Análisis de la expresión de metiltransferasas de histonas ...

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS

AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE METILTRANSFERASAS DE

HISTONAS Y COMPONENTES DE LOS COMPLEJOS BAF

(SWI/SNF) DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE LA LÍNEA

CELULAR DE EPITELIO CORNEAL RCE1(5T5)

T E S I S

Que presenta

IBT. María Jimena García Murillo

Para obtener el grado de:

MAESTRA EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOLOGÍA CELULAR

Director de la Tesis:

Dr. José Federico Bernardo Castro Muñoz-ledo

Ciudad de México JULIO, 2018

Expresión de metiltransferasas de histonas y complejos BAF/PBAF en la diferenciación del epitelio corneal

1

Agradecimientos

De alguna manera llegue aquí, gracias a todos los que me tuvieron paciencia y no perdieron la

esperanza en mí, en que era capaz de hacerlo. A mis amigos, mi pareja, familia, y seres queridos.

Agradezco especialmente al Dr. Federico que me ayudo a desarrollar este trabajo, a integrar y analizar

críticamente mis resultados. A Erika Sánchez Guzmán que me apoyó constantemente en la parte

experimental y técnica, en estar al pendiente de mí y de mi trabajo, junto con mis compañeros quienes

me ayudaron a discutir activamente mis resultados y así poder hilar mis ideas, en especial a Tere.

Finalmente, a mis asesores por dar una opinión crítica y constructiva del trabajo.

Este trabajo fue realizado en el departamento de Biología Celular del Centro de Investigación y de

Estudios Avanzados del IPN, bajo la dirección del Dr. José Federico Bernardo Castro Muñoz-Ledo, y fue

financiado en parte gracias al donativo 219601 y la beca de maestría CVU: 706026, otorgados por el

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT).


2


3

ÍNDICE

ABREVIATURAS ........................................................................................................................................ 5

ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................... 6

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................................. 6

RESUMEN ................................................................................................................................................ 9

ABSTRACT .............................................................................................................................................. 10

1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 11

2 MARCO TEÓRICO ........................................................................................................................... 12

2.1 Estructura de la cromatina .................................................................................................... 12

2.2 Epigenética ............................................................................................................................ 13

2.2.1 Los complejos remodeladores de la cromatina ............................................................ 16

2.2.2 Las monometiltransferasas de histonas ........................................................................ 28

2.3 La vía de NOTCH .................................................................................................................... 33

3 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN. ................................................................................................ 37

4 HIPÓTESIS ...................................................................................................................................... 41

5 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 43

5.1 Objetivo general .................................................................................................................... 43

5.2 Objetivos particulares ........................................................................................................... 43

6 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 45

6.1 Materiales ............................................................................................................................. 45

6.2 Métodos ................................................................................................................................ 47

6.2.1 Cultivo Celular ............................................................................................................... 47

6.2.2 Tinción con Rodamina B ................................................................................................ 47

6.2.3 Extracción de RNA Total ................................................................................................ 48

6.2.4 RT-PCR Punto Final ........................................................................................................ 48

6.2.5 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR) ..................................................................................... 49

6.2.6 Extracción de proteínas totales ..................................................................................... 52

6.2.7 Cuantificación de proteínas .......................................................................................... 52

6.2.8 Fraccionamiento celular ................................................................................................ 52

6.2.9 Coinmunoprecipitación ................................................................................................. 53

6.2.10 SDS-PAGE y Western blot .............................................................................................. 53

6.3 Análisis Estadístico ................................................................................................................ 54


4

7 RESULTADOS .................................................................................................................................. 55

7.1 Expresión de los componentes del complejo de remodelación de cromatina BAF(SWI/SNF)

durante la proliferación y diferenciación de las células RCE1(5T5). ................................................. 55

7.1.1 Expresión de metiltransferasas de histonas durante la proliferación y diferenciación de

las células RCE1(5T5). .................................................................................................................... 62

7.2 Cinéticas de expresión de proteínas de Pax6, BRM, Brg1 y Prdm16..................................... 65

7.3 Análisis de la composición de los complejos remodeladores de cromatina por

coinmunoprecipitación...................................................................................................................... 69

7.4 Efecto de la activación de la vía de NOTCH sobre la expresión de los complejos

remodeladores de cromatina BAF y PBAF, y de las metiltransferasas de histonas, PRDM3 y

PRDM16. ............................................................................................................................................ 71

7.4.1 Los ligandos y receptores de la vía de Notch, modulan la expresión de Prdm16 y no así

la expresión de BAF250a,b /Arid1a,b y BAF200/Arid2. ................................................................. 73

8 DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 79

9 PERSPECTIVAS ................................................................................................................................ 88

10 CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 89

11 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 90

12 MATERIAL SUPLEMENTARIO ....................................................................................................... 102

12.1 Apéndice 1 ........................................................................................................................... 102


5

ABREVIATURAS

µg Microgramo

µm micrómetro

3T3 Línea celular de fibroblastos de ratón

BSA Albumina de suero bovino

cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario

DMEM Dulbecco-Vôgt's Modified Eagle Medium

DNA Ácido desoxirribonucleico

EGF Factor de Crecimiento Epidermal

EtBr Bromuro de Etidio

FBS Suero fetal de bovino

K3 Citoqueratina 3

K5 Citoqueratina 5

kDa Kilo Dalton

mg Miligramo

min Minutos

ml Mililitro

mM Milimolar

NICD Dominio Intracelular de Notch

p/v Relación peso sobre volumen

pb Pares de bases

PBS Buffer Salino de Fosfatos

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

RCE1 (5T5) Rabbit Corneal Epithelial 1, línea celular

RNA Ácido ribonucleico

RNAm Ácido ribonucleico mensajero

rpm Revoluciones por minuto

seg segundos

TA Temperatura ambiente

v/v Relación volumen sobre volumen


6

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Conservación de los componentes de los complejos SWI/SNF y RSC durante la

evolución ...................................................................................................................... 20

Tabla 2 Subunidades de los complejos BAF/PBAF ................................................................... 22

Tabla 3 Anticuerpos y condiciones experimentales utilizadas (concentración) ...................... 45

Tabla 4 Proteínas recombinantes (ligandos solubles) de la vía de NOTCH utilizados .............. 47

Tabla 5 Secuencia y características de los oligos utilizados para RT-qPCR .............................. 49

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Principales estructuras en la compactación del DNA ............................................... 12

Figura 2 Modelo solenoide de la fibra de cromatina condensada de 30nm, en una vista

lateral ........................................................................................................................ 12

Figura 3 Vista global del núcleo celular .................................................................................. 14

Figura 4 Ejemplos clave de la contribución de la cromatina a la función del epigenoma. ..... 15

Figura 5 Diferentes acciones de la actividad de remodelación de la cromatina dependiente

de ATP sobre el DNA nucleosomal ............................................................................ 16

Figura 6 Clasificación de los complejos remodeladores de la cromatina ATP-dependientes 17

Figura 7 Evolución de los complejos SWI/SNF desde levadura hasta los complejos BAP de la

mosca y BAF de los vertebrados. .............................................................................. 19

Figura 8 Predicción de la arquitectura de dominios en los componentes de los complejos

humanos BAF y PBAF ................................................................................................ 24

Figura 9 El ensamble combinatorial de los complejos remodeladores de la cromatina BAF

(Brahma-associated factor) produce especificidad biológica ................................... 26

Figura 10 Estructura y relaciones de los dominios de la familia de proteínas Prdm ................ 29

Figura 11 Funciones biológicas y bioquímicas de Evi-1/Prdm3 ................................................ 32

Figura 12 Estructura de PRDM16 .............................................................................................. 33

Figura 13 Vía metabólica de NOTCH ......................................................................................... 35

Figura 14 Esquematización de las condiciones de amplificación utilizadas en los protocolos de

RT-qPCR ..................................................................................................................... 49

Figura 15 Productos de amplificación de RT-qPCR de los oligonucleótidos diseñados. ........... 51


7

Figura 16 Expresión de RNAm de Brg1/SMARCA4 y PAX6 en la diferenciación del epitelio

corneal (RCE-5T5)....................................................................................................... 56

Figura 17 RNAm de Brm/SMARCA2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5) ............................................................................................................................ 57

Figura 18 RNAm de BAF45a/PHF10 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5) ............................................................................................................................ 58

Figura 19 RNAm de Arid1a/BAF250a y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5). ........................................................................................................................... 59

Figura 20 RNAm de Arid1b/BAF250b y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5). ........................................................................................................................... 60

Figura 21 RNAm de Arid2/BAF200 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5). ........................................................................................................................... 61

Figura 22 RNAm de Prdm3/Evi1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). .. 62

Figura 23 RNAm de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). ........ 63

Figura 24 RNAm de CTBP2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5)............ 64

Figura 25 Proteínas totales: expresión de PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5) ............................................................................................................................ 65

Figura 26 Proteínas totales: expresión de Brg1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal

(RCE-5T5) ................................................................................................................... 66

Figura 27 Proteínas totales: expresión de BRM y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal

(RCE-5T5) ................................................................................................................... 67

Figura 28 Proteínas totales: expresión de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio

corneal (RCE-5T5)....................................................................................................... 68

Figura 29 Coinmunoprecipitación de las subunidades núcleo de los complejos BAF/PBAF por

sus ATPasas ................................................................................................................ 70

Figura 30 Efecto de las proteínas recombinantes rhNotch-1 y rmJagged-2 sobre la

proliferación celular ................................................................................................... 72

Figura 31 Cambios en la expresión de RNAm de (a)Pax6 y (b)K3 promovidos por las formas

recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1 ........................................................ 74

Figura 32 Cambios en la expresión de RNAm de Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b y

Arid2/BAF200 promovidos por las formas recombinantes solubles de Notch-1 y

Jagged-1. .................................................................................................................... 75


8

Figura 33. Cambios en la expresión de los RNAm de Prdm16 y marcadores de diferenciación

K3 y Pax6 promovidos por las formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-

1. ................................................................................................................................ 77

Figura 34 Perfil general de expresión de los mRNA que codifican para las subunidades de los

complejos remodeladores de cromatina BAF y PBAF. .............................................. 81

Figura 35 Configuraciones propuestas de los posibles complejos remodeladores BAF y PBAF

en las diferentes etapas de la diferenciación del epitelio córneal............................ 85


9

RESUMEN

La remodelación de la estructura tridimensional de la cromatina y la modificación covalente de

las histonas son parte de los mecanismos epigéneticos que participan en la diferenciación celular. En

este trabajo iniciamos el estudio de los complejos remodeladores de la cromatina BAF/PBAF y de las

monometiltransferasas de histonas PRDM16 y PRDM3, utilizando como modelo a la línea de epitelio

corneal de conejo RCE1(5T5). Detectamos cambios en la expresión de estos elementos, principalmente

durante la transición entre la proliferación y la formación del epitelio estratificado; las subunidades

que constituyen a los complejos aumentaron su expresión entre 2 y 10 veces los niveles iniciales,

mientras que PRDM3 y PRDM16 se incrementaron hasta 3 veces, con resultados similares en los

niveles de las proteínas correspondientes. Por otra parte, demostramos interacciones proteína-

proteína entre los complejos remodeladores de cromatina y el factor homeótico PAX6. Reportamos

que la activación de la vía de NOTCH aumenta la expresión de PRDM16 alrededor de 20 veces respecto

a su expresión basal, pero no así para los complejos remodeladores de cromatina estudiados. Es

probable que esta vía no regule a los complejos remodeladores, pero requiera la participación de

PRDM3 y PRDM16. Con base en los resultados, proponemos la composición de subunidades de los

complejos remodeladores BAF/PBAF que posiblemente predominen durante las etapas de

diferenciación observadas en cultivo. Mediante este análisis, sugerimos las posibles combinaciones de

las principales subunidades de los complejos que incluyen a las ATPasas Brg1 y BRM; a las subunidades

núcleo BAF170, BAF155, BAF47; y a las subunidades ARID1a/BAF250a, ARID1b/BAF250b y

ARID2/BAF200 que son indispensables para el ensamble de los complejos. Es posible que los elementos

epigenéticos estudiados participen tanto en etapas tempranas de la diferenciación (complejos que

contienen Brg1 con p63), como en el silenciamiento de los genes que no se expresan en el fenotipo

terminal. Éstos interactúan con la vía de NOTCH y con PAX6 durante la etapa de transición, donde

probablemente contribuyen a la modificación de la expresión genética asociada a la formación de un

epitelio corneal estratificado a partir de sus precursores proliferativos


10

ABSTRACT

Remodeling of Chromatin 3D structure and the covalent modification of histones constitute part

of the epigenetic mechanisms involved in cell differentiation. We started the study of chromatin

remodeling complexes BAF/PBAF and PRDM16 and PRDM3 methyltransferases during differentiation

of the rabbit corneal epithelial cell line RCE1(5T5). We observed changes in the expression of mRNAs

encoding these proteins, mainly during the transition between proliferation and the development of

a stratified epithelium. The remodeling complex subunits increased their expression from 2 to 10-fold,

depending on the analyzed subunit; in contrast, PRDM3 and PRDM16 increased up to 3–fold. Similar

results were observed when we determined the expression of the corresponding proteins. On the

other hand, we show the existence of protein-protein interactions among the chromatin remodeling

complexes and the homeotic factor PAX6. On the other hand, activation of NOTCH signaling

upregulates PRDM16 expression about 20-fold, contrasting with the subunits of the chromatin

remodeling complexes which did not show any significant modification. Therefore, NOTCH pathway

probably does not seem regulate the expression of chromatin remodelers, but it is required for PRDM3

and PRDM16 activation. Based in these results, we propose the possible configuration of the

predominant BAF/PBAF remodeling complexes along the differentiation stages identified in cell

culture. Through such analysis; we suggest the possible subunit combinations for BAF/PBAF

complexes, including BRG1 and BRM ATPases; the core subunits BAF170, BAF155, BAF47; and

ARID1a/BAF250a, ARID1b/BAF250b, and ARID2/BAF200 subunits, which are essential for complex

assembly. We propose that the studied epigenetic elements participate both in early determination

(complex containing BRG1 and p63), and in silencing of genes which are not required for terminal

phenotype expression. These elements interact with NOTCH pathway and the transcription factor

PAX6 during the transition stage, where they probably contribute to establish a stratified corneal

epithelium from its proliferative precursors.


11

1 INTRODUCCIÓN

Si todas las células somáticas de nuestro cuerpo comparten la misma información genética, ¿por

qué no todas se comportan de la misma manera? ¿por qué existen diversos tipos celulares? ¿qué las

hace diferentes? ¿por qué se “apagan” y “encienden” de manera coordinada distintos grupos de

genes? Estas y otras preguntas permitieron el descubrimiento de un sistema de regulación de la

expresión genética que utiliza al código genético como base y actúa gracias a otros factores, como las

proteínas asociadas a la cromatina, el plegamiento del material genético y los RNAs no codificantes.

La Epigenética (del griego epi, en o sobre, y genética [del griego antiguo: γενετικός, guennetikós,

‘genetivus’, y este de γένεσις, génesis, ‘origen’]) es la disciplina que estudia la función de estos

componentes, a través del análisis de todos los procesos que controlan la expresión genética sin

modificar o alterar a la secuencia del DNA.

Actualmente sabemos que el nivel de compactación de la cromatina es de suma importancia en

la regulación de la expresión genética, ya que implica qué tan accesible es ésta para su transcripción.

La estructura tridimensional o “arquitectura” de la cromatina es determinante para definir la identidad

celular y como consecuencia, ésta sufre cambios durante la transición entre estados de diferenciación

o en algunas patologías. Por ello, es importante explorar los mecanismos remodeladores de la

cromatina, en particular la expresión de los componentes de los complejos proteicos que realizan dicha

remodelación durante la diferenciación. En este trabajo estudiamos a los complejos remodeladores

BAF/PBAF/SWI-SNF que, junto con proteínas involucradas en la metilación de las histonas que

intervienen en la organización de la heterocromatina constitutiva, y con vías metabólicas previamente

identificadas en nuestro laboratorio, participan activamente en la diferenciación del epitelio corneal.

El presente proyecto explora por primera vez la importancia de los procesos que participan en la

modificación estructural de la cromatina durante la diferenciación del epitelio corneal y genera un

sinnúmero de preguntas al respecto. Primeramente, describiremos las características generales de los

complejos remodeladores de cromatina, de las enzimas involucradas en la modificación covalente de

las histonas, y de algunas de las vías de señalización que modifican la actividad de los mecanismos

epigenéticos; para después analizar sus patrones de expresión y algunas de las relaciones que

interconectan a estos elementos entre sí, y con factores de transcripción indispensables para la

diferenciación epitelial.


12

2 MARCO TEÓRICO

2.1 Estructura de la cromatina

Los genomas se encuentran ordenados de manera tridimensional en el núcleo celular, iniciando

con el plegamiento de las fibras de DNA en torno a los nucleosomas, y culminando en la agregación de

dominios cromosómicos para formar territorios cromosómicos (Cavalli & Misteli, 2013).

