente reacciones

bloqueadas. Finalmente, una enzima estará bloqueada o no acoplada al crecimiento si todas las

reacciones que catalizan están bloqueadas o no acopladas, respectivamente.

𝑀𝑎𝑥 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥 = 𝑣𝑗/𝜇 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁


{


𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥 , ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝐴𝑇𝑃𝑀 = 𝑁𝐺𝐴𝑀

𝜇𝐹𝐵𝐴 }

𝑀𝑖𝑛 𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛 = 𝑣𝑗/𝜇 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁


{


𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥, ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝐴𝑇𝑃𝑀 = 𝑁𝐺𝐴𝑀

𝜇𝐹𝐵𝐴 }

2.7

Tabla 2.2. Criterio de clasificación de acoplamiento de las reacciones al crecimiento según FCF

[198]

Clasificación Criterio1

Bloqueadas 𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛 = 0 ˄ 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥 = 0

No acoplada al crecimiento 𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛 = 0 ˄ | 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥| = ∞

Direccionalmente acopladas al crecimiento 𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛 = 0 ˄ | 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥| = 𝑐𝑡𝑒

Parcialmente acopladas al crecimiento |𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛| = 𝑐𝑡𝑒1 ˄ | 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥| = 𝑐𝑡𝑒2

Completamente acopladas al crecimiento 𝑅𝑗,𝑚𝑖𝑛 = 𝑅𝑗,𝑚𝑎𝑥 = 𝑐𝑡𝑒 1 cte, cte1 y cte2 son constantes positivas diferentes de cero


Clostridium sp

También fue evaluada la capacidad predictiva de la expresión de enzimas, lo cual fue realizado

mediante comparación de la enzimas presentes tanto en el modelo GSM reconstruido como en el

proteoma de la cepa Clostridium butyricum DSM 10702 cultivada en glicerol [26]. Dado que la

FCF es un proceso estacionario y el proteoma reportado por Gungormusler-Yilmaz et al. [26]

procede de un cultivo por lotes, se decidió emplear el proteoma correspondiente a la fase

exponencial de crecimiento, pues la velocidad específica de crecimiento es aproximadamente

constante durante esta etapa de crecimiento. Para dicha comparación fueron excluidas enzimas

bloqueadas según FCF. En el caso de las enzimas no bloqueadas que fueron detectadas en el

proteoma, se supuso eran activas y catalizaban al menos una reacción, por lo tanto la expresión de

la enzima podía ser: a) predicha si el flux de al menos una reacción catalizada por esta enzima era

diferente de cero o b) no predicha si los fluxes de todas las reacciones catalizadas por la enzima

detectada en el proteoma eran cero. Por otro lado, todas las enzimas de expresión predicha fueron

empleadas en la comparación de su nivel de expresión reportado por Gungormusler-Yilmaz et al.

[26] como el Log2 del Ion Total Actual (TIC, por sus siglas en inglés: Total ion Current) con su

respectivo flux normalizado con base en el flux de consumo de glicerol. Dado que algunas enzimas

reportaron más de un valor de nivel de expresión y/o catalizan más de una reacción activa, fueron

empleados los valores máximos de nivel de expresión y de flux normalizado para la comparación.

Finalmente, fue realizada la validación experimental usando datos de cepas de Clostridium

butyricum cultivadas en sustratos diferentes al glicerol, como glucosa [146] y otros carbohidratos

[199]. Las predicciones de crecimiento con estos sustratos fueron realizadas empleando como

función objetivo la mostrada en la Ecuación 2.5. Por otro lado, fue empleado el transcriptoma

reportado por Calusinska et al. [200] para la cepa C. butyricum CWBI 1009 como validación del

modelo GSM. Esta cepa fue cultivada en glucosa usando fermentación por lotes a condiciones no

controladas de pH. Así mismo, Calusinska et al. [200] emplearon reactor de 20L, por consiguiente

características como agitación o suministro de gas no son consideradas como parámetros de

incidencia como sí lo es el medio de cultivo a esta escala [100, 101]. La comparación entre

transcriptómica y fluxes predichos fue realizada de manera análoga a la comparación previamente

descrita entre proteómica y fluxes predichos. Por lo tanto, fue empleado el transcriptoma detectado

durante la fase de crecimiento exponencial, el cual está compuesto por ARN mensajeros

codificantes para un total de 913 enzimas (513 únicas y 381 redundantes).

2.1.4 Modelado de escenarios con incremento en el rendimiento de PDO

2.1.4.1 Predicción de estados fenotípicos de mutantes por knockout

Con el objetivo de predecir escenarios con incremento en el rendimiento YPDO/S, fueron realizadas

perturbaciones en la modelo GSM mediante la deleción in silico de enzimas. Las deleciones fueron

tanto simples como dobles siguiendo la estrategia de minimización de Regulación on/off (ROOM,

por sus siglas en inglés: Regulatory On/Off Minimization) [201], la cual es mostrada en la

Ecuación 2.8. Las enzimas consideradas en el análisis fueron las clasificadas como

direccionalmente acopladas al crecimiento de acuerdo al análisis FCF descrito en el apartado 2.1.3,

Predicción del crecimiento con FBA. La aproximación ROOM fue seleccionada para la predicción

de los estados fenotípicos de mutantes dado que ésta ha sido reportada como la aproximación más

adecuada para predecir mutantes por knockout [45]. Lo anterior, debido a que la aproximación

ROOM busca mantener tanto la estabilidad de la red metabólica como de la expresión de genes y

por consiguiente minimiza el número de reacciones que cambian su flux según unos límites de

confianza dados. Es decir que ROOM emplea números binarios y su desarrollo es mediante

Capítulo 2:

Metodología 31

programación que incluye variables enteras (MIP por sus siglas en inglés: Mixed Integer

Programming), el cual fue resuelto empleando el solver CPLEX 12.6.0.0 para GAMS.

𝑀𝑖𝑛 ∑𝑏𝑗

𝑁

𝑗=1

𝑆𝑢𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑎

{

∑ 𝑆𝑖𝑗𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥 ˄ 𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑖𝑛 {

0 ∀ 𝑣𝑗 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑐

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑚𝑎𝑥 ˄ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑚𝑖𝑛 ∀ 𝑣𝑗 {𝑛𝑜 𝑐𝑎𝑡 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑐 𝑐𝑎𝑡 𝑝𝑜𝑟 𝑖𝑠𝑜𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑐

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑏𝑗(𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑎𝑥 − 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑢 ) ≤ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑢 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑏𝑗(𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑖𝑛 − 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑙 ) ≥ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑙 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑢 = 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒 + 𝛿|𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒| + 휀 ∀ 𝑗 ∈ 1,… , 𝑁

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑙 = 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒 − 𝛿|𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒| − 휀 ∀ 𝑗 ∈ 1,… , 𝑁

𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥 =


𝑎𝑎 ∙ 𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒)


𝑎𝑎 ∙ [𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒) − 1]

𝑏𝑗 = [0,1] ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝛿 ≈ 0.05 휀 ≈ 0.001

𝑆𝑢𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑎 { 𝐹𝐵𝐴 𝑐𝑒𝑝𝑎 𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒.

}

2.8

Dónde:

𝑏𝑖 es la variable binaria de la reacción j, siendo 1 si la reacción cambió su flux

significativamente en comparación con la cepa silvestre y 0 en caso contrario.

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑢 y 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑙 son los límites superior e inferior de confianza, respectivamente, en los

cuales se considera no hay cambio significativo del flux de la reacción j en comparación con la

cepa silvestre.

𝛿 y 휀 son los rangos de tolerancia relativo y absoluto para el cambio de flux, respectivamente.


Clostridium sp

2.1.4.2 Perturbación en la composición de la biomasa

Adicional a las perturbaciones realizadas al modelo GSM mediante la deleción de enzimas,

también se llevaron a cabo perturbaciones en la composición de la biomasa. Lo anterior, en busca

de mejoras en la predicción de PDO producido en función de la composición de biomasa, la cual

puede ser controlada de acuerdo a la composición del medio de cultivo [202, 203]. Estas

perturbaciones fueron realizadas mediante variación de los coeficientes estequiométricos de las 8

macromoléculas (Proteína, ADN, ARN, Peptidoglicano, Lípido, Ácido Teicoico, Carbohidrato y

Trazas), 7 ácidos grasos (C18:1, C18:0, C14:0, C16:0, C16:1, C17cyc y C19cyc), 20 aminoácidos

(Glutamato, Glicina, Alanina, Lisina, Aspartato, Arginina, Glutamina, Serina, Metionina,

Triptófano, Fenilalanina, Tirosina, Cisteína, Leucina, Histidina, Prolina, Asparagina, Valina,

Treonina e Isoleucina), 8 nucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, ATP, GTP, CTP y UTP), 3

fosfolípidos (Fosfatidilglicerol o PtdGly, fosfatidiletanolamina o PtdEtn y fosfatidil N-

metiletanolamina o PtdMen) y 6 cofactores (NAD, NADP, CoA, FAD, FMN y THF). Diferentes

FBA fueron realizados empleando método de Monte Carlo donde las composiciones fueron

asignadas de manera aleatoria con una distribución Normal con desviación estándar relativa (DER)

del 30%. En total fueron realizadas 10000 simulaciones, donde 965 de ellas fueron excluidas dado

que al menos una de las composiciones generadas era negativa. El análisis estadístico fue realizado

mediante cálculo de los coeficientes de correlación de Pearson, Ecuación 2.9. Como variables de

respuesta fueron considerados el rendimiento de biomasa (YX/S) y el rendimiento de PDO (YPDO/S),

mientras que el tamaño de la muestra corresponde a las restantes 9035 combinaciones de

coeficientes estequiométricos.

𝑟𝑋𝑌 =𝐶(𝑋, 𝑌)

𝜎𝑋 ∙ 𝜎𝑌 2.9

Dónde:

𝑟𝑋𝑌 es el coeficiente de correlación de Pearson entre la variable independiente X y variable de

respuesta Y.

𝜎𝑋 y 𝜎𝑌 son las desviaciones estándar de la variable independiente X y variable de respuesta Y,

respectivamente. 𝐶(𝑋, 𝑌) es la covarianza entre la variable independiente X y variable de respuesta Y.

2.1.4.3 Predicción de estados fenotípicos empleando co-fermentación

Finalmente como estrategia de mejora del rendimiento de PDO (YPDO/S) fue evaluada la

perturbación en el medio de cultivo mediante empleo de dos sustratos: glucosa y glicerol. Siendo la

glucosa empleada por la célula en la ruta oxidativa, permitiendo emplear más glicerol en la ruta

reductiva y por lo tanto incrementar la conversión del glicerol a PDO [204]. Fueron evaluados

diferentes fluxes de consumo de glicerol y de glucosa empleando un diseño experimental factorial

completo con el fin de obtener un plano de fases fenotípico (PhPP, por sus siglas en inglés:

Phenotypic phase plane) [58].

2.2 Desarrollo del modelo en estado dinámico

El desarrollo del DFBA tanto por aproximaciones DOA como DA requiere de la parametrización

de las ecuaciones diferenciales para su resolución numérica [30, 158]. Para lo anterior fue

empleado el polinomio de interpolación de Lagrange, Ecuación 2.10, el cual es de orden P si pasa

Capítulo 2:

Metodología 33

por P+1 puntos (xa, yb). Así mismo, la Ecuación 2.11 muestra la primera derivada del polinomio de

interpolación de Lagrange [205]. Los puntos de colocación xa fueron calculados mediante uso de

polinomios ortogonales, la Tabla 2.3 muestra los valores de dichos puntos correspondientes a

diferentes polinomios estándar de seis puntos de colocación, los cuales fueron calculados a partir

de paquete Orthopolynom de R Project. El empleo de un mayor número de puntos de colocación

supondría una mayor precisión en el ajuste de las ecuaciones diferenciales, sin embargo la

demanda computacional se incrementaría de manera exponencial. Posteriormente se hizo la

transformación de los puntos de colocación para el intervalo de integración de acuerdo al tamaño

de paso Δt, como es mostrado en la Ecuación 2.12.

𝑌𝑃(𝑋) = ∑[𝑦𝑏(𝑥𝑎) ∙ 𝑙𝑏(𝑥𝑎)]

𝑃+1

𝑎=1

{

𝑦𝑏(𝑥𝑎) = {

0 𝑎 ≠ 𝑏𝑦𝑏 𝑎 = 𝑏

𝑙𝑏(𝑥𝑎) =∏𝑥 − 𝑥𝑏𝑥𝑎 − 𝑥𝑏

𝑃+1

𝑏=1𝑏≠𝑎

∀ 𝑎, 𝑏 ∈ 1,… , 𝑃 + 1 2.10

Dónde:

𝑌𝑃(𝑋) es el polinomio interpolador de Lagrange de la variable dependiente Y en función de la

variable independiente X.

𝑃 + 1 es el número de puntos de colocación por los cuales pasa el polinomio de grado 𝑃.

𝑥𝑎 es el punto de colocación a.

𝑦𝑏 es el punto de intercepción b.

𝑙𝑏(𝑥𝑎) es el término b del polinomio interpolador de Lagrange

𝑑 𝑌𝑃(𝑋)

𝑑𝑋= ∑ [𝑦𝑏(𝑥𝑎) ∙

𝑑 𝑙𝑏(𝑥𝑎)

𝑑 𝑥]

𝑃+1

𝑎=1

2.11

Tabla 2.3 puntos de colocación xa para diferentes polinomios ortogonales con 6 puntos de

colocación

polinomio ortogonal x0 x1 x2 x3 x4 x5

Chebyshev de Primer orden -0.9659 -0.7071 -0.2588 0.2588 0.7071 0.9659

Chebyshev de segundo orden -0.9010 -0.6235 -0.2225 0.2225 0.6235 0.9010

Laguerre 0.2228 1.1889 2.9927 5.7751 9.8375 15.9829

Legendre -0.9325 -0.6612 -0.2386 0.2386 0.6612 0.9325

Hermite -2.3506 -1.3359 -0.4361 0.4361 1.3359 2.3506

𝑡𝑎 =∆𝑡

𝑥5 − 𝑥0∙ 𝑥𝑎 +

∆𝑡

2 2.12

Ahora bien, dado que la aproximación DOA demanda mayor capacidad de cómputo que la

aproximación DA, esta última fue empleada para la selección tanto del polinomio ortogonal como

del tamaño de paso más adecuados. La función objetivo a solucionar en cada intervalo g

empleando la aproximación DA es mostrada en la Ecuación 2.13. El vector z corresponde a las

concentraciones de los metabolitos extracelulares, uno por cada reacción de intercambio presente

en modelo GSM, es decir 78 incluyendo la biomasa X, por consiguiente fueron calculados 468


Clostridium sp

puntos de intercepción para cada intervalo además de todos los fluxes del vector v. Los parámetros

cinéticos empleados son los mencionados en el numeral 2.1.2 (Ajuste de modelos cinéticos

empleados como restricciones.). Finalmente, la Tabla 2.4 muestra los valores z0 y X0

correspondientes a las concentraciones iniciales de los metabolitos extracelulares medidos

experimentalmente en las diferentes fermentaciones, los metabolitos no incluidos en la esta tabla

tienen una concentración inicial igual cero.

𝑀𝑎𝑥 𝜇

(𝑤 ∙ ∑ 𝑣𝑗2𝑁

𝑗 =1 + (1 − 𝑤) ∙ 𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑2 )


{

𝑑𝑧𝑖𝑑𝑡

= − ∑ 𝑆𝑖𝑗


𝑗=1


𝑑𝑋

𝑑𝑡= (𝜇 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋


𝑁

𝑗 =1

= 0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑤 {1.00 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] ≤ 163𝑚𝑀

0.04 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] > 163𝑚𝑀

𝑘𝑑 {𝑘𝑑𝑙𝑖𝑚 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] ≤ 163𝑚𝑀

𝑘𝑑𝑒𝑥𝑐 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] > 163𝑚𝑀

𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜𝑚𝑎𝑥 =










𝑘𝐼𝐺𝑙𝑦 )


𝑋(𝑡) ≥ 0 𝑋(𝑡0) = 𝑋0

𝑡𝑔 = 𝑡0 + 𝑔 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺 }

∀ 𝑡𝑔 ∈ [𝑡0, 𝑡𝑓]

2.13

Posteriormente, fueron realizadas las predicciones del análisis de balance de flujo dinámico

(DFBA) usando aproximaciones DOA, SOA y DA, Ecuaciones 1.8, 1.10 y 2.13, respectivamente.

Las ecuaciones diferenciales de las aproximaciones DOA y DA fueron parametrizadas empleando

el método de colocación ortogonal como fue descrito previamente. Dado que la aproximación

DOA es altamente sensible al tamaño de paso, debido a la alta probabilidad de pérdida de

factibilidad a tamaños de pasos relativamente altos, incluso 0.20h, se decidió hacer la comparación

empleando un tamaño de paso de 0.15h para las tres aproximaciones.

Capítulo 2:

Metodología 35

Tabla 2.4. Condiciones iniciales (z0) empleadas en el desarrollo de DFBA según condición de

limitación o exceso de glicerol para cultivo por lote.

(Metabolitos restantes tienen concentración inicial igual a cero).

Metabolito z

Condición inicial de exceso de

glicerol

Condición inicial de limitación de

glicerol

Fermentación 1 Fermentación 2 Fermentación 1 Fermentación 2

Glicerol 406.30 mM 524.78 mM 136.20 mM 150.27 mM

Nitrógeno 21.43 mM 21.43 mM 21.43 mM 21.43 mM

Fosfato 9.41 mM 9.41 mM 9.41 mM 9.41 mM

Cisteína 4.13 mM 4.13 mM 4.13 mM 4.13 mM

Biotina 0.0164 mM 0.0164 mM 0.0164 mM 0.0164 mM

PABA 0.0219 mM 0.0219 mM 0.0219 mM 0.0219 mM

H+ 0.0001 mM

1 0.0001 mM

1 0.0001 mM

1 0.0001 mM

1

PDO 5.92 mM 6.64 mM 7.63 mM 8.03 mM

Ac. Acético 3.00 mM 14.58 mM 2.83 mM 6.42 mM

Ac. Butírico 1.93 mM 1.82 mM 2.16 mM 0 mM

Etanol 0 mM 4.13 mM 8.04 mM 7.61 mM

Biomasa (X0) 0.0115 g/L 0.109 g/L 0.042 g/L 0.101 g/L 1 Equivalente a pH de 7.

2.3 Validación experimental del modelo dinámico desarrollado

2.3.1 Mantenimiento de la cepa y medio de cultivo empleado

La validación experimental de la predicción de producción de PDO fue realizada empleando la

cepa nativa Clostridium sp IBUN 158B disponible en el grupo de investigación de

Microorganismos Solventogénicos de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Dicha

cepa fue activada en un vial de 40mL con Medio Reforzado para Clostridium (RCM, por sus siglas

en inglés: Reinforced Clostridial Medium) estéril a pH 7 y cultivada anaeróbicamente durante 12

horas a 37°C previo choque térmico según es descrito por Aragón [15]. Posteriormente, 10 mL del

cultivo en RCM fue empleado como inóculo para crecimiento en medio industrial, cuya

composición fue previamente estandarizada y es mostrada en la Tabla 2.5 [15, 16]. Este último

cultivo se llevó a cabo bajo condiciones anaerobias en vial de 100 mL durante 24 horas a 37°C,

seguidamente el vial fue almacenado a temperatura ambiente durante 48 horas para permitir

esporulación y ser empleado como stock para la realización de posteriores cultivos en biorreactor.

2.3.2 Fermentación en condiciones controladas.

Los inóculos de la fermentación fueron obtenidos mediante el cultivo de 10mL de suspensión stock

en viales de 100 mL de medio industrial. Dichos inóculos fueron cultivados a 37°C durante 16

horas posterior a ser expuesto a choque térmico. La fermentación fue realizada en un reactor

BIOSTAT® A empleando como volumen de cultivo 1L de medio industrial e inóculo del 10%.

Durante el proceso se mantuvieron controladas las siguientes condiciones: temperatura de 37°C,

pH de 7, agitación de 90 rpm, N2 como gas de burbujeo, flujo gas de 0.005vvm, oxígeno disuelto

<1.5%, en la Figura 2.2 es mostrado el montaje del reactor.


Clostridium sp

Tabla 2.5. Composición medio industrial para cultivo de Clostridium en Glicerol [15, 16]

Componente Contenido por litro medio cultivo

Glicerol 40 g

Extracto de levadura 3 g

Cisteína 0.5 g

K2HPO4 1 g

KH2PO4 0.5 g

Biotina 4 mg

Ácido para amino benzoico 3 mg

Resarsurina1 50 μL

Solución de minerales

MgCl2 5 g/L

CaCl2 3 g/L

FeSO4·7H2O 3.7 g/L

MnSO4·H2O 3.3 g/L

CoCl2·6H2O 3.8 g/L

Na2MoO4 1.3 g/L

Zn2SO4 2.8 g/L

H2BO3 0.12 g/L

CuSO4·5H2O 0.18 g/L

NiCl2·6H2O 0.13 g/L

4 mL

1 Empleada como indicador visual de presencia de oxígeno, por tanto sólo era adicionada a los

medios usados en el cultivo de inóculos en viales.

