ANALISIS LABORATORIO DE ENZIMAS

Resumen

En el presente texto se analizarán las características que condicionan las funciones de la amilasa a diferentes condiciones .La amilasa salival es la enzima bucal más destacada e importante dentro de los componentes de la saliva, su función principal es la de metabolizar el almidón de los residuos de los alimentos que permanecen en la boca después de las comidas .Al considerar la actividad catalítica de una enzima, se realizaron pruebas que permitieron analizar las características de la amilasa y desarrollar las observaciones, éstas fueron, labilidad térmica, influencia del pH, especificidad de la enzimas e influencia de activadores e inhibidores.

ANALISIS

Las enzimas son catalizadoras en todas las reacciones del metabolismo, estos son específicos para determinar la reacción. Estas provocan una transformación.

Las enzimas pueden aumentar o disminuir la actividad enzimática según las condiciones como por ejemplo el pH puede alterar la forma de la enzima dificultando la unión del sustrato con el que actúa, existe un pH óptimo para la actividad enzimática.

En el caso de la temperatura, la velocidad de la reacción es directamente proporcional a temperatura y cuando esta es muy baja no hay reacción es apreciable. Pero un aumento excesivo en esta provoca la alteración de la estructura de la enzima, es decir deja de funcionar o empieza su desnaturalización.

En el proceso de digestión, las moléculas ingeridas deben ser degradadas en componentes más sencillos con el fin de ser asimilada, la digestión comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan en la boca, es decir la amilasa salivar comienza a degradar los almidones rompiendo sus enlaces liberando maltosa, glucosa y dextinas de almidón.

La amilasa es una enzima que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón que es u polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por amilasa y amilo pectina, ambos son polisacáridos de la glucosa. La amilasa está formada por cadenas lineales de glucosa unidas por alfa 1-4 mientras que la amilo pectina tienen posee alfa1-4 y alfa 1-6 formando cadenas ramificadas, es decir que dejan destinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.

Para determinar cómo actúa la amilasa se partió de una muestra de saliva, recogida en un vaso de precipitado, esta se disolvió en 10 ml de solución, que posteriormente fue sometida a diferentes pruebas como lo son la de labilidad termina de las enzimas, influencia de pH en la actividad de las enzimas, especificidad de la enzima e influencia de los activadores e inhibidores

Con respecto a la labilidad térmica, se pretende determinar cuál es la influencia que tiene ante la actividad de las enzimas. Cada enzima posee una temperatura óptima para la acción de las enzimas (37 41 ºc ), debido a que el incremento o disminución de la temperatura permite la aceleración de la reacción. La solución de saliva fue sometida a diferentes temperaturas 0ºc, 37ºc y temperatura ambiente con el fin de observan cómo se comporta la solución a estas temperaturas y al aplicar el reactivo de lugol .

La coloración producida por el reactivo de lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras del almidón. Es decir que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de la molécula obteniendo una solución coloreada (azul violeta).

Los resultados que se obtuvieron al realizar esta prueba fueron :

Cuando la solución de almidón con amilasa se sometió a una temperatura de 0ºc, a la cual se le adiciono reactivo de lugol se obtuvo una coloración amarilla con precipitado purpura , al realizar la solución de amilasa salivar se tuvo un error debido a que no había la cantidad de amilasa suficiente en esta solución para que las soluciones tomen una coloración completa . Cuando la amilasa reacciona con almidón se debía obtiene un rompimiento de enlaces en la estructura llevando hasta glucosa. Sin embargo al poseer una mínima cantidad de amilasa en la solución el desdoblamiento del almidón a estructuras más sencillas es mínimo por ende se obtuvo solamente en precipitado de color purpura evidenciando la actividad de la enzima, además, al encontrarse a una temperatura mínima el sistema enzimática puede disminuir su actividad.

Cuando la misma solución se sometió a una temperatura de 37ºc con reactivo de lugol se obtiene una solución de color amarillo con precipitado purpura, debido a que la enzima amilasa reacciona con el almidón obteniendo rompimiento de enlaces en proporciones casi despreciables, sin embargo al obtener un precipitado de color purpura se evidencia el paso de una macro estructura a estructuras más simples como lo son la glucosa.

La misma solución de los experimentos anteriores fue sometida a una temperatura ambiente y posteriormente sometida al termostato 37ºc se obtiene que al incrementar la energía cinética de las estructuras tanto del almidón como de la enzima se puede obtener que haya más fácil un rompimiento de enlaces, sin embargo debido a la cantidad de amilasa en la solución la solución no se tornó totalmente purpura pero al existir un precipitado morado se puede decir que hay una cantidad despreciable de hemiacetales que reaccionan con el reactivo de lugol.