Figura 1 Principales estructuras en la compactación del DNA, el nucleosoma, la fibra de 10 nm ("beads-on-a-string"), la fibra

de cromatina de 30 nm y el cromosoma en metafase (Wheeler R., obtenido de https://en.wikipedia.org/wiki/Chromatin en

2017)

Durante la interfase, cuando las células no se

dividen, el material genético se encuentra disperso en la

mayor parte del núcleo como un complejo de

nucleoproteínas llamado cromatina. Las proteínas más

abundantes asociadas al DNA eucarionte son las histonas,

una familia de proteínas básicas pequeñas, evolutivamente

muy conservadas. En las histonas, los aminoácidos con

carga eléctrica positiva se ponen en contacto con los grupos

fosfato del DNA con carga negativa aproximadamente cada

10.4 pb, proporcionando 14 puntos de contacto DNA-

histona relativamente débiles, que en conjunto proporcionan estabilidad posicional. El nucleosoma

canónico es un disco octamérico (Figura 2) de aproximadamente 10 nm de diámetro, compuesto por

dos copias de cada una de las cuatro histonas canónicas: H3, H4, H2A y H2B, alrededor del cual se

empaquetan aproximadamente 147 pb de DNA y que finalmente se asocian con una molécula de la

histona H1 (Lodish, et al., 2005) (Clapier & Cairns, 2009).

Figura 2 Modelo solenoide de la fibra de

cromatina condensada de 30nm, en una vista

lateral. (Adaptado de M. Grustein, 1992).


13

La cromatina es una forma de organización altamente dinámica que modula tanto la estabilidad

del DNA como los patrones de expresión genética. Esta regulación se da, entre otras cosas, gracias a

su estructura tridimensional dinámica, que a su vez es regulada sustancialmente por mecanismos

epigenéticos.

2.2 Epigenética

Actualmente sabemos que a pesar de que las células somáticas de un individuo comparten su

genoma, la expresión diferencial de distintos genes permite que cada célula manifieste una identidad

o fenotipo particular. En 1942, Conrad H. Waddington acuñó el término “epigénetica”, para definir a

todos los cambios que ocurren en el fenotipo sin que se presenten cambios en el genotipo, y de esta

manera explicar aspectos del desarrollo para los cuales existía poco entendimiento mecanístico.

Posteriormente, el avance del conocimiento y el desarrollo de metodologías más sensibles y con

mayor poder de resolución permitieron identificar a procesos como el empaquetamiento del DNA

como un mecanismo de regulación de la expresión genética. Actualmente se sabe que entre más

densamente empaquetados estén los nucleosomas, el DNA se encuentra más protegido del daño, pero

al mismo tiempo, es menos accesible para ser transcrito. A esta cromatina altamente compactada y

silenciada transcripcionalmente se le conoce como heterocromatina, la cual tiene funciones

importantes para la organización del genoma, la segregación de los cromosomas, la estabilidad de los

programas de expresión genética y la progresión del desarrollo (Oberdoerffer & Sinclair, 2007; Pinheiro

et al., 2012). Por otra parte, a la cromatina más accesible y transcripcionalmente activa se le conoce

como eucromatina (Grewal & Jia, 2007; Obe et al., 2002; Oberdoerffer & Sinclair, 2007).

Gracias al análisis de los territorios cromosómicos en numerosos tipos celulares y tejidos,

sabemos que la arquitectura de la cromatina no se establece al azar, sino que es específica para cada

caso (Misteli, 2008), y que se conserva a lo largo de la evolución (Tanabe et al., 2002). Este arreglo

tridimensional de la cromatina también se hereda parcialmente de células progenitoras a células hijas

que pertenecen a un mismo linaje (Shatskikh & Gvozdev, 2013; Tanabe et al., 2002), junto con los

patrones de distribución posicional de los genes, que cambian durante procesos fisiológicos como la

diferenciación, el envejecimiento, y distintas patologías (Cavalli & Misteli, 2013), determinando así la

aparición de los distintos tipos celulares terminales.


14

Figura 3 Vista global del núcleo celular. Adaptado de (Cavalli & Misteli, 2013).

El descubrimiento de los fenómenos epigenéticos revolucionó el concepto de regulación

genética tal como se conocía. Esto debido a que: i) implica que las modificaciones realizadas a la

cromatina pueden ser reversibles; un ejemplo de ello son las proteínas que modifican covalentemente

a las histonas en los nucleosomas, como es el caso de las acetilasas, además de otras proteínas que

“leen” estas modificaciones; o las proteínas que remueven las marcas dependiendo del contexto

celular (Allis & Jenuwein, 2016). ii) También se demostró que el ambiente tiene impacto sobre la

expresión genética al promover la modificación de histonas y la metilación del DNA. iii) Condujo al

descubrimiento de los RNA no codificantes, entre los que se encuentran los siRNAs (small interfering

RNA), snoRNAs (small nucleolar RNA), lncRNAs (long non-coding RNA), etc., que no tienen una

traducción a proteína y que entre otras funciones, regulan a los RNA mensajeros. Finalmente, iv)

permitió descubrir que la estructura tridimensional de la cromatina se modifica gracias a la actividad

de reguladores como los complejos remodeladores de la cromatina y variantes de histonas, llevando

a la conclusión de que esta arquitectura tiene una función biológica en el control de la expresión

genética.

El plegamiento de los dominios de cromatina está determinado por la actividad transcripcional de las regiones genómicas.

Se forman límites en la interfase de las partes activas e inactivas del genoma. Los dominios grandes con un estado de

actividad similar se juntan para formar dominios cromosómicos. Las regiones represivas de los cromosomas tienden a

agruparse con otras regiones represivas en el mismo brazo cromosómico, mientras que los dominios activos se encuentran

más expuestos en el exterior de los territorios cromosómicos donde tienen más oportunidad de unirse a dominios activos

de otros cromosomas dando lugar a “superdominios” topológicos compuestos de dominios genómicos funcionalmente

similares. La ubicación de los territorios está limitada por su asociación con la periferia nuclear, burbujas de transcripción,

cuerpos nucleares y clusters de centrómeros, entre otros.


15

En la Figura 4 se resumen las funciones del epigenoma, mencionando algunos de los ejemplos

más conocidos.

Figura 4 Ejemplos clave de la contribución de la cromatina a la función del epigenoma (Allis & Jenuwein, 2016). En el centro

de la figura se muestra la base de la cromatina con cuatro nucleosomas junto con los mecanismos principales, como las

modificaciones en las histonas (mod), la metilación del DNA (Me), variantes de histonas y la remodelación (nucleosoma

amarillo) y RNA no codificante (ncRNA; líneas azules curveadas), que modifican la estructura de la cromatina y su función de

manera inter-dependiente. Las distintas adaptaciones de esta cromatina base se asocian con las funciones del epigenoma

destacadas en los cuadros. Además, se ilustran algunos de los principales factores de la cromatina que regulan dichas

transiciones. Para una explicación más a fondo de ellos consulte la referencia:(Allis & Jenuwein, 2016). Abreviaturas: Air,

antisense insulin-like growth factor 2 receptor RNA; ATRX, α-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked; BAF, BRG1-

associated factor; DAXX, death-domain-associated protein; CTCF, CCCTC-binding factor; DNA-me, DNA methylation; DNMT,

DNA (cytosine-5)- methyltransferase; EED, embryonic ectoderm development; ESET, ERG-associated protein with SET

domain; EZH2, Enhancer of zeste homologue 2; H2A.X, histone H2 variant; H3K4me3, histone H3 lysine 4 tri- methylation;

HAT, histone acetyltransferase; HP1, heterochromatin protein 1; KMT, lysine methyltransferase; lncRNA, long non-coding

RNA; MLL, mixed-lineage leukaemia; PCAF, p300/CBP-associated factor; PRC, Polycomb repressive complex; RNAi, RNA-

mediated interference; SUV39H1, Su(var)3–9 homologue 1; TAFs, TATA-box binding protein associated factors; TET, ten-

eleven translocation; TFs, transcription factors; TGS, transcriptional gene silencing; TRR, Trithorax related; Xist, X-inactive

specific transcript.


16

2.2.1 Los complejos remodeladores de la cromatina

La estructura de la cromatina proporciona, simultáneamente, una solución para el

empaquetamiento de la información y un mecanismo sofisticado para la regulación de la expresión

genética (Tang et al., 2010). Para que esta estructura conserve su funcionalidad y fluidez, se requiere

de un control estricto de sus modificaciones. El remodelamiento de la cromatina se lleva a cabo gracias

a complejos multiproteícos de gran tamaño con gran afinidad por los nucleosomas. Estos complejos

pueden interactuar con otras proteínas, incluyendo otros complejos y factores de transcripción, así

como también con modificaciones covalentes de la cromatina y/o del genoma. Estos complejos tienen

el propósito de localizar sitios

específicos del genoma, y gracias a la

hidrólisis de ATP, modificar la

accesibilidad de la cromatina para que

otras proteínas de unión al DNA puedan

ingresar, contribuyendo así a la

regulación de la expresión genética.

Este remodelado dependiente de ATP

parece ser crucial, tanto para el

ensamble de estructuras de la

cromatina, como para su disolución

(Clapier & Cairns, 2009; J. I. Wu, 2012;

Wurster & Pazin, 2012; Yoo & Crabtree,

2009).

Asimismo, estos complejos se

requieren para empacar por completo al genoma, para especializar regiones de la cromatina y para

regular la accesibilidad al DNA en las regiones empaquetadas. Todos los remodeladores de cromatina

conocidos poseen cinco propiedades básicas: a) afinidad por el nucleosoma, más que hacia el DNA

mismo; b) capacidad de reconocer las modificaciones covalentes en las histonas a través de sus

dominios proteicos; c) poseen un dominio ATPasa dependiente de DNA requerido para el

remodelamiento, que funciona como un motor de translocación para romper los contactos DNA-

histonas; d) poseen dominios y/o proteínas reguladoras del dominio ATPasa; y e) contienen dominios

y/o proteínas que permiten la interacción con otros factores de transcripción, o con la cromatina. En

conjunto, estas propiedades compartidas permiten el acoplamiento, selección y remodelado de los

Figura 5. Diferentes acciones de la actividad de remodelación de la

cromatina dependiente de ATP sobre el DNA nucleosomal. Figura

tomada de (Tang et al., 2010). DBP indica: “DNA binding proteín”

proteína de unión a DNA


17

nucleosomas. Sin embargo, sabemos que según su composición combinatorial pueden tener distintos

blancos y tareas (Clapier & Cairns, 2009).

Como se muestra en la Figura 5, después de la hidrólisis de ATP, una región protegida de la

cromatina se puede volver accesible a complejos de proteínas de unión al DNA tales como factores de

transcripción (en verde). Los nucleosomas se pueden desenvolver, movilizar o remover para permitir

estos procesos. En algunos casos, los complejos remodeladores dependientes de ATP pueden utilizar

el ATP para introducir variantes de histonas dentro del nucleosoma mediante un proceso llamado

intercambio de dímero (Tang et al., 2010).

Los complejos remodeladores de cromatina-ATP dependientes son complejos multiproteícos

grandes (>1 MDa) que constan de 4 a 17 subunidades y se encuentran altamente conservados en

eucariotas. Se caracterizan por la presencia de una subunidad ATPasa que pertenece a la superfamilia

II de proteínas relacionadas con helicasas (Singleton & Wigley, 2002). Las proteínas que pertenecen a

esta clase contienen un dominio ATPasa que está formado de dos partes, la región DExx y la región

HELICc, separadas entre sí por un segmento de unión (linker). Esta clase se puede subdividir en al

menos 4 familias diferentes con base en la presencia adicional de dominios únicos dentro o adyacentes

al dominio con actividad

ATPasa: SWI/SNF, ISWI,

NURD/Mi-2/CHD e INO80

(Cigall Kadoch et al., 2016).

Figura 6 Clasificación de los

complejos remodeladores de la

cromatina ATP-dependientes.

Figura tomada de (Clapier & Cairns,

2009):

Como se muestra en la Figura 6, la familia SWI/SNF contiene un dominio HSA, involucrado en

la unión a actina y a proteínas relacionadas con actina, y un bromodominio importante para su unión

a histonas que contienen lisinas acetiladas. La familia ISWI contiene los dominios SANT y SLIDE,

importantes para la unión a histonas (He & Cvekl, 2012). La familia CHD/NURD/Mi-2 contiene un

chromodominio en tándem, utilizado también para su unión a histonas. La familia INO80, al igual que


18

la familia SWI/SNF, contiene un dominio HSA pero también se caracteriza por la presencia de una

inserción más larga entre los dominios DExx y HELICc (Clapier & Cairns, 2009).

Los complejos SWI/SNF/RCS de mamíferos, también llamados complejos BAF/PBAF (Brama-

/Brg1- associated factor complex) están constituidos por 10 a 15 subunidades proteicas, tienen una

masa molecular aparente de 2 MDa (aproximadamente 12 veces el tamaño de un nucleosoma), y de

1.14 MDa en levadura. Éstos utilizan la energía derivada de la hidrólisis del ATP para conseguir la

movilización coordinada de nucleosomas y la modulación de la accesibilidad a la cromatina (Cigall

Kadoch, Copeland, et al., 2016). En términos de expresión genética, pueden servir tanto como

activadores y como represores. Existen alrededor de 300,000 complejos BAF por célula troncal de

ratón y parece que cerca de la mitad de ellos se encuentran en todo momento asociados a la cromatina

(C. Kadoch & Crabtree, 2015).

2.2.1.1 Historia

El complejo SWI/SNF se descubrió inicialmente por medio de dos tamizajes independientes

hechos en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Estos tamizajes buscaban identificar mutaciones en

los genes de inhibición del fenotipo “mating type switching” (SWI) y la vía de la fermentación de la

sacarosa (“Sucrose non fermenting” SNF) (Sudarsanam & Winston, 2000; Wang et al., 1996). En estos

estudios, se consiguió purificar a la proteína SWI/SNF2p que era parte de un complejo que contenía

11 polipéptidos adicionales, con un peso molecular combinado superior a 1.5 MDa. El complejo

SWI/SNF purificado, era capaz de alterar la estructura del nucleosoma de manera ATP-dependiente

(Kadoch et al., 2016; Masliah-Planchon et al., 2014; Vignali, et al., 2000; Workman & Kingston, 1998).

Actualmente se piensa que a lo largo de la evolución, los complejos remodeladores de

cromatina se modificaron según las necesidades de los organismos, utilizando como base un núcleo

de subunidades esenciales, pero ganando, perdiendo o cambiando subunidades accesorias,

probablemente para adaptarse a los cambios epigéneticos que ocurren en los organismos

multicelulares con genomas más grandes, y por lo tanto, con una necesidad de regulación más estricta

(Figura 7) (Cigall Kadoch, Copeland, et al., 2016).


19

Figura 7 Evolución de los complejos SWI/SNF desde levadura hasta los complejos BAP de la mosca y BAF de los vertebrados,

tomada de (Kadoch & Crabtree, 2015). Se muestra el cambio en la estructura de las subunidades de estos complejos,

relacionados entre sí, a lo largo de los últimos 500 millones de años de evolución. Los colores se utilizan para indicar

homología.

De esta manera, el desarrollo de multicelularidad y la necesidad de reprimir a la mayoría de

los genes, estuvieron vinculados evolutivamente a la aparición de la represión mediada por polycomb

(Pc), a la regulación mediada por la histona H1, y a la existencia de grandes modificaciones en la

estructura de las subunidades de SWI/SNF de levaduras en su transición hacia los complejos BAP en

las moscas. Posteriormente, el aumento en el tamaño y complejidad del genoma, así como la

metilación del DNA, condujeron a que en los vertebrados se presentara una transición en la estructura

de las subunidades y del ensamble combinatorial. Finalmente, con la aparición de un sistema nervioso

complejo, cuatro subunidades específicas para las neuronas esenciales para la morfogénesis

dendrítica, la sinaptogénesis y la conectividad en el sistema nervioso (Kadoch & Crabtree, 2015), se

añadieron al multímero.

Mientras en levaduras existen dos complejos remodeladores distintos SWI/SNF y RSC, en

Drosophila los dos complejos ortólogos se llaman BAP (Brahma associated proteins) y PBAP

(Polybromo associated BAP complexes). En mamíferos, estos dos complejos se llaman BAF (Brg1

associated factors) y PBAF (Polybromo associated BAF). De esta manera, las células eucarióticas

poseen dos subfamilias de los complejos remodeladores de la cromatina SWI/SNF, que se diferencian

entre sí por la presencia de componentes particulares. Estas dos subfamilias son: SWI/SNF/BAP/BAF y

RSC/PBAP/PBAF, las cuales poseen componentes característicos que son mutualmente excluyentes


20

(Kadoch & Crabtree, 2015; Masliah-Planchon et al., 2014; Tang et al., 2010) y se resumen en la Tabla

1.