Figura 2.2. Montaje cultivo Clostridium sp IBUN 158B en reactor BIOSTAT A.

Capítulo 2:

Metodología 37

2.3.3 Cuantificación de biomasa, sustrato y productos.

La biomasa fue medida de manera indirecta por espectrofotometría a través de lectura de la

densidad óptica a una absorbancia a 600nm en Espectrofotómetro ThermoScientific Evolution 201,

fue empleado como blanco medio estéril. La curva de calibración de peso seco fue realizada con

biomasa obtenida al finalizar el cultivo. Por otro lado, los metabolitos PDO, glicerol, ácido

butírico, ácido acético, ácido láctico, acetona, butanol y etanol, fueron cuantificados a través de

una metodología desarrollada dentro del grupo de investigación Microorganismos

Solventógenicos, en la cual se llevó a cabo una cromatografía líquida ultra rápida (UFLC) con un

detector de índice de refracción (Shimadzu ® RID 10A), a una temperatura de 60°C y una columna

AMINEX HPX – 87H (Biorad ®) a 63°C, con fase móvil de ácido sulfúrico 3 mM y un flujo de

0.5 ml/min. Con un tiempo de corrida de 50 minutos. El software integrador fue Lab Solutions

Versión 1.25 (Shimadzu ®). Las muestras de 1 mL, tomadas de la fermentación fueron

centrifugadas a 14000 rpm por 5 minutos. Posteriormente el sobrenadante fue filtrado con

membranas de 0.2 μm y almacenado a -20°C. Finalmente las muestras fueron descongeladas a

temperatura ambiente, introduciendo un volumen 750 μL, en viales de muestreo y posteriormente

colocadas en el automuestreador del equipo UFLC Shimadzu ® Prominence LC- 20AD para ser

inyectadas con un volumen de 20 μl. Las relaciones lineales y los tiempos de retención obtenidos

en este estudio se presentan en la Tabla 2.6.

Tabla 2.6. Relaciones de detección en cromatografía líquida

Sustancia Tiempo de

retención (min)

Relación lineal

Concentración (g/L)= f(Área)

Coeficiente de

correlación (R2)

Láctico 14.644 4.621*10-06

* Área + 1.224*10-01

0.9998

Glicerol 15.588 7.034*10-06

* Área + 9.977*10-02

0.9998

Ac. Acético 17.286 1.282*10-05

* Área + 9.391*10-03

0.9999

1,3-Propanodiol 20.353 8.046*10-06

* Área + 1.797*10-01

0.9999

Ac. Butírico 23.641 1.016*10-05

* Área + 2.261*10-02

0.9998

Acetona 24.346 1.361*10-05

* Área + 4.757*10-01

0.9994

Etanol 24.981 1.378*10-05

* Área - 6.219*10-02

0.9999

Butanol 41.045 9.212*10-06

* Área - 2.150*10-01

0.9996

2.4 Determinación de algunos parámetros de significancia

2.4.1 Desarrollo del análisis de sensibilidad global

En el desarrollo del análisis de sensibilidad global fueron evaluadas la composición de los 44

precursores de la formación de biomasa (7 ácidos grasos, 20 aminoácidos, 8 nucleótidos, 3

fosfolípidos y 6 cofactores) y de las 8 macromoléculas (Proteína, ADN, ARN, peptidoglicano,

lípido, ácido teicoico, carbohidrato y trazas), en adición fueron considerados los 8 parámetros

cinéticos mostrados en la Tabla 2.1, totalizando 60 parámetros de entrada a ser evaluados. La

perturbación tanto de los precursores como de las macromoléculas fue realizada mediante

variación de sus respectivos coeficientes estequiométricos en el modelo GSM. El modelo FBA

dinámico fue analizado siguiendo método de Monte Carlo, donde las K combinaciones de los

parámetros fueron generadas aleatoriamente usando una distribución normal con desviación

estándar relativa del 30% excepto para los 3 parámetros cinéticos correspondientes al consumo del

glicerol, cuya desviación estándar relativa fue del 20%, la Tabla 2.7 resume los 60 parámetros


Clostridium sp

evaluados y los respectivos rangos de variación. En total fueron realizadas 3150 combinaciones

aleatorias, sin embargo fueron considerados en el análisis 2280 de ellas dado que las restantes

simulaciones presentaron inconsistencias matemáticas como composiciones negativas o errores en

el transcurso de la simulación que la detenía antes de agotar el sustrato. Dichas simulaciones se

detenían debido a la pérdida de optimalidad en algún intervalo dado, lo cual es ocasionado por el

tamaño de paso seleccionado. Por tal motivo, en las simulaciones realizadas por método de Monte

Carlo se empleó un tamaño de paso de 0.20h.

Tabla 2.7. Parámetros evaluados en análisis de sensibilidad global de DFBA.

Parámetro Unidades Valor medio Límite inferior Límite superior

C18:1 % molar de Ácidos grasos 4.00% 0.01% 11.14%





C17cyc % molar de Ácidos grasos 12.00% 0.95% 35.63%

C19cyc % molar de Ácidos grasos 5.00% 0.10% 15.83%

Glutamato % molar de Proteína 7.41% 0.14% 13.75%

Glicina % molar de Proteína 6.43% 0.25% 12.58%

Alanina % molar de Proteína 5.74% 0.50% 11.93%

Lisina % molar de Proteína 8.77% 0.70% 17.23%

Aspartato % molar de Proteína 5.69% 0.16% 11.85%

Arginina % molar de Proteína 3.27% 0.08% 6.63%

Glutamina % molar de Proteína 2.43% 0.12% 4.80%

Serina % molar de Proteína 6.64% 0.09% 14.64%

Metionina % molar de Proteína 2.59% 0.00% 5.83%

Triptófano % molar de Proteína 0.74% 0.01% 1.61%

Fenilalanina % molar de Proteína 4.33% 0.12% 8.33%

Tirosina % molar de Proteína 4.08% 0.08% 7.92%

Cisteína % molar de Proteína 1.18% 0.05% 2.35%

Leucina % molar de Proteína 8.94% 0.43% 19.14%

Histidina % molar de Proteína 1.35% 0.12% 3.01%

Prolina % molar de Proteína 2.74% 0.01% 5.81%

Asparagina % molar de Proteína 6.53% 0.36% 14.58%

Valina % molar de Proteína 6.27% 0.10% 13.50%

Treonina % molar de Proteína 4.97% 0.16% 10.08%

Isoleucina % molar de Proteína 9.92% 0.45% 19.47%

dATP % molar de ADN 35.10% 2.39% 50.00%

dGTP % molar de ADN 14.90% 0.00% 47.61%

dCTP % molar de ADN 14.90% 0.00% 47.61%

dTTP % molar de ADN 35.10% 2.39% 50.00%

ATP % molar de ARN 38.47% 2.20% 66.90%

GTP % molar de ARN 19.41% 0.12% 42.73%

CTP % molar de ARN 11.80% 0.58% 35.53%

UTP % molar de ARN 30.32% 0.49% 58.32%

PtdGly % molar de Lípidos 24.47% 3.17% 54.98%

PtdEtn % molar de Lípidos 19.42% 1.41% 55.74%

PtdMen % molar de Lípidos 56.11% 2.20% 83.49%

Capítulo 2:

Metodología 39

Tabla 2.7: (Continuación).

Parámetro Unidades Valor medio Límite inferior Límite superior

NAD+ % molar de trazas 15.16% 1.65% 30.73%

NADP+ % molar de trazas 13.53% 0.61% 29.52%

CoA % molar de trazas 13.69% 2.45% 31.19%

FAD % molar de trazas 12.82% 1.30% 28.63%

FMN % molar de trazas 22.07% 3.10% 45.17%

THF % molar de trazas 22.72% 4.50% 41.11%

Proteína % másico de biomasa 52.84% 0.10% 75.69%

ADN % másico de biomasa 2.60% 0.17% 7.33%

ARN % másico de biomasa 6.55% 0.94% 18.58%

Peptidoglicano % másico de biomasa 10.08% 0,69% 27,18%

Lípido % másico de biomasa 7.60% 0.50% 20.17%

Ácido teicoico % másico de biomasa 11.06% 0.06% 26.87%

Carbohidrato % másico de biomasa 4.32% 0.21% 11.01%

Trazas % másico de biomasa 4.95% 0.32% 14.16%

𝑣0𝑎𝑎 mmol/g h 0.1578 0.0121 0.3338

𝑣∞𝑎𝑎 mmol/g h 11.50 0.32 22.42

𝑅𝑎𝑎 g h/mmol 0.0859 0.0011 0.18498

𝑘𝑑𝑙𝑖𝑚 h

-1 0.0350 0.0045 0.0671

𝑘𝑑𝑒𝑥𝑐 h

-1 0.0105 0.0002 0.0209


mmol/g h 174.86 54.84 291.48


mM 482.1 46.7 818.1


mM 755.4 433.4 1189.8

A partir de los perfiles obtenidos por aproximación de Monte Carlo fue realizado análisis de

sensibilidad global MPSA siguiendo procedimiento propuesto por Zi et al. [187], quienes

proponen el empleo del estadístico Kolmogorov–Smirnov (K-S). Dicho estadístico se define como

la máxima distancia vertical entre las distribuciones de frecuencia acumulada de casos aceptables e

inaceptables. Un valor alto de K-S para un parámetro dado indica una alta sensibilidad del modelo

a dicho parámetro [187]. Ahora bien, cada predicción k es clasificada como aceptable o inaceptable

mediante comparación entre un valor límite de aceptación y la suma de los errores cuadrados

(SEC) de los n valores experimentales predichos por dicho perfil k, Ecuación 2.14. Se empleó

como suposición un error de 1g/L en la medición de las concentraciones experimentales de PDO,

es decir que el límite de aceptación calculado a partir de la propagación del error de 6 mediciones

fue 36 g2/L

2 (6232.7mM

2).

𝑆𝐸𝐶(𝑘) =∑(𝑥𝑒𝑥𝑝(𝑖) − 𝑥𝑝𝑟𝑒𝑑(𝑖, 𝑘))2

𝑛

𝑖=1

∀ 𝑘 ∈ 1,… , 𝐾 2.14

En adición, se realizaron otros dos análisis de sensibilidad MPSA, el primero empleando como

variable de respuesta la productividad máxima de PDO (QPDO) calculada como la relación entre la

máxima concentración de PDO producida y el menor tiempo requerido, y el segundo considerando

como variable de respuesta el máximo rendimiento de PDO producido (YPDO/S). Los valores

experimentales de QPDO y YPDO/S fueron calculados empleando concentraciones en los instantes

inicial y final de la fermentación 1 a concentración alta de glicerol. Por otro lado, para el cálculo de

los límites de aceptación se continuó empleando como base un error supuesto de 1g/L en la


Clostridium sp

medición de las concentraciones y 30 minutos en la medición del tiempo. Por consiguiente, a partir

de los cálculos de propagación del error, los valores de aceptación empleados para QPDO y YPDO/S

fueron (0.057g/L·h)2 y (0.052 mol/mol)

2, respectivamente. Por otro lado fue calculado el valor

crítico DK-S del estadístico K-S, el cual depende del número de muestras K empleadas en el

análisis, como se observa en la Ecuación 2.15. Donde todo valor de K-S menor al valor crítico DK-S

corresponde a distribuciones de valores aceptables e inaceptables estadísticamente iguales.

𝐷𝐾−𝑆 =1.36

√𝐾 2.15

Junto al análisis de sensibilidad MPSA fue realizado el análisis de sensibilidad global PRCC

mediante el cálculo del coeficiente de Pearson, Ecuación 2.9. En el desarrollo del PRCC fueron

evaluadas las variables respuestas QPDO y YPDO/S. En dicho análisis PRCC fue excluido el perfil de

formación de PDO, dado que es un análisis de sensibilidad estático. Sin embargo, fue realizada una

aproximación dinámica del análisis PRCC para dicha variable de respuesta.

Finalmente, similar a los perfiles realizados por aproximación de Monte Carlo en el análisis de

sensibilidad global, fueron realizados los perfiles considerando de manera agrupada los

precursores, las macromoléculas, parámetros cinéticos de formación de ácido acético y parámetros

cinéticos de muerte celular, es decir excluyendo los parámetros cinéticos de consumo de glicerol.

Los intervalos de entrada de los anteriores parámetros corresponden a los mostrados en la Tabla

2.7. Posteriormente, dichos parámetros de entrada fueron considerados en conjunto.

2.4.2 Desarrollo de aproximación segregada del modelo dinámico

A continuación, fueron comparados los datos experimentales de producción de PDO de la

validación experimental con las predicciones por aproximación de Monte Carlo según las

distribuciones poblacionales de acuerdo a la composición celular (contenido de precursores y

macromoléculas), edad y capacidad de formación de ácido acético. Se asumió nuevamente una

desviación estándar relativa del 30% en los parámetros de entrada. Por lo anterior, esta nueva

validación es equivalente a un modelo de balance de poblaciones (PBM por sus siglas en inglés

Population Balance Model) para poblaciones microbianas [120]. Por consiguiente, fue desarrollada

una aproximación in silico de un modelo tanto estructurado como segregado de la producción de

PDO.

2.4.3 Predicción dinámica de la producción de PDO para mutantes por

knockout

Posterior a la evaluación del análisis de sensibilidad de los diferentes componentes de la biomasa y

de los parámetros cinéticos, fueron evaluadas las perturbaciones en la red metabólica mediante

deleción in silico de algunas enzimas. Fueron evaluadas mutantes tanto dobles como simples, sin

embargo a diferencia de las predicciones en estado estacionario empleando FBA, donde sólo es

posible comparar rendimientos, en las predicciones en dinámico del DFBA se buscó comparar

también las productividades QPDO. Ahora bien, debido a la alta demanda de cómputo que

implicaría una evaluación de mutantes en dinámico dado el alto número de posibles mutantes

(66430 dobles y 365 simples), fue considerada la información obtenida en estado estacionario a

partir de análisis FCF y ROOM. A partir de dicho análisis fue encontrado que 41 mutantes simples

causaron al menos un cambio en la red metabólica y por consiguiente sólo dichas mutantes fueron

Capítulo 2:

Metodología 41

evaluadas mediante aproximación ROOM dinámico (D-ROOM), Ecuación 2.16. Lo anterior fue

realizado suponiendo que D-ROOM era la aproximación más adecuada para predecir los estados

fenotípicos de las mutantes en estado dinámico, como ha sido encontrado previamente en estado

estacionario con aproximación ROOM [45]. Así mismo fue calculado el perfil de máxima

formación de PDO según la aproximación dinámica de FVA (D-FVA), Ecuación 2.17.

2.4.4 Perturbación en condiciones de cultivo

En primer lugar fueron evaluadas las concentraciones iniciales de biomasa y glicerol como las

mejores alternativas para disminuir los tiempos de fermentación en cultivos por lotes. Fueron

evaluados mediante un diseño factorial completo de 15 concentraciones de biomasa y 13

concentraciones de glicerol. Posteriormente, como alternativa final para incrementar tanto la

concentración final de PDO como el tiempo de cultivo se empleó cultivo por lote alimentado. La

función objetivo empleada fue mantenida, sin embargo algunas de las restricciones fueron

modificadas, como es mostrado en la Ecuación 2.18, dado que el volumen del reactor V es

dependiente del tiempo, al igual que el flujo de alimentación F, por consiguiente fueron

considerados como variables adicionales del modelo dinámico del FBA.

Como se observa en la Ecuación 2.18, fueron evaluadas dos estrategias de alimentación, en la

primera se consideró un flujo constante α durante toda la fermentación. En dicha estrategia fue

desarrollado un diseño factorial completo, donde igualmente fue evaluada la concentración del

glicerol en el flujo de alimentación, el cual fue expresado como porcentaje másico de una solución

acuosa. Como restricción adicional, se asumió que el volumen inicial del reactor, V0, era 1.0L y el

volumen máximo, Vmax, 1.5L. Por otro lado, se asumió que el flujo alimentación también contenía

una fuente de nitrógeno y fósforo, con el fin de evitar limitación del crecimiento por agotamiento

de estos sustratos, sin embargo sus concentraciones en el flujo de alimentación no fueron

optimizadas dado que en el modelo no son considerados como sustratos limitantes o inhibidores.

Con relación a las condiciones iniciales de metabolitos y biomasa, fueron empleados los valores

correspondientes a la fermentación 1 a exceso de glicerol, mostrados en la Tabla 2.4.

Posteriormente fue evaluado el flujo de alimentación enlazado al control de pH como segunda

estrategia de alimentación, según se muestra en la Ecuación 2.18. Para esta nueva estrategia de

alimentación fueron mantenidas las restricciones de volúmenes y contenido de nitrógeno y fósforo

en el flujo de alimentación. Fue realizado de nuevo un diseño factorial completo, considerando una

vez más como segunda variable el contenido de glicerol en el flujo de alimentación además del

factor de proporcionalidad β.


Clostridium sp

𝑀𝑖𝑛 ∑𝑏𝑖

𝑁

𝑖=1


{

𝑑𝑧𝑖,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑑𝑡= − ∑ 𝑆𝑖𝑗


𝑗=1

∙ 𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 ∙ 𝑋𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑑𝑋𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑑𝑡= (𝜇𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥 ˄ 𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑖𝑛 {

0 ∀ 𝑣𝑗 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑐

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑚𝑎𝑥 ˄ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑚𝑖𝑛 ∀ 𝑣𝑗 {𝑛𝑜 𝑐𝑎𝑡 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑒𝑐 𝑐𝑎𝑡 𝑝𝑜𝑟 𝑖𝑠𝑜𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑐

∑ 𝑆𝑖𝑗𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑁

𝑗 =1

= 0, ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑏𝑗(𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝑚𝑎𝑥 − 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑢 ) ≤ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑢 ∀ 𝑗 ∈ 1,… , 𝑁

𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 − 𝑏𝑗(𝑣𝑗,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑖𝑛 − 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

𝑙 ) ≥ 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑙 ∀ 𝑗 ∈ 1,… , 𝑁

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑢 = 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒 + 𝛿|𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒| + 휀 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑙 = 𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒 − 𝛿|𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒| − 휀 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑚𝑎𝑥 =


𝑎𝑎 ∙ 𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒)


𝑎𝑎 ∙ [𝑒(𝑅𝑎𝑎∙𝑣𝐺𝑙𝑦,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒) − 1]

𝑣𝐺𝑙𝑦,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 = (𝑣𝑚𝑎𝑥𝐺𝑙𝑦






𝑏𝑗 = [0,1] ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁

𝛿 ≈ 0.05 휀 ≈ 0.001

𝑧𝑖,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒(𝑡) ≥ 0 𝑧𝑖,𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒(𝑡0) = 𝑧𝑖,0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑋𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒(𝑡) ≥ 0 𝑋𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒(𝑡0) = 𝑋0

𝑡𝑔 = 𝑡0 + 𝑔 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺

𝑀𝑖𝑛1

𝜇𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒(𝑤 ∙∑𝑣𝑗,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

2

𝑁

𝑗=1

+ (1 − 𝑤) ∙ 𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑,𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒2 )

𝑆𝑢𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑎 { 𝐷𝐹𝐵𝐴 𝑐𝑒𝑝𝑎 𝑠𝑖𝑙𝑣𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒

}

2.16

Capítulo 2:

Metodología 43

𝑀𝑎𝑥 𝑣𝑃𝐷𝑂


{

𝑑𝑃𝐷𝑂𝑚𝑎𝑥

𝑑𝑡= 𝑣𝑃𝐷𝑂 ∙ 𝑋

𝑑𝑋

𝑑𝑡= (𝜇 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋


𝑁

𝑗 =1

= 0 ∀ 𝑖 ∈ 1,… ,𝑀


𝑚𝑎𝑥 ∀ 𝑗 ∈ 1,… ,𝑁



𝜇 = 𝜇𝐷𝐹𝐵𝐴

𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜𝑚𝑎𝑥 = 𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜,𝐷𝐹𝐵𝐴

𝑚𝑎𝑥

𝑣𝐺𝑙𝑦 = 𝑣𝐺𝑙𝑦,𝐷𝐹𝐵𝐴 𝑃𝐷𝑂𝑚𝑎𝑥(𝑡) ≥ 0 𝑃𝐷𝑂𝑚𝑎𝑥(𝑡0) = 𝑃𝐷𝑂0

𝑋(𝑡) ≥ 0 𝑋(𝑡0) = 𝑋0

𝑡𝑔 = 𝑡0 + 𝑔 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺

𝑀𝑖𝑛1

𝜇𝐷𝐹𝐵𝐴(𝑤 ∙∑𝑣𝑗,𝐷𝐹𝐵𝐴

2

𝑁

𝑗=1

+ (1 − 𝑤) ∙ 𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑,𝐷𝐹𝐵𝐴2 )

𝑆𝑢𝑗𝑒𝑡𝑜 𝑎 { 𝐷𝐹𝐵𝐴

}

∀ 𝑡𝑔 ∈ [𝑡0, 𝑡𝑓]

2.17


Clostridium sp

𝑀𝑖𝑛1

𝜇(𝑤 ∙∑𝑣2 + (1 − 𝑤) ∙ 𝑣𝐴𝑇𝑃 𝑝𝑟𝑜𝑑

2 )


{

𝑑(𝑉 ∙ 𝑧𝑖)

𝑑𝑡= 𝐹 ∙ 𝑆𝐹,𝑖 − ∑ 𝑉 ∙ 𝑆𝑖𝑗


𝑗=1


𝑑(𝑉 ∙ 𝑋)

𝑑𝑡= 𝑉 ∙ (𝜇 − 𝑘𝑑) ∙ 𝑋

𝑑𝑉

𝑑𝑡= 𝐹

𝐹 = {𝛼 𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝐴𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒

𝛽 ∙ 𝑣𝐻+ ∙ 𝑋 ∙ 𝑉 𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝐴𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛𝑙𝑎𝑧𝑎𝑑𝑜 𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝐻


𝑁

𝑗 =1

= 0 ∀ 𝑖 ∈ 1, … ,𝑀


𝑚𝑎𝑥 ∀ 𝑗 ∈ 1, … , 𝑁

𝑤 {1.00 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] ≤ 163𝑚𝑀

0.04 ∀ [𝐺𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑜𝑙] > 163𝑚𝑀



𝑣𝑎.𝑎𝑐é𝑡𝑖𝑐𝑜𝑚𝑎𝑥 =











𝑧𝑖(𝑡) ≥ 0 𝑧𝑖(𝑡0) = 𝑧𝑖,0 ∀ 𝑖 ∈ 1, … ,𝑀𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟

𝑋(𝑡) ≥ 0 𝑋(𝑡0) = 𝑋0

𝑉(𝑡) ≤ 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉(𝑡0) = 𝑉0

𝑡𝑔 = 𝑡0 + 𝑔 𝑡𝑓 − 𝑡0

𝐺 ∀ 𝑔 ∈ 0… . 𝐺 }

∀ 𝑡𝑔 ∈ [𝑡0, 𝑡𝑓]

2.18

Dónde:

𝐹 es el flujo de alimentación al reactor (expresado en L/h). Siendo 𝛼 y 𝛽 son constantes de

proporcionalidad correspondientes a alimentación constante y enlazada al control de pH,

respectivamente.