Con respecto a la coloración de las soluciones a las diferentes temperaturas la coloración amarilla se debe a la presencia de amilo pectina esta se colorea entre amarillo y naranja, y la amilasa pude tomar un oscura (negro).

Con respecto, a la influencia del pH sobre la actividad de las enzimas podemos decir que la alfa-amilasa es una enzima que no funciona a pH extremos (ácidos o básicos) o que disminuye notablemente su actividad. Se obtuvo como resultado que al someter la solución de amilasa a temperaturas de 37 ºc durante 10 minutos, con diferentes pH (5.0, 6.8, 8.0). Cuando se sometió la solución de amilasa con almidón a un PH 5.0 se obtuvo una coloración amarillo con precipitado purpura oscuro indicando la ruptura mínima de enlaces del almidón debido a la actividad enzimática de la amilasa, obteniendo el desdoblamiento del almidón llevándolo hasta glucosa, sin embargo, al preparar la solución de amilasa salivar, esta no tenía un alto porcentaje de esta enzima por ende los enlaces de la amilo pectina (1-6) y amilasa (1-4) no se rompen totalmente. Pero al obtener un precipitado de coloración purpura podemos decir que es positiva produciendo una velocidad moderada debido a su pH.

Cuando la misma solución de almidón con amilasa a un pH de 6.8 en presencia de reactivo de lugol se obtuvo que hay rompimiento de enlaces alfa 1-4 y alfa 1-6, no en su totalidad esto se debe a que la cantidad de amilasa en la solución adicionada al tubo de ensayo no es suficiente para que la enzima degrade todos los enlaces existentes en el almidón y por ende hay una porción de glucosa mínima. Esto se evidencia en la coloración tomada la cual fue amarillo con precipitado purpura claro.

En un pH de 8.0, la solución de amilasa con almidón en presencia del reactivo de lugol se obtiene una coloración traslucida con precipitado morado en una cantidad casi despreciable, esto evidencia que hay rompimiento de enlaces existentes en el almidón. A este pH podemos decir que la enzima empieza a desnaturalizarse o pierde su actividad enzimática si se somete a un pH elevado, debido a que no estaría en su PH óptimo.

El pH es muy importante debido a que estimula o reduce la actividad enzimática, el sustrato en nuestro caso el almidón reacciona con la amilasa, con el fin de romper los enlaces amilo pectina y amilasa cuando se rompen dichos enlaces se obtiene una solución coloreada.

Posteriormente, se analizó la especificidad de las enzimas debido a que se puede formarse un complejo enzima sustrato ligando el sustrato con el centro catalítico de la enzima. Es decir, que la enzima cataliza una de las posibles reacciones del substrato.

Se sometió una solución de almidón con amilasa, incubada 10 minutos con 37 pc, obteniendo que la enzima se degrade al almidón en azucares pequeños (glucosa) la coloración obtenida fue naranja intenso, es decir que el complejo formado de coloración anaranjado determino que la prueba aplicada es positiva.

Una solución de invertida y almidón fue sometida a incubación, se aplicó la coloración con yodo y posteriormente se realizó la prueba de felina con el fin de obtener un complejo sustrato enzima de coloración amarillo oscuro, esta reacción es positiva debido a que se hidrolizan, la enzima rompe enlaces y al degradarse el almidón en moléculas simples de glucosa se obtiene la coloración amarilla, es decir, existen azucares reductores.

Cuando la sacarosa ( alfa-D-Glucopiranosil - (1→2) - beta-D-Fructofuranósido) junto con la amilasa son sometidas a una incubación y se aplican las pruebas de yodo y fehling , se obtiene una coloración blanca opaca, debido a su coloración podemos decir que no la amilasa no es específica para el sustrato de sacarosa debido a que este disacárido no tiene poder reductor en la reacción de fehling por lo tanto no forma un complejo sustrato enzima por ende la reacción será negativa para el reactivo de fehling.

La reacción de sacarosa e invertrasa (sacarasa) sometida a incubación presentan una coloración amarillo claro, la invertasa es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y galactosa obteniendo que al aplicar la reacción de fehling esta reacción sea positiva debido a la hidrolisis de la sacarosa. Sin embargo, al aplicar a la sacarosa la reacción de fehling es negativa, debido a que no presenta grupos libres hemiacetales.