Tabla 1 Conservación de los componentes de los complejos SWI/SNF y RSC durante la evolución (adaptada de Euskirchen,

Auerbach, & Snyder, 2012; Tang et al., 2010).

Organismo

Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogaster Homo sapiens

Complejo Swi/Snf RSC BAP PBAP BAF PBAF

Componentes ortologos entre las especies

Swi2/Snf2p Sth1 BRM/Bhrama Brg1 o hBRM

Brg1

Swi3 Rsc8/Swh3 MOIRA/BAP155 BAF155 y BAF170

Swil/Adr6 OSA BAF250 a, b

Rcs9 BAP170 BAF200

Rsc1,2,3,4 Polybromo BAF180

Snf12/Swp73 Rsc6 BAP60 BAF60 a, b, c

Snf5 Sfh1 BAP45/SNR1 INI1/BAF47/hSNF5

BAP111 BAF57

BAF45 a, b, c, d

Arp 7,9 BAP55/BAP47 BAF53 a, b

Actina β-actina

BRD7

Swp82

Snf6

Snf11

Taf14

Rtt102

Rcs5, 7, 9, 10, 14, 30,

58

Htl1

2.2.1.2 Composición

Las subunidades de los complejos BAF o PBAF son codificadas comúnmente por más de un

gen, permitiendo su ensamblaje combinatorial, lo que conlleva a la formación de gran diversidad de

complejos remodeladores de cromatina, cuya expresión puede ser modulada a lo largo del desarrollo

y la diferenciación celular (Euskirchen et al., 2012).

En mamíferos, los complejos se encuentran energizados por una de dos subunidades parálogas

con actividad de ATPasa BRG1 (SMARCA4) y BRM (SMARCA2), y que son ortólogas a la proteína Snf2p

de la levadura (Tabla 1). Estas ATPasas se ensamblan en los complejos de manera mutuamente


21

excluyente (Euskirchen et al., 2012). El complejo BAF puede contener cualquiera de las dos ATPasas

BRM (Brahma) o BRG1 (Brahma-related gene 1); por el contrario, PBAF solo puede contener a la

ATPasa BRG1.

Además, ambos complejos contienen subunidades “núcleo” comunes: BAF47/Ini1 (“Integrase

interactor 1” codificada por el gen SMARCB1), BAF155 (“Brg1 Associated Factor” codificada por el gen

SMARCC1), y BAF170 (gen SMARCC2), y de 7 a 15 subunidades accesorias que complementan el

complejo, una de las cuales es la β-actina (Euskirchen et al., 2012; Masliah-Planchon et al., 2014).

Por otro lado, la presencia de algunas subunidades excluyentes determina su pertenencia a

una de las dos categorías (BAF o PBAF), que corresponden a sus ortólogos en levadura (SWI/SNF o

RSC). Los complejos BAF contienen una proteína de la familia OSA/BAF250/ARID1a/b homóloga a

Swi1 y por lo tanto se identifican como ortólogos de SWI/SNF. Los complejos PBAF contienen a la

subunidad BAP180/BAF180 (PBRM1) ortóloga a Polybromo en levaduras, y a la subunidad

BAP170/BAF200 (ARID2) ortóloga a RSC9 en levadura, lo cual los identifica como ortólogos del

complejo RSC de levadura (Euskirchen et al., 2012; Mohrmann & Verrijzer, 2005; Sudarsanam &

Winston, 2000).

Las otras proteínas que también forman parte de cualquiera de los dos tipos de complejo

pertenecen a las familias génicas: BAF60a/b/c, BAF45a/b/c/d, BAF57, BAF53a/b (una variante a la

vez); además de algunas otras subunidades no identificadas a la fecha. Cabe mencionar que las ARP

(actin related protein) nucleares son componentes de las familias de complejos remodeladores de la

cromatina SWI/SNF e INO80 (Clapier & Cairns, 2009; Kadoch & Crabtree, 2015). Todas estas

subunidades han sido estudiadas por separado y sus características se resumen a continuación (ver

Tabla 2).


22

Tabla 2 Subunidades de los complejos BAF/PBAF adaptado de (Masliah-Planchon et al., 2014)

Subunidad Gen (alias) Peso molecular predicho (kDa)

Tipo de complejo SWI/SNF

Dominio Función conocida

BRG1 SMARCA4 184.5 Subunidad núcleo

ATPasa/bromo Subunidad catalítica ATPasa y helicasa

BRM SMARCA2 181 Subunidad núcleo de BAF

ATPasa/bromo Subunidad catalítica ATPasa y helicasa

BAF47/INI1 SMARCB1 (bSNF5, INI1)

44 Subunidad núcleo

SNF5 Desconocida

BAF155 SMARCC1 (SWI3) 123 Subunidad núcleo

Cromo/SANT/BRCT Desconocida

BAF170 SMARCC2 133 Subunidad núcleo

Cromo/SANT/BRCT Desconocida

BAF250a ARID1A (SMARCF1)

242 Subunidad núcleo de BAF

ARID Unión al DNA

BAF250b ARID1B 236 Subunidad núcleo de BAF

ARID Unión al DNA

BAF200 ARID2 197 BAF/PBAF ARID Unión al DNA

BAF57 SMARCE1 47 BAF/PBAF HMG Desconocida

BAF45a PHF10 56 BAF/PBAF Dedos de zinc_RING Desconocida

BAF45b/c/d DPF1/3/2 42.5/43/44 BAF/PBAF Dedos de zinc_RING Desconocida

BAF53a/b ACTL6A/B 47.5/47 BAF/PBAF Actina Asociación a cromatina / matriz nuclear, potenciador

de actividad ATPasa

Β-actina ACTB 41.5 BAF/PBAF Actina Desconocida

BAF60a/b/c SMARCD1/2/3 58/59/55 BAF/PBAF SWIB/MDM2 Desconocida

BCL7A/B/C BCL7A/B/C 23/23/23.5 BAF Desconocido Desconocida

BCL11A/B BCL11A/B 91/95.5 BAF Dedos de zinc_C2H2 Desconocida

BRD9 BRD9 67 BAF Bromo Unión a H3 acetilada

SYT SS18 46 BAF Desconocido Coactivador transcripcional

BAF180 PBRM1 193 PBAF BAH/HMG/Bromo Desconocida

BRD7 BRD7 74 PBAF Bromo Desconocida

La mayoría de las subunidades de los complejos SWI/SNF son capaces de unirse al DNA o a la

cromatina. Algunos dominios proteicos que cumplen con este objetivo y que están presentes en las

diferentes subunidades del complejo son los dominios HMG, ARID (AT-rich interaction domain), SANT,

y Krüppel (J. I. Wu, Lessard, & Crabtree, 2009). Aún no se determina claramente si existe una

identificación secuencia específica; sin embargo, algunas estructuras de la cromatina pueden estar

favorecidas para su unión, como ocurre para el surco menor de la doble hélice del DNA, o las uniones

helicoidales de cuatro vías (Das et al., 2009; Euskirchen et al., 2012; Morozov et al., 1998; Wang et al.,

1998).

Por otro lado, las modificaciones epigenéticas también contribuyen a la asociación de los

complejos remodeladores a zonas específicas de la cromatina, como ocurre para las modificaciones


23

covalentes en residuos localizados en la cola de las histonas (metilación, ubiquitinación, formilación,

acetilación, entre otras), y que por lo tanto permiten el reconocimiento de sitios específicos según el

patrón de modificación, la arquitectura del sitio y las proteínas asociadas, más que por el reclutamiento

de factores de transcripción. Cabe señalar que estas modificaciones específicas de sitio pueden actuar

colectivamente para orquestar la estabilidad genómica y la expresión o represión de genes. De las

numerosas modificaciones que pueden sufrir las histonas, la acetilación de lisinas es una de las más

dinámicas (Allfrey et al., 1964) ya que parece dirigir tanto cambios estructurales como la actividad

transcripcional (Berger, 2002; Turner, 1998). Esta función dinámica de la acetilación de lisinas es en

parte resultado de la existencia de bromodominios en las proteínas que interaccionan con la

cromatina. Los bromodominios (BRD) son los únicos dominios proteicos conocidos que actúan como

dominios que unen grupos acetil-lisina (Zeng & Zhou, 2002), y las proteínas que los contienen parecen

participar en procesos como el cáncer, la inflamación y la replicación viral (Zeng & Zhou, 2002).

En mamíferos, los complejos BAF (mSWI/SNF) y PBAF(mRSC) contienen ocho bromodominios:

(seis en PBRM1, uno en la subunidad ATPasa [ya sea BRG1 o BRM], y uno en BRD7), dos proteínas con

dedos PHD (que corresponden a las subunidades BAF45), dos cromodominios (BAF155 y BAF170), y

entre siete y nueve dominios de unión al DNA que reconocen características arquitectónicas como

pueden ser las estructuras cruciformes del DNA, las secuencias ricas en AT, o bien, características de

reconocimiento HMG (Kadoch & Crabtree, 2015).

Los complejos SWI/SNF y RSC tienen entre sus componentes a diferentes módulos de interacción

proteína-proteína o proteína-DNA, que cooperan para efectuar la actividad remodeladora del

nucleosoma. La subunidad catalítica ATPasa BRG1/BRM contiene a los dominios catalíticos HELIC y

DExx, a cuatro dominios de interacción proteína-proteína; un dominio QLQ, un dominio HSA,

involucrado en la unión a la beta actina y a BAF53a/b (Szerlong et al., 2008), un dominio BRK (función

desconocida) y un bromo dominio, un motivo con un haz de cuatro hélices importante para la unión

de histonas acetiladas (Haynes et al., 1992). A continuación, mencionamos algunas de las funciones

conocidas de las proteínas de los complejos, destacando el tipo de dominios que poseen:

BAF170 y BAF155 son proteínas de andamiaje importantes para el ensamble de muchos

componentes de ambos complejos (Chen & Archer, 2005). Cada una contiene un dominio

CHROMO (CHRomatin Organization MOdifier), constituido por 60 aminoácidos, importante

para la identificación de la cromatina como blanco (Koonin et al., 1995); lo que indica una alta

afinidad por histonas metiladas (Brehm et al., 2004); un dominio SANT que es un motivo de


24

aproximadamente 50 aminoácidos que posiblemente funciona como un módulo que acopla la

unión de colas de histonas con la catálisis, y adicionalmente, un módulo de unión al DNA,

secuencia especifico (Ogata et al., 1994).

BAP180/BAF180 (PBRM1) ortóloga a Polybromo, es importante en la unión de histonas

acetiladas (Kadoch & Crabtree, 2015).

BRD7 y Polybromo (BAF180) contienen bromodominios, encontrados también en ambas

ATPasas y en muchas otras subunidades de los complejos SWI/SNF. Se sugiere que reconocen

histonas acetiladas en lisinas (Singh et al., 2007).

BAF200 y BAF250 son dos proteínas de unión a regiones de DNA ricas en AT para lo cual utilizan

su dominio BRIGHT (Kortschak et al., 2000). BAF200 además poseen dos dominios de dedos

de Zinc C2H2 canónicos importantes en la unión al DNA de manera secuencia dependiente, así

como en interacciones proteína-proteína (Lessard et al., 2007).

BAF45 contiene dos dominios similares (Lessard et al., 2007) que en conjunto conforman un

dominio PHD doble (dedo C4HC3 Zn) (Lessard et al., 2007). Encontrado en otros complejos que

involucran interacciones proteína-proteína (Tang et al., 2010). Además, se sospecha que sus

homeodominios “PLANT” interpretan modificaciones particulares en las histonas (Euskirchen

et al., 2012; Musselman & Kutateladze, 2011).

BAF57 contiene a una región “coiled coil” importante en la homodimerización con la región

“coiled coil” de las subunidades BAF155/BAF170 (Chen & Archer, 2005; Tang et al., 2010).

Figura 8 Predicción de la arquitectura de dominios

en los componentes de los complejos humanos BAF

y PBAF. Las proteínas y los dominios se encuentran

aproximadamente en escala. Los módulos rosas sin

etiqueta indican regiones de baja complejidad.

Tomado de: (Tang et al., 2010).


25

2.2.1.3 Los complejos BAF y el desarrollo

La evidencia acumulada hasta la fecha sugiere que la composición de los complejos SWI/SNF

es altamente variable y depende de los contextos celulares y de la etapa del desarrollo embrionario

(Masliah-Planchon et al., 2014; Mohrmann & Verrijzer, 2005; Wang et al., 1996). Por ejemplo, en

humanos, BAF60, BAF45, BAF53 y BAF250 existen como diferentes isoformas provenientes de

diferentes genes, pero sólo uno de cada uno puede incorporarse en un tejido especifico o a un

complejo remodelador especifico del tipo celular (Euskirchen et al., 2012). BRG1 (SMARCA4) y BRM

(SMARCA2) se coexpresan en la mayoría de los tejidos, con excepción de las células troncales

embrionarias, donde BRG1 (SMARCA4) es la única ATPasa que se expresa (Kadoch, Williams, et al.,

2016; Kadoch, Copeland, et al., 2016) .

Durante el desarrollo del sistema nervioso, los estudios genéticos indican que el intercambio

de subunidades ayuda a dirigir la transición de células pluripotenciales a células multipotenciales y

finalmente, hasta neuronas postmitóticas comprometidas (Yoo & Crabtree, 2009). Complejos

BAF/PBAF especializados, como los encontrados en las células troncales embrionarias, incluyen a

BRG1, BAF155, y BAF60A, pero excluyen a BRM, BAF170, y BAF60C (Ho et al., 2009; Kaeser, Aslanian,

Dong, Yates, & Emerson, 2008). Al perecer se requiere una composición particular para cada estado

celular, y por ello, se les ha llegado a denominar de manera diferente.

En la Figura 9 se ilustra la composición de los complejos BAF en algunos de los tipos celulares

caracterizados hasta ahora. Las unidades análogas de cada complejo se presentan como formas

similares en el mismo color, ocupando posiciones específicas en la ilustración del complejo, como si se

tratara de un rompecabezas. Los dominios que le permiten a las subunidades interactuar con el DNA

se muestran en la superficie de cada proteína, como se explica en el pie de figura. En cada caso, las

subunidades son miembros estables del complejo; en algunos casos se demostró que éstas no son

intercambiables mediante desafíos experimentales con una subunidad sintetizada in vitro. Para las

subunidades marcadas con un signo de interrogación, no es claro cuál miembro de la familia está

presente en dicha posición. Las subunidades variables que distinguen a los complejos mostrados se

encuentran destacadas con negritas.


26

Figura 9 El ensamble combinatorial de los complejos remodeladores de la cromatina BAF (Brahma-associated factor)

produce especificidad biológica. Tomado de (Ho & Crabtree, 2010) BAF200, también conocida como ARID1A; BAF250,

también conocida como ARID2; BRD, proteína que contiene bromodominio; HDAC, desacetilaza de histonas; MBD, dominio

de unión a metil-CpG; PHD homeodiminio plant; RbBP, proteína de unión a retinoblastoma.

Al complejo BAF en las células troncales embrionarias (ESC) se le llamó esBAF; en los

progenitores neurales, npBAF, y en las neuronas, nBAF. En los progenitores cardiacos, la composición

del complejo BAF también es distinta pero no se ha caracterizado por análisis proteómico, a diferencia

del resto de los complejos ilustrados en la Figura 9. En los tipos celulares respectivos se demostró

experimentalmente que se trata de intermediarios de procesos específicos (los cuales se mencionan

debajo de cada complejo) que no pueden llevarse a cabo por medio de complejos con una composición

diferente. En algunos casos, se muestran factores de transcripción clave que trabajan en cooperación

con los complejos BAF (como son OCT4 y SOX2 en las ESC, CREST en las neuronas, y GATA4 y TBX5 en

los progenitores cardiacos).

Las funciones que desempeñan las proteínas que constituyen estos complejos durante el

desarrollo, se analizaron por separado mediante numerosas técnicas y modelos como Drosophila

melanogaster, ratón y en las células troncales embrionarias, entre otros (Ho & Crabtree, 2010; J. I. Wu,

2012; Yoo & Crabtree, 2009). Interesantemente, la localización de los complejos BAF/PBAF en el


27

genoma coincide con la de los principales factores que determinan el destino celular (Alver et al.,

2017). Se reportó que los complejos BAF tejido-específicos interaccionan con una variedad de factores

de transcripción en diferentes tipos celulares, permitiéndoles así tomar funciones contexto-

dependientes generadas por sus diferentes compañeros de interacción (Clapier & Cairns, 2009).