𝑣𝐻+ es el flux de formación de protones exportados al medio de cultivo y deben ser

neutralizados con solución de álcali (en mmol/g·h)

𝑉 es el volumen del reactor en el instante de tiempo 𝑡, mientras que 𝑉0 es el volumen en el

instante inicial y 𝑉𝑚𝑎𝑥 es la capacidad máxima del reactor (expresados en L).

𝑆𝐹,𝑖 es la concentración del metabolito i en el flujo de alimentación F (expresado en mM).

.

3. Capítulo 3: Resultados

3.1 Desarrollo modelo en estado estacionario

3.1.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM

A partir de los 4086 genes detectados en la anotación del genoma de la bacteria Clostridium sp

IBUN 13A, fueron seleccionados 641 de ellos, los cuales codifican para 365 enzimas que catalizan

diferentes reacciones de la red metabólica. Las enzimas involucradas en otros procesos como

replicación del ADN no fueron incluidas en la reconstrucción del modelo GSM. De acuerdo a la

base de datos de KEGG, dichas enzimas seleccionadas catalizan 671 reacciones en las cuales están

involucrados 606 metabolitos, estando 303 de estos metabolitos bloqueados de acuerdo a análisis

con GapFind [129]. En adición, dado que no se cuenta con información experimental de la

composición de la bacteria empleada, fueron utilizadas las 17 reacciones empíricas que describen

la composición de precursores y macromoléculas reportada para la bacteria C. beijerinckii [134]. A

partir de dichas reacciones fue calculada la fórmula elemental de la biomasa por mol Carbono, la

cual fue CH1.624O0.456N0.216P0.033S0.0047, mientras que su peso molecular estimado fue 25.12 g/mol C.

A partir de la red cruda y la reacción de biomasa previamente descritas, fue realizado el

procedimiento de curado por ingeniería reversa. Así mismo, fueron incluidas 86 reacciones de

transporte y 78 reacciones de intercambio. Entre dichas reacciones de transporte e intercambio fue

incluido el consumo de iones, glicerol, carbohidratos y aminoácidos, y la formación de productos

como ácidos orgánicos, solventes, agua, CO2, H2, protones y biomasa. Durante el proceso de

curación semiautomatizada por ingeniería reversa y automatizada por GapFill fueron identificados

inconsistencias en la formación de ADN, péptidos, lípidos, proteínas, ARN y cofactores, las cuales

fueron solucionadas mediante la adición de 59 reacciones, permitiendo reducir el número de

metabolitos bloqueados a 63. La Tabla 3.1 resume las principales características del modelo GSM

reconstruido y curado, el cual al estar reconstruido a partir de 641 genes se simplificó como

iCbu641. Por otro lado, la Figura 3.1 muestra la distribución de reacciones citosólicas.

El modelo reconstruido permite in silico consumir los sustratos extracelulares glicerol, glucosa,

sacarosa, fructosa, galactosa, manosa, maltosa, arabinosa, glucosamina, manitol, xilosa, ribosa,

celobiosa, trehalosa y rafinosa, los cuales también han sido detectados ser consumidos in vivo por

diferentes cepas de Clostridium butyricum [189, 199]. No obstante, el modelo no incluye el

consumo de polisacáridos como almidón o carboximetilcelulosa (CMC). De manera análoga, a

partir de datos experimentales fue incluida la reacción de intercambio de PDO extracelular y por

tanto conviertiendo iCbu641 en el primer modelo GSM curado de una cepa de Clostridium

productora de PDO [22, 128, 130-136].


Clostridium sp

Tabla 3.1 Características principales de modelo iCbu641.

Característica Número

Genes 641

Enzimas 365

Total reacciones 891

Reacciones citosólicas a 727

Reacciones de transporte 86

Reacciones de intercambio 78

Total metabolitos 701

Metabolitos bloqueados 63 a

Incluye las 17 reacciones empíricas de formación de macromoléculas y biomasa [134] y las 59

reacciones adicionadas en la curación

Número de reacciones

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Ru

ta f

un

cio

na

l

Metabolismo de aminoacidos y asociados

Metabolismo de carbohidratos

Metabolismo de nucleotidos

Metabolismo vitaminas y cofactores

Metabolismo de lípidos

Producción de energía y carbono

Biosíntesis glicanos, terpenoides y poliketidos

Síntesis precursores biomasa

Figura 3.1 Distribución de reacciones citosólicas del modelo GSM reconstruido de acuerdo a ruta

funcional.

Notación: (■) reacciones asociadas a genes (■) reacciones no asociadas a genes.

3.1.2 Modelos cinéticos ajustados

La Figura 3.2 muestra la cinética ajustada para el máximo flux de secreción de ácido acético, la

cual fue calculada a partir de datos experimentales en estado estacionario [88, 108]. Dicha cinética

fue empleada como restricción tanto en las predicciones en estado estacionario como en estado

transciente. Por otro lado, en la Figura 3.3 es observado el ajuste de la cinética del flux de consumo

de glicerol en función de la concentración de glicerol en el medio de cultivo, la cual fue empleada

como restricción sólo en las predicciones dinámicas. Finalmente la Tabla 3.2 muestra los valores

ajustados de los parámetros cinéticos de las ecuaciones 2.3 y 2.4.

Capítulo 3:

Resultados 47

Flux consumo glicerol (mmol/g h)

0 20 40 60 80 100

Flu

x s

ec

rec

ión

Ac

. A

cé

tic

o (

mm

ol/g

h)

0

2

4

6

8

10

12

Figura 3.2 Ajuste modelo cinético de tipo alostérico de máximo flux de secreción de ácido acético

en función del flux de consumo de glicerol.

Notación: (●) Datos experimentales C. butyricum DSM 5431 [108]. (○) Datos experimentales C.

butyricum F2b [88]. (──) Modelo ajustado.

Glicerol extracelular (mM)

0 100 200 300 400 500

Flu

x c

on

su

mo

glic

ero

l (m

mo

l/g

h)

0

10

20

30

40

50

60

Figura 3.3 Ajuste cinética de flux de consumo de glicerol en función de glicerol extracelular.

Notación: (●) Datos experimentales Clostridium sp. IBUN 158B (──) Modelo ajustado.


Clostridium sp

Tabla 3.2. Valores ajustados de parámetros cinéticos empleados como restricciones en modelos

FBA y DFBA con glicerol como única fuente de carbono.

Parámetro Descripción Valor

Unidades Origen datos

experimentales

𝑣0𝑎𝑎

Flux basal de formación de ácido acético

(Flux consumo de glicerol tiende a cero) 0.1578 mmol/g h [88, 108]

𝑣∞𝑎𝑎

Flux máximo de formación de ácido

acético (flux de consumo de glicerol tiende

a infinito)

11.50 mmol/g h [88, 108]

𝑅𝑎𝑎 Tasa de formación de ácido acético en

función del flux de consumo de glicerol. 0.0859 g h/mmol [88, 108]

𝑘𝑑𝑙𝑖𝑚

Constante de muerte a condiciones de

limitación de glicerol 0.0350 h

-1 [108]

𝑘𝑑𝑒𝑥𝑐

Constante de muerte a condiciones de

exceso de glicerol 0.0105 h

-1 [108]


Flux máximo de consumo de glicerol 174.86 mmol/g h Este estudio y

[15]


Constante de afinidad del flux consumo de

glicerol a la concentración de glicerol en el

medio

482.1 mM Este estudio y

[15]


Constante de inhibición del flux consumo

de glicerol por concentración de glicerol en

el medio

755.4 mM Este estudio y

[15]

3.1.3 Predicción de la distribución de fluxes usando glicerol como

sustrato

El modelo GSM reconstruido fue empleado junto con el FBA para predecir la distribución de

fluxes de Clostridium butyricum cultivado en glicerol. Las primeras predicciones fueron realizadas

con maximización de biomasa, Ecuación 2.1, sin embargo dichas predicciones al ser comparadas

con datos experimentales de C. butyricum DSM 5431, sobreestimaron en cerca de un 300% los

rendimientos de biomasa (YX/S) mientras que no fue predicha la producción de PDO. Por lo

anterior, fue necesario evaluar otras funciones objetivo NLP. En primera instancia fue evaluada la

maximización de biomasa mientras minimiza el uso enzimático, Ecuación 2.5. Las nuevas

predicciones tuvieron errores cercanos al 4.5% y 1.5% en los rendimientos de biomasa y PDO,

respectivamente, en comparación con los valores experimentales a condiciones de limitación de

glicerol (<15g/L) [108].

Sin embargo, la nueva función objetivo sobreestimó los rendimientos de biomasa a condiciones de

exceso de glicerol (sin alcanzar condiciones de inhibición). Se buscó predecir estas nuevas

condiciones de crecimiento mediante la Ecuación 2.6 empleando un valor de w igual a 0.04, la cual

consiste en la maximización de biomasa mientras minimiza el uso enzimático y la producción de

ATP. Las predicciones realizadas con optimización LP, Ecuación 2.1, y optimizaciones NLP,

Ecuaciones 2.5 y 2.6, son mostradas en la Figura 3.4 donde se evidencia la capacidad predictiva de

las funciones NLP empleadas, con errores medios de 5.3% y 2.5%, en los rendimientos de biomasa

y PDO respectivamente. Caso contrario sucedió con la función LP donde se observa las

predicciones más alejadas a los valores experimentales.

Capítulo 3:

Resultados 49


0 20 40 60 80 100

Flu

x s

ec

rec

ión

PD

O (

mm

ol/g

h)

0

20

40

60


0 20 40 60 80 100

Ve

loc

ida

d d

e c

rec

imie

nto

(h

-1)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

A B

Figura 3.4. Análisis de robustez en función del flux de consumo de glicerol.

(A) Velocidad específica de crecimiento µ (B) Flux de secreción de PDO. Notación: Datos

experimentales de C. butyricum DSM 5431 cultivados en (●) glicerol en limitación y (○) glicerol

en exceso [108]. Líneas continuas corresponden a predicciones de: maximización biomasa (LP) en

negro, maximización de biomasa mientras minimiza el uso enzimático (NLP) en rojo y

maximización de biomasa mientras minimiza el uso enzimático y la producción de ATP (NLP) en

verde.

Así mismo, se buscó determinar la capacidad predictiva de las enzimas empleadas en la red

metabólica. Para lo anterior se comparó la predicción de fluxes de las 365 enzimas presentes en

iCbu641 con la expresión de las 286 enzimas no redundantes detectadas en el proteoma de la fase

exponencial del cultivo en limitación de glicerol de Clostridium butyricum DSM 10702 reportado

por Gungormusler-Yilmaz et al. [26]. Fueron encontradas 174 enzimas en común, donde 27 de

ellas estaban bloqueadas de acuerdo a análisis FCF, Ecuación 2.7, y por consiguiente no fueron

consideradas en análisis posteriores. Entre las enzimas bloqueadas destacan 10 involucradas en la

biosíntesis de glicanos, terpenoides y poliketidos, mientras que otras 12 enzimas están asociadas al

metabolismo de carbohidratos y las últimas 5 son del metabolismo de aminoácidos y asociados.

A partir de las 147 enzimas consideradas en el análisis, se obtuvo la predicción en la expresión de

123 de ellas, es decir que la capacidad predictiva del modelo fue del 83.7%. La Figura 3.5 muestra

la relación entre los fluxes predichos y los niveles de expresión de las enzimas predichas, donde se

observa una tendencia entre dichas variables. En relación a las restantes 24 enzimas con expresión

no predicha, corresponden a enzimas direccionalmente enlazadas al crecimiento y 21 de ellas están

involucradas en rutas de síntesis de aminoácidos y nucleótidos y metabolismo de carbohidratos. En

relación a las 3 enzimas restantes, una corresponde al metabolismo del piruvato (piruvato fosfato

dikinasa, EC.2.7.9.1), otra al metabolismo de glicerofosfolípidos (glicerol 3-fosfato deshidrogenasa

(NADP), EC.1.1.1.94), mientras que la última está involucrada en procesos de reciclaje (nicotinato

fosforibosiltrasferasa, EC.6.3.4.21).

De manera similar fue hecha la comparación con las enzimas detectadas en la fase exponencial del

cultivo en glicerol de Clostridium sp 158B [19]. De las 17 enzimas en común con en el proteoma

detectado en la fase exponencial, el modelo predijo la expresión de 16 de ellas, predicción del

94.1%. Siendo la enzima Cisteína sintetasa (EC.2.5.1.47) la única con expresión no predicha.


Clostridium sp

Nivel de expresión enzima (Log2 TIC)

14 16 18 20 22 24 26 28

Flu

x n

orm

ali

za

do

(%

)

0.01

0.1

1

10

100

Figura 3.5. Comparación fluxes predichos y proteoma experimental.

Flux normalizado (expresado como porcentaje basado en el flux de consumo de glicerol) y nivel de

expresión (reportada como Log 2 TIC) de las 123 enzimas predichas. Notación: (──) línea de

tendencia.

3.1.4 Predicción de estados fenotípicos empleando otros sustratos

Así mismo, buscando evaluar la robustez del modelo iCbu641, valores experimentales y simulados

fueron comparados usando otros sustratos. En primer lugar fueron comparados predicciones de

FBA con rendimientos experimentales de Clostridium butyricum W5 cultivado en glucosa [146],

como es mostrado en la Tabla 3.3. Es observada la capacidad del modelo GSM reconstruido de

predecir no sólo valores experimentales de cultivos en glicerol, sino también en glucosa, debido a

un error inferior al 6% en la predicción del rendimiento de biomasa. En adición, todos los

rendimientos experimentales reportados estaban en su respectivo rango predicho como factible de

acuerdo a FVA.

Tabla 3.3. Comparación de rendimientos experimentales y predichos (mol/mol) de Clostridium

butyricum W5 cultivado en glucosa [146]

Producto Valor Experimental Rango factible predicho

Biomasa 0.027 0.0279 (0.0228-0.0330)

Acetato 0.172 0.574 (0-1.053)

Lactato 0.566 0.179 (0-0.773)

Butirato 0.295 0.114 (0-0.454)

H2 1.325 0.661 (0.046-1.345)

Etanol 0.043 0.215 (0 -0.714)

Capítulo 3:

Resultados 51

De manera análoga fueron empleados datos experimentales de Clostridium butyricum TM-9A

cultivado en diferentes sustratos [199]. Los rendimientos experimentales fueron comparados con

rendimientos predichos mediante análisis de robustez, similares a los mostrados en la Figura 3.4,

como se muestra en la Tabla 3.4. Los rendimientos de biomasa predichos están de acuerdo a los

valores experimentales obtenidos, mostrando los rendimientos más bajos para las pentosas y el más

alto para el trisacárido rafinosa. Mientras que los rendimientos usando monosacáridos fueron

inferiores que para disacáridos. En adición, los rendimientos experimentales de hidrógeno

empleando los diferentes carbohidratos, estaban en los respectivos rangos predichos por FVA,

exceptuando la arabinosa, lo cual podría sugerir la necesidad de una curación adicional para

predecir el crecimiento en pentosas.

Tabla 3.4. Comparación de rendimientos experimentales y simulados (mol/mol) de Clostridium

butyricum TM-9A cultivado en diferentes carbohidratos [199]

Carbohidrato Rendimiento experimental Rendimientos predichos

YX/Sa YH2/S YX/S

a Rango factible YH2/S

Arabinosa 2.5% 0.067 6.7% 0.204-1.101

Ribosa 25.3% 0.843 6.7% 0.236-1.100

Xilosa 32.3% 0.589 11.1% 0.327-1.406

Manosa 30.8% 0.668 36.2% 0.046-1.346

Fructosa 32.2% 0.848 37.2% 0.092-1.374

Galactosa 35.9% 0.864 29.1% 0.478-1.711

Celobiosa 35.9% 0.945 59.9% 0.141-2.468

Trehalosa 65.7% 1.612 72.3% 0.030-2.485

Sacarosa 74.9% 1.494 70.1% 0-2.323

Rafinosa 100.0% 2.716 100.0% 0-3.141 a Rendimientos de biomasa fueron normalizados usando como referencia valor de rafinosa.

Seguidamente, asumiendo correlación entre fluxes predichos y expresiones de ARN mensajeros

(ARNm) fue realizada la comparación entre resultados predichos por el FBA y experimentales del

transcriptoma de la cepa C. butyricum CWBI 1009 cultivada en glucosa [200]. De las 284 enzimas

compartidas en los dos sistemas 51 estaban bloqueadas de acuerdo al análisis FCF. Dichas enzimas

bloqueadas están clasificadas de la siguiente forma: 9 del metabolismo de aminoácidos y similares,

21 del metabolismo de carbohidratos, 19 de la biosíntesis de glicanos, terpenoides y poliketidos y 2

del metabolismo de cofactores y vitaminas. De las restantes 237 enzimas, el modelo predijo la

expresión de 180 (75.9%). Similar a la comparación con información de proteómica, las 57

enzimas no predichas corresponden a enzimas direccionalmente acopladas al crecimiento y de

acuerdo a su clasificación por ruta metabólica son: 25 del metabolismo de aminoácidos y

nucleótidos, 17 del metabolismo de carbohidratos, 11 del metabolismo de cofactores y vitaminas y

3 del metabolismo central.

Finalmente fue evaluada la robustez del modelo para predecir el estado fenotípico de mutantes por

knockout. Como referencia fue empleada la cepa modificada de Clostridium butyricum W5

reportada por Cai et al. [206]. Dicha mutante tiene bloqueada la expresión de la enzima 3-

hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC.1.1.1.157) y por tanto la producción de ácido butírico. Los

rendimientos experimentales de las cepas nativa y mutante son mostrados en la Tabla 3.5. Por otro

lado, la Tabla 3.5 también muestra los rendimientos predichos de la cepa nativa usando FBA y de

la cepa mutante usando ROOM. Las simulaciones predicen incremento en la producción de etanol,

tal como fue detectado experimentalmente, sin embargo el valor experimental del rendimiento de

etanol sale del rango predicho. Así mismo, es coherente la reducción en el rendimiento de la


Clostridium sp

biomasa, siendo cerca del 1% experimentalmente y 5% de acuerdo al modelo. En el caso de

rendimiento de hidrógeno, las predicciones no son concluyentes, sin embargo los datos

experimentales están los rangos predichos.