Después se realizó la prueba de la influencia de activadores e inhibidores. Existen series de sustancias que inhiben la acción enzimática sin transformarse. La inhibición enzimática puede ser reversible e irreversible, un inhibidor es una molécula la cual posee un parecido estructural

con el sustrato de manera que pude competir para con el entro activo pero no posee un enlace susceptible que pueda ser atacado por la enzima.

Existen un tipo de moduladores alostaticos los cuales pueden estimular o disminuir la actividad de la enzima, los inhibidores alostaticos no corresponden a ningún tipo de inhibición. Al someter la solución (almidón y amilasa) con cloruro de sodio y el reactivo de lugol obtenemos una coloración amarilla esto significa que la reacción es negativa con una coloración amarilla esto se debe a que la enzima necesita un cofactor ya que son imprescindibles para la actividad enzimática, debido a que NaCl no posee un ion metálico en su estructura no existirá la actividad enzimático.

Mientras que para la solución (amilasa y almidón) con sulfato cúprico podemos decir que al incubarse y realizarse la prueba de lugol, se obtuvo que la coloración es azul verdosa esto significa que el sulfato de cúprico en su estructura posee un ion metálico el cual es imprescindible para la actividad enzimática.

Para determinar cuál es la actividad enzimática de la renina, ante todo, se debe tener en cuenta que las enzimas son catalizadores de naturaleza orgánica, producidas por el resultado actividad celular, la renina o angiotensinogenosa es una enzima segregada por células renales especiales y esta incrementa la secreción de aldosterona, hormona que ayuda a controlar el equilibrio hídrico y sales del cuerpo. Mientras que la leche es una de las proteínas completas, esta posee grasas y proteínas al igual que la caseína.

En el proceso de coagulación se cumplen dos etapas. La primera , es estrictamente enzimática donde actúa la renina sobre la kappa caseína la cual protege la estabilidad de la miscela de caseína, se libera un glicopéptido hidrofílico, que reduce la carga superficial de las miscelas y además aumenta las fuerzas de repulsión electrostáticas que las mantiene separadas, logrando desestabilizar el complejo de proteína y la presencia de catión calcio de micelas y posteriormente se origina un gel, se agrega un catión de leche como cloruro; el tiempo de coagulación depende estrictamente de la acción enzimática de la renina.

La renina presenta máxima actividad a un pH acido de 5,5 y no actúa a un pH mayor a 7. En cuanto la temperatura se encuentra en 35 y 40 ºc se logra una actividad máxima.

Respecto a la actividad enzimática de la renina, podemos decir que la formación del coagulo depende de las condiciones de temperatura y pH.

Cuando se somete las distintas leches a diferentes temperaturas con una solución de cuajo se determinó el tiempo de formación del coagulo, las leches que se sometieron a la pruebas son la leche pasteurizada, UTH, y cruda sin embargo, al empezar a realizar las diversas pruebas la leche cruda se dañó (presentaba pequeños fragmentaciones) por lo tanto se realizaron pruebas con la leche pasteurizada y la leche UTH, sin embargo, tomaremos como referencia la leche cruda.

La leche pasteurizada a diferentes temperaturas, las cuales son 5,29, 35, 45, 60, 80 con el fin de conocer el comportamiento de la enzima frente al sustrato al suministrar temperatura.

Cuando la leche pasteurizada se lleva a una temperatura de 5 ºc se observa que no presenta formación de coagulo, el tiempo que se mantuvo a esta temperatura fue de más 30 minutos y no se observó cambio alguno esto se debe a que el sistema enzimático está inactivo por lo tanto la enzima no puede actuar de forma eficaz, en esta temperatura la actividad enzimática es mínima.

Cuando la leche pasteurizada se encuentra a temperatura ambiente (20ºc) se observó que cuando pasa más poco tiempo la leche en presencia de la solución de cuajo no forma el coagulo sin embargo cuando se dejó en tiempo de 34 minutos la solución presento formación de coágulo, esto se debe a que la temperatura no es óptima para alcanzar la velocidad máxima de la reacción por lo tanto es más lenta.

De este mismo tipo de leche fue sometido a una temperatura diferente la cual fue de 35 º , la actividad enzimática optima de la renina se encuentra entre las temperaturas de 37 y 40 grados Celsius por lo tanto podemos decir que a esta temperatura el tiempo empleado para la formación del coagulo fue de 3,45 minutos. Por lo tanto, la velocidad de reacción es apta para la actividad enzima debido que se incrementó la energía cinética de las moléculas reactantes. Por lo tanto, podemos decir que a esta temperatura predomina la desnaturalización obteniendo un coagulo en la parte inferior de tubo.