Estos complejos son cruciales para el desarrollo adecuado de los organismos donde fueron

estudiados. Tal es el caso del mantenimiento de la capacidad de autorenovación y de la

pluripotencialidad en las células troncales embrionarias de ratón (Ho et al., 2009). En este caso, la

deleción de BAF47 o BAF155 en el complejo esBAF es letal para el embrión antes de la implantación

(Lessard et al., 2007). Pero también son esenciales para la expresión de fenotipos diferenciados a

través de un cambio de subunidades que les permite interactuar con otros factores de transcripción

como ocurre durante el desarrollo neural (Kadoch et al., 2013; Yoo & Crabtree, 2009).

Se sabe que BRM está involucrada en la activación del genoma del zigoto (Bultman et al.,

2000), mientras que durante el crecimiento del blastocisto y su implantación, así como en la activación

de las células troncales embrionarias, BRG1, BAF155 y BAF47, tienen una función fundamental

(Bultman et al., 2000; Bultman et al., 2006; Kim et al., 2001; Klochendler-yeivin et al., 2000). Por otra

parte, mientras que para la gametogénesis y la fertilidad en individuos adultos se requiere de las

subunidades BRM, MOR y BAP60 en Drosophila melanogaster (Hansis et al., 2004; Ho & Crabtree,

2010); para la neurulación y el desarrollo del sistema nervioso central se necesitan BRG1, BAF53A,

BAF45A y BAF53B (Lessard et al., 2007; Yoo & Crabtree, 2009). En contraste, durante el desarrollo del

tubo cardíaco participan Polybromo, BAF60C y BAF45C (Singh & Archer, 2014); para la diferenciación

muscular se requiere de BRG1 (Lange et al., 2008), y de BRG1 y BAF57 para la diferenciación de

timocitos (Wurster & Pazin, 2012).

Además, el análisis de Brg1 demostró que esta enzima desempeña funciones tejido-específicas

en el desarrollo neuronal, retinal y del cristalino. Por ejemplo, estudios sobre la participación del gen

Young durante la diferenciación terminal de la retina del pez cebra, mostraron que Brg1 actúa rio abajo

de Shh y Ath5, induciendo la salida del ciclo celular y el inicio de la diferenciación (Leung etal., 2008).

Asimismo, se encontró que Brg1 es importante para el mantenimiento de las células troncales neurales

y de las células progenitoras en el ratón, además de participar en la regulación de componentes de la

cascada de señalización dependiente de Shh y Notch (Yoo & Crabtree, 2009).

En el cristalino, Brg1 promueve la diferenciación terminal y la enucleación (cariolisis) de las

fibras del cristalino (He et al., 2010). Se demostró que en cristalinos transgénicos la expresión de


28

dominantes negativas de Brg1 en las fibras postmitóticas evitan su diferenciación terminal. De manera

similar, se conocen varios defectos posteriores a la inactivación condicional de Brg1 en el ectodermo

superficial que da origen al cristalino y al epitelio corneal. En ambos modelos, los núcleos celulares de

las fibras del cristalino no se degradaron y la zona libre de organelos (OFZ) estaba ausente con la

consecuente pérdida de transparencia del mismo (He et al., 2010).

2.2.2 Las monometiltransferasas de histonas

Como se mencionó anteriormente, la unidad básica de la organización de la cromatina está

compuesta por proteínas envueltas por aproximadamente 147 pb de DNA dependiendo de la especie,

para formar un nucleosoma. En los nucleosomas se empaqueta una enorme cantidad de información

genética a pesar del diminuto espacio; sin embargo, la cromatina tiene suficiente fluidez para

remodelarse y conseguir la expresión o represión de distintos genes en respuesta a varios estímulos y

gracias a los distintos mecanismos epigenéticos. Entre estos, además de los complejos remodeladores,

se encuentran las modificaciones covalentes (metilación, acetilación, fosforilación, sumoilación,

ubiquitinación, etc.) de las histonas en aminoácidos localizados en posiciones específicas (Allis &

Jenuwein, 2016). Estas “etiquetas” permiten controlar la expresión genética gracias a un sistema de

enzimas que marcan a las histonas (“escritoras”), a otras que distinguen dichas marcas (“lectoras”), y

a otras que se encargan de eliminarlas de manera específica (“borradores”) (Hughes et al., 2013). Por

ejemplo, la metilación de histonas ocurre en los residuos de lisina, ya sea como mono, di o

trimetilaciones, como en el caso de la lisina nueve de la histona tres (H3K9me1, H3K9me2, y

H3K9me3); generando una marca asociada funcionalmente con la supresión de la expresión genética

y la conformación cerrada de la cromatina (heterocromatina) (Allis & Jenuwein, 2016). Como estas

existen más marcas especificas a las que se les atribuyen funciones de activación transcripcional (p.

ej., H3K4me), entre otras (Allis & Jenuwein, 2016). A continuación, se describen a detalle dos proteínas

involucradas en el marcaje o etiquetado de histonas.

2.2.2.1 La familia de proteínas PRDM

Prdm3 y Prdm16 son metiltransferasas que actúan sobre residuos de lisina (lisina-metil

transferasas, KMT). En particular, estas enzimas llevan a cabo en el citoplasma la metilación específica

de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me1), que sirve como base para generar su trimetilación asociada

a la estructura de la heterocromatina constitutiva (Pinheiro et al., 2012). Estas proteínas son parte de

la familia Prdm, que está definida con base en la presencia de un dominio N-terminal conservado; PR.

Este dominio se identificó originalmente como un motivo compartido por dos proteínas: PRDI-BFI


29

(positive regulatory domain I-binding factor 1), comúnmente llamada Prdm1 (PR domain containing

1); y RIZ1 (retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene 1), ahora conocida como Prdm2 (Buyse

et al., 1995). A este dominio se le denominó PR por ser ortólogo a PRDI-BF1-RIZ1 (Herz et al., 2013) Los

dominios PR se relacionan con los dominios catalíticos SET (nombrados por los factores de Drosophila:

Suppressor of variegation 3-9, Enhancer of zeste y Trithorax), un módulo metiltransferasa que media

la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil-metionina al grupo ε-amino de la cadena lateral

de una lisina, y que define a un amplio grupo de metiltransferasas de histonas (HMT) (Huang et al.,

1998; Schneider et al., 2002; Sun et al., 2008; Wu et al., 2010). En todas, a excepción de Prdm11, el

dominio PR está seguido por arreglos repetidos de dedos de zinc que median la unión secuencia-

específica con el DNA, así como interacciones proteína-proteína (Hohenauer & Moore, 2012) (Figura

10).

Figura 10 Estructura y relaciones de los dominios de la familia de proteínas Prdm. (A) Se ilustra la estructura de los dominios

en cada miembro de la familia Prdm humana junto con las relaciones entre sus dominios “Positive regulatory” PR. Solamente

se muestra la isoforma más larga. Las líneas naranjas destacan los PR conservados en C. elegans y Drosophila. Las

características de las proteínas marcadas con asteriscos se derivan de UniProt. (B) Ejemplo de conservación de la estructura

de una Prdm entre especies. Se muestran los ortólogos Prdm3 de ratón, Hamlet de Drosophila y EGL-43 de C. elegans. Los

dedos de zinc con secuencia similar entre los ortólogos se muestran del mismo color, también se muestran las posiciones y

secuencias de los sitios de unión a CtBP compartidos. AWS, asociado con el dominio SET; CtBP, C-terminal Binding Protein;

KRAB, Krüppel-Associated Box; Rb, retinoblastoma; SSX, sarcoma sinovial X. Figura tomada de (Hohenauer & Moore, 2012)


30

La familia de proteínas PRDM está formada por 16 (en roedores) o 17 (en primates) miembros,

que funcionan como coreguladores de la transcripción durante la diferenciación, participando en una

amplia variedad de procesos durante el desarrollo, la proliferación y la señalización celular. Las

proteínas PRDM se expresan tanto en tejidos embrionarios/fetales como en adultos. Los genes que las

codifican se dividen en 5 subfamilias principales con base en su secuencia, en la estructura proteica y

en el número de repetidos de Zinc similares entre ellas. De esta manera, Prdm 2, 3 y 16 constituyen

una subfamilia (Ding et al., 2013; Hohenauer & Moore, 2012; Warner et al., 2014).

Algunas proteínas de la familia PRDM muestran actividad intrínseca de HMT; sin embargo, la

mayoría carece de esta función y por ello reclutan a enzimas modificadoras de histonas para mediar

su función. Así también, se asocian con desacetilasas de histonas (HDAC) para promover la represión

transcripcional, o bien, con histona acetiltransferasas (HAT) para la activación transcripcional (Allis &

Jenuwein, 2016). En algunos casos, el reclutamiento ocurre a través de los dedos de zinc; en otros, es

a través de dominios adicionales como los dominios ricos en prolina reportados para Prdm1, Prdm3,

Prdm6 y Prdm16. Dichos dedos de zinc pueden utilizarse para unirse directamente al DNA y en el caso

de algunas proteínas de la familia (como ocurre con Prdm1, Prdm3, Prdm5, Prdm9, Prdm14 y Prdm16),

para que la unión se lleve a cabo de manera específica de secuencia. Las proteínas PRDM también

reclutan co-represores que sucesivamente se asocian con enzimas modificadoras de histonas; por

ejemplo, Prdm2, Prdm3, Prdm16 y Hamlet se unen a CtBP (C-terminal binding protein) a través de

sitios canónicos PLDLS de unión a CtBP. Finalmente, cabe mencionar que el mismo factor Prdm puede

regular grupos divergentes de blancos en diferentes tipos celulares. Por lo tanto, la selección del blanco

de Prdm está bajo un control contexto-dependiente (Hohenauer & Moore, 2012).

2.2.2.2 H3K9me1: Prdm3/Evi1 y Prdm16

Originalmente, Prdm3 y Prdm16 se identificaron debido a que su desregulación causa

malignidades mieloides (Morishita, 2007). Ambas proteínas son ortólogos de Hamlet en Drosophila

(Herz et al., 2013). Prdm3 y Prdm16 son KMT esenciales para la formación de la heterocromatina, ya

que catalizan la metilación de la lisina 9 en la histona H3 (H3K9me1). Dicha marca sirve como base para

que esta posición sea trimetilada por la enzima Suv39h, generando un marcaje (H3K9me3) que es de

suma importancia para el mantenimiento de la heterocromatina constitutiva, implicada a su vez en la

organización tridimensional de la cromatina y la estructura de la lámina nuclear (Pinheiro et al., 2012).

Ambas metiltransferasas participan en el desarrollo. Como ejemplo, se describió que

intervienen en la formación del esqueleto craneofacial del pez cebra, lo que se demuestra al eliminar


31

a los genes Prdm3 o Prdm16, lo que reduce la expresión de los factores de transcripción dlx2a y barx1,

que son característicos de la cresta neural y genera defectos en el viscerocranium (o esqueleto facial)

y el neurocranium (bóveda craneal y base del cráneo) estudiados en pez cebra y defectos identificados

río abajo de la vía de señalización de shh (Ding et al., 2013). Asimismo, en ratones, la mutación de

Prdm16 causa anormalidades del desarrollo, que incluyen una mandíbula hipoplásica y el paladar

hendido (Bjork, Fujiwara, et al., 2010; Bjork et al., 2010; Horn et al., 2011). Debido a éstas y otras

evidencias, sabemos que las funciones de ambas proteínas se sobrelapan parcialmente, al igual que su

expresión durante el desarrollo de diversos tejidos, como el cerebro, los arcos faríngeos y las aletas

pectorales en el pez cebra. No obstante, al mismo tiempo Prdm3 y Prdm16 poseen funciones

independientes subordinadas al contexto (Ding et al., 2013).

2.2.2.3 Prdm3

El gen Prdm3/MDS1 (myelodysplasia síndrome 1) / EVI1-1 (ecotropic viral integration site 1) se

identificó inicialmente como un locus común para la integración retroviral en los tumores mieloides

de ratones AKXD. Estudios subsecuentes revelaron que dicho gen codifica un factor de transcripción

con dos dominios de dedos de zinc, que mapea en el locus 3q26n del cromosoma humano 3, y que

tiende a estar activado transcripcionalmente en leucemias mieloides humanas y en síndromes

mielodisplásicos debido a translocaciones e inversiones que involucran a dicho locus (Hirai, 1999).

Prdm3 posee dos dominios de dedos de zinc múltiples separados, con diferentes

especificidades de unión al DNA. Los dedos de zinc N-terminales se unen predominantemente a

motivos parecidos al factor de transcripción GATA; y los dedos de zinc C-terminales se unen a una

secuencia parecida a ETS. Cuando Prdm3 se une a secuencias parecidas a ETS, se encuentra cerca de

sitios de inicio de la transcripción (TSS), mientras que cuando se une a motivos parecidos a GATA,

tiende a localizarse más lejos de los TSS. De manera interesante, Prdm3 se une a cualquiera de estos

motivos, pero no interacciona de manera simultánea con ambos, ya que en contextos distintos se

genera una competencia entre los promotores (Hohenauer & Moore, 2012).

Evi-1 tiene la habilidad de reprimir la señalización de TGFβ con base en el primer dominio de

dedos de zinc, y potenciando la actividad de AP-1 a través del segundo dominio de dedos de zinc. El

primer dominio contribuye a reprimir la señalización que inhibe la proliferación celular al interactuar

físicamente con Smad3 (un mediador intercelular de la señalización por TGFβ) y por lo tanto

inactivando a esta proteína. Por otra parte, el segundo dominio de dedos de zinc promueve la


32

proliferación celular a través del promotor de c-fos. La expresión constitutiva de Evi-1 conduce a la

transformación maligna (Morishita, 2007). (Figura 11).

Figura 11 Funciones biológicas y bioquímicas de Evi-1/Prdm3. Figura tomada de (Hirai, 1999)

Actualmente se sabe que Evi1 interacciona con diversos genes blanco como GATA-2,

GADD45G, FOG2, SKI1 (SNON), KLF5 (BTEB2), DCN, y MAP3K14 (NIK). También se reportó que

interactúa con muchas otras proteínas, incluyendo a BRG1, CBP/p300, Dnmt3a/b, JNK, CTBP2, HDAC1,

HDAC4, RUNX1, UXT, MBD3, P/CAF, CTBP1, SMAD1/2, SMAD3, SUV39H1, complejos polycomb y GATA-

1 (Fog et al., 2011; Matsugi et al., 1990; Morishita, 2007). Morishita (2007) y por otra parte Fog y

colaboradores (2011), describieron que CBP y PCAF funcionan como coactivadores transcripcionales,

CTBP1 y CTBP2 funcionan como corepresores, y HDAC1 y HDAC4 funcionan como histona desacetilasas

para reprimir la transcripción (Fog et al., 2011; Morishita, 2007).

2.2.2.4 Prdm16

Prdm16 se identificó originalmente en estudios de síndromes mielodisplásicos, ya que una

translocación [t(1;3)(p36;q21)] coloca a Prdm16 bajo el control del gen constitutivo de la riboforina 1

(RPN1), generando la expresión ectópica de la isoforma de Prdm16 que carece del dominio PR,

causando leucemia mieloide (Chuikov et al., 2010; Morishita, 2007; Warner et al., 2014). Más

recientemente se demostró que este gen es crítico para la función de las células troncales

hematopoyéticas, al regular la renovación celular, la diferenciación y la apoptosis, aunque existe la

posibilidad de que el mantenimiento de la población de células troncales sea una función general de

Prdm16 (Chuikov et al., 2010).


33

Prdm16 presenta una homología cercana al 64% en su secuencia de nucleótidos y del 63% en

su estructura primaria con Prdm3, por lo cual se conoce también como MDS1/EVI1-like. Contiene 10

motivos de dedos de zinc, separados en dos clusters (7 dedos en uno y 3 en otro), y un dominio de

unión a CtBP. La molécula completa tiene 1275 aminoácidos de longitud, con una masa molecular

aproximada de 170 kDa. En la Figura 12 se ilustra también una variante de splicing con un dominio PR

más corto (Warner et al., 2014).

Figura 12 Estructura de PRDM16 (Warner et al., 2014)

Prdm16 posee diferentes actividades, algunas de las cuales están bien caracterizadas y se

relacionan con procesos de diferenciación, incluyendo la promoción de la diferenciación del tejido

adiposo pardo (BAT), a través de su interacción con los coactivadores transcripcionales PGC1α y

PGC1β, a la vez que simultáneamente reprime la formación del tejido adiposo blanco (WAT) al inhibir

la expresión de los genes específicos de este proceso, mediante su interacción con CtBP 1 y 2 (Warner

et al., 2014). Por otra parte, en el tejido hematopoyético y en el sistema nervioso, la deficiencia de

Prdm16 conduce a cambios en los niveles de especies reactivas de oxigeno (ROS) (Chuikov et al., 2010),

a la pérdida de las células troncales (Fog et al., 2011) y a un aumento en la muerte celular debido a

una distribución alterada del ciclo celular (Chuikov et al., 2010).