Tabla 3.5. Comparación rendimientos experimentales y predichos de cepas nativa y mutante de

Clostridium butyricum W5 cultivadas en glucosa [206]

Producto Rendimientos experimentales Rendimientos predichos (rango FVA)

Nativa Mutante Nativa (FBA) Mutante (ROOM)

H2 1.25a 0.69 0.661 (0.046-1.345) 0.694 (0-1.787)

Etanol 0.18 3.31 0.215 (0-0.714) 0.680 (0-1.069)

Biomasab 100% 99.2%

a 100% 95.0%

a Valores calculados a partir de información reportada en el artículo

b Rendimientos reportados como porcentaje con base en la cepa nativa.

3.1.5 Modelado de escenarios con incremento del rendimiento de PDO

Con el objetivo de emplear el modelo iCbu641 para predecir incrementos en el rendimiento de

PDO, YPDO/S, fueron evaluados tres escenarios diferentes. El primer escenario consistió en la

predicción de mutantes por knockout de enzimas dobles o simples mediante aproximación ROOM.

Inicialmente se realizó análisis FCF a condiciones de cultivo descritas en 2.3.1 Mantenimiento de

la cepa y medio de cultivo empleado, encontrando 86 enzimas bloqueadas, 145 direccionalmente

acopladas, 61 parcialmente acopladas y 73 completamente acopladas al crecimiento. Dado que la

deleción de las enzimas parcial o completamente acopladas al crecimiento afectaría negativamente

dicho crecimiento y las enzimas bloqueadas no inciden en la distribución de fluxes, la evaluación

de mutantes fue realizada sólo considerando las 145 enzimas direccionalmente acopladas al

crecimiento. Entre dichas enzimas direccionalmente acopladas, 20 de ellas mostraron ser

esenciales, dado que catalizan al menos dos reacciones que al ser bloqueadas simultáneamente,

bloquean el crecimiento. Así es el caso de las enzimas Dihidrodipicolnato reductasa (EC.1.17.1.8)

o Prolina oxidasa (EC.1.5.1.2). Resultados similares fueron obtenidos con 18 deleciones dobles de

enzimas como Prefenato deshidrogenasa (EC.1.3.1.12) y Prefenato deshidrogenasa (NADP)

(EC.1.3.1.13) o Shikimato deshidrogenasa (EC.1.1.1.25) y Quinato/shikimato deshidrogenasa

(EC.1.1.1.282). En relación al rendimiento de PDO, ninguna deleción simple permitió mejorarlo

más allá del 1% en comparación con la cepa nativa. Una de las mejores mutantes predichas

corresponde a la deleción doble de las lactato deshidrogenasas EC.1.1.1.27 y EC.1.1.1.28

permitieron predecir el mayor incremento de YPDO/S, aunque dicho incremento fue sólo del 1.2%.

Ahora, en busca de validar las predicciones de las mutantes predichas, fueron empleadas las

mutantes simples por knockout obtenidas a partir de la cepa Clostridium sp. IBUN 158B para

mejorar la producción de PDO [17]. Las enzimas inactivadas fueron hidrogenasa (ΔhydA-420s),

lactato deshidrogenasa (ΔldhA-508s), y 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (Δhbd-414s), las

cuales corresponden a la producción de hidrógeno, ácido láctico y ácido butírico, respectivamente.

Todas las mutantes fueron viables, sin embargo los cultivos sólo fueron hechos en dos de ellas,

como es mostrado en la Tabla 3.6. Los rendimientos experimentales de PDO están de acuerdo con

los rangos predichos por FVA, permitiendo validar las simulaciones realizadas mediante

aproximación ROOM. En adición, la Tabla 3.6 muestra que el modelo fue capaz de predecir la

reducción en el rendimiento de biomasa al eliminar la formación de hidrógeno o ácido láctico, tal

como fue obtenido experimentalmente.

Capítulo 3:

Resultados 53

Tabla 3.6. Comparación rendimientos experimental y predichos de cepas nativa y mutantes de

Clostridium sp. IBUN 158B cultivadas en glicerol [17].

Cepa Rendimiento Experimental Rendimiento predichos (rango FVA)

YX/Sa YPDO/S YX/S

a YPDO/S

Nativa 100.0±8% 0.538±0.047 100% 0.588 (0.479-0.656)

ΔhydA-420s 46.7±9% 0.465±0.031 75.8% 0.610 (0.478-0.721)

ΔldhA-508s 61.6±3% 0.579±0.021 98.9% 0.595 (0.489-0.659)

Δhbd-414s No disponibles b 95.0% 0.572 (0.448-0.656)

a Rendimientos de biomasa fueron normalizados usando los de la cepa nativa como base.

b Datos no medidos experimentalmente.

La segunda estrategia evaluada, después del estudio de mutantes consistió en la perturbación de la

composición de la biomasa. La Figura 3.6 presenta tanto para limitación como para exceso de

glicerol los coeficientes de correlación de YX/S y YPDO/S, mostrando una baja correlación de los

precursores (ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos, lípidos polares y cofactores), pero sí una alta

correlación a las macromoléculas, especialmente las proteínas (principal componente con 86.7%

base molar). Esto podría sugerir que un bajo contenido de proteínas en la célula podría mejorar

YX/S y simultáneamente reducir YPDO/S, debido a sus correlaciones negativa y positiva,

respectivamente. Sin embargo, debido a que las desviaciones estándar relativas obtenidas de YX/S y

YPDO/S fueron del 3.3% y 0.67% en limitación de glicerol y del 3.1% y 0.25% en exceso de glicerol,

respectivamente, se podría sugerir que en estado estacionario la conversión de glicerol a PDO es

estable ante cambios en la composición de la biomasa.

Finalmente, la tercera estrategia evaluada consistió en el uso de dos sustratos, glucosa y glicerol.

La Figura 3.7A muestra que los valores experimentales se aproximan a los valores máximos

predichos para sus respectivos rangos de FVA. Lo anterior permitió dar validez a esta

aproximación y así obtener el PhPP en función de los fluxes de consumo de glucosa y glicerol,

Figura 3.7B, la cual predice una conversión completa del glicerol a PDO (YPDO/S=1) usando

relaciones de fluxes entre la glucosa y el glicerol de al menos 0.5.


Clostridium sp

Correlación

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

Pre

cu

rso

r d

e b

iom

asa

TrazasCarbohidratoÁc. teicoico

LípidosPeptidoglicano

ARNADN

ProteínaTHFFMNFADCoA

NADPNAD

PtdMenPtdEtnPtdGly

UTPCTPGTPATP

dTTPdCTPdGTPdATP

IsoleucinaTreonina

ValinaAsparagina

ProlinaHistidinaLeucinaCisteínaTirosina

FenilalaninaTriptófanoMetionina

SerinaGlutamina

ArgininaAspartato

LisinaAlaninaGlicina

GlutamatoC19cycC17cyc

C16:1C16:0C14:0C18:0C18:1

Correlación

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

A B

Figura 3.6. Coeficientes de correlación de Pearson de rendimientos de biomasa y PDO en función

de precursores de biomasa.

(A) Glicerol en limitación (B) Glicerol en exceso. Notación: (■) YX/S (■) YPDO/S

Capítulo 3:

Resultados 55

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

05

1015

2025

30

02

46

810

1214

YP

DO

/S (m

ol/

mo

l)

Consumo de glic

erol

(mmol/g

h)

Consumo de glucosa

(mmol/g h)

BA

vglucosa/vglicerol

0 0.053 0.104 0.238 1.149

YP

DO

/S (

mo

l/m

ol)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Figura 3.7. Rendimientos de PDO usando glucosa y glicerol como sustratos.

(A) Comparación valores experimentales (puntos con desviación estándar como barras de error

[204]) y rangos FVA predichos (cajas verticales) de YPDO/S en función de relaciones de fluxes de

consumo de glucosa/glicerol. (B) Máximo YPDO/S predicho usando FVA a diferentes fluxes de

consumo de glucosa y glicerol

3.2 Desarrollo y validación de modelo en estado dinámico

Inicialmente fue seleccionado el polinomio ortogonal y el tamaño de paso a emplear, mediante

aproximación DA, Ecuación 2.13. Los perfiles obtenidos evaluando los diferentes polinomios son

mostrados en la Figura 3.8. Se observa que la selección del polinomio ortogonal no tiene efecto en

la predicción de los diferentes perfiles. También se encontró que bajo los parámetros cinéticos

reportados en la Tabla 3.2, el tamaño de paso comprendido en el intervalo de 0.05h a 0.40h

tampoco tuvo incidencia en la predicción del PDO producido, Figura 3.9. Por lo anterior para

simulaciones posteriores se siguió empleando el polinomio ortogonal de Legendre con 6 puntos de

colocación y un tamaño de paso no superior a 0.40 horas.

Posteriormente fueron comparadas las predicciones mediante las aproximaciones SOA, DOA y

DA. Los perfiles de consumo de glicerol y formación de PDO son mostrados en la Figura 3.10,

donde no fueron detectadas diferencias en las predicciones. En adición, la Figura 3.11 muestra el

tiempo de simulación requerido por la aproximación DOA, el cual fue considerablemente superior,

por lo cual se decidió seguir usando la aproximación DA. Por otro lado, de la Figura 3.12 a la

Figura 3.15, se comparan los perfiles de biomasa, glicerol, PDO, ácido acético, ácido butírico y

ácido láctico tanto experimentales como predichos por DFBA. Los valores experimentales son

mostrados en el Anexo A.


Clostridium sp

Figura 3.8. Comparación glicerol y PDO extracelulares predichos con DFBA por aproximación

DA empleando diferentes polinomios ortogonales y tamaño de paso 0.20h.

Tiempo (h)

0 10 20 30

PD

O (

mM

)

0

50

100

150

200

250delta 0.05h

delta 0.10h

delta 0.15h

delta 0.20h

delta 0.25h

delta 0.30h

delta 0.35h

delta 0.40h

Figura 3.9. Comparación PDO extracelular predichos con DFBA por aproximación DA

empleando diferentes tamaños de paso y polinomio ortogonal de Legendre.

Capítulo 3:

Resultados 57

Figura 3.10. Perfiles de consumo de glicerol y producción de PDO predichos por DFBA

empleando aproximaciones SOA, DOA y DA.

Fue empleado polinomio ortogonal de Legendre en las aproximaciones DOA y DA. El tamaño de

paso empleado fue 0.15 horas..

Aproximación

SOA DA DOA

Tie

mp

o s

imula

ció

n (

s)

1e+0

1e+1

1e+2

1e+3

1e+4

1e+5

1e+6

Figura 3.11. Tiempo empleado en desarrollo de DFBA por aproximaciones SOA, DOA y DA.

Fue empleado polinomio ortogonal de Legendre en las aproximaciones DOA y DA. El tamaño de

paso empleado fue 0.15 horas.


Clostridium sp

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Bio

ma

sa

(g

/L)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Glic

ero

l (m

M)

0

100

200

300

400

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Ácid

o a

cé

tico

(m

M)

0

20

40

60

80

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

PD

O (

mM

)

0

50

100

150

200

250

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Ácid

o b

utí

rico

(m

M)

0

10

20

30

40

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Ácid

o lá

ctico

(m

M)

0

1

2

3

4

5



Clostridium sp IBUN 158B cultivado en glicerol con concentración inicial ~38g/L.

(Fermentación 1 exceso glicerol). Temperatura 37°C, pH 7, agitación 90rpm.

Capítulo 3:

Resultados 59

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Bio

ma

sa

(g

/L)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Glic

ero

l (m

M)

0

100

200

300

400

500

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Ácid

o a

cé

tico

(m

M)

0

20

40

60

80

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

PD

O (

mM

)

0

100

200

300

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Ácid

o b

utí

rico

(m

M)

0

20

40

60

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25

Ácid

o lá

ctico

(m

M)

0

1

2

3

4

5




(Fermentación 2 exceso glicerol). Temperatura 37°C, pH 7, agitación 90rpm.


Clostridium sp

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Bio

ma

sa

(g

/L)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Glic

ero

l (m

M)

0

20

40

60

80

100

120

140

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Ácid

o a

cé

tico

(m

M)

0

5

10

15

20

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

PD

O (

mM

)

0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Ácid

o b

utí

rico

(m

M)

0

5

10

15

20

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 25 30

Ácid

o lá

ctico

(m

M)

0

1

2

3

4




(Fermentación 1 limitación glicerol). Temperatura 37°C, pH 7, agitación 90rpm.

Capítulo 3:

Resultados 61

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Bio

ma

sa

(g

/L)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Glic

ero

l (m

M)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Ácid

o a

cé

tico

(m

M)

0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

PD

O (

mM

)

0

20

40

60

80

100

120

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Ácid

o b

utí

rico

(m

M)

0

5

10

15

20

Tiempo (h)

0 5 10 15 20

Ácid

o lá

ctico

(m

M)

0

1

2

3

4




(Fermentación 2 limitación glicerol). Temperatura 37°C, pH 7, agitación 90rpm.


Clostridium sp

Finalmente, fue realizada la validación en la expresión de enzimas en las fases exponencial y

estacionaria. En la comparación fue predicha la expresión del 82.9% de las enzimas, es decir 107

de las 129 enzimas detectadas en ambas fases de crecimiento de Clostridium butyricum DSM

10702 en glicerol [26]. La Figura 3.16 muestra la comparación de fluxes predichos con valores de

expresión tanto en fase exponencial como en fase estacionaria.

Nivel de expresión enzima (Log2 TIC)

14 16 18 20 22 24 26 28

FL

ux

(m

mo

l/g

h)

0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

100

Figura 3.16. Comparación flux predicho con DFBA por aproximación DA y nivel de expresión de

enzima en proteoma de C. butyricum DSM 10702 [26] de las 107 enzimas predichas.

Notación: (●) fase exponencial y (○) fase estacionaria

3.3 Determinación algunos parámetros de significancia

3.3.1 Análisis de sensibilidad global

Los 2280 perfiles de PDO obtenidos por aproximación de Monte Carlo son mostrados en la Figura

3.17, los cuales fueron empleados en los análisis de sensibilidad global. En primer lugar fue

desarrollado el análisis de sensibilidad MPSA, siendo mostrado los resultados del estadístico K-S

de las diferentes variables de respuesta en la Figura 3.18A. Así mismo, en la Figura 3.18B son

mostrados los coeficientes de correlación del análisis de sensibilidad PRCC. Mientras que el

Anexo B muestra las figuras de frecuencias acumuladas necesarias para el cálculo del estadístico

K-S de los 60 parámetros evaluados. De manera análoga, en la Figura 3.19 se observa la

aproximación dinámica del análisis de sensibilidad PRCC considerando como variable de

respuesta la concentración de PDO en el tiempo.

Los análisis de sensibilidad MPSA y PRCC muestran resultados semejantes, donde los parámetros

de entrada con mayor significancia son los tres parámetros cinéticos de consumo de glicerol,

siendo positiva la relación de VmaxGly

y KiGly

y negativa la relación de KsGly

. Por otro lado, ningún

Capítulo 3:

Resultados 63

precursor como macromolécula mostró tener algún efecto significativo tanto en la formación de

PDO como en el tiempo de formación de éste. Finalmente, los parámetros cinéticos Raa

y V0aa

de

formación de ácido acético presentaron incidencia en la conversión de glicerol a PDO.

Figura 3.17. Comparación perfil PDO experimental y 2280 predichos aleatoriamente usando

método de Monte Carlo en DFBA por aproximación DA.

Variación de la composición de 44 precursores y 8 macromoléculas además de 8 parámetros

cinéticos estimados. Nomenclatura: perfiles aleatorias (negro) perfil predicción en condiciones

centrales (rojo). Valores experimentales en punto. Barras de error corresponden a error en la

medición estimado en 2.5%


Clostridium sp

Estadístico K-S

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Ki_GlyKs_Gly

Vmax_GlyKd_excKd_lim

R_aaV?_aaV0_aa

TrazasCarbohidrato

Ác. teicoicoLípidos

Peptidoglicano ARNADN

ProteínaTHFFMNFADCoA

NADPNAD

PtdMenPtdEtnPtdGly

UTPCTPGTPATP

dTTPdCTPdGTPdATP

IsoleucinaTreonina

ValinaAsparagina

ProlinaHistidinaLeucinaCisteínaTirosina

FenilalaninaTriptófanoMetionina

SerinaGlutamina

ArgininaAspartato

LisinaAlaninaGlicina

GlutamatoC19cycC17cyc

C16:1C16:0C14:0C18:0C18:1 YPDO/S

QPDO

PDO

DK-S

Coeficiente Correlación

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

YPDO/S

QPDO

A B

I

II

III

IV

V

I

II

III

IV

V

Figura 3.18 Resultados de análisis de sensibilidad globales del modelo dinámico desarrollado.

Análisis sensibilidad desarrollados (A) MPSA y (B) PRCC, en función de parámetros de entrada

44 precursores (I), 8 macromoléculas (II), 3 parámetros cinéticos formación ácido acético (III), 2

parámetros cinéticos de muerte celular (IV) y 3 parámetros cinéticos de consumo de glicerol (V).

Capítulo 3:

Resultados 65

Tiempo (h)

0 20 40 60 80 100 120 140

Co

eficie

nte

Co

rre

lació

n

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

V0_aa

Vmax_Gly

Ks_Gly

Ki_Gly

Figura 3.19. Perfiles de Coeficientes Pearson de análisis de sensibilidad global PRCC de los 4

parámetros de entrada de mayor significancia en la formación de PDO.

A partir de los resultados obtenidos en los análisis de sensibilidad global, fueron considerados por

separado los parámetros evaluados descartando los tres de mayor incidencia, es decir relacionados

con el consumo de glicerol. La Figura 3.20 muestra los diferentes perfiles obtenidos considerando

la variación de cada grupo de parámetros. Se observa que el único grupo de parámetros con

incidencia en el PDO producido al final del cultivo es el relacionado con la cinética de formación

de ácido acético. Así mismo, en el transcurso de la fermentación, los precursores inciden de menor

forma en la producción de PDO al ser comparados con los otros parámetros. Lo anterior también se

evidencia en La Figura 3.21, dónde son mostradas las desviaciones estándar relativas del PDO a

través del tiempo obtenidas a partir de la Figura 3.20. Finalmente, en la Figura 3.21 igualmente se

puede observar un aumento progresivo de la desviación estándar relativa hasta aproximadamente el

punto de inflexión de crecimiento exponencial a crecimiento exponencial desacelerado, para

posteriormente disminuir hasta estabilizar al llegar al final de la fermentación.

3.3.2 Desarrollo de aproximación segregada de modelo dinámico

En primer lugar fue evaluado el efecto de la deviación estándar relativa de la composición de la

biomasa en el perfil de deviación estándar relativa de la formación de PDO, los resultados son

mostrados en la Figura 3.22.A. Así mismo la Figura 3.22.B muestra las distribuciones

poblacionales según variabilidad composición de la biomasa, dónde el peso molecular promedio de

la biomasa fue 25.16g/mol C. No obstante, la desviación estándar relativa del peso molecular de la

biomasa fue 1.0%, 2.1% y 3.1%, asumiendo desviación estándar relativa de la composición del

10%, 20% y 30%, respectivamente.


Clostridium sp

Figura 3.20. Comparación perfil PDO experimental y predichos aleatoriamente usando método de

Monte Carlo en DFBA por aproximación DA.

Perturbando: (A) Los 44 precursores (B) las 8 macromoléculas (C) los 2 parámetros cinéticos de

muerte celular, (D) 3 parámetros cinéticos formación ácido acético y (E) Todos los anteriores de

forma simultánea. Notación: perfiles aleatorias (negro) perfil condiciones medias (azul), perfil

promedio predicciones aleatorias (verde), límite superior 95% de confianza (amarillo) y límite

interior 95% confianza (rojo). Valores experimentales en punto. Barras de error corresponden a

error en la medición estimado en 2.5%.

Capítulo 3:

Resultados 67

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

Desvi

ació

n e

stá

ndar

rela

tiva

PD

O (

%)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Figura 3.21. Perfiles desviaciones estándar relativas de formación de PDO predicho considerando

sólo variación de: precursores (negro), macromoléculas (rojo), cinética muerte celular (amarillo),

cinética ácido acético (verde), todos los anteriores de manera simultánea (azul).

La desviación estándar relativa empleada de los diferentes parámetros de entrada evaluados fue del

30%

Tiempo (h)

0 10 20 30 40

De

svia

ció

n e

sta

nd

ar

rela

tiva P

DO

(%

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Peso molecular biomasa (g/mol C)

23 24 25 26 27 28

% F

recue

ncia

0

5

10

15

20

25

30

35

A B

Figura 3.22. Efecto de la desviación estándar relativa de la composición de precursores y

macromoléculas en modelo segregado.