Con respecto, a la leche pasteurizada que se sometió a una temperatura de 45ºc podemos decir que el tiempo empleado para la formación del coagulo es de 1,56 minutos por consiguiente podemos decir que a esta temperatura se obtiene la mayor velocidad de la reacción, por lo tanto esta es la temperatura óptima para la actividad enzimática.

Para la temperatura de 60 ºc podemos decir que el tiempo de coagulación es de 3,59 es decir que el tiempo de coagulación es mayor al tiempo empleado en la temperatura optima, por ende se concluye que no es la temperatura adecuada para el buen funcionamiento de la enzima pero si permite que exista una actividad enzimática en esta temperatura podemos decir que va disminuyendo la capacidad enzimática la cual no se encuentra actuando al 100 %.

En cuanto a la temperatura de 80 ºc podemos decir que la actividad enzimática a esta temperatura disminuye debido a que la desnaturalización térmica es evidente, como el tiempo de coagulación fue de 5,50 podemos decir que la enzima actúa en un 45% a su capacidad máxima.

Por lo tanto podemos decir que las reacciones catalizadas por enzimas producen un brusco descenso en la actividad enzimática cuando alcanzan la actividad máxima, es decir que en el sistema se está realizando una desnaturalización térmica.

Con respecto a la prueba realizada a la leche UHT (ULTRA ALTA PASTEURIZADA) es una leche con un proceso térmico con flujo continuo, la cual se aplica a unas temperaturas de 135 a 150 ºc, de tal manera se destruyen las esporas bacterianas, la caseína apenas se modifica, las proteínas apenas se modifican los complejos que se forman normalmente son poco intensos ,

en este proceso las enzimas sufren modificaciones, las proteasas no se inactivas totalmente, por consiguiente la actividad enzimática en este tipo de leche es mínimo, es decir, no hay

coagulación esto se comprueba en la practica debido a que al pasar mas de 30 minutos en diferentes tempraturas estas muestras no sufren ningún cambio.

Acerca de la prueba de pH podemos decir que las enzimas determinan su actividad respecto a ciertos factores el pH es uno de ello. A continuación analizaremos, las diferentes leches con acido láctico e hidróxido de sodio.

La leche pasteurizada podemos decir que el pH inicial fue de 6,41 cercano al pH neutro, cuando a la solución se le adiciona renina obtenemos que el nuevo pH de la solución es de 6,79 es decir que el pH incrementa y presenta una diferencia de 0,38 a pesar del incrementar el PH estén no es el pH optimo para la formación de coagulo.

el Ph inical es de 6,48 de la solución de leche con acido láctico 0,5 ml . cuando se le adiciona la enzima “renina ” podemos decir que el pH disminuye cuando se le adiciona la renina tomando un valor de 6,18 obteniendo una diferencia de 0,3, cuando el pH disminuye a 5,98 se evidencia la formación del coagulo, el tiempo empleado para este cambio es de 3,34 minutos.

Cuando a una solución de leche pasteurizada y acido láctico (ml) el pH inical es de 6,48 mientras que cuando se le adiciona renina el pH toma un valor de 6,25 la disminución de pH contribuye a deterctar el pH optimo para la actividad enzimática por ende cuando se forma el coagulo es de 5,55 en pH se obtiene la formación del cuagulo en un tiempo de 1,50 minutos

A la solución de leche pasteurizada se le adiciona 1,5 ml de hidróxido de sodio esta solución el pH es de 6,48 mientras que si se agrega la enzima “renina ” el pH que toma esta solución es de 8,97 alejandose del pH optimo de la reaccion, no hubo formación de cuagulo; igualmente, le pasa a la solución donde se adiciona 2,5 ml de naoh debido a que al adicionar estas soluciones se incrementa el Ph BASICO de la solución.

Posteriormente, se analizo el efecto del tratamiento térmico previo de loa leche sobre la acción enzimática obteniendo que la leche pasteurizada a una temperatura de 35ºc la renina tarda 5 minutos en formar el cagulo, por lo anto podemos decir que la velocidad de la reaccion es aceptable, afirmando que a esta temperatura la ctividad enzimática no es máxima.

Cuando la leche entera se somete a el primer hervor podemos decir que la leche sepasteurizo, posteriormente se incrementa su temperatura a 35 ºc obteniendo que el tiempo de la formación del coagulo es de 4,11, es evidente que su velocidad de reaccion incremen to por lo tanto la formación del coagulo es mas rápida.

Este mismo procedimiento sufrio la leche uth, obteniendo que no hay formación de coagulo, esto se debe a el tratamiento a que fue sometido debido a que las estructuras existentes en la leche han sido modificadas.