2.3 La vía de NOTCH

Actualmente se sabe que la señalización dependiente de NOTCH está involucrada tanto en el

desarrollo como en la renovación de tejidos. Considerando que NOTCH es importante en el

establecimiento de linajes celulares, así como en la proliferación, la apoptosis, la diferenciación y la

migración celular, y que estos procesos dependen de la estructura de la cromatina y de su

remodelación durante el desarrollo, existe un gran interés en establecer la relación que guardan los

procesos epigenéticos con esta ruta de señalización (revisado por Schwanbeck, 2015).

La familia de los receptores transmembranales de NOTCH es parte de una red de comunicación

célula-célula conservada evolutivamente. Se considera que esta ruta de señalización es uno de los

mecanismos involucrados en la determinación del destino celular, así como en la ejecución de

programas de diferenciación, en el control de la proliferación y del carácter troncal (Artavanis-


34

Tsakonas & Muskavitch, 2010; Fiuza & Arias, 2007; Rangarajan et al., 2001). Sin embargo, sus

interacciones dependen del contexto celular, y las consecuencias de su activación varían de un modelo

a otro (Liu et al., 2010). En mamíferos, existen cuatro receptores Notch (Notch1-4) y cinco ligandos:

tres ortólogos de Delta (Delta-like-1, -3 y -4) y dos de Serrated denominados Jagged-1 y Jagged-2. De

manera posterior al contacto entre una célula emisora y otra receptora, se presenta la Proteólisis

Intramembranal Regulada (RIP), que inicia un proceso de 3 cortes sucesivos que culmina en la

liberación del dominio intracelular de Notch (NICD). Éste se trasloca al núcleo donde desplaza a

moléculas co-represoras para formar un complejo activador de la transcripción junto con la proteína

CSL (CBF1 o RBPjκ en mamíferos, Suppressor of hairless en Drosophila y LAG-1 en Caenorhabditis

elegans) (Figura 13) (Bray, 2006; Fiuza & Arias, 2007; Gomperts et al., 2009; Gordon et al., 2008; Radtke

& Raj, 2003).


35

A continuación, se muestra un esquema de la activación de la vía de Notch:

Figura 13 Vía metabólica de NOTCH. Tomada de CST Signaling Pathway Diagrams for Development and Differentiation,

©2006–2015 Cell Signaling Technology, Inc.


36


37

3 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN.

A nivel mundial, alrededor de 12.7 millones de personas esperan un trasplante de córnea debido

que sufrieron la pérdida irreversible de su transparencia. Este padecimiento puede estar asociado a

un trauma o lesión que deja cicatrices, o deberse a infecciones como la queratitis herpética (Verdiguel-

sotelo et al., 2016), a condiciones hereditarias como la distrofia de Fuchs (CENATRA, 2016; Kim et al.,

2017; Verdiguel-sotelo et al., 2016) y ocasionalmente, puede ser consecuencia de una cirugía ocular

(Garralda et al., 2006). Debido a la escasez de donadores de tejidos, únicamente se satisface el

requerimiento de corneas para una de cada 70 personas. Por este motivo, el daño corneal es la tercera

causa de ceguera a nivel mundial después de las cataratas y el glaucoma. En promedio, 10 millones de

personas padecen ceguera corneal bilateral (Gain et al., 2016). En el caso de México, para el período

comprendido entre 1963 y diciembre de 2014 se trasplantaron 49,893 pacientes, donde en promedio,

extrapolado hasta los primeros semestres de 2016 y 2017, cerca de 1800 pacientes por año son

trasplantados con córneas provenientes de cadáver (CENATRA, 2016). Cabe señalar que, en nuestro

país el queratocono es la causa predominante del trasplante de córnea (Gain et al., 2016).

Para el desarrollo de alternativas terapéuticas, enfocadas en la reparación de la superficie ocular

o generar dispositivos que sustituyan a los tejidos provenientes de donadores, es indispensable la

comprensión de los procesos que dan lugar a la formación y reparación de un epitelio especializado

como el que recubre la córnea, además de adquirir la capacidad de regular los procesos de

diferenciación, migración, y proliferación epitelial. Por ello, se han desarrollado sistemas in vitro que

utilizan a las células epiteliales como modelo experimental, entre los que destacan los queratinocitos

de epidermis humana o de ratón (Hennings et al., 1980; Rheinwald & Green, 1975), y las células de

epitelio corneal del mamífero (revisado por Castro-Muñozledo, 2008). En particular, el control de la

proliferación y diferenciación del epitelio corneal de mamífero posee características distintivas que

hacen a este tejido un modelo relevante; entre éstas destacan: i) el que cada célula basal individual

está sometida a una demanda excepcionalmente alta de poder regenerativo, ya que el epitelio yace

sobre un estroma extremadamente plano, sin interdigitaciones, a diferencia de otros epitelios

estratificados. ii) Al estar completamente expuesto, el epitelio corneal es muy susceptible al daño por

agentes ambientales, por lo que requiere una alta capacidad de regeneración. iii) Dado que es un

epitelio no pigmentado, todas sus células basales están expuestas al efecto de la energía solar y de las

fuentes de radiación, lo que las hace susceptibles a sufrir mutaciones que alteren su funcionalidad y

regulación. iv) Paradójicamente, a pesar de su localización desprotegida, los carcinomas corneales son


38

poco frecuentes. v) gracias a marcadores moleculares, se postula al limbus como el nicho putativo

único para la localización de las células troncales del epitelio corneal (Cotsarelis et al., 1989; Keivyon

& Tseng, 1989; Schermer et al., 1986; Sun & Lavker, 2004; R. L. Wu et al., 1994). Finalmente, vi) debido

a que la estructura corneal se establece bajo condiciones que sólo se presentan durante el desarrollo

embrionario, el daño corneal en etapas postnatales implica, en gran cantidad de casos, cambios en la

organización estructural del tejido, lo que lleva a la pérdida de transparencia de la córnea y, por lo

tanto, a la pérdida de la capacidad visual del paciente (p. ej., quemaduras, procesos ulcerativos

asociados a infecciones virales como Herpes, etc.).

En nuestro laboratorio, se estableció una línea celular inmortal que replica in vitro el proceso de

diferenciación del epitelio corneal (Castro-Muñozledo, 1994). En este modelo, se buscaron marcadores

moleculares que permitieran monitorear los cambios tempranos del proceso de diferenciación,

anteriores a la expresión del fenotipo terminal, caracterizado por la expresión de las citoqueratinas K3

y K12 (Schermer et al., 1986; R. L. Wu et al., 1994). Estos estudios permitieron establecer que las

enzimas Lactato deshidrogenasa (LDH) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), normalmente

consideradas como enzimas “housekeeping”, anteceden por un día la expresión de las citoqueratinas

características del epitelio corneal (Garcia-Villegas et al., 2009; Hernández-Quintero, García-Villegas,

& Castro-Muñozledo, 2002). Además, de acuerdo con hallazgos de nuestro grupo y a estudios de otros

grupos de investigación, se concluyó que el factor de transcripción Pax6 controla la expresión del

programa de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009; Kitazawa, Hikichi, Nakamura, & Sotozono,

2017; Sasamoto et al., 2016a), mientras que factores de transcripción como Sp1 y AP2 controlan la

expresión de las citoqueratinas específicas del tejido (Chen et al., 1997), y posiblemente participan en

la regulación tejido-específica (Adhikary et al., 2005; Banks et al., 1999; Gingras et al., 2003). Estas y

otras evidencias permitieron concluir que la diferenciación del epitelio corneal depende de una

compleja red de factores de transcripción entre los que destacan ∆Np63α (Di Iorio et al., 2005;

Robertson et al., 2009), AP1 (Adhikary et al., 2005; Adhikary et al., 2004), KLF6 (Chiambaretta et al.,

2002; Nakamura, Chiambaretta, Sugar, Sapin, & Yue, 2004), ESE-1 y los factores que responden a la

cascada de señalización de Wnt3a, Wnt6, y Wnt9b (Fokina & Frolova, 2006). Todos éstos regulan parte

del proceso de diferenciación corneal durante el desarrollo embrionario (Fokina & Frolova, 2006;

Nakamura et al., 2004) y en el adulto (Nakamura et al., 2004); siendo importantes para la expresión

correcta del fenotipo terminal (Adhikary et al., 2005; Adhikary et al., 2004).


39

Al revisar el conocimiento sobre esta intrincada red de regulación genética, que enfatiza la

participación de los factores de transcripción ∆Np63α y PAX6 (Di Iorio et al., 2005; Sasamoto et al.,

2016b; Simpson & Price, 2002), observamos que cada vez se estudia con mayor frecuencia la

participación de los mecanismos epigenéticos en los programas de diferenciación de diversos tejidos,

en particular, las modificaciones covalentes de histonas y sus enzimas asociadas. Aún más, se hace

evidente al remodelado de la cromatina como un proceso necesario para la progresión de la

diferenciación; ya que al determinar la estructura tridimensional de la cromatina también se afecta la

disponibilidad transcripcional del genoma. La evidencia sugiere que para lograr la expresión

coordinada de numerosos genes localizados en diferentes cromosomas y regiones cromosómicas, se

requieren complejos remodeladores de la cromatina como los complejos BAF, que pueden

relacionarse con distintos factores de transcripción y cuya actividad depende de su configuración

combinatorial (Ho & Crabtree, 2010), para culminar en la expresión del fenotipo terminal.

Hasta ahora, en células epiteliales la configuración temporal de los complejos remodeladores de

cromatina y la actividad de los mecanismos de modificación covalente de la cromatina no se han

descrito. Tomando en cuenta que ∆Np63α y PAX6 son indispensables para dirigir la diferenciación

adecuada del epitelio corneal (Di Iorio et al., 2005; Sasamoto et al., 2016b; Simpson & Price, 2002), y

que existen numerosos reportes sobre su interacción directa con proteínas de los complejos BAF y con

las metiltransferasas de histonas Prdm16 y Prm3, procesos promovidos en parte a través de la

estimulación de la vía de señalización dependiente de Notch (Bi et al., 2014; Endo et al., 2012; Kinameri

et al., 2008); en este trabajo nos propusimos iniciar el análisis de la participación de los complejos

remodeladores de la cromatina y de las metiltransferasas de histonas en la diferenciación de las células

RCE1(5T5) de epitelio corneal de conejo.

Existen reportes que sugieren que la expresión de Brg1 es regulada por p63 (Mardaryev et al.,

2014), y que ambas moléculas participan en el mantenimiento de la capacidad proliferativa de las

células progenitoras de la epidermis (Mardaryev et al., 2014). Más aún, p63 y el complejo BAF

refuerzan la actividad transcripcional de la cromatina durante la diferenciación de los queratinocitos

de epidermis humana (Bao et al., 2015). Por otra parte, también se describió que Brg1 interacciona

con Pax6, mostrando actividad diferencial dependiente del linaje celular, ya que esta interacción

permite la progresión de la diferenciación del cristalino en mamíferos (Y. Huang et al., 2010), en


40

contraste con su efecto en progenitores neurales de ratón, donde promueve el potencial proliferativo

(Ninkovic et al., 2013).

Adicionalmente, resultados de diferentes laboratorios demuestran que los complejos

remodeladores de cromatina regulan la expresión de ligandos de la vía de NOTCH (Leung et al., 2008),

hecho que conlleva a la generación de fenotipos diferenciados. Por ejemplo, en el órgano sensorial de

Drosophila se ha visto que las mutantes dominantes negativas de BRM carentes de actividad catalítica,

generan fenotipos similares a los obtenidos cuando se interrumpe la señalización de la vía de NOTCH

(Armstrong et al., 2005). Por otra parte, durante el desarrollo de la retina en el pez cebra, la eliminación

de Brg1 aumenta la expresión de genes asociados con la vía de señalización de Notch (Leung et al.,

2008). De manera importante, resultados de nuestro laboratorio sugieren que la expresión del

receptor Notch-1 es predominante durante la etapa proliferativa de las células epiteliales de la córnea,

mientras que Notch-2 es más abundante durante la diferenciación terminal (Mata-Lozano, 2012). En

particular, se demostró que la estimulación de la población celular con ligandos de Notch o con Notch,

promueve la estimulación diferencial de la proliferación o de la diferenciación: mientras Notch-1

soluble aumenta la capacidad proliferativa, la estimulación con Jagged-1 la disminuye, facilitando la

expresión del fenotipo terminal (Mata-Lozano, 2012). Es importante resaltar que esta vía participa en

el control de las PRDM, particularmente Prdm3 y 16. La interacción entre las metiltransferasas de

histonas y la vía de NOTCH parece ser importante durante el desarrollo del sistema nervioso central

de los mamíferos (Kinameri et al., 2008), así como para el desarrollo de las neuronas del receptor

olfatorio en Drosophila (Endo et al., 2012), y para el desarrollo del tejido adiposo pardo en ratón (Bi

et al., 2014). Curiosamente, en Drosophila melanogaster también se reportó la interacción de estas

proteínas con subunidades de los complejos remodeladores BAF, donde Osa (BAF250) induce a Hamlet

(Prdm16/Prdm3) para regular la amplificación transitoria de los progenitores neurales previa a la

expresión del fenotipo terminal (Eroglu et al., 2014a).

Por consiguiente, para conocer los mecanismos que regulan la diferenciación y la reparación de

la superficie ocular, el propósito de este trabajo consiste en iniciar el análisis de la regulación

epigenética de la proliferación y la diferenciación del epitelio corneal de mamífero. Es de nuestro

interés entender la participación de procesos epigenéticos como la remodelación de cromatina y su

modificación covalente sobre el control del programa de diferenciación, y a largo plazo, establecer la

conexión entre estos procesos, la vía de señalización de Notch y la actividad de los factores de


41

transcripción p63 y Pax6; la cual parece ser crucial en el programa de diferenciación. Para este trabajo

utilizaremos a la línea celular inmortal RCE1(5T5), que replica el proceso de diferenciación del epitelio

corneal. Más aún, con base en la evidencia acumulada en nuestro laboratorio (Castro-Muñozledo et

al., 2017; T. Chen et al., 1997; Garcia-Villegas et al., 2009; Gomez-Flores et al., 2010), ha sido posible

distinguir tres etapas distintivas del programa de diferenciación: la primera consiste en una etapa

proliferativa “no diferenciada”; la segunda corresponde al cese de la proliferación ocasionado por la

confluencia en cultivo y el subsecuente inicio del programa de diferenciación, y finalmente, la

expresión del fenotipo terminal. Considerando estos antecedentes nos hemos planteado la siguiente

hipótesis:

4 HIPÓTESIS

Los complejos remodeladores de la cromatina SWI/SNF y las metiltransferasas de histonas

Prdm16 y Prdm3 presentan cambios en su expresión relacionados con el inicio del programa de

diferenciación y con la manifestación del fenotipo terminal. Dichos cambios, tienen una función

relevante como elementos rio arriba del factor de transcripción Pax6, considerado el gen maestro del

programa de diferenciación, a la vez que su actividad es modulada a través de la vía de señalización de

NOTCH.


42


43

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo general

Caracterización de la expresión de los complejos de remodelación de cromatina y proteínas

asociadas durante la diferenciación y proliferación de la línea celular de epitelio corneal de conejo

RCE1(5T5).

5.2 Objetivos particulares

Establecer las cinéticas de expresión de los mensajeros que codifican para las proteínas:

Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200, BAF45a, Brg1, Brahma y Oct4 durante la

proliferación y la diferenciación de la línea celular de epitelio corneal de conejo RCE1(5T5).

Determinar las cinéticas de expresión de los mensajeros que codifican para las

metiltransferasas de histonas Prdm3 y Prdm16, durante la proliferación y la diferenciación de

las células RCE1(5T5).

Analizar los cambios en la expresión de Arid1a y Prdm16 en respuesta a la estimulación con

efectores de la vía de NOTCH.

Analizar mediante western blot, los cambios en los niveles de las proteínas correspondientes.

Analizar la composición del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF por medio de

coinmunoprecipitación con las ATPasas Brg1 y Brahma y western blot en diferentes etapas de

la diferenciación.

Analizar si existen interacciones proteína-proteína entre los complejos y el factor de

transcripción Pax6 durante las diferentes etapas de la diferenciación.


44


45

6 MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Materiales

El suero fetal de bovino, el suero de ternera, el TRIzol™ y la reverso transcriptasa SuperScript™

II, se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). El Taq PCR Core Kit fue de Qiagen (Valencia, CA) y

el Kit Maxima™ SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (2X) fue de Fermentas, Inc (Waltham, MA, USA). Las

pastillas de inhibidores de proteasas COMPLETE™ (No. Cat. 11836753001) fueron de Roche Applied

Science (Penzberg, Alemania). Las Dynabeads® Protein G (No. catálogo 10009D) se adquirieron a

Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA); las Membranas de PVDF de 0.45 µm (Cat. no.