(A) Perfiles desviaciones estándar relativas PDO y (B) Distribución poblacional representada como

el peso molecular de la biomasa. Notación desviaciones estándar relativas: 30% (Negro), 20%

(Rojo), 10% (Verde). Desviación estándar relativa de parámetros cinéticos muerte celular y

formación de ácido acético fueron mantenidas constantes en 30%


Clostridium sp

Finalmente fue predicha la formación de PDO considerando las distribuciones poblacionales y

comparadas con los perfiles obtenidos experimentalmente en las diferentes fermentaciones

realizadas durante la validación. Los resultados del modelo segregado por composición celular,

edad y capacidad de formación de ácido acético son mostrados en la Figura 3.23.

Figura 3.23. Comparación perfiles PDO experimental y predichos aleatoriamente por modelo

segregado usando método de Monte Carlo en DFBA por aproximación DA

Variación de los 44 precursores, las 8 macromoléculas, los 2 parámetros cinéticos de muerte

celular y los 3 parámetros cinéticos formación ácido acético para fermentaciones a (A) Exceso de

glicerol – Fermentación 1, (B) Exceso de glicerol – Fermentación 2, (C) Limitación de glicerol –

Fermentación 1, (D) Limitación de glicerol – Fermentación 2. Notación: predicciones aleatorias

(negras), predicción no segregada (azul), perfil promedio predicciones segregadas (verde), límite

superior 95% de confianza (amarillo) y límite interior 95% confianza (rojo). Valores

experimentales en puntos. Barras de error corresponden a error en la medición

Capítulo 3:

Resultados 69

3.3.3 Predicción en dinámico de GSM a través de deleción de enzimas

Los perfiles de PDO obtenidos por aproximación D-ROOM para las mutantes simples evaluadas

son mostrados en la Figura 3.24, donde también es mostrado el PDO predicho por DFBA junto al

máximo perfil de PDO calculado por aproximación D-FVA. Se observa que ninguna mutante

simple presentó mejoras significativas en la producción de PDO o el tiempo de producción y por

tanto la productividad en relación a la cepa nativa. Por otro lado, la Figura 3.25 presenta la

concentración y productividad final de PDO normalizados con respecto a la cepa nativa de 435

mutantes por knockout doble de enzimas, donde tampoco fueron observadas mejoras significativas

en la producción de PDO.

Tiempo(h)

0 10 20 30 40

PD

O (

mM

)

0

50

100

150

200

250

Figura 3.24. Comparación perfil PDO experimental y predichos para 41 mutantes por knockout

simple de enzimas usando aproximación D-ROOM.

Perfil rojo: predicción PDO de cepa nativa con DFBA con aproximación DA. Perfil azul: máxima

predicción de PDO de cepa nativa usando aproximación D-FVA. Barras de error corresponden a

error en la medición estimado en 2.5%.


Clostridium sp

Figura 3.25. Predicción de valores máximos de PDO y Productividad QPDO normalizados de 435

mutantes por knockout doble de enzimas evaluadas empleando aproximación D-ROOM.

Valores normalizados en relación a valor predicho de cepa nativa mediante DFBA por

aproximación DA

1.1.1.205

1.1.1.60

2.3.1.35

2.7.1.304.1.2.4

95.0%

95.5%

96.0%

96.5%

97.0%

97.5%

98.0%

98.5%

99.0%

99.5%

100.0%P

DO

No

rmal

izad

o

1.1.1.205

1.1.1.60

2.3.1.35

2.7.1.304.1.2.4

95.0%

95.5%

96.0%

96.5%

97.0%

97.5%

98.0%

98.5%

99.0%

99.5%

100.0%

Qp

do

No

rmal

izad

a

Capítulo 3:

Resultados 71

3.3.4 Perturbación en las condiciones de cultivo

Los resultados de rendimiento y productividad de PDO en función de la biomasa y glicerol inicial

son mostrados en la Figura 3.26. En la predicción de los rendimientos YPDO/S, se observa una

reducción de éste a concentraciones bajas de glicerol. En relación a las productividades, el modelo

predice valores óptimos con concentraciones de glicerol cercanas a 500mM (46g/L). Por otro lado,

se observa un comportamiento monotónico de la productividad en función de la concentración del

inóculo.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

100200

300400

500600

0.050.10

0.150.20

QP

DO (

g/L

h)

S o (m

M)

Xo (g/L)

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

100200

300400

500600

0.050.10

0.15

YP

DO

/S (

mol/m

ol)

S o (m

M)

Xo (g/L)

Figura 3.26. Superficies de respuesta de rendimiento (YPDO/S) y productividad (QPDO) de PDO de

acuerdo a las concentraciones iniciales de biomasa (X0) y glicerol (S0) predichos mediante DFBA

por aproximación DA

Posteriormente, como alternativa final para mejorar tanto la concentración final de PDO como la

productividad, se realizó predicciones de cultivos por lote alimentado. En el caso de flujo de

alimentación constante los resultados predichos de producción, productividad y rendimiento son

mostrados en la Figura 3.27. En primer lugar se evidencia una relación inversa entre el flujo de

alimentación y concentración de glicerol en la alimentación, dado que a medida que el flujo

aumenta, la concentración del glicerol en éste debe disminuir con el fin de no inhibir el crecimiento

por exceso de sustrato, afectando de esta manera la formación de PDO. También se observa un

incremento de la concentración máxima de PDO de unos 18.8g/L hasta 46.9g/L, en comparación

con predicciones de cultivo por lote, mientras que la productividad QPDO aumentó de 0.5 a

0.64g/L·h, es decir incrementos de hasta un 144% y 28%, respectivamente. En el caso del

rendimiento YPDO/S los valores se mantuvieron aproximadamente constantes.


Clostridium sp

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.00

0.05

0.100.15

0.200.25

020

4060

80100

QP

DO (

g/L

h)

Flu

jo(m

L/m

in)

Contenido glicerol en flujo alimentación (%)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.00

0.05

0.10

0.150.20

0.25

020

4060

80100

YP

DO

/S (

mol/m

ol)

Flu

jo(m

L/m

in)


0

10

20

30

40

50

0.00

0.05

0.100.15

0.200.25

020

4060

80

PD

O (

g/L

)

Flu

jo

(mL/

min

)


Figura 3.27. Predicciones de lote alimentado con flujo alimentación contante.

Valores predichos mediante DFBA por aproximación DA de Concentración (PDO), Productividad

(QPDO) y Rendimiento (YPDO/S) de 1,3-propanodiol en función de flujo contante α de alimentación y

porcentaje másico de glicerol en flujo de alimentación asumiendo V0=1L y Vmax=1.5L.

La segunda estrategia de alimentación evaluada fue alimentación enlazado al control de pH, cuyas

predicciones son mostradas en la Figura 3.28. En esta segunda estrategia de alimentación es

observado nuevamente la relación inversa entre flujo de alimentación y concentración de glicerol

en flujo de alimentación para evitar inhibición por este sustrato. Ahora bien, asumiendo un

rendimiento YPDO/S mínimo de 0.55 se obtuvo que la máxima producción de PDO predicha fue

66.1g/L mientras que su respectiva productividad fue 1.05g/L·h.

Capítulo 3:

Resultados 73

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

020

4060

80

QP

DO (

g/L

h)

Pro

porc

iona

lidad

(%)


0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

020

4060

80100

YP

DO

/S (

mol/m

ol)

Pro

porc

iona

lidad

(%)


0

20

40

60

80

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

020

4060

80

PD

O (

g/L

)

Pro

porc

iona

lidad

(%)


Figura 3.28. Predicciones de lote alimentado con flujo alimentación enlazado al control de pH

Valores predichos mediante DFBA por aproximación DA de Concentración (PDO), Productividad

(QPDO) y Rendimiento (YPDO/S) de 1,3-propanodiol en función de porcentaje β de flujo alimentación

proporcional a control de pH y porcentaje másico de glicerol en flujo de alimentación asumiendo

V0=1L y Vmax=1.5L.

A continuación fue realizada predicción dinámica de cultivo por lote alimentado a condiciones

óptimas de alimentación según es mostrado en Figura 3.28 y condiciones óptimas de glicerol

inicial y e inóculo mostradas en la Figura 3.26. Los resultados son mostrados en la Figura 3.29. Se

observa que las condiciones iniciales no afectaron la producción de PDO, sin embargo mejoraron

la productividad de 1.05 a 1.19g/L·h, al disminuir el tiempo predicho de fermentación de 62.4 a

55.5 horas.


Clostridium sp

Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

Glic

ero

l (g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

Tiempo (h)

0 10 20 30 40 50 60

PD

O (

g/L

)

0

20

40

60

Figura 3.29. Comparación de perfiles predichos de cultivos por lote y lote alimentado.

Predicciones mediante DFBA por aproximación DA de consumo de glicerol y formación de PDO

de cultivo por lote (negro) y lote alimentado (rojo) a condiciones iniciales de glicerol y biomasa de

Tabla 2.4 y lote alimentado (verde) a condiciones iniciales de glicerol e inóculo óptimas.

4. Capítulo 4: Discusión

4.1 Reconstrucción y curación del modelo GSM.

El modelo reconstruido iCbu641, el cual está compuesto de 891 reacciones y 701 metabolitos,

Tabla 3.1, se caracteriza por ser el primer modelo GSM curado de una cepa de Clostridium

productora de PDO. Lo anterior, dado que los modelos GSM de otras cepas solventogénicas no

incluyen las enzimas PDO deshidrogenasa (EC.1.1.1.202) y glicerol deshidratasa (EC.4.2.1.30)

[25, 131, 133-136]. No obstante, en la base de datos BioCyc existe reportado un modelo GSM de

la bacteria Clostridium butyricum 60E.3, en el cual se incluyen dichas enzimas [207]. Sin embargo,

los autores aclaran que el modelo no ha sido revisado de manera manual y por tanto no cuenta con

un proceso de curación. Esto permite revalidar al modelo iCbu641 como el primero curado [208], a

pesar que la anotación empleada está incompleta, por ende el genoma empleado de Clostridium sp

IBUN 13A es un genoma crudo [18].

Al mirar en detalle el modelo reconstruido, como fue mencionado previamente, en primer lugar,

dado que el pH intracelular fue ajustado a un valor constante de 7, las disociaciones de los ácidos y

bases están dadas por sus respectivas constantes de disociación (pKa). De esta forma, ácidos como

el acético y el butírico, en realidad están en sus formas conjugadas, es decir acetato y butirato,

respectivamente [23]. En segundo lugar, se encuentra que iCbu641 está en la capacidad de

consumir no sólo glicerol, sino una gran variedad de carbohidratos. No obstante, entre dichos

carbohidratos no se incluyeron los polisacáridos, a pesar que experimentalmente ha sido detectado

crecimiento empleando algunos de ellos, tales como almidón o CMC [189]. Lo anterior es debido a

que estos polisacaridos no cuentan con una formula elemental definida haciendo dificil cuantificar

su consumo en base molar. Así mismo, practicamente ningún modelo listado en la Tabla 1.7

incluye reacciones de cosumo de dichos compuestos extracelulares. La única excepción es el

modelo GSM de la bacteria C. thermocellum iSR432, en dónde es incluida toda una ruta

metabólica para consumir celulosa, la cual está compuesta de 21 reacciones, lo anterior porque el

objetivo de tal modelo era precisamente predecir el consumo de celulosa [136].

En tercer lugar, con respecto a la red central, fueron detectadas las reacciones tanto de la ruta

oxidativa como la ruta reductiva del consumo del glicerol, Figura 1.3. Así mismo, el modelo

cuenta con las reacciones involucradas en la glicólisis y la ruta de las pentosas fosfato. En relación

a las 9 reacciones involucradas en el ciclo del ácido cítrico (TCA), sólo 4 fueron detectadas a partir

de la información obtenida de la anotación del genoma. No obstante, otras dos reacciones fueron

incluidas en el proceso de curado, dado que eran necesarias en la síntesis de diferentes precursores

y en la estabilidad del modelo en estado estacionario. Las reacciones incluidas fueron las

conversiones de oxaloacetato a citrato y de 2-oxoglutarato a succinil CoA. En contraste, las 3

reacciones no incluidas son las correspondientes a las conversiones de succinil CoA a succinato, de

succinato a fumarato y de malato a oxaloacetato. Ahora bien, al revisar en detalle las enzimas

involucradas en las tres reacciones no incluidas en iCbu641, se tiene que los genes de las enzimas


Clostridium sp

Malato deshidrogenasa (EC.1.1.5.4), conversión de malato a oxaloacetado, y Succinato:CoA ligasa

(EC.6.2.1.4 o EC.6.2.1.5), transformación de succinil CoA a succinato, no fueron detectados en los

genomas mencionados en la Tabla 1.7, algunos de ellos completamente secuenciados, por lo tanto

no deberían ser incluidos en los respectivos modelos GSM, como sucede con la Malato

deshidrogenasa. Sin embargo, la transformación de succinil CoA a succinato es incluida en los

modelos GSM de C. acetobutylicum [133] y C. beijerinckii [134], a pesar que dichos genomas sí

están completamente secuenciados y reportados en KEGG [209]. Por otro lado, la enzima

Fumarato reductasa (EC.1.3.5.4), conversión de succinato a fumarato, sólo ha sido detectada en los

genomas de C. beijerinckii y C. ljungdahlii, por consiguiente están sólo en dichos modelos GSM

[134, 135]. Por lo cual, se recomienda experimentación adicional que permita comprobar la

presencia o ausencia de los genes codificantes a estas tres enzimas en el genoma de Clostridium sp

IBUN 13A. En complemento, los modelos simplificados de Clostridium butyricum de Rafieenia &

Chaganti [137] y Bizukojc et al. [22] coinciden en incluir sólo dos reacciones simplificadas del

ciclo TCA, la primera es la conversión directa de Acetil CoA a Isocitrato, mientras que en la

segunda el Isocitrato es convertido a 2-oxoglutarato, lo cual está de acuerdo con 4 de las 6

reacciones incluidas en iCbu641. Opuesto a lo anterior, el modelo crudo de Clostridium butyricum

60E.3 [207] no incluye ninguna reacción del ciclo TCA, haciendo evidente la necesidad de realizar

un proceso de curación de dicho modelo metabólico.

En cuarto lugar, el modelo reconstruido se caracteriza por ser capaz de sintetizar de novo todos los

aminoácidos, nucleótidos, cofactores, ácidos grasos, fosfolípidos, además de ácido teicoico,

requeridos en la síntesis de biomasa. Sin embargo, otros componentes como terpenoides, a pesar

que no están bloqueados y podrían ser sintetizados de novo, no son anticipados por el modelo dado

que dichos componentes no son incluidos en la síntesis de biomasa. Ahora bien, en las paredes

celulares de cepas de Clostridium han sido detectados terpernoides, los cuales son posiblemente

sintetizados para proteger la célula de las altas concentraciones de ácidos secretados durante el

cultivo [210]. Esto podría ser solucionado mediante la inclusión de dichos compuestos como

precursores de la síntesis de biomasa, pero su contenido en la célula no se conoce de manera

precisa [210]. Otra ruta metabólica que está bloqueada, pero de forma parcial, es la síntesis de

peptidoglicanos, lo anterior debido al difícil seguimiento de la síntesis de este polímero, por lo

tanto el modelo GSM incluye una reacción empírica de formación de Peptidoglicano a partir de

unos precursores dados, por consiguiente muchas reacciones intermedias están bloqueadas.

Igualmente, las rutas de síntesis de las vitaminas B1 y B6 también se encuentran bloqueadas

debido a la falta de reacciones intermedias, sin embargo dichas reacciones intermedias tampoco

están presentes en los modelos GSM de referencia [25, 131, 133-136], haciendo que la incapacidad

de sintetizar dichas vitaminas sea común en todos los modelos reconstruidos de cepas

solventogénicas de Clostridium. Así mismo, estas vitaminas no son incluidas como precursores de

la biosíntesis de biomasa y por tanto su producción no será predicha por el FBA.

Finalmente, entre los 63 metabolitos bloqueados mencionados en la Tabla 3.1, además de los 7

involucrados en la síntesis de vitamina B6, destacan los 31 involucrados en rutas alternas de

síntesis o degradación de aminoácidos y nucleótidos y los 15 pertenecientes a rutas de consumo de

carbohidratos. Estos metabolitos podrían estar bloqueados debido a la falta de información del

genoma secuenciado que permitiera incluir reacciones que los conectara con el resto de la red

metabólica. Así mismo, podría ser ocasionado por errores en la anotación automatizada del

genoma que llevaron a incluir sus reacciones correspondientes de manera equivocada. Lo anterior

permite sugerir mejorar en trabajos posteriores el modelo GSM reconstruido a partir de nueva

información que pueda ser obtenida del genoma anotado, ya sea empleando herramientas

bioinformáticas diferentes tales como ConsPred [211] o completando los gaps o espacios del

genoma mediante detección de genes por biología molecular.

Capítulo 4:

Discusión 77

4.2 Predicciones de estados fenotípicos en estado estacionario

4.2.1 Predicción del crecimiento en glicerol

Una vez reconstruido y curado el modelo GSM, se buscó predecir el crecimiento de Clostridium

butyricum en glicerol mediante FBA. Como ya fue mencionado previamente, el FBA es un proceso

de optimización donde debe ser escogida una función objetivo que permita predecir el

comportamiento fenotípico [31]. La selección de dicha función objetivo ha sido centro de

diferentes estudios y una de las más seleccionadas es la maximización de la biomasa, la cual tiene

como fundamento teórico que en la historia evolutiva del microorganismo se han seleccionado las

rutas que permitan obtener los más altos rendimientos de biomasa [35]. Lo anterior ha sido

demostrado con relativa facilidad en procariotas, pero no es del todo cierto para células eucariotas

[31]. En el caso específico de estudios en cepas de Clostridium solventogénicas, Senger &

Papoutsakis [128], Lee et al. [130] , Salimi et al. [131], McAnulty et al. [132], Milne et al. [134] y

Roberts et al. [136] coincidieron en emplear la maximización de la biomasa como función objetivo

y por tanto fue seleccionada como la primera alternativa para predecir el crecimiento de C.

butyricum en glicerol.

No obstante, como es observado en la Figura 3.4, la maximización de la biomasa se alejó más de

un 300% en la predicción del crecimiento, mientras que no predijo la formación de PDO. Lo

anterior fue opuesto a lo esperado, dado que la producción de PDO en Clostridium sp IBUN 13A,

y en general en Clostridium butyricum, está condicionada a la expresión del regulón dha [212] y la

respectiva actividad de las enzimas glicerol deshidratasa (EC.4.2.1.30) y PDO deshidrogenasa

(EC.1.1.1.202). Ambas situaciones han sido demostradas ocurren sólo en presencia de glicerol

[193, 194, 213] y por consiguiente la predicción del FBA debió anticipar conversión de glicerol a

PDO.

La anterior falta de predicción puede ser interpretada a través del balance redox. Al ser una

bacteria anaeróbica, Clostridium butyricum debe emplear el sustrato simultáneamente como

aceptor y donor de electrones [214]. Por otro lado, el FBA predice que los equivalentes reducidos

formados pueden ser empleados eficientemente sobreproduciendo ácido fórmico e hidrógeno. Por

consiguiente el FBA predice que el sustrato puede ser empleado prácticamente sólo como donor de

electrones y así mejorar la formación tanto de ATP como de biomasa mediante el proceso de

fosforilación a nivel de sustrato [19]. Es por lo anterior que la optimización LP es incapaz de

predecir la formación de compuestos reducidos, como el mismo PDO, siempre que la célula esté en

capacidad de producir hidrógeno y/o ácido fórmico. Resultados similares fueron obervados al usar

glucosa como sustrato, donde el ácido fórmico y el hidrógeno fueron sobreproducidos en lugar de

productos reducidos como butanol o etanol (datos no mostrados). En consecuencia, es posible

sugerir que la optimización LP es inadecuada en la predicción de rendimientos experimentales de

microorganismos capaces de producir ácido fórmico y/o hidrógeno. Lo anterior, a pesar que la

optimización LP es la más empleada [37, 38, 43], incluso en cepas solventogénicas de Clostridium

[128, 131, 132, 134, 136].

Dado lo anterior, una nueva función objetivo fue planteada, la cual fue maximización de la

biomasa mientras minimiza el uso enzimático, Ecuación 2.5. Esta función objetivo está basada en

la hipótesis que la célula busca maximizar el crecimiento mientras que emplea la menor cantidad

de enzimas, dado que éstas requieren energía para su producción [38]. Los resultados son

mostrados en la Figura 3.4, donde se observa un buen ajuste de los datos experimentales a

limitación de glicerol. Esto permitió sugerir que la bacteria C. butyricum DSM 5431, la cual es


Clostridium sp

productora natural de hidrógeno y ácido fórmico, en efecto busca minimizar el uso de enzimas. Así

mismo, la predicción del nuevo estado fenotípico demuestra que la célula prefiere usar la ruta del

PDO para regenerar el NADH y por consiguiente validar el mecanismo de regulación

transcripcional del regulón dha, el cual está controlado por la presencia de glicerol [193, 194, 213],

y por tanto también confirma la capacidad de predecir un adecuado balance redox. Ahora bien, esta

función objetivo convierte el FBA en una optimización NLP no convexa, por ende no garantiza

que el óptimo calculado sea en realidad el óptimo global. Sin embargo, Schuetz et al. sugirieron

que los óptimos locales predichos son en realidad óptimos globales [38]. Lo anterior fue validado

al realizar predicciones del crecimimiento en glicerol usando las optimizaciones LP y NLP y como

restricciones adicionales la no formación de ácido fórmico e hidrógeno, obteniendo como resultado

exactamente el mismo estado fenotípico con ambas optimizaciones.