IPVH000010) marca Immobilon-P®, se obtuvieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania); y el Sustrato

quimio luminiscente WesternSure® ECL PREMIUM (No. de producto 926-95000) fue de ©LI-COR

(Lincoln, Nebraska USA). El Tween® 20, el Triton X-100, y la albúmina de suero bovino (BSA) se

compraron a Sigma-Aldrich. Inc (St Louis Mo.). Los anticuerpos utilizados en este proyecto se

enumeran, junto con el proveedor correspondiente, en la Tabla 3. Los ligandos solubles utilizados se

obtuvieron de R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA) (Tabla 4). El resto de los reactivos fue grado

analítico.

Tabla 3 Anticuerpos y condiciones experimentales utilizadas (concentración)

Antígeno Descripción PM

(kDa) Fuente

Concentración WB

Pax6 (Cat. sc-32766)

IgG1 monoclonal de ratón (clona AD2.38), dirigido contra los

aminoácidos 1–206 en el extremo N-terminal de Pax-6 humana

43 Santa Cruz Biotechnology Inc.

1:1000

Prdm16 (Cat. no. PA5-20872)

IgG de conejo, policlonal, dirigido contra un péptido de 17

aminoácidos del carboxilo terminal de la PRDM16 humana. Reactividad

con humano, ratón y rata.

120 - 140

Thermo Fisher Scientific Inc.

1:5000

Prdm3/Evi1 ab (47AT612.84.88) (Cat.

no. MA5-11142)

IgG1 de ratón, monoclonal, dirigido contra una proteína de fusión con

GST que codificaba para el extremo N-terminal de la EVI1 humana.

Reactividad con humano y ratón.

117-139

Thermo Fisher Scientific Inc.

1:100 a 1:2000

Arid1a/BAF250A (D2A8U) (Cat. no.

12354)

IgG de conejo, monoclonal dirigido contra un péptido sintético

correspondiente a los residuos alrededor de la Gly1293 de Arid1a/BAF250a humana.

250 Cell Signaling Technology, Inc.

1:1000


46

Reactividad con humano, ratón, rata y mono.

Brg-1(G-7) (Cat. no. sc-17796)

IgG1 de ratón, monoclonal, dirigido contra los aminoácidos 209-296 mapeados cerca del extremo N-

terminal de la Brg1 humana. Reactividad con humano, ratón y

rata.

220 Santa Cruz Biotechnology Inc.

1:2000

Brm (Cat. no. ab15597)

IgG de conejo, policlonal, dirigido contra la proteína de fusión

BRM/SMARCA2 de ratón derivada de los residuos 48-214 de la

secuencia humana correspondiente. Reactividad con humano, ratón y

rata.

200 Abcam plc. 1:3000

BAF47/ SMARCB1 (D8M1X)

(Cat. no. 91735)

IgG de conejo, monoclonal, dirigido contra un péptido sintético

correspondiente a los residuos alrededor de la Leu120 de la BAF155/SMARCC1 humana.



1:2000

BAF155/SMARCC1 (D7F8S)

(Cat. no. 11956)


correspondiente a los residuos alrededor de la Gly975 de la BAF155/SMARCC1 humana.



1:2000

BAF170/SMARCC2 (D809V)

(Cat. no. 12760)


correspondiente a los residuos alrededor de la Ile818 de la BAF170/SMARCC2 humana.


162, 170

Cell Signaling Technology, Inc.

1:2000

Actina Anticuerpo monoclonal contra actina muscular de conejo

amablemente proporcionado por el Dr. José Manuel Hernández de

nuestro departamento.

41.7 Departamento biología celular,

CINVESTAV

1:3000

Anti-ratón (Cat. no. 31430)

Anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano dirigido

contra IgGs de ratón (H+L)

-- Pierce Biotechnology,

Thermo Scientific

1:4000

Anti-conejo (Cat. no. 65-6120)

Anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano dirigido contra IgGs de conejo (H+L) *

-- Invitrogen Corporation

1:2000


47

Tabla 4 Proteínas recombinantes (ligandos solubles) de la vía de NOTCH utilizados

Nombre Origen No. de catálogo Fuente

rrNotch-1/Fc chimera Rata 1057-TK ©2018 R&D Systems,

Inc. rhNotch-1/Fc chimera Humano 3647-TK

rrJagged-1/Fc chimera Rata 599-JG

rmJagged-2/Fc chimera Ratón 4748-JG

rrDLL1/Fc chimera Rata 3970-DL

rhDLL1/Fc chimera Humano 1818-DL

6.2 Métodos

6.2.1 Cultivo Celular

Las células RCE1 (5T5) se sembraron a una densidad de 2.7 x 103 células/cm2 (Castro-

Muñozledo, 1994) en presencia de 2.2 x 104 células/cm2 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C (4

µg/ml) como células alimentadoras (Rheinwald & Green, 1975, 1977). Los cultivos se suplementaron

con DMEM/F12-Ham (3:1) conteniendo 5% (v/v) de FBS, 5 µg/ml de insulina, 0.4 µg/ml de

hidrocortisona, 2x10-9 M de triiodotironina (L-T3), 1 x10-10 M de toxina del cólera, 24.3 mg/L de adenina

y 10 ng/ml de EGF (Castro-Muñozledo, 1994). Los fibroblastos 3T3 (Todaro & Green, 1963) se

cultivaron como ya se ha descrito (Castro-Muñozledo et al., 1997). Los cultivos se mantuvieron a 36°C

en una atmósfera humidificada de 10% CO2 -90% aire. En todos los experimentos el medio se cambió

cada tercer día. Para los estudios de proliferación y diferenciación en presencia de las formas

recombinantes de Notch o Jagged-1, éstas se añadieron a las concentraciones finales indicadas para

cada experimento. En este último caso, los cultivos se mantuvieron en medio suplementado con 0.5%

(v/v) de FBS, y sin la adición correspondiente de 10 ng/ml EGF.

6.2.2 Tinción con Rodamina B

Este método se basa en la tinción específica de queratinocitos mediante el colorante Rodamina

B (Castro-Muñozledo et al., 1997). Brevemente, una vez que se retiró el medio de cultivo y se lavó con

PBS, las cajas de cultivo se fijaron con formalina al 10% (v/v) en PBS durante 2 horas a 4°C.

Posteriormente, los cultivos se lavaron con agua corriente, y se tiñeron con una solución acuosa de

Rodamina B al 2% (p/v), por 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Enseguida, se removió el

colorante y los cultivos se lavaron con HCl 0.1N para eliminar el exceso del mismo; las cajas se dejaron

secar durante toda la noche. Para la cuantificación del número de células, se extrajo el colorante con

una mezcla 1:1 de NaOH 0.4N y SDS 5% (p/v), incubando 10 minutos a TA. El colorante extraído de las

células epiteliales se recuperó con una pipeta y se determinó su absorbancia a 550nm, empleando


48

como blanco de reactivos cultivos de fibroblastos 3T3 a las densidades indicadas (ver párrafos

anteriores) para eliminar la absorbancia asociada a la tinción inespecífica.

6.2.3 Extracción de RNA Total

El RNA total se extrajo de cultivos de células RCE1 (5T5) a diferentes tiempos como se indica

para cada experimento. Para ello, las células se cultivaron en cajas de 60 mm. Para la extracción, se

retiró el medio y las células se lavaron dos veces con PBS-DEPC frío. Posteriormente las células se

lisaron con TRIzol™ por 5 min a TA. Se añadieron 500 µl de cloroformo por cada mililitro de lisado,

incubando 3 min a TA y se centrifugó a 12,000 rpm por 15 min a 4°C. Se colectó la fase acuosa

resultante y el RNA se precipitó por 10 min mediante la adición de isopropanol a TA. Se volvió a

centrifugar a 12,000 rpm durante 10 min a 4°C, la pastilla se lavó con etanol al 75% (v/v) en H2O DEPC,

y se centrifugó nuevamente a 7500 rpm por 5 min a 4°C. Finalmente la muestra se resuspendió en

agua DEPC para su posterior uso. La integridad del RNA se verificó por la presencia de los RNAs

ribosomales 28s y 18s en un gel de agarosa al 1% (p/v) con 0.5 mg/ml de Bromuro de Etidio (EtBr) a

una concentración final de 1.25 mM. La concentración y pureza del RNA se determinó

espectrofotométricamente registrando la absorbancia a 260 nm y a 280 nm utilizando un

espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.; Waltham, MA.). El RNA se almacenó

a -70°C hasta su uso.

6.2.4 RT-PCR Punto Final

Una alícuota del extracto de RNA total, conteniendo 4 μg de RNA, se sometió a transcripción

reversa con SuperScript™ II Reverse Transcriptase, para obtener cDNA total siguiendo las instrucciones

del fabricante. Para ello, el cDNA se amplificó utilizando el Taq PCR Core Kit. Todas las reacciones de

PCR punto final se llevaron a cabo bajo el mismo programa: [1 min de desnaturalización a 94°C, 1 min

de alineamiento a 55°C y 1 min de extensión a 72°C] 30X y una extensión final a 72°C por 10 min. Como

control endógeno se utilizaron oligonucleótidos para amplificar al mensajero que codifica a la proteína

ribosomal acídica P0 (PR-P0) (Gomez-Flores et al., 2010). Para las reacciones de PCR se utilizó un

termociclador MyCycler™ (Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA). Los productos de PCR se analizaron

por electroforesis en un gel de agarosa al 1% (p/v) conteniendo 0.5 mg/ml de EtBr.


49

6.2.5 RT-PCR Cuantitativa (RT-qPCR)

Se obtuvo cDNA a partir de RNA total aislado de células RCE1 (5T5) cultivadas durante 3-10

días en tres experimentos independientes. La amplificación se hizo mediante RT-qPCR utilizando el kit

MaximaTM SYBR Green/Rox qPCR Master Mix (2X) siguiendo las especificaciones del fabricante. Estos

experimentos se llevaron a cabo en un termociclador StepOne™ system (Applied Biosystems, Life

technologies).

Los oligonucleótidos utilizados se enlistan en la Tabla 5 y las condiciones de amplificación se

muestran en la Figura 14. El punto de adquisición del SYBR Green se fijó al final del paso de extensión

(72°C- 35 s). La curva de especificidad de productos (Melt) se llevó a cabo como un gradiente de 50°C

a 95°C, con una duración de 45 segundos en el primer paso y 5 segundos en cada temperatura

posterior (Mata-Lozano, 2012).

Tabla 5 Secuencia y características de los oligonucleótidos utilizados para RT-qPCR

Gen Secuencia (5’3’) Longitud %GC Tm(°C) Producto

(pb)

Pax6†† Fw: CATCTCCCGAATTCTGCAGGTGTC 24 54.17 63.52

207 Rv: CCCTCGGACAGTAATCTGTCTCGG 24 58.33 64.05

∆Np63α††† Fw: TGACCACCATCTATCAGATTGAGCATTACT 30 40 63.79

77 Rv: ATGTCGAAATTGCTCAGGGATTTTCAGA 28 39.29 63.44

K3† Fw: TCCGTCACAGGCACCAAC 18 61.1 59.89

175 Rv: TGCGTTTGTTGATTTCGTCT 20 40 56.59

Oct4† Fw: GTGGAGGAAGCCGACAACAAT 21 52.38 60.88

171 Rv: GGCGATGTGTCTGATCTGCTG 21 57.14 61.40

Brg1 / SMARCA4*

Fw: ACCCTCAGGACAACATGCAC 20 55.00 60.25 108

Rv: ACCGCATCCCCATTCCTTTC 20 55.00 60.40

Figura 14 Esquematización de las condiciones de amplificación utilizadas en los protocolos de RT-qPCR.


50

Brm / SMARCA2*

Fw: AAGTGACGCACACGGAAAC 19 52.63 58.99 149

Rv: CTCCTCCTCGTAATCGGAATCA 22 50.00 59.11

Arid1a† Fw: GGGATTTCCAGCAGCCAAGG 20 60 58.9

150 Rv: GAGTGGTCCTGAGCGAGAT 20 60 58.7

Arid1b* Fw: CGTTCTCAGATGTGGGTGATT 21 47.62 58.02

126 Rv: GGTCCTTGTTGGGCTCATAG 20 55.00 57.96

Arid2* Fw: AGTTCATACCCACCAGCAGC 20 55.00 60.04

137 Rv: CCACAGCAAGGCTAACAGGA 20 55.00 59.96

BAF45a/PHD10*

Fw: GAAGGGTAAGGAGTCCAACAAG 22 50.00 58.32 99

Rv: GTGCTCATATCCAGGCAAGAA 21 47.62 58.08

Prdm3* Fw: TTTCACGGACCCTAGCA 17 52.94 54.74

105 Rv: CCTGACGAAGTGGCAAAT 18 50.00 55.25

Prdm16† Fw: TGGCTCAAGTACATCCGTGT 20 50 56.2

64 Rv: TGATCTGACACATGGTGAGG 20 50 54.2

CTBP2* Fw: TCAAGGAGGGCAGGATACGA 20 55.00 60.03

94 Rv: AGGTTCGGGGCATCTTTCAG 20 55.00 60.04

PR-P0‡ Fw: GCAGGTGTTTGACAATGGCAGC 22 54.5 59.7

231 Rv: GCCTTGACCTTTTCAGCAAGTGG 23 52.2 58.9

*Diseñados para este trabajo; †Diseñados previamente en nuestro laboratorio; ‡(García-Villegas et al., 2007); ††(Garcia-Villegas et al., 2009); †††(Castro-Muñozledo et al., 2017).

El diseño de los oligonucleótidos para este trabajo siguió las siguientes pautas recomendadas para el

sistema:

Longitud óptima: aproximadamente 18-22 bp

Temperatura de fusión (Tm): dentro del rango de 52-60°C

Contenido de GC: 40-60%

Verificación de la presencia de bases G y C en las últimas 5 bases de los extremos 3’ de los

oligonucleótidos, evitando más de 3 G o C’s en el extremo 3’, con el propósito de promover la

unión específica de los oligonucleótidos a sus secuencias blanco.

Evitar secuencias de dinucleótidos repetidas. El máximo aceptable fue de 4 dinucleótidos

Evitar secuencias de bases repetidas (más de 4)

Evitar secuencias del molde que formen estructuras secundarias durante la reacción de PCR

Longitud del amplicón: entre 70 y 150 bp

Temperatura de alineamiento similar

El diseño se realizó con las herramientas Primer-BLAST© de NCBI y PrimerQuest Tool© de

Integrated DNA Technologies, Inc. Primero, se realizaron alineamientos de las variantes de RNAm de

los genes/proteínas de interés del conejo a partir de la base de datos de NCBI. Puesto que el genoma


51

del conejo no está completamente anotado, si la secuencia para conejo aparecía como “predicha”

también se incluían las secuencias de humano, rata, y ratón. Los alineamientos se realizaron con la

herramienta Clustal Omega© del EMBL-EBI. Posteriormente, se identificaron los segmentos

conservados de las secuencias, se colocaron en el software de diseño de los oligonucleótidos y se

ajustaron los parámetros correspondientes para obtener de 10 a 30 pares de oligonucleótidos. Estos

se evaluaron con las herramientas OligoAnalyzer 3.1© de Integrated DNA Technologies y Primer-

BLAST© del NCBI para establecer la especificidad de la unión y por lo tanto favorecer la posibilidad de

amplificación de un solo producto para la especie de interés; asimismo se evaluó su capacidad para la

formación de homodímeros, heterodímeros y horquillas. Después, se eligió el par más adecuado y se

adquirieron mediante el sistema de adquisición de oligonucleótidos personalizados de Sigma-Aldrich

©Merck KGaA. Una vez en el laboratorio se resuspendieron según las instrucciones del proveedor, se

probaron en el sistema verificando la amplificación única del material previsto con el software del

sistema (StepOne™ versión 2.3 de Life Technologies Corp.) y un gel de agarosa al 3% p/v en

amortiguador TBE con 0.5 mg/ml de EtBr como se muestra en la Figura 15.

Figura 15 Productos de amplificación de RT-qPCR de los oligonucleótidos diseñados. (1) Brg1/ SMARCA4; (2) Brm/ SMARCA2;

(3) Arid1b/BAF250b; (4) Arid2/BAF200; (5) BAF45a/PHD10; (6) Prdm3/Evi1; (7) CTBP2; (8) PRP0. Productos de amplificación

RT-qPCR en gel de agarosa al 2% (p/v) en TBE 1x, marcador de peso molecular MassRuler™ DNA Ladder Mix, ready-to-use,

©Thermo Fisher Scientific Inc.

Los datos obtenidos para la Ct de cada amplicón de interés se evaluaron según los métodos

del equipo StepOne™ versión 2.3 de Life Technologies con la metodología de 2-∆∆Ct utilizando como

referencia interna al gen constitutivo PR-P0 (según los métodos estándar de laboratorio; (Garcia-


52

Villegas et al., 2009). Además de la referencia correspondiente según el experimento, para establecer

las cinéticas de expresión se utilizó la expresión basal correspondiente de cada gen (valor al día 3 de

cultivo) según lo descrito en la Sección 8.1 y para los tratamientos con proteínas recombinantes se

utilizó la condición de medio basal, detallada posteriormente (ver Sección 8.4.2).