No obstante, la función objetivo NLP empleada no predijo el crecimiento en condiciones de exceso

de glicerol, sugiriendo que Clostridium butyricum crece de forma sub-óptima cuando el sustrato

está en exceso, lo cual también ha sido observado en E. coli [38]. Lo anterior podría ser opuesto a

lo demostrado en modelos cinéticos no estructurados como el de Monod, dónde el crecimiento es

mayor en condiciones de sustrato en exceso [215]. Sin embargo, un crecimiento sub-óptimo en

exceso de glicerol no traduce en un menor valor en el crecimiento predicho en comparación con un

crecimiento óptimo en limitación de glicerol. Pues como se muestra en la Figura 3.3, a

concentraciones de glicerol inferiores a 15g/L el flux de consumo de glicerol es menor y por tanto

la velocidad específica crecimiento (µ) también será baja a pesar que dicho crecimiento suceda de

manera óptima.

Tal comportamiento sub-óptimo puede ser entendido si es analizado desde el punto de vista

termodinámico. El crecimiento, como cualquier reacción, es termodinámicamente factible si su

fuerza impulsora expresada como energía libre de Gibbs es negativa (ΔGcrecimiento<0). La energía

libre de Gibbs del crecimiento puede ser expresada en función del rendimiento de biomasa y de las

energías libres de Gibbs del catabolismo y el anabolismo como es mostrado en la Ecuación 4.1

[214]. Por lo tanto, un incremento en la factibilidad estará enlazada a una reducción en el

rendimiento de biomasa, lo cual sucede en escenarios como competición con otros

microorganismos por los sustratos presentes en el medio [214]. Sugirirendo que el cultivo en

exceso de glicerol podría inducir el comportamiento previamiente descrito, con el objetivo de

prevalecer en dicho ambiente. Por consiguiente, este comportamiento fue incluido en la función

objetivo de la Ecuación 2.5. mediante la adición de la minimización de la producción de ATP,

Ecuación 2.6, debido a que una reducción en la producción de ATP está enlazada a la respectiva

reducción en el rendimiento de biomasa.

∆𝐺𝑐𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =1

𝑌𝑋/𝑆∆𝐺𝑐𝑎𝑡𝑎𝑏𝑜𝑙𝑖𝑠𝑚𝑜 + ∆𝐺𝑎𝑛𝑎𝑏𝑜𝑙𝑖𝑠𝑚𝑜 4.1

La nueva función objetivo por lo tanto maximiza la biomasa mientras minimiza el uso enzimático

y la producción de ATP. La Figura 3.4 permite constatar la adecuada predicción del crecimiento

empleando la función objetivo para condiciones sub-óptimas. No obstante, dicha función objetivo

también predijo un incremento en el rendimiento de PDO de un 28% en comparación con la

función objetivo empleada para cultivo óptimo. Lo anterior está de acuerdo con lo mostrado en la

Tabla 1.3, donde Zeng [21] calculó que a exceso de glicerol el rendimiento de PDO podría ser

hasta un 30% superior en relación a un cultivo en limitación de glicerol.

Ahora bien, Zeng [21] predijo que el incremento en la formación de PDO al pasar de limitación a

exceso de glicerol es ocasionado por una reducción en la formación de hidrógeno. Como es

Capítulo 4:

Discusión 79

mostrado en la Figura 1.3, la enzima Piruvato-ferredoxina oxidoreductasa (EC.1.2.7.1) reduce la

ferredoxina durante la transformación de piruvato a acetil CoA. Por consiguiente es requerida la

regeneración de dicha ferredoxina, proceso llevado a cabo por la enzima hidrogenasa (EC.1.12.7.2)

mientras es formado hidrógeno simultáneamente. Por lo tanto, Zeng [21] con el fin de validar su

hipótesis calculó la relación entre hidrógeno formado y ferredoxina reducida (𝛼𝐻2/𝐹𝑑). Si la

relación es igual a 1 equivaldría a una conversión estequiométrica. En caso que la relación fuera

mayor a 1, la enzima ferredoxina reductasa (EC.1.18.1.4) también estaría interviniendo mediante el

consumo de NADH y así reducir más ferredoxina y por ende sería una reacción competidora de la

formación de PDO. De forma opuesta, si la relación es menor a 1, la ferredoxina oxidada es

insuficiente, llevando a la enzima ferredoxina reductasa también a oxidar la ferredoxina mediante

consumo de NAD, lo cual favorecería la formación de PDO. Zeng encontró que dicha relación era

aproximadamente igual a 1.1 y 0.4 a limitación y exceso de glicerol, respectivamente. Lo anterior

permitió a Zeng comprobar que un exceso de glicerol favorece la formación de PDO gracias a la

baja formación de hidrógeno. Ahora bien, al calcular dicha relación empleando los fluxes

predichos, se obtuvo los valores de 1.46 y 0.40 a condiciones óptimas y sub-óptimas,

respectivamente, es decir valores coherentes con lo obtenido experimentalmente [21].

Ahora bien, Saint-Amans et al. [79] propusieron que la direccionalidad de la enzima ferredoxina

reductasa está regulada por la relación acetil-CoA/CoA, dónde una alta relación favorece el

consumo de NADH, mientras que una baja relación favorece el consumo de NAD. Sin embargo,

Abbad-Andaloussi et al. [126] sugirieron que el consumo del glicerol por parte Clostridium

butyricum está controlado por la enzima glicerol deshidratasa. Lo anterior es basado en que su

producto (3-hidroxipropionaldehido o 3-HPA) es altamente tóxico para la célula y por lo tanto la

enzima PDO deshidrogenasa lo debe consumir tan pronto es formado, por lo cual es requerida altas

concentraciones de NADH para favorecer la conversión de 3-HPA a PDO. Es por lo anterior que la

enzima ferredoxina reductasa tiende a oxidar la ferredoxina y formar más NADH. Así, el NADH

sobreproducido también tiende a inhibir la enzima Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa

(EC.1.2.1.12), por lo tanto favorece el redireccionamiento del glicerol hacia la ruta reductiva,

mejorando la formación de PDO a exceso de glicerol. Por consiguiente, en contrapartida, a

limitación de glicerol, la célula al funcionar de manera óptima no requería NADH en exceso,

permitiendo a la enzima Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa actuar de manera óptima. Lo anterior

favorecería la obtención de acetil CoA y por ende la formación de hidrógeno, ATP y así mismo de

biomasa, reduciendo a la postre la conversión de glicerol a PDO. Finalmente, con el objetivo de

evitar los anteriores procesos de regulación, sería posible pensar en producir el PDO por tecnología

de enzimas. No obstante, dicho proceso resulta ser económicamente poco viable dado que requiere

de NADH como co-sustrato, el cual hace del proceso costoso, ya sea porque el NADH deba ser

regenerado, inmovilizado, retenido o reemplazado [216].

4.2.2 Predicción de la expresión de enzimas

Posterior a la validación extracelular del modelo, fue realizada la validación de la red metabólica

en estado estacionario, la cual fue realizada evaluando la capacidad del FBA para predecir la

expresión de las enzimas. La validación fue realizada empleando 174 enzimas que fueron

detectadas experimentalmente en la fase exponencial de crecimiento. Inicialmente fueron

descartadas las enzimas bloqueadas, es decir 27, de las cuales 10 pertenecen a la biosíntesis de

glicanos y terpenoides, cuya explicación por estar bloqueadas ya fue mencionada previamente. Lo

mismo corresponde a las 5 enzimas pertenecientes al metabolismo de aminoácidos, cuyas rutas no

están completas. Sin embargo, entre la 12 enzimas del metabolismo de carbohidratos bloqueadas

destaca las enzimas β-glucosidasa (EC.3.2.1.21), 6-P-β-glucosidasa (EC.3.2.1.86), sorbitol


Clostridium sp

deshidrogenasa (EC.1.1.1.14), β-galactosidasa (EC.3.2.1.23), 6-P-β-galactosidasa (EC.3.2.1.85) y

fructokinasa (EC.2.7.1.4), las cuales se caracterizan por consumir sustratos como celobiosa,

arbutina, sorbitol, galactosa, lactosa y fructosa, los cuales no fueron definidos como parte del

medio de cultivo empleado experimentalmente. Aunque al ser empleado un medio complejo es

posible que estos sustratos se encontraran en niveles basales. Así mismo, es posible que dichas

enzimas se hayan expresado de forma constitutiva, como sucede con la fructokinasa [217]. Las

restantes 6 enzimas del metabolismo de carbohidratos están bloqueadas dado que hacen parte de

rutas incompletas como el metabolismo de amino-azúcares y nucleótido-azúcares. Este es el caso

de las enzimas manosa 6-P isomerasa (EC.5.3.1.8), GDP-manosa fosforilasa (EC.2.7.7.22) o UDP-

glucosa deshidrogenasa (EC.1.1.1.22), las cuales podrían ser desbloqueadas completando su ruta

metabólica e incluyendo sus productos en la biosíntesis de biomasa.

De las 147 enzimas restantes consideradas en la comparación, el modelo predijo la expresión del

83.7% de ellas. Permitiendo inferir la adecuada capacidad predictiva del modelo para la selección

de rutas metabólicas a pesar de no haber sido incluidas restricciones experimentales, tales como

datos de transcriptómica. Las enzimas con expresión predicha permiten sugerir la existencia en

efecto de una correlación entre nivel de expresión y flux predicho, Figura 3.5. Esto implica que la

actividad por unidad molar para la mayoría de las enzimas tenderá a estar en un rango casi

constante. No obstante, algunas enzimas, como la fosfopiruvato hidratasa (EC.4.2.1.11) y la

enzima hidrogenasa (EC.1.12.7.2), destacan por la alta relación entre su flux predicho y su nivel de

expresión detectado. Por consiguiente, estas enzimas tienen una actividad por unidad molar mucho

más alto que el promedio.

Por otro lado, la ausencia de predicción de las 24 enzimas restantes pudo ser debido a la presencia

de rutas alternativas que llevaran a cabo conversiones equivalentes a las realizadas por las enzimas

no predichas. Lo anterior permitiría suponer que la célula podría usar diferentes rutas de manera

simultánea para obtener un metabolito dado, mientras el FBA escogerá sólo una de estas rutas,

dichos casos son mostrados en la Tabla 4.1. Entre las enzimas no predichas listadas en la Tabla 4.1

destaca la Piruvato fosfato dikinasa, la cual está involucrada en la ruta de la gluconeogénesis, sin

embargo también actúa en lugar de la piruvato kinasa, pero consumiendo AMP en lugar de ADP

[218, 219]. En adición, algunas de las enzimas no predichas están involucradas en procesos de

reciclaje de algunas moléculas. En contraste, el FBA sólo permite predecir procesos netos, siendo

incapaz de anticipar la formación de moléculas que luego serán reutilizadas en otros procesos. Tal

es el caso de la enzima Nicotinato fosforibosiltrasferasa (EC.6.3.4.21), encargada de reciclar la

fracción de piridina de nucleótidos proveniente de fragmentos de ADN o ARN ya no empleados

[220]. Caso similar es observado con las enzimas Pirimidina-nucleosido fosforilasa (EC.2.4.2.2),

Uracil fosforibosiltransferasa (EC.2.4.2.9) y citidina deaminasa (EC.3.5.4.5), las cuales están

involucradas en procesos de reutilización de piridinas y/o nucleósidos.

La mayoría de las enzimas no predichas listadas anteriormente están involucradas en el

metabolismo de nucleótidos y aminoácidos. No obstante, la expresión de enzimas pertenecientes al

metabolismo de carbohidratos pudo no haber sido predicha por otras razones. En primer lugar,

porque algunas de ellas están relacionadas con el consumo de sustratos no incluidos en el modelo.

Dichas enzimas son glucógeno fosforilasa (EC.2.4.1.1), α-glucosidasa (EC.3.2.1.20) y aldosa

epimerasa (EC.5.1.3.3), las cuales están involucradas en el consumo de almidón, maltosa y

galactosa, respectivamente. Así mismo, ciertas enzimas, al igual que algunas enzimas bloqueadas,

están involucradas en el metabolismo de compuestos simplificados al momento de ser incluidos en

la síntesis de biomasa, por tanto su expresión no es anticipada por el FBA, tal es el caso de la

enzima UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa (EC.5.1.3.4). Finalmente, otro grupo de enzimas no

predichas están involucradas en el almacenamiento de energía en forma de granulosa, proceso que

Capítulo 4:

Discusión 81

no puede ser predicho por FBA. Dichas enzimas son: ADP glucosa pirofosforilasa (EC.2.7.7.27),

almidón sintasa (EC.2.4.1.21) y la enzima ramificadora del glucógeno (EC.2.4.1.18). La granulosa

es un polisacárido que es producido y almacenado por la célula durante su crecimiento, para ser

posteriormente empleado como fuente de energía mientras está en forma de espora [221].

Tabla 4.1. Comparación entre enzimas no predichas por FBA y enzimas equivalentes

Enzima con expresión no predicha Enzima equivalente activa según FBA

Shikimato deshidrogenasa

(EC.1.1.1.25)

Quinato/Shikimato deshidrogenasa

(EC.1.1.1.282)

Glicerato: NAD(P) oxidoreductasa

(EC.1.1.1.60)

Glicerato deshidrogenasa (EC. 1.1.1.29)

Glicerol 3-P deshidrogenasa (EC.1.1.1.94) Glicerol kinasa (EC.2.7.1.30)

Prefenato deshidrogenasa

(EC.1.3.1.12)

Prefenato deshidrogenasa (NADP)

(EC.1.3.1.13)

Ribonucleotido reductasa (EC.1.17.4.2) Nucleosido difosfato kinasa (EC.2.7.4.6)

Glicina hidroximetiltransferasa (EC.2.1.2.1) Fosfoserina fosfatasa (EC.3.1.3.3)

Homoserina O-succiniltransferasa

(EC.2.3.1.46) + Cistationina γ-sintasa

(EC.2.5.1.48)

homoserina O-acetiltransferasa

(EC.2.3.1.31)1 + Metionina sintasa

(EC.2.5.1.49)

Glucokinasa (EC.2.7.1.2) D-glucosa permeasa (EC.2.7.1.199)

Piruvato fosfato dikinasa (EC.2.7.9.1) Piruvato kinasa (EC.2.7.1.40)

Treonina deaminasa (EC.4.3.1.19) 3-isopropilmalato deshidrogenasa (EC.1.1.1.85)

Asparagina sintasa (EC.6.3.5.4) Asparagina sintetasa (EC.6.3.1.1) 1 Adicionada en el gapfilling

De manera análoga, tras comparación con el proteoma reportado por Comba González et al. [19],

de las 17 enzimas detectadas en el proteoma durante la fase exponencial de crecimiento sólo la

expresión de la enzima Cisteína sintetasa (EC.2.5.1.47) no fue predicha. Lo anterior es debido a

que el medio de cultivo empleado contenía cisteína, lo cual permite anticipar al modelo que dicho

aminoácido no es necesario ser sintetizado. No obstante, al asumir que dicha enzima está activa es

posible sugerir que existe algún mecanismo de desrepresión que ocasiona su expresión a pesar que

el medio cuenta con cisteína, como ha sido detectado en Aspergillus nidulans, donde la expresión

de esta enzima está asociada la escasez de los aminoácidos arginina, histidina o prolina [222].

Por lo tanto, la predicción de fluxes mediante FBA podría no anticipar la expresión de algunas

enzimas por alguno de los siguientes motivos:

Presencia de rutas paralelas que permitan hacer conversiones similares mediante uso de otras

enzimas.

Simplificación en algunas partes de la red que anticipe la no necesidad de algunas enzimas.

Procesos de reciclaje que permiten reutilizar fragmentos de moléculas en otros procesos.

Presencia de algunos sustratos en el medio de cultivo, ya sea en concentraciones basales, que no

fueron incluidos en el modelo.

Expresión constitutiva de enzimas que permitirían consumir sustratos no presentes en el medio

de cultivo y por consiguiente no incluidos en el modelo.

Almacenamiento de energía en forma de polisacáridos para ser empleados como sustratos

durante etapas de latencia.

Los anteriores motivos, o inclusos otros, están controlados por la célula mediante diferentes

estrategias de regulación, desde transcripcionales que controlen la expresión de las enzimas, hasta


Clostridium sp

químicos, mediante mecanismos de inhibición o regulación alostérica. Los cuales no pueden ser

anticipados por el FBA, a menos que sean incluidas las restricciones adecuadas. Sin embargo,

dicha adición podría llevar a un incremento considerable en la complejidad del modelo, como

sucede al incluir lógica Booleana [223, 224].

Finalmente, fue realizada la validación de la red metabólica en estado dinámico, mediante

comparación de fluxes predichos por DFBA y enzimas detectadas en el proteoma, tanto en las

fases exponencial como estacionaria de crecimiento. El número de enzimas consideradas en la

comparación fue 129, mientras que la capacidad predictiva equivalente al 82.9%. Dichos

resultados son coherentes con los obtenidos por FBA, lo cual es esperado dado que el DFBA está

basado en un FBA multietapa en el que es incorporado el ambiente extracelular [30, 158].

4.2.3 Predicción del crecimiento en otros sustratos

De manera similar a la predicción de estados fenotípicos en glicerol, fueron evaluados otros

sustratos como glucosa. En primer lugar, en la Tabla 3.3 y la Tabla 3.4 evidencian la capacidad

predictiva de iCbu641 al emplear diferentes sustratos, dado la coherencia entre datos

experimentales y predichos, en especial los rendimientos de biomasa, no obstante se recomienda

curación adicional para mejorar la predicción del crecimiento en pentosas.

En segundo lugar, la validación mediante empleo de datos de transcriptómica fue coherente con lo

obtenido durante la comparación con datos de proteómica, sin embargo el porcentaje de predicción

fue menor, es decir 76%. Esta disminución en la capacidad predictiva está ligada a las 11 enzimas

no predichas pertenecientes a rutas de vitaminas y cofactores. Entre dichas enzimas destaca las 7

involucradas en el metabolismo de tiamina o vitamina B1, la cual no es predicha dado que no hace

parte de la síntesis de biomasa, además que su ruta de síntesis de novo no está completa, como fue

mencionado previamente. No obstante, el transcriptoma anticipa la expresión de las enzimas

Cisteina desulfurasa (EC.2.8.1.7) y 1-deoxi-D-xilulosa-5-P sintasa (EC.2.2.1.7), las cuales no

hacen parte del modelo GSM reconstruido, permitiendo sugerir que C. butyricum podría sintetizar

de novo la tiamina. Por otro lado, entre las enzimas no predichas se encuentran la tiamina kinasa

(EC.2.7.6.2) y la aminopirimidina aminohidrolasa (EC.3.5.99.2). Las cuales están involucradas en

procesos de salvamento de la tiamina, haciéndolas enzimas imposibles de predecir por FBA

aunque la ruta sea completada y la tiamina incluida en la síntesis de biomasa. Lo anterior debido a

que el salvamento de la tiamina es un proceso de reciclaje de esta molécula [225, 226].

Así mismo, el modelo no predice la expresión de la enzima Holo-ACP sintetasa (EC.2.7.8.7), la

cual cataliza la hidrólisis de la Coenzima A para sintetizar la proteína transportadora de acilos

(ACP por sus siglas en inglés: Acyl Carrier Protein), proteína fundamental en el proceso de

síntesis de ácidos grasos [227]. Por lo tanto, en este caso el FBA predice el proceso exactamente

contrario al mencionado previamente, dado que según FBA todo el ACP presente en el citoplasma

es continuamente reciclado. Sin embargo, según información de transcriptómica [200], la célula

requeriría que el ACP sea sintetizado de novo. Lo anterior también es observado en la proteína

Holo-[carboxilasa], la cual es sintetizada a partir de biotina y es requerida en la síntesis de ácidos

grasos, por consiguiente el FBA anticipará que no es necesaria la biotina durante el crecimiento y

no será consumida a pesar que usualmente es suministra en el medio de cultivo y su concentración

ha sido optimizada [16]. Por lo tanto, la posibilidad de incluir proteínas específicas en la síntesis de

biomasa permitiría dar mayor precisión al FBA para predecir la expresión de enzimas, pero sería

requerido saber el contenido de estas proteínas en la célula.