6.2.6 Extracción de proteínas totales

Se removió el medio de las cajas de cultivo y se lavaron dos veces con PBS frío. A continuación,

se les agregó el volumen suficiente de amortiguador RIPA (1ml por caja de 60 mm) que contenía coctel

inhibidor de proteasas cOmplete™ (No. Cat. 11836753001; Roche Applied Science, Alemania);

posteriormente se incubaron en frío durante 20 min para después raspar con gendarme y pasar a un

tubo Eppendorf de 1.5 ml. A continuación, se sonicó en hielo mediante 3 pulsos de 10 segundos (30

segundos totales), a una potencia de 30W. El sonicado se centrifugo 15 min a ~ 14 000 xg para hacer

una pastilla con los restos celulares, la cual se desechó. Se colectó el sobrenadante pasándolo a un

tubo nuevo, tomando una alícuota para determinación de la concentración de proteínas.

6.2.7 Cuantificación de proteínas

Se utilizó el método de Lowry (Lowry et al., 1951), teniendo como referencia concentraciones

conocidas de albumina bovina preparadas como diluciones seriadas a partir de una concentración

inicial de 1 mg/ml y los siguientes reactivos: PBS o amortiguador de lisis. Las determinaciones se

registraron a una longitud de onda de 750nm.

6.2.8 Fraccionamiento celular

Se obtuvieron extractos de núcleos y citoplasma mediante el protocolo de fraccionamiento

subcelular descrito por (Patten, 2016) publicado por abcam®

(“http://www.abcam.com/protocols/subcellular-fractionation-protocol” consulta de abril del 2018,

©1998-2018 Abcam plc.). Primero, se remueve el medio de cultivo de las cajas, y se lavan dos veces

con PBS frío. A continuación, se agregan 500 µl/caja de 60mm de amortiguador de fraccionamiento

HEPES 20mM pH 7.4 + Sacarosa 250mM + KCl 10mM + MgCl2 1.5mM + EDTA 1mM + EGTA 1mM + DTT

1mM + coctel inhibidor de proteasas cOmplete™. Se raspa con gendarme y se coloca en un tubo

Eppendorf de 1.5 ml enfriado previamente. A continuación, la muestra se lisa pasando por una jeringa

calibre 25 Ga al menos 15 veces y se incuba en hielo 20 minutos. Posteriormente las muestras se

centrifugan 5 min a 3000 rpm para separar los núcleos del extracto citoplasmático. El extracto

citoplasmático, que contiene lo restos de membrana celular, se transfiere a un tubo nuevo y se

almacena a -70°C hasta su uso. Subsecuentemente, la pastilla que contiene los núcleos se lava dos


53

veces con 500 µl de amortiguador de fraccionamiento, dispersando con pipeta y pasando 10 veces a

través de una jeringa 25 Ga, para centrifugar 10 min a 3000 rpm. A continuación, se descarta el

amortiguador y los núcleos se resuspenden en amortiguador de lisis estándar conteniendo 10% (v/v)

de glicerol 0.1% (p/v) de SDS. Finalmente, se sónica brevemente (3 segundos a 30W de potencia) en

hielo.

6.2.9 Coinmunoprecipitación

Los experimentos de coinmunoprecipitación se realizaron utilizando una adaptación al

protocolo de abcam© (2016) (“http://www.abcam.com/protocols/immunoprecipitation-protocol-1”,

consulta abril 2018, ©1998-2018 Abcam plc.). En forma breve, a la pastilla de núcleos congelada, se

resuspendió en amortiguador de lisis no desnaturalizante (20 mM Tris HCl pH 7.9, 137 mM NaCl, 10%

glicerol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA) al que se le agregó coctel inhibidor de proteasas

COMPLETE™. Posteriormente, se homogenizó con pipeta, se incubó con agitación constante 2h a 4°C

y el extracto se pasó por una jeringa calibre 25 Ga al menos 15 veces, y se incubó en hielo 10 minutos

y se sometió a un spin para precipitar los restos celulares. A continuación, 250 µg del extracto nuclear

se incubaron con 2 µg del anticuerpo indicado, completando a un volumen de 100 µl con PBS. Esta

suspensión se dejó en agitación toda la noche a 4°C, para posteriormente mezclarla con 15 l de perlas

magnéticas Dynabeads® Protein G previamente preparadas de acuerdo con las instrucciones del

fabricante. Después, se incubaron con agitación rotacional durante una hora a temperatura ambiente

para formar los complejos Dynabeads® Protein G + anticuerpo + proteína del extracto nuclear. En

siguiente término, los complejos se separaron de la suspensión mediante el uso de un imán y de ser

necesario un spin. La pastilla con el inmunoprecipitado se lavó dos veces con PBS + 0.1% (v/v) Tween

20. Finalmente, la pastilla de perlas se resuspendió con 10 µl de PBS a los que se le agregaron 20 µl de

amortiguador de carga para electroforesis Laemmli (Tris-HCl 62.5 mM pH 6.8, glicerol 25% (v/v), SDS

2% (p/v), azul de bromofenol 0.01% (p/v)), hirviéndose durante 10 minutos para separar el complejo

y las perlas. Las perlas magnéticas se separaron del sobrenadante mediante el uso de un imán y el

líquido se utilizó directamente para SDS-PAGE.

6.2.10 SDS-PAGE y Western blot

Se realizaron geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida (30:1) al 12.5% o al 8%, para

separar las proteínas por peso molecular (Arndt et al., 2012). Las proteínas se desnaturalizaron al

mezclar con amortiguador Laemmli y hervir durante 10 min. Se cargaron 15 µg de proteína total por

muestra en las cinéticas de expresión. Los geles se corrieron en amortiguador (Tris 0.6% (p/v), Glicina


54

2.88% (p/v), SDS 0.1% (p/v)) a corriente constante de 15-45 mA/gel. A continuación, se realizó la

transferencia húmeda de las proteínas a membranas de PVDF activadas previamente con metanol

absoluto durante un minuto. Se utilizó amortiguador de transferencia húmeda Tris 25 mM, Glicina 192

mM, SDS 0.01% (p/v), Metanol 20%) en un sistema Mini Trans-Blot® de Bio-Rad Laboratories. La

transferencia se realizó a corriente constante ~ 100 mA a 4°C toda la noche. Tras la transferencia las

membranas se bloquearon con leche en polvo libre de grasa al 5% (p/v) en PBS + 0.1%(v/v) Tween 20,

durante al menos 2 horas. Se realizaron las incubaciones con los anticuerpos primario y secundario

correspondientes (Tabla 3). Entre cada una de las incubaciones, se realizaron 5 lavados de 10 min con

PBS + 0.1%(v/v) Tween 20. Finalmente, las membranas se revelaron con el sustrato

quimioluminiscente WesternSure® PREMIUM según las instrucciones del fabricante. Los resultados se

cuantificaron con el software Image Studio Versión 5.2.5 (©LI-COR, EUA, 2015).

Cuando fue necesario, se realizó un protocolo suave de stripping (abcam, 2017) para remover

los anticuerpos y reutilizar la membrana, utilizando el amortiguador de stripping suave glicina 1.5%

(p/v), SDS 0.1% (p/v), Tween 20 1% (v/v) en agua acidificada a pH 2.2. De manera posterior al stripping,

se siguió el protocolo de Western blot a partir del bloqueo.

6.3 Análisis Estadístico

Los datos se presentan como las medias más su desviación estándar. Se realizaron pruebas t de

Student para comparar dos grupos o ANOVA (p-valor < 0.05) seguida por prueba de Tukey para

comparar grupos experimentales cuando se indique significancia. Cada experimento se realizó al

menos tres veces, con excepción del experimento de coinmunoprecipitación que se realizó una sola

vez.


55

7 RESULTADOS

7.1 Expresión de los componentes del complejo de remodelación de cromatina

BAF(SWI/SNF) durante la proliferación y diferenciación de las células

RCE1(5T5).

Considerando que la composición temporal y espacial del complejo de remodelación de

cromatina BAF se asocia tanto a cambios específicos en la capacidad de expresión génica relacionados

a la progresión del ciclo celular (Hah et al., 2010; Ruijtenberg & Van Den Heuvel, 2015), como a cambios

asociados con el carácter troncal (Kaeser et al., 2008), con el reprogramado de células (Kleger et al.,

2012), con la amplificación transitoria de poblaciones celulares que inician el proceso de diferenciación

(Eroglu et al., 2014b; Krasteva et al., 2012; Lamba et al., 2008) o con la expresión del fenotipo terminal

(Albini et al., 2015; He et al., 2010), exploramos los cambios en la expresión de los mensajeros que

codifican a las principales subunidades de los complejos remodeladores de cromatina BAF y cuya

expresión se ha asociado a procesos de diferenciación celular. Para ello, las células RCE1(5T5) se

cultivaron y diariamente se extrajo RNA total a partir del tercer día después de la siembra, para

determinar por RT-qPCR los niveles de expresión de los mensajeros correspondientes a lo largo de la

proliferación y diferenciación. Como controles del experimento, cultivos paralelos se tripsinizaron para

establecer el cambio en el número de células (Apéndice 1, Figura suplementaria 1); y con el propósito

de referir las curvas de expresión de estos mensajeros respecto a la expresión de marcadores

moleculares del proceso de diferenciación. En este caso, se emplearon como referencia el mRNA que

codifica al factor de transcripción Pax6, considerado como el gen maestro que enciende el programa

de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009) y el mRNA del factor de transcripción Np63,

relacionado con el potencial proliferativo y la potencialidad de las células epiteliales (Di Iorio et al.,

2005; Pellegrini et al., 2001).

Al examinar la expresión de los mensajeros que codifican a Pax6 y Np63 , se observaron los

patrones típicos encontrados durante el crecimiento y la diferenciación del epitelio corneal. Mientras

Pax6 aumenta paulatinamente a partir del cuarto día de cultivo hasta alcanzar en el décimo día de

cultivo niveles 5 veces superiores a los detectados al inicio del experimento (ver Apéndice 1, Figura

suplementaria 2) siguiendo un comportamiento similar a la curva de proliferación de la población

celular, los niveles del mensajero de Np63 alcanzaron un máximo de 3 veces los valores de

expresión basal al alcanzarse la confluencia (6° día en cultivo), disminuyendo paulatinamente una vez


56

que las células estratifican y se diferencian terminalmente (Apéndice 1, Figura suplementaria 2). En

contraste, la expresión de los mensajeros de las ATPasas Brg1/SMARCA4 y Brm/SMARCA2, cuya

presencia en el complejo BAF es mutuamente excluyente, muestran un marcado aumento a partir del

día 3 de cultivo y alcanzan un máximo al estar los cultivos cercanos a la confluencia (5-6 día de cultivo;

ver Figuras 16 y 17), para luego disminuir y mantenerse en niveles estables, similares a los basales en

el caso de Brg1, y 3 veces superiores a los basales en el caso de Brm. En transcripción relativa a sus

niveles basales, mientras Brg1 aumenta sólo 2 veces entre los días 4 y 5 (Figura 16), Brm se incrementa

cerca de 10 veces entre los días 3 y 5 después de la siembra (Figura 17).

Días de cultivo celular

0 2 4 6 8 10 12

Nú

me

ro d

e c

élu

las

105

106

107

No. de células

Ex

pre

sió

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pre

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No

rma

liz

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a)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Brg1/SMARCA4 (n = 4)

Figura 16 Expresión de RNAm de Brg1/SMARCA4 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el

cultivo se extrajo el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-

qPCR se determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada

al día 3 de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BRG1

en verde. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,

consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.


57


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Nú

me

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e c

élu

las

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106

107

No. de células

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n d

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No

rma

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0

1

2

3

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5

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Pax6 (n = 5)

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0

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8

10

12

Brm/SMARCA2 (n = 4)

Figura 17 RNAm de Brm/SMARCA2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo

el RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se

determinaron los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3

de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BRM en verde

seco. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,



58

Por otra parte se evalúo la subunidad BAF45a/PHF10, conocida por ser la variante de la familia

de genes presente en el complejo BAF durante la proliferación de progenitores neurales (npBAF); en

la transición de células troncales/progenitoras hacia neuronas postmitóticas (Lessard et al., 2007), así

como para el mantenimiento de células troncales hematopoyéticas, donde es una subunidad exclusiva

del complejo PBAF a diferencia de BAF45d que es exclusiva del complejo BAF (Krasteva et al., 2017).

Esta subunidad mostró una expresión ligeramente mayor durante la fase de crecimiento exponencial

en las células corneales cultivadas y disminuyó un 25% al estar los cultivos confluentes, para finalmente

reducirse aproximadamente a la mitad de su expresión al formarse un epitelio estratificado (Figura

18).


0 2 4 6 8 10 12

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107

No. de células

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rma

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2

3

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Pax6 (n = 5)

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0.0

0.5

1.0

1.5

2.0BAF45a / PHF10 (n = 4)

Figura 18 RNAm de BAF45a/PHF10 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo



de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de BAF45a en azul

verde. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia,



59

En siguiente término se estableció el patrón de expresión de los mensajeros que codifican a

las tres subunidades nucleares mutuamente excluyentes que determinan el tipo de complejo

remodelador de cromatina. Estas subunidades son dos de la misma familia Arid1a/BAF250a/SMARCF1

y Arid1b/BAF250b, que forman parte del complejo BAF; y Arid2/BAF200 que forma parte del complejo

PBAF.

En el caso de Arid1a/BAF250a, observamos que su expresión se incrementa aproximadamente

2.5 veces entre los días 5 y 6 de cultivo, que corresponden al período en el que las células inician la

formación de un epitelio estratificado, de manera casi simultánea con el aumento en la expresión de

Pax6. Posteriormente la expresión decae a sus niveles basales que se mantienen prácticamente hasta

el 9-10 día en cultivo (Figura 19).


0 2 4 6 8 10 12

Nú

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107

No. de células

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a)

0

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Pax6 (n = 5)

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1.0

1.5

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2.5

3.0Arid1a / BAF250a (n = 4)

Figura 19 RNAm de Arid1a/BAF250a y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo



de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de

Arid1a/BAF250a en rosa. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con

fines de referencia, consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.


60


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Nú

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las

105

106

107

No. de células

Pax6 (n = 5) E

xp

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liz

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0

2

4

6

Arid1b /BAF250b (n = 3)

Figura 20 RNAm de Arid1b/BAF250b y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo



de cultivo con la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de

Arid1b/BAF250b en café. También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con

fines de referencia, consulte las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.

Por otro lado, Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 presentaron cambios de magnitud superior en

su expresión. Mientras que BAF250b aumentó 5.5 veces entre el día 3 y el día 6 de cultivo para luego

decaer a niveles basales el día 10 después de la siembra (Figura 20), BAF200 mostró un cambio muy

marcado entre los días 3 y 6 de cultivo, alcanzando niveles máximos el día 6, cuando se encontraron

niveles de transcripción correspondientes a un incremento de 10 veces los detectados el día 3 de

cultivo cuando las células aún estaban en su fase de crecimiento exponencial (Figura 21).

Subsecuentemente, a partir de día 7 los niveles de Arid2/BAF200 disminuyeron y se mantuvieron en

niveles 4 veces superiores a los iniciales hasta finalizar el experimento (Figura 21).


61


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No. de células

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Pax6 (n = 5)

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4

6

8

10

12

Arid2 / BAF200 (n = 3)

Figura 21 RNAm de Arid2/BAF200 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el

RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron

los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con

la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de Arid2/BAF200 en azul.

También se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte

las Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.


62

7.1.1 Expresión de metiltransferasas de histonas durante la proliferación y diferenciación de

las células RCE1(5T5).

Considerando que las familias de metiltransferasas de histonas participan en el mantenimiento

de la integridad estructural de la heterocromatina (Harms et al., 2015; Pinheiro et al., 2012), así como

en el control de la expresión genética durante el desarrollo (Y. Chen et al., 2016; Horn et al., 2011;

Watanabe & Murakami, 2016), la diferenciación (Bi et al., 2014; Ding et al., 2013; Frühbeck et al., 2009;

Khani et al., 2017; Lussi et al., 2016) y la expresión del fenotipo terminal (Benitez et al., 2014; Harms

et al., 2014), establecimos las cinéticas de expresión de PRDM3 y PRDM16 durante la proliferación y

diferenciación de las células RCE1(5T5) mediante RT-qPCR. Como se muestra en la Figura 22, la

expresión de Prdm3 aumentó a los días 5 y 6 de cultivo, que corresponden al momento en que las

células alcanzan la confluencia; encontrándose un máximo el día 5 de cultivo, cuando se llegó a niveles

de expresión 2.5 veces superiores a los niveles basales detectados el día 3 posterior a la siembra.

Posteriormente su expresión se redujo hasta niveles menores a los basales cuando los epitelios se

encuentran completamente estructurados (día 10 después de la siembra) (Figura 22).