Capítulo 4:

Discusión 83

Finalmente, la Tabla 3.5 muestra los rendimientos predichos y experimentales tanto de una cepa

nativa como de una cepa mutante por knockout. En dicha mutante fue bloqueada la expresión de la

enzima β-hydroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC.1.1.1.157), y por tanto evitando la conversión de

acetoacetil-CoA a hidroxibutanoil-CoA y a la postre la obtención de ácido butírico. El objetivo de

esta deleción era la eliminación de rutas competidoras de la formación de hidrógeno. No obstante,

Cai et al. [206] sugirieron que al bloquear esta reacción, la célula evitaría la acumulación del

acetoacetil-CoA mediante la formación de etanol, lo cual implicaría un consumo de NADH y por

consiguiente una nueva ruta competidora que llevaría a la reducción en la formación de hidrógeno.

Lo anterior sucede experimentalmente y también es predicho por FBA y ROOM, permitiendo

validar la importancia de ROOM para la predicción de estados fenotípicos de mutantes por

knockout.

4.3 Predicciones de estados fenotípicos en estado transiente.

De la Figura 3.8 a la Figura 3.10 son mostrados los estudios preliminares de selección de

polinomio ortogonal, tamaño de paso y aproximación dinámica a emplear, respectivamente. Los

resultados permitieron concluir, en primer lugar que al emplear 6 puntos de colocación la selección

del polinomio ortogonal no tuvo incidencia en la predicción de PDO producido, dado que la

diferencia máxima en predicciones fue 2.5x10-5

mM (1.9x10-6

g/L). Lo anterior está de acuerdo con

reportes en los cuales han sido evaluados diferentes polinomios ortogonales de Jacobi para estudiar

la difusión a través de una esfera reactiva, es decir una sola ecuación diferencial de segundo orden

[228, 229]. Dichos reportes consideraron hasta 8 polinomios ortogonales, encontrado que para 6

puntos de colocación, todos los polinomios evaluados tuvieron un error cercano de 10-5

, mientras

que a partir de 12 puntos de colocación se obtuvo el menor error, el cual fue 10-14

al emplear el

polinomio de Legendre. Por lo tanto, fue seleccionado el polinomio de Legendre, el cual también

es el más empleado en este tipo de aplicaciones [30, 157, 230]. Lo anterior también está de acuerdo

con Sharifian & Fanaei [231], quienes al emplear colocación ortogonal determinaron que fue

posible predecir de manera adecuada el comportamiento de un modelo de crecimiento no

estructurado. Lo que permitiría disminuir el tiempo de simulación en comparación con otros

métodos numéricos tales como el método de diferencias finitas o el método de Galerkin. Dicha

disminución en el tiempo de simulación facilitaría el desarrollo de modelos segregados de

crecimiento u oscilatorios de control automatizado.

Así mismo, los perfiles obtenidos por las diferentes aproximaciones mostraron una máxima

diferencia de 0.07g/L en la concentración final de PDO. No obstante, la aproximación DOA fue en

primer lugar considerablemente más demorada, pues tomó cerca de 5200 veces más tiempo en

converger que la aproximación DA. Otra desventaja de la aproximación DOA es el realizar una

sola optimización durante todo el tiempo de fermentación. Lo anterior la hace inviable de emplear

si es necesario un cambio de la función objetivo en algún momento dado de la fermentación.

Ejemplo de dicho cambio de función objetivo es la misma producción de PDO, donde hay un

cambio de estado fenotípico ocasionado por el glicerol al pasar de estar en exceso a estar en

limitación. Por consiguiente, fue seleccionada la aproximación DA, la cual adicionalmente, a

diferencia de la aproximación SOA, mantiene las ecuaciones diferenciales, ventaja que permite

posteriores perturbaciones el modelo [30, 158].

Ahora bien, con respecto a la selección del tamaño de paso para la aproximación DA, éste no

afectó en las predicciones en el intervalo evaluado, es decir entre 0.05 y 0.40h. No obstante, al

emplear un tamaño de paso de 0.20h en la aproximación DOA había pérdida de factibilidad (datos

no mostrados), por tal motivo en la comparación de aproximaciones fue empleado un tamaño de


Clostridium sp

paso de 0.15h. Lo anterior es opuesto a lo reportado por Laiglecia et al. [156], quienes emplearon

un tamaño de paso de 1.0h para predecir el crecimiento de la microalga Synechocystis sp. PCC

6803. Sin embargo, las velocidades máximas de consumo de los sustratos limitantes empleadas por

Laiglecia et al. [156], es decir fósforo y nitrógeno, fueron cerca de 50 veces inferiores a la

calculada para Clostridium sp IBUN 158B. Por lo tanto, es posible sugerir que los valores de los

parámetros cinéticos empleados inciden en el tamaño de paso seleccionado a fin de evitar pérdidas

de factibilidad. Lo anterior está de acuerdo con lo realizado en el análisis de sensibilidad por el

método de Monte Carlo, debido a que se tuvo que emplear un tamaño de paso de 0.20h para

reducir el número de combinaciones aleatorias que perdieran la optimalidad y al mismo tiempo no

aumentar de manera considerable el tiempo de simulación.

Por otro lado, según es observado de la Figura 3.12 a la Figura 3.15, las predicciones dinámicas

fueron acordes con los datos experimentales de producción de PDO de la cepa Clostridium sp

IBUN 158B cultivada en glicerol en reactor por lotes. Así mismo, las predicciones de consumo de

glicerol, formación de biomasa y formación de ácido butírico fueron similares a los valores

experimentales. Sin embargo, es observada una subestimación en el consumo de glicerol y por

consiguiente en la formación de PDO a concentraciones de glicerol inferiores a 50mM (4.6g/L),

Figura 3.14 y Figura 3.15. Lo anterior es debido al ajuste de la cinética del flux de consumo de

glicerol, permitiendo sugerir que la constante de afinidad de la célula al glicerol fue sobreestimada

y por ende las predicciones de consumo de flux fueran subestimadas a concentraciones inferiores a

50mM.

Por otro lado, también es observada diferencias significativas entre valores predichos y

experimentales de la formación de ácido acético a partir de la fase de crecimiento exponencial

desacelerado. Lo anterior es debido a la cinética empleada de máximo flux de formación de ácido

acético en función del flux de consumo de glicerol, Figura 3.2. Dado que dicho ajuste obedece a un

comportamiento alostérico, la formación de este ácido disminuirá considerablemente al reducirse

el consumo de glicerol. No obstante, este comportamiento regulatorio es descrito en otras cepas de

Clostridium butyricum, pues a partir de comparación de cultivos en glucosa y glicerol se observó

que la formación de ácido acético en efecto estaba regulada a nivel enzimático por la presencia del

glicerol, mas no es a nivel genómico [79], lo cual valida la regulación de tipo alostérica empleada

en el presente estudio. Ahora bien, lo anterior también se observa en la Figura 4.1, donde se

muestra los fluxes de PDO y ácidos acético y butírico predichos en función de la concentración de

glicerol. Así mismo, se observa el favorecimiento de la formación de PDO a condiciones de exceso

de glicerol (>15g/L) donde el flux de formación de ácido acético es mayor que el flux de

formación de ácido butírico. Por el contrario, a limitación de glicerol (<15g/L) el flux de formación

de ácido butírico es superior, lo que conlleva a una reducción considerable en el flux de formación

de PDO. Lo anterior es coherente con lo reportado, dado que la actividad de la enzima tiolasa

(EC.2.3.1.9), involucrada en la formación de ácido butírico, tendió a ser aproximadamente

contante a diferentes fluxes de consumo del glicerol, mientras que la enzima acetato kinasa

(EC.2.7.2.1), encargada de la síntesis de ácido acético, sí incrementó su actividad de manera

considerable al aumentar el flux de consumo de glicerol, llegando incluso a ser 15 veces más activa

a fluxes altos. También se encontró que las enzima glicerol deshidratasa y PDO deshidrogenasa

aumentaron su actividad en función al flux de consumo de glicerol [125, 126].

Finalmente, a partir de la validación experimental es posible observar que la formación ácido

láctico sólo es predicho a condiciones de limitación de glicerol. Lo anterior también es ocasionado

por la restricción de máxima formación de ácido acético, lo que fuerza al modelo a predecir la

secreción de protones producidos durante el crecimiento mediante la formación de otros ácidos,

como es el caso del ácido láctico, aunque su concentración máxima predicha es sólo de 0.3g/L. No

Capítulo 4:

Discusión 85

obstante, la formación de ácido láctico implica también el consumo de NADH, haciéndolo una ruta

competidora de la obtención de PDO a pesar que está favoreciendo la formación de biomasa [79,

80]. Por el contrario, el ácido láctico fue detectado experimentalmente sólo al final de una de las

fermentaciones a condiciones de exceso de glicerol. Dicho valor detectado fue de 0.17g/L, lo cual

permitiría sugerir que para la cepa Clostridium sp IBUN 158B la formación de ácido láctico no

resulta ser una ruta que compita de forma considerable con la formación de PDO. Así mismo,

Chatzifragkou et al. [95], quienes detectaron la formación de al menos 0.3g/L de ácido láctico,

sugirieron que la formación de ácido láctico es debida al exceso de NADH presente en el

citoplasma y por lo tanto la expresión de la enzima lactato deshidrogena está controlada por

mecanismos de regulación, los cuales como fue mencionado previamente no fueron incluidos en el

modelo desarrollado.

Figura 4.1. Comparación de fluxes predichos de formación de PDO (verde), ácidos acético (azul)

y butírico (rojo) en función de glicerol extracelular.

Línea gris vertical corresponde al cambio de estado fenotípico subóptimo a óptimo a partir de

15g/L (163mM) de glicerol.

4.4 Perturbaciones en el modelo GSM

4.4.1 Análisis de sensibilidad y desarrollo del modelo segregado

Diferentes análisis de sensibilidad globales fueron realizados en estado estacionario y estado

dinámico. Por un lado la Figura 3.6 muestra análisis de sensibilidad global PRCC en estado

estacionario, siendo evaluado el efecto de la composición de la biomasa en los rendimientos de

biomasa y PDO considerando el glicerol en limitación y en exceso. Se observa el bajo efecto de la

composición de precursores, mientras que en el caso de las macromoléculas la correlación fue

mayor. No obstante, dado que las máximas desviaciones estándar relativas de los rendimientos de

biomasa y PDO fueron 3.3% y 0.7%, respectivamente, es posible sugerir que el modelo GSM es lo

0

5

10

15

20

25

30

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Flu

x se

cre

ció

n P

DO

(m

mo

l/g·

h)

Flu

x se

cre

ció

n á

cid

os

(mm

ol/

g·h

)

Glicerol (mM)


Clostridium sp

suficientemente robusto como para no predecir cambios en la conversión de glicerol a PDO

mediante cambios en la composición de la biomasa. Por lo tanto, cambios en el medio de cultivo

que conlleven a la modificación en la composición de la biomasa para mejorar el rendimiento de

PDO serían innecesarios. Sin embargo, dichas modificaciones en las condiciones de cultivo

podrían reducir el rendimiento de PDO, como Dabrock et al. [202] encontraron al usar hierro en

exceso. Ahora bien, los resultados en estado estacionario no son concluyentes dado que no permite

predecir la dinámica del PDO en el tiempo.

Por tal motivo fueron realizados análisis de sensibilidad global MPSA y PRCC en dinámico,

Figura 3.18 y Figura 3.19, donde además de la composición celular fueron considerados

parámetros cinéticos muerte celular, formación de ácido acético y consumo de glicerol. Los

diferentes resultados obtenidos fueron coherentes entre ellos, mostrando que los parámetros de

mayor significancia sobre la producción de PDO y tiempo de cultivo fueron los asociados al

consumo de glicerol. Lo anterior ha sido observado también el emplear la glucosa como fuente de

carbono [30, 169]. El efecto de dichos parámetros en la formación de PDO fue positiva en el caso

de VmaxGly

y KiGly

y negativa en relación a KsGly

, lo cual está de acuerdo con lo reportado con otros

modelos dinámicos de escala genómica [46, 232]. Por otro lado, ningún precursor o

macromolécula tuvo un efecto significativo tanto en la formación de PDO como en el tiempo de

formación de éste, lo cual es coherente con los resultados de análisis de sensibilidad en estado

estacionario y lo reportado por Hjersted & Henson [165], quienes evaluaron dos composiciones de

biomasa diferentes. Finalmente, los parámetros cinéticos Raa

y V0aa

correspondientes a la formación

de ácido acético presentaron incidencia en la conversión de glicerol a PDO, lo cual demuestra la

correspondencia que hay en la formación de dichos metabolitos como lo describió previamente

Zeng [21] y se muestra en la Figura 4.1.

Los anterior resulta ser positivo, en el sentido que da robustez al modelo, dado que los parámetros

de mayor incidencia corresponden a los parámetros ajustados a partir de datos experimentales del

cultivo de la cepa Clostridium sp IBUN 158B. Los restantes parámetros fueron obtenidos a partir

de datos reportados para otras cepas de Clostridium [88, 108, 134], los cuales fueron analizados

por separado y posteriormente en conjunto en el desarrollo de un modelo poblacional. La Figura

3.21, muestra en efecto que los precursores son los que tienen menor incidencia en la formación de

PDO a lo largo de la fermentación, mientras que la dispersión en la composición de las

macromoléculas causó la mayor variación en la formación de PDO durante la fase de crecimiento.

Así mismo, la Figura 3.21 muestra que la dispersión en la predicción de PDO es máxima al llegar a

la fase exponencial desacelerada para luego estabilizar en la fase estacionaria. Por otro lado,

también es corroborado que la cinética de formación de ácido acético es la única que incidió en la

conversión final del glicerol a PDO, validando lo obtenido en el análisis de sensibilidad global.

En relación al modelo poblacional desarrollado, que desde el punto de vista cinético corresponde a

un modelo segregado en el cual la población está distribuida de acuerdo a la composición celular,

la edad y la capacidad de producción de ácido acético. Lencastre Fernandes et al. [120] resaltan la

posibilidad de desarrollar modelos estructurados de forma numérica mediante aleatorización de los

parámetros cinéticos. Esto con el objetivo de reducir la complejidad matemática propia de los

modelos segregados. No obstante, uno de los retos es seleccionar el número de células a ser

modeladas de tal forma que el resultado sea independiente de dicho número de células [233]. Danø

et al. [234] reportaron que 1000 células evaluadas resultó ser suficiente para tal fin. Lo anterior

está de acuerdo con los resultados obtenidos, pues a partir de las 900 células modeladas, el

promedio poblacional de PDO producido varió menos de un 0.3% con respecto al promedio del

máximo número de células consideradas, es decir cerca de 3300.

Capítulo 4:

Discusión 87

Así mismo, se evaluaron diferentes porcentajes de dispersión de la composición de la biomasa

mientras que la dispersión de los demás parámetros fueron mantenidas constantes, Figura 3.22. Se

observa una disminución en la dispersión máxima de la formación de PDO de 14.6 a 10.7% al

disminuir la dispersión de la composición del 30 al 10%. Así mimo, en dicho intervalo, la

desviación estándar relativa del peso molecular de la biomasa disminuyó de un 3.1 a 1.0%. Ahora

bien, dado que existe incertidumbre en la dispersión experimental de la composición celular de

Clostridium sp IBUN 158B, se decidió mantener una dispersión en la composición de precursores

y macromoléculas del 30% en el desarrollo del modelo segregado. Lo anterior fue debido a que a

dicha dispersión, la desviación estándar relativa obtenida, es decir 3.1%, es cercana al valor

obtenido para cultivos de la bacteria E. coli, el cual varió desde 2.75% [215] hasta 2.51% [235].

Con respecto a la desviación de los parámetros cinéticos incluidos en el modelo segregado, es decir

muerte celular y formación de ácido acético, también fueron mantenidos en 30%, apoyado

principalmente en lo reportado por Mönier et al. [236], quienes en el desarrollo de su modelo

poblacional encontraron varios parámetros con una desviación entre 28.4 y 33.3%.

A continuación, en la Figura 3.23 se compara los valores de PDO obtenidos experimentalmente

durante la validación y los perfiles predichos por el modelo estructurado-segregado obtenido. Se

observa el adecuado ajuste del modelo obtenido, dado que 24 de las 30 mediciones experimentales

obtenidas en las 4 fermentaciones realizadas estuvieron dentro de sus respectivos rangos esperados

según DFBA. Lo anterior también se evidencia en la Figura 4.2, donde se compara valores

predichos y experimentales, donde el coeficiente de correlación ajustado fue del 97.6% y el error

de ajuste del 4.4%. Lo que permite sugerir que el modelo obtenido a partir de la red metabólica fue

adecuado para predecir la conversión de glicerol a PDO empleando la cepa nativa colombiana

Clostridium sp IBUN 158B. No obstante, en la Figura 4.2 también se evidencia la subestimación al

predecir el PDO producido al finalizar el crecimiento a condiciones de glicerol en limitación, lo

cual se discutió previamente. Finalmente, se observa en la Figura 3.23 que las curvas promedio

obtenidas por el modelo segregado (en verde) y las curvas obtenidas por el modelo no segregado

(en azul) tuvieron una distancia relativa promedio del 0.17%, lo cual era esperado dado que fue

empleada una distribución normal durante el proceso de aleatorización, además ayuda a concluir

que el número de células modeladas fue adecuado, como se sugirió previamente.

PDO experimental (mM)

0 100 200 300 400

PD

O p

red

icho

(m

M)

0

100

200

300

400

Fermentación 1 Exceso

Fermentación 2 Exceso

Fermentación 1 Limitación

Fermentación 2 Limitación

Figura 4.2. Comparación valores PDO experimentales y predichos por modelo estructurado-

segregado.

Barras de error corresponden a desviación estándar predicha por modelo segregado.


Clostridium sp

4.4.2 Predicción de mutantes por knockout

Posterior a ser evaluada la composición de la biomasa y los parámetros cinéticos, fue considerada

las perturbaciones en el modelo GSM reconstruido mediante mutantes por knockout simples y

dobles de enzimas tanto en estado estacionario como en estado dinámico. Los resultados predichos

fueron coherentes tanto en estacionario como en dinámico, dado que ninguna mutante evaluada

estuvo en la capacidad de incrementar tanto el rendimiento YPDO/S como la productividad QPDO de

la cepa nativa. Lo anterior puede ser entendido si se parte en primer lugar que el PDO es un

metabolito primario [11, 237], es decir que su producción está directamente relacionada con el

crecimiento, por lo tanto durante las simulaciones tanto del FBA como del DFBA el rendimiento

de PDO predicho será lo más alto posible. Lo anterior se evidencia en la Figura 3.24, donde el

perfil de PDO predicho por el DFBA, en rojo, es prácticamente igual al perfil de PDO predicho por

D-FVA, en azul, dado que la máxima distancia relativa fue del 0.6%. Siendo el perfil de D-FVA la

máxima formación de PDO posible sin afectar el crecimiento predicho por DFBA.

Ahora bien, según Montoya Solano [17], una de las mejores estrategias que permitiría incrementar

el rendimiento YPDO/S es la deleción de aquellas rutas que también consuman NADH, dado que es

precursor necesario para obtener PDO. Sin embargo, a pesar de buscar bloquear rutas

competidoras, el bloqueo de los productos seleccionados por Montoya Solano [17] (hidrógeno,

ácido láctico y ácido butírico), presentaba igualmente efectos negativos en la formación de PDO

y/o biomasa, como ya fue mencionado previamente. En el caso de la formación de hidrógeno, se

asoció con la necesidad de reducir el NAD a NADH para favorecer la actividad de la enzima PDO

deshidrogenasa a exceso de glicerol. Mientras que el bloqueo de la formación ácido butírico

obligaría a la célula a producir etanol con el fin de evitar la acumulación de acetoacetil-CoA.

Finalmente la deleción del ácido láctico ocasionaría que la célula reduzca su crecimiento para

evitar la acumulación de protones. Por estos motivos, las mutantes obtenidas por Montoya Solano

[17] resultaron reducir ya sea el rendimiento de PDO o el rendimiento de biomasa, lo cual también

fue predicho por la aproximación ROOM, Tabla 3.6.