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No. de células

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0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Prdm3 / EVI1 (n = 5)

Figura 22 RNAm de Prdm3/Evi1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el

RNA total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron

los niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con

la desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de PRDM3 en azul claro. También


63

se muestra el número de células (línea punteada) y la expresión de pax6 (línea roja) con fines de referencia, consulte las

Figuras suplementarias 1 y 2 para más información.

Por otra parte, al medir los niveles de expresión de PRDM16, se encontró un comportamiento

similar al de PRDM3, observándose que el aumento en los niveles del mensajero correspondiente

ocurrió entre los días 5 y 6 después de la siembra; y un incremento máximo de 3 veces los niveles

basales se tuvo al día 6 de cultivo. Cabe mencionar que en el caso de Prdm16, se presentó una

disminución abrupta los días 7, 8 y 9 de cultivo hasta alcanzar niveles dos veces superiores a los

detectados al inicio del experimento (Figura 23). Finalmente, el mRNA de Prdm16 aumentó

nuevamente hasta 3 veces los niveles iniciales (Figura 23).


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No. de células

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0

1

2

3

4

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Pax6 (n = 5)

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rdm

16

(N

orm

aliz

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a)

0

1

2

3

4

Prdm16 (n = 4)

Figura 23 RNAm de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el RNA

total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron los

niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con la

desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de PRDM3 en azul claro. También




64

Adicionalmente, se evaluó CtBP2 (C-terminal binding protein 2) una proteína de represión

transcripcional que recluta a las metiltransferasas PRDM3 y PRDM16, junto con otras proteínas para

formar complejos represores y así ejercer su efecto (Stankiewicz et al., 2014). Este reclutamiento es

posible gracias a que PRDM3 y PRDM16 contienen dominios de unión a esta familia de proteínas (Di

Zazzo et al., 2013). Además, las CtBP participan en la regulación de la proliferación y supervivencia

celular (Touitou et al., 2001; Zhao et al., 2014). En el cultivo de epitelio corneal, se observó que la

expresión de mensajero de esta proteína prácticamente no se modifica, ya que su expresión máxima

alcanzada el día 7 de cultivo, es apenas 1.3 veces el valor basal no encontrándose diferencias

significativas. Sin embargo, cuando las células se encuentran terminalmente diferenciadas formando

un epitelio (día 10), la expresión se deprimió aproximadamente a un 50% del valor basal como se

observa en la Figura 24.


0 2 4 6 8 10 12

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No. de células

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6 (

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0

1

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3

4

5

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Pax6 (n = 5)

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pre

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e C

TB

P2

(N

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a)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0CTBP2 (n = 4)

Figura 24 RNAm de CTBP2 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Durante el cultivo se extrajo el RNA

total diariamente a partir del tercer día de cultivo después de la siembra, se obtuvo cDNA y por RT-qPCR se determinaron los

niveles de expresión de los RNAm correspondientes. Se muestra la expresión promedio normalizada al día 3 de cultivo con la

desviación estándar calculada para al menos cuatro repeticiones biológicas en cada punto de CTBP2 en azul claro. También




65

7.2 Cinéticas de expresión de proteínas de Pax6, BRM, Brg1 y Prdm16

Con el propósito de definir si los cambios en la expresión de los mensajeros que codifican para

el factor Pax6, así como para las ATPasas Brg1 y BRM, y la metiltransferasa de histonas Prdm16

corresponden a cambios en los niveles de las proteínas respectivas. Se obtuvieron diariamente

extractos de proteínas totales de los cultivos, abarcando desde la etapa proliferativa y hasta la

diferenciación de las células epiteliales. Estos extractos fueron procesados mediante electroforesis en

geles de poliacrilamida-SDS e inmunotransferidos para determinar la cantidad de proteína por

inmunotinción con los anticuerpos respectivos. Como era de esperarse, en el caso del factor de

transcripción Pax6, propuesto como la proteína cuya expresión dirige el programa de diferenciación

del epitelio corneal (García-Villegas et al., 2009), los niveles aumentaron de manera constante a partir

del 4 día de cultivo, alcanzando un máximo al finalizar el experimento (Figura 25) con un aumento de

cerca de 80 veces la cantidad relativa de proteína basal cuando se ha constituido un epitelio

estratificado con 4 o 5 capas de células (día 10).

Nú

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No. de células


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e P

AX

6 (

No

rma

liz

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a)

0

20

40

60

80

Pax6

Figura 25 Proteínas totales: expresión de PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas de

células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales, las

muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a

membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga, actina. Se

realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su desviación

estándar para PAX6 en rojo. La línea punteada indica la cantidad de células según el Apéndice 1 Figura suplementaria 1.


66

Por otra parte, la cantidad de la ATPasa Brg1 aumentó cerca de dos veces los niveles basales

(Figura 26), siguiendo una cinética similar a la expresión de su RNA mensajero, con un máximo a los 5

días en cultivo, para luego decrecer a los niveles encontrados al inicio del experimento (Figura 26).


0 2 4 6 8 10 12

Ex

pre

sió

n d

e B

rg1

(N

orm

aliz

ad

a)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Brg1

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107

No. de células

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sió

n d

e P

ax

6 (N

orm

aliz

ad

a)

0

20

40

60

80Pax6

Figura 26 Proteínas totales: expresión de Brg1 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas

de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales,

las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a



estándar para BRG1 en verde y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de células según el Apéndice

1 Figura suplementaria 1.


67

Para la ATPasa BRM se encontró que la cantidad de proteína sólo aumentó cerca de dos veces

los niveles encontrados en el día 3 de cultivo (Figura 27), contrastando con el aumento pronunciado

del mensajero que la codifica, cuyos niveles aumentaron cerca de 10 veces (ver Figura 17). No

obstante, la cantidad de repeticiones biológicas no fue suficiente para obtener datos medios

confiables, como lo muestran las barras de desviación estándar de cada punto, principalmente a partir

del día 6 (Figura 27).

Nú

me

ro d

e c

élu

las

105

106

107

No. de células

Ex

pre

sió

n d

e P

ax

6 (N

orm

aliz

ad

a)

0

20

40

60

80Pax6


0 2 4 6 8 10 12

Ex

pre

sió

n d

e B

RM

(N

orm

aliz

ad

a)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0BRM

Figura 27 Proteínas totales: expresión de BRM y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron cajas

de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas totales,

las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se transfirieron a



estándar para BRM en verde seco y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de células según el

Apéndice 1 Figura suplementaria 1.


68

Finalmente, al evaluar los niveles de la proteína PRDM16 encontramos un aumento de 6 veces

a partir del valor basal en el momento en que las células inician la estratificación una vez que se alcanza

la confluencia en cultivo (Figura 28). Cabe señalar que el patrón de expresión de la proteína concuerda

con el RNA mensajero que la codifica en temporalidad. Sin embargo, en magnitud la proteína alcanza

valores equivalentes a 6 veces el basal en comparación con las 3 veces que aumenta el mensajero (ver

Figura 23).

No

. de

cé

lula

s

105

106

107

No. de células


0 2 4 6 8 10 12

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n d

e P

rdm

16

(N

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aliz

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a)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0Prdm16

0 2 4 6 8 10 12

Ex

pre

sió

n d

e P

ax

6 (N

orm

aliz

ad

a)

0

20

40

60

80Pax6

Figura 28 Proteínas totales: expresión de Prdm16 y PAX6 en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-5T5). Se cultivaron

cajas de células RCE-5T5, a partir del tercer día de cultivo se extrajo una caja 24 h y se obtuvieron extractos de proteínas

totales, las muestras se cuantificaron y se cargaron en un gel desnaturalizante SDS-PAGE al 12%. Posteriormente se

transfirieron a membranas de PVDF y se realizó la inmunotinción con el anticuerpo correspondiente y su control de carga,

actina. Se realizaron al menos cuatro repeticiones, se cuantificaron y se muestran los promedios para cada día junto con su

desviación estándar para Prdm16 en azul marino y PAX6 en rojo como marcador. La línea punteada indica la cantidad de

células según el Apéndice 1 Figura suplementaria 1.


69

7.3 Análisis de la composición de los complejos remodeladores de cromatina

por coinmunoprecipitación.

Una vez establecido el patrón de expresión de las principales subunidades de los complejos

remodeladores de cromatina, y tomando en cuenta que éstos complejos cambian de composición

durante el proceso de diferenciación (Ho & Crabtree, 2010; Yoo & Crabtree, 2009), a continuación

exploramos el cambio en la composición de los complejos durante el crecimiento y la diferenciación

de las células de epitelio corneal. Para ello, se llevaron a cabo experimentos de coinmunoprecipitación

con extractos nucleares obtenidos de cultivos de células RCE1(5T5) a los 3, 5, 6 y 10 días después de la

siembra. Estos tiempos corresponden a las tres etapas del programa de diferenciación identificadas:

cultivos proliferativos “no diferenciados” (3 días después de la siembra); cultivos confluentes que han

iniciado el programa de diferenciación (5 y 6 días); y cultivos diferenciados, consistentes en epitelios

estratificados compuestos por 4 o 5 capas de células (10 días). En estos experimentos, la

inmunoprecipitación se llevó a cabo con un anticuerpo dirigido contra la ATPasa BRM, o con un

anticuerpo dirigido contra la ATPasa Brg1. La identidad del material que coinmunoprecipitó se

determinó en experimentos de Western blot mediante anticuerpos dirigidos contra las proteínas

BAF155, BAF47 y BAF170, que son componentes del núcleo de los complejos BAF y PBAF, además, con

anticuerpos contra la proteína Arid1a que es característica del complejo BAF, y con anticuerpos

dirigidos contra el factor de transcripción Pax6.

Como se observa en la Figura 29, los componentes núcleo de los complejos remodeladores de

cromatina se encuentran en los precipitados obtenidos con anticuerpos dirigidos contra Brg-1 o contra

BRM a lo largo del crecimiento y la diferenciación de las células de epitelio corneal de conejo. Es

notable que coexisten al menos dos tipos de complejo remodelador de cromatina; el primero está

constituido por la ATPasa Brg1 y las subunidades Arid1a/BAF250a, BAF170, BAF155 y BAF47, y el

segundo por la ATPasa BRM y las subunidades Arid1a/BAF250a, BAF170, BAF155 y BAF47. Ambos tipos

de complejo se expresaron principalmente durante la fase proliferativa y en el momento en que las

células alcanzan la confluencia (5° día de cultivo). Posteriormente, a partir del 6° día de cultivo, parecen

disminuir los niveles de ambos complejos (Figura 29). Una de las subunidades que mostró mayor

variación en ambos casos fue Arid1a, que mostró niveles mayores en cultivos

preconfluentes/confluentes, para disminuir al 6° día, y desaparecer casi por completo en el complejo

asociado a Brg1. En contraste, el complejo asociado a BRM tuvo su mayor expresión al día 10 en cultivo

(Figura 29).


70

Figura 29 Coinmunoprecipitación de las subunidades núcleo de los complejos BAF/PBAF por sus ATPasas. Se sembraron

cajas de 60mm en condiciones normales de cultivo, a partir del día 3 y en los días 5, 6 y 10 se tomó una muestra adecuada y

se procesó para separar los núcleos del resto de la célula y extraer sus proteínas. Después de cuantificar proteína, se tomaron

300 µg de extracto nuclear y se incubaron con 2 µg de anticuerpo (antí-Brg1 o anti-BRM según corresponda) toda la noche a

4°C. Posteriormente el complejo Ag-Ab se atrapó con 15 µl de perlas magnéticas ligadas a proteína G Dynabeads® a

temperatura ambiente durante 30 min. El complejo se precipito con un imán para separar el precipitado y sobrenadante, el

precipitado se resuspendió en 20 µl de amortiguador Laemmli + 30 µl de PBS, se procedió a hervir la muestra y continuar con

SDS-PAGE y western blot contra los anticuerpos que se muestran en la figura. Los sobrenadantes de la precipitación se

corrieron simultáneamente (WB) para verificar que la mayoría de la proteína se mantuviera en el precipitado (resultados no

mostrados). Se muestran imágenes de western blots realizados por separado por lo cual la exposición en el revelado varía. Se

muestran las imágenes para una sola repetición biológica de ambas precipitaciones, la imagen puede no ser representativa.

Mientras que, BAF47 mostró tener niveles altos en cada uno de los complejos y en los tiempos

de cultivo examinados (Figura 29), así como BAF 155 mantuvo niveles bajos en todas las condiciones

ensayadas (Figura 29). Asimismo, parece que BAF170 disminuyó para el 10 día de cultivo, cuando el

cultivo se ha constituido como un epitelio estratificado. De manera muy interesante, se observó que

Pax6 coinmunoprecipitó con el complejo asociado a Brg1, sugiriendo que este complejo tiene una

actividad biológica importante para el desarrollo del programa de diferenciación; por otro lado, esta

interacción no se observó al precipitar con BRM (Figura 29). Asimismo, los resultados sugieren que

ambos complejos remodeladores de cromatina se requieren para la activación del programa de

diferenciación, la cual ocurre alrededor del 5to y 6to día en cultivo.

n = 1


71

7.4 Efecto de la activación de la vía de NOTCH sobre la expresión de los

complejos remodeladores de cromatina BAF y PBAF, y de las

metiltransferasas de histonas, PRDM3 y PRDM16.

Los resultados anteriores nos sugieren que tanto los componentes clave de los complejos

remodeladores BAF y PBAF, como las metiltransferasas de histonas podrían cumplir una función

relevante en la progresión de la diferenciación de la línea celular RCE1 (5T5), ya que sus patrones de

expresión revelan un aumento en la actividad de estos elementos al 5 y/o 6 día de cultivo, cuando se

inicia la expresión de los marcadores asociados a la diferenciación terminal, en especial PAX6 con el

que pueden establecer una interacción proteína-proteína (He et al., 2010; He & Cvekl, 2012; Jaglin &

Fishell, 2013; Ninkovic et al., 2013). Los componentes epigenéticos examinados sufren cambios que

sugieren una coordinación con la expresión del marcador de proliferación epitelial Np63 (Pellegrini

et al., 2001). Éstos parecen desencadenarse en el momento que el cultivo alcanza la confluencia,

implicando al establecimiento de contactos célula-célula como un requisito para iniciar la

estratificación.

Uno de los sistemas activados por contacto es la vía de señalización de NOTCH, la cual participa

en la diversificación de las neuronas del sistema olfatorio en Drosophila (Endo et al., 2011), así como

también, junto con el factor de transcripción p63, en la regulación de la autorenovación y

diferenciación de los queratinocitos epidermales de ratón y de humano, (Nguyen et al., 2005).

Tomando en cuenta los numerosos reportes que demuestran interacciones entre elementos de la vía

de Notch, los complejos remodeladores de la cromatina y las metiltransferasas de histonas, en

siguiente término evaluamos el efecto de estimular a las células RCE1(5T5) con las formas

recombinantes solubles de Notch y de sus ligandos Jagged y Delta.

Para determinar la concentración óptima del ligando o receptor recombinante necesarios en

estos experimentos las células se alimentaron a partir del primer día en cultivo con medio

suplementado con una baja concentración de suero (ver Métodos), y concentraciones crecientes de

las formas solubles recombinantes del receptor o ligando correspondiente (ver Tabla 4 para más

detalles sobre estas proteínas recombinantes). Las células RCE1(5T5) se estimularon con 10, 25, 50,

100 o 200 ng/ml de la forma recombinante soluble de alguno de los ligandos Jagged-2, Delta-1 y Notch-

1. Cultivos paralelos se mantuvieron en el medio basal sin ningún factor añadido (control, sin EGF), y

otros se suplementaron con medio al que se le añadieron 10 ng/ml de EGF, condición que promueve


72

la mayor respuesta proliferativa de las células epiteliales (testigo positivo). Se realizó cambio de medio

cada tercer día y a los 4 o 5 días después de la siembra, antes de que el cultivo alcanzara confluencia,

los cultivos se fijaron y tiñeron con Rodamina B.

Como se observa en la Figura 30a, cuando la forma recombinante de Jagged-2 de ratón

(rmJagged-2) se añadió a una concentración de 200 ng/ml, inhibió un 30% la proliferación de las células

RCE1(5T5), respecto a los cultivos control que se mantuvieron en medio basal sin aditivos y contrastó

con el incremento del 30% observado en aquellos cultivos estimulados con 10 ng/ml de EGF (Figura

30a), ambos estadísticamente significativos. En contraste, la estimulación con la forma recombinante

soluble de Notch-1 de humano (rhNotch-1) incrementó aproximadamente un 20% la proliferación de

las células epiteliales corneales cuando se añadió a concentraciones de 200 ng/ml (Figura 30b); no

obstante, este efecto no fue significativo. Por otra parte, los ligandos tipo Delta-1 (DLL-1)

(a) (b)

Figura 30 Efecto de las proteínas recombinantes rhNotch-1 y rmJagged-