Así mismo, la Figura 3.24 muestra predicciones dinámicas de mutantes simples mientras que la

Figura 3.25 presenta los rendimientos y productividades máximos de mutantes dobles, donde se

evidencia que ninguna mutante evaluada mejoró la producción de PDO de la cepa nativa. Incluso,

algunas mutantes ocasionaron reducciones en la productividad, es decir aumento en el tiempo de

cultivo, lo cual es debido a la disminución del rendimiento de biomasa YX/S. Esto demuestra la

importancia de no afectar el crecimiento, reforzado el criterio empleado para selección de mutantes

a evaluar, pues sólo fueron consideradas la deleción de enzimas direccionalmente asociadas al

crecimiento. Esto debido a que si era bloqueada la producción de enzimas total o parcialmente

acopladas al crecimiento podría reducir considerablemente la formación de biomasa, como el caso

de la hidrogenasa, o incluso evitar el crecimiento. La anterior estrategia es aplicada de manera

similar por la aproximación OptKnock, la cual mediante optimización binivel busca mutantes por

knockout sobreproductoras que minimicen la reducción de YX/S [41, 238]. Sin embargo, OptKock

requiere de optimización LP, por lo tanto no fue empleado en el presente estudio, pues como fue

mencionado previamente, la predicciones más alejadas de datos experimentales fueron obtenidas

por optimización LP. Ahora bien, la evaluación in silico de las diferentes mutantes se hizo bajo el

supuesto que la capacidad de consumo del glicerol no se ve afectada durante el proceso de

mutación, lo cual no es completamente válido. Lo anterior es debido a que el proceso de deleción

requiere modificar la pared celular mediante electroporación [17, 206, 239], haciendo posible que

factores como la afinidad al sustrato se vea afectada, la cual ya se demostró afectar

significativamente la producción de PDO. No obstante, es inviable tener constantes de afinidad

Capítulo 4:

Discusión 89

para cada mutante potencial y por consiguiente no es posible contar con predicciones más precisas

para dichas mutantes.

Ahora bien, si fuera considerada exclusivamente la maximización de la producción de PDO, el

FBA predice un rendimiento teórico de 0.758 mol/mol, Figura 4.3, aunque este rendimiento sólo es

logrado si no hay crecimiento y el restante 24.2% del glicerol es empleado para regenerar el NAD

a NADH. Lo anterior no tiene sentido biológico pues, como fue mencionado, el PDO es un

metabolito primario, pero este valor puede ser considerado como límite matemático de la máxima

conversión de glicerol a PDO. Por otro lado, si es considerada la Tabla 1.3, el máximo rendimiento

de PDO posible es 0.725 mol/mol, línea amarilla Figura 4.3, el cual es logrado si no hay formación

de ácido butírico e hidrógeno, no obstante este valor es posible si el rendimiento de biomasa es el

más bajo posible [21]. Ahora, si son considerados escenarios biológicamente factibles, como es

crecimiento en exceso de glicerol, línea verde Figura 4.3, el rendimiento máximo de PDO tenderá

a 0.71mol/mol si el flux de consumo de glicerol tiende a infinito. Sin embargo, como se observa en

la Figura 3.3, el máximo flux de consumo de glicerol para la cepa Clostridium sp IBUN 158B es

cerca de 40mmol/g·h, por lo tanto el máximo rendimiento de PDO de esta cepa nativa será

aproximadamente 0.685 mol/mol, punto azul celeste Figura 4.3. Es decir que el mayor incremento

posible es inferior al 5.5% en relación al máximo biológicamente posible, porcentaje que quizá

resulte insuficiente para motivar el desarrollo de una mutante por knockout, más aún cuando el

rendimiento de biomasa podría verse considerablemente afectado.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

10

20

30

40

5060

7080

0.00.2

0.40.6

0.8

1.0

YP

DO

/S (m

ol/m

ol)

v glicerol (mm

ol/g h)

% YX/S

Figura 4.3. Superficie de respuesta máximo valor predicho por FBA de YPDO/S en función de flux

de consumo glicerol y rendimiento YX/S.

Nomenclatura: Líneas azul y verde corresponden a valores de rendimientos YPDO/S predichos por

funciones objetivo óptima y sub-óptima, respectivamente (Figura 3.4). Punto azul celeste: máximo

valor YPDO/S posible por cepa nativa Clostridium sp IBUN 158B. Línea amarilla: máximo valor

YPDO/S posible predicho por Zeng [21]


Clostridium sp

Dado que la estrategia de mutación por knockout no resulta ser la mejor opción para mejorar la

producción o productividad del PDO, se hace interesante evaluar otras estrategias de mutación. La

primera de ellas es el desarrollo de mutantes por sobreexpresión que consuman más rápido el

glicerol y así reducir el tiempo de cultivo, similar a lo obtenido por Montoya Solano [17]. También

la obtención de mutantes con mayor tolerancia al PDO producido, el cual es el producto con mayor

efecto inhibitorio durante el crecimiento de Clostridium butyricum en glicerol [240, 241]. Entre las

estrategias para mejorar la tolerancia, podría estar la aplicación de la ingeniería de proteínas, la

cual permitiría cambiar la conformación de enzimas claves en la tolerancia al PDO, o incluso las

mismas enzimas involucradas en la ruta reductiva del consumo de glicerol [242, 243].Finalmente,

además de la ingeniería de proteínas, como estrategia novedosa está la biología sintética, la cual

permitiría crear enzimas que catalicen reacciones no existentes en la naturaleza, como es la

producción de PDO a partir de homoserina [244].

4.4.3 Modificaciones en el medio y modo de cultivo

En primer lugar fue considerada la estrategia de alimentación de dos sustratos en estado

estacionario. Por un lado, la glucosa es usada como fuente de carbón, mientras que el glicerol es

empleado para mantener el balance redox, lo cual permitiría obtener valores más altos de YPDO/S

[204]. Los resultados son mostrados en la Figura 3.7, en donde en primer lugar es validado los

valores predichos con los resultados experimentales. En segundo lugar, es observada la línea de

optimalidad, la cual corresponde a la máxima conversión empleando el menor flux de consumo de

glucosa posible. Dicha línea es predicha para una relación de fluxes de 0.375 siempre que el

glicerol se encuentre en limitación. Al asumir glicerol en exceso la línea de optimalidad es

predicha con una relación de fluxes aproximada de 0.3, esta reducción en la línea de optimalidad es

debido a que a condiciones de exceso de glicerol la célula es más eficiente convirtiendo el glicerol

en PDO y por lo tanto requiere de menos glucosa para lograr la máxima conversión. No obstante,

lograr estas relaciones de fluxes requiere información experimental, dado que no es posible

establecer a priori qué relación molar de sustratos permitiría la relación de fluxes deseada. Por otro

lado, esta aproximación sólo es válida en estado estacionario, pues en un cultivo por lote existe la

posibilidad que la célula decida crecer de forma diaúxica, es decir consumir un sustrato y luego el

otro, como ha sido observado en cultivos de otras cepas solventogénicas de Clostridium [245-247].

Posteriormente, fue considerado el efecto de la concentración inicial de biomasa y glicerol en un

cultivo por lote. En primer lugar, la Figura 3.26 muestra la reducción en la conversión de glicerol a

PDO a concentraciones de glicerol inferiores a 100mM, lo cual está de acuerdo con lo mencionado

previamente a cerca del error en el ajuste de la constante de afinidad al sustrato. En relación a las

productividades, a partir de la Figura 3.26, el valor óptimo de glicerol inicial estimado es 46g/L, el

cual es acorde a rangos encontrados previamente para esta cepa [15, 16]. Por otro lado, a pesar del

comportamiento monotónico de la productividad en función de la concentración del inóculo, se ha

encontrado que para cultivos de Clostridium sp. IBUN 158B la concentración del inóculo no debe

exceder los 0.12g/L, con el fin de asegurar un inóculo en fase exponencial [15, 16]. Es por lo

anterior que la productividad óptima predicha es 1g/L·h, mientras que su respectiva concentración

final de PDO es 23.5g/L, valores que están en los intervalos correspondientes de cultivos por lotes

de cepas de Clostridium productoras de PDO como se observa en la Figura 4.4.

Seguidamente fue evaluada la estrategia de cultivo por lote alimentado. En primer lugar fue

considerada una alimentación contante, los resultados son mostrados en la Figura 3.27. Se obtuvo

una máxima concentración de PDO de 46.9g/L, similar a lo reportado previamente para

Clostridium sp 158B, 46g/L [15]. Sin embargo, la productividad predicha es inferior debido a la

Capítulo 4:

Discusión 91

diferencia en la concentración del inóculo. Por otro lado, dicho valor es inferior a otras cepas de

Clostridium con valores reportados de producción y productividad de 70.8g/L y 0.71g/L·h [95] o

61.2g/L y 1.02g/L·h [97], respectivamente.

Dado lo anterior, y a partir de resultados obtenidos por Reimann et al, quienes al cambiar la

estrategia de alimentación de flujo constante a flujo de alimentación enlazado con control de pH,

lograron aumentar la concentración final de PDO de 47.5 a 70.3g/L [103], fue considerada esta

segunda estrategia de alimentación. Según los resultados mostrados en la Figura 3.28, es predicho

menores conversiones de glicerol a PDO en comparación con la estrategia de alimentación

constante. Lo anterior es debido al acercamiento a la concentración inhibitoria de PDO, lo que

impide predecir conversiones más altas. Por tal motivo fue seleccionada una conversión molar

mínima de 0.55, evitando al máximo que quede glicerol sin consumir. La máxima concentración de

PDO predicha fue 66.1g/L cuya productividad es 1.05g/L·h. Los anteriores valores están en el

rango esperado de acuerdo a reportes de producción de PDO por lote alimentado empleando

diferentes cepas de Clostridium, Tabla 1.5, lo cual se evidencia en la Figura 4.4.

PDO (g/L)

0 20 40 60 80 100

Lote

Lote Alimentado

QPDO

(g/Lh)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

A B

Figura 4.4. Comparación de valores predichos mediante DFBA y diferentes cepas de Clostridium.

Predicciones realizadas por aproximación DA de (A) Producción PDO y (B) Productividad QPDO a

condiciones iniciales de glicerol y biomasa de: Tabla 2.4 (puntos rojos) y óptimas de productividad

(puntos verdes) con valores reportados para diferentes cepas de Clostridium (Diagrama de Caja y

bigotes) Fuente: revisión bibliográfica propia

Dado todos los resultados obtenidos, es posible evidenciar que las predicciones no sólo ajustaron

manera adecuada la formación de PDO de la cepa nativa Clostridium sp IBUN 158B, sino que

permitieron validar que los resultados predichos están dentro del rango esperado tras comparar con

diferentes cepas productoras de PDO. Lo anterior permite proponer que el modelo obtenido es por

lo tanto una herramienta válida que permitiría predecir una gran variedad de escenarios que de ser

evaluados experimentalmente serían altamente demandantes de tiempo y recursos. Lo que resulta

ser un aporte valioso al grupo de investigación de Microorganismos Solventogénicos, el cual está

en la actualidad vinculado estratégicamente con la industria para lograr una producción de PDO a

mayor escala. Por consiguiente, los nuevos retos estarían enfocados por un lado en permitir enlazar

el comportamiento celular con todo el proceso de producción donde se incluya etapas de

separación y purificación como ha sido propuesto en otros modelos biológicos [248] y así estimar

la factibilidad técnico-económica de un posible proceso industrial. Finalmente, por otro lado, el

nuevo modelo estaría en la capacidad de ser empleado para diseñar sistemas de control

automatizados eficientes ante procesos oscilatorios no deseados [231, 249, 250].


Clostridium sp

5. Capítulo 5: Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo se puede concluir que:

• Se obtuvo el primer modelo metabólico de escala genómica de una cepa de Clostridium

productora de PDO, el cual también está en la capacidad de consumir una gran variedad de

sustratos.

• Las predicciones con FBA permitieron encontrar dos estados metabólicos diferentes de

acuerdo al contenido de glicerol en el medio, los cuales son predichos mediante funciones

objetivos independientes.

• La aproximación dinámica del FBA permitió obtener un modelo cinético estructurado con una

adecuada capacidad predictiva de datos experimentales, el cual representa ser de utilidad para

el grupo dado que permitiría reducir la cantidad de experimentación.

• El análisis de sensibilidad permitió establecer que la predicción de producción de PDO no es

tan sensible a los parámetros obtenidos de literatura como sí sucede con los parámetros

cinéticos ajustados de la cepa evaluada experimentalmente.

• Las perturbaciones de la red metabólica permitió sugerir que las mutantes por knockout no son

una alternativa viable para mejorar la producción de PDO. Haciendo necesario considerar otro

tipo de mutantes, como el caso de cepas más tolerantes al PDO producido.

• Las perturbaciones en el medio de cultivo ayudaron a sugerir las mejores condiciones de

fermentación por lote alimentado que aumentaría la formación de PDO y también su

productividad.

• La predicción de formación de PDO por células de diferentes características, permitió obtener

in silico no sólo un modelo cinético estructurado, sino también segregado, haciéndolo un

aporte significativo junto con la reconstrucción del modelo metabólico.

• El modelo desarrollado es un aporte significativo al avance del grupo de investigación en

busca de entender esta fermentación, en especial considerando la alianza con la industria

Ecodiesel con el fin de montar una planta producción de PDO, dado que permitiría proponer

un proceso industrial de producción en el cual se considere el comportamiento metabólico.


Clostridium sp

5.2 Recomendaciones

Para la realización de estudios posteriores que complementen esta tesis de doctorado se

recomienda tener en cuenta los siguientes aspectos:

• Emplear herramientas bioinformáticas complementarias tales como ConsPred o información

experimental adicional que permita validar la presencia o ausencia de reacciones en el modelo,

tales como las relacionadas con la síntesis de las vitaminas B1 y B6, el ciclo del ácido cítrico y

otras rutas bloqueadas, lo cual aunque no mejore la predicciones del ambiente extracelular, sí

podría mejorar la capacidad predictiva en la expresión de enzimas, es decir el ambiente

intracelular.

• Utilizar datos transcriptómicos como restricciones booleanas en el desarrollo de un Análisis de

Balance de Flujo Regulatorio (rFBA por sus siglas en inglés: Regulatory Flux Balance

analysis) que ayude a predecir con mayor exactitud estados fenotípicos del cultivo de

Clostridium sp IBUN 158B en glicerol.

• Mejorar la composición de la biomasa incluyendo compuestos tales como terpenoides o

proteínas como la ACP, lo cual también permitiría mejorar la capacidad predictiva de la

expresión de algunas enzimas.

• Integrar el modelo obtenido del cultivo a procesos de separación para simular de manera

completa el proceso industrial de producción de PDO que permita estimar factibilidades

técnico-económicas. Lo anterior podría ser logrado empleando predicciones del modelo

estructurado para la realización de un modelo no estructurado, el cual podría ser implementado

posteriormente en programas de simulación y optimización tales como SuperPro Designer® o

Aspen Plus®.

• Evaluar nuevas estrategias que permitan mejorar la producción de PDO, tales como ingeniería

de proteínas o biología sintética.

A. Anexo: Concentraciones de

metabolitos extracelulares de

fermentaciones realizadas

Tabla A.1. Fermentación 1 a exceso de glicerol

t (h) X

(g/L)

Glicerol

(mM)

PDO

(mM)

A. acético

(mM)

A. butírico

(mM)

A. láctico

(mM)

butanol

(mM)

0 0.012 406.3 5.9 3.0 1.9 0 0

4 0.016 395.8 6.4 3.3 2.2 0 0

16.5 0.217 354.7 32.2 7.3 5.1 0 0

20 0.260 292.8 43.9 9.2 6.8 0 0

24 0.355 261.4 68.9 12.8 13.1 1.4 0

28 0.902 199.1 141.4 23.0 24.0 1.9 0

39.5 0.991 18.8 255.9 66.8 41.0 1.9 0

Tabla A.2. Fermentación 2 a exceso de glicerol

t (h) X

(g/L)

Glicerol

(mM)

PDO

(mM)

A. acético

(mM)

A. butírico

(mM)

A. láctico

(mM)

butanol

(mM)

0 0.110 524.8 6.6 14.6 1.8 0 0

3 0.071 529.7 9.3 15.5 2.2 0 0

7 0.075 514.2 12.4 16.1 2.3 0 0

17.5 0.800 349.2 129.6 35.8 19.9 0 0

19.5 1.221 241.1 195.3 43.3 33.1 0 0

24 1.723 55.2 329.9 70.8 56.2 0 0

27 1.501 12.6 343.9 66.6 61.5 0 0


Clostridium sp

Tabla A.3. Fermentación 1 a limitación de glicerol

t (h) X

(g/L)

Glicerol

(mM)

PDO

(mM)

A. acético

(mM)

A. butírico

(mM)

A. láctico

(mM)

butanol

(mM)

0 0.042 136.2 7.6 2.8 2.2 0 0

3.25 0.057 131.3 14.6 3.2 3.8 0 0

5.5 0.083 121.5 17.5 3.3 3.6 0 0

7.5 0.119 123.4 14.6 3.3 4.2 0 0

9.5 0.142 118.3 17.9 3.5 6.3 0 0

11.5 0.171 113.5 21.1 4.2 5.0 0 0

13.6 0.220 98.2 23.0 4.2 4.9 0 0

20.1 0.366 62.6 53.7 10.2 9.0 0 0

25.5 0.470 9.8 87.2 15.8 13.4 0 0

29.25 0.429 3.3 106.4 16.7 18.3 0 0

Tabla A.4. Fermentación 2 a limitación de glicerol

t (h) X

(g/L)

Glicerol

(mM)

PDO

(mM)

A. acético

(mM)

A. butírico

(mM)

A. láctico

(mM)

butanol

(mM)

0 0.101 150.3 8.0 6.4 0.0 0 0

5.55 0.209 133.9 21.6 8.6 4.3 0 0

9 0.274 100.0 36.6 10.5 6.0 0 0

13.05 0.446 68.3 69.3 19.3 9.0 0 0

17 0.437 38.5 92.3 25.6 10.9 0 0

20.8 0.530 6.5 113.9 28.4 14.8 0 0

B. Anexo: Frecuencias acumuladas de

análisis de sensibilidad global MPSA

Figura B.1 Frecuencia acumulada de MPSA con respecto a precursores.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 3.0% 6.0% 9.0% 12.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C18:1

Inaceptable Aceptable

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C18:0


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C14:0


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 20.0% 40.0% 60.0% 80.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C16:0



Clostridium sp

Figura B.1. Continuación

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C16:1


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C17cyc


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor C17cyc


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Glutamato


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Glicina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 3.0% 6.0% 9.0% 12.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Alanina


Anexo B. Frecuencias acumuladas de análisis sensibilidad global MPSA

99


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Lisina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 3.0% 6.0% 9.0% 12.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Aspartato


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.0% 4.0% 6.0% 8.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Arginina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 1.5% 3.0% 4.5% 6.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Glutamina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Serina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 1.5% 3.0% 4.5% 6.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Metionina



Clostridium sp


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 0.5% 1.0% 1.5% 2.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Triptófano


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.5% 5.0% 7.5% 10.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Fenilalanina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.0% 4.0% 6.0% 8.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Tirosina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 0.6% 1.2% 1.8% 2.4%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Cisteína


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Leucina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 0.8% 1.6% 2.4% 3.2%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Histidina



101


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 1.5% 3.0% 4.5% 6.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Prolina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Asparagina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Valina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 3.0% 6.0% 9.0% 12.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Treonina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor Isoleucina


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor dATP



Clostridium sp


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor dGTP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor dCTP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor dTTP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 17.5% 35.0% 52.5% 70.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor ATP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor GTP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor CTP



103


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 15.0% 30.0% 45.0% 60.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor UTP


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 15.0% 30.0% 45.0% 60.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor PtdGly


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 15.0% 30.0% 45.0% 60.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor PtdEtn


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 22.5% 45.0% 67.5% 90.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor PtdMen


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 8.0% 16.0% 24.0% 32.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor NAD


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 8.0% 16.0% 24.0% 32.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor NADP



Clostridium sp


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 8.0% 16.0% 24.0% 32.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor CoA


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 8.0% 16.0% 24.0% 32.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor FAD


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor FMN


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 12.5% 25.0% 37.5% 50.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Precursor THF



105

Figura B.2 Frecuencia acumulada de MPSA con respecto a macromoléculas.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 20.0% 40.0% 60.0% 80.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Proteína


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 2.0% 4.0% 6.0% 8.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula DNA


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula ARN


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 7.0% 14.0% 21.0% 28.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Peptidoglicano


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Lípido


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 7.0% 14.0% 21.0% 28.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Ácido Teicoico



Clostridium sp


Figura B.3 Frecuencia acumulada de MPSA con respecto a parámetros cinéticos de muerte celular.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 3.0% 6.0% 9.0% 12.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Carbohidrato


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0.0% 4.0% 8.0% 12.0% 16.0%

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Macromolécula Trazas


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.02 0.04 0.06 0.08

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico: Kd_lim


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.006 0.012 0.018 0.024

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico: Kd_exc



107

Figura B.4 Frecuencia acumulada de MPSA con respecto a parámetros cinéticos de máxima

formación de ácido acético.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.1 0.2 0.3 0.4

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico V0_aa


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 6 12 18 24

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico V∞_aa


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 0.05 0.1 0.15 0.2

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico R_aa



Clostridium sp

Figura B.5. Frecuencia acumulada de MPSA con respecto a parámetros cinéticos consumo de

glicerol.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

40 110 180 250 320

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico Vmax_gly


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

40 240 440 640 840

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico: Ks_gly


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

400 600 800 1000 1200

Fre

cue

nci

a ac

um

ula

da

Parámetro cinetico: Ki_gly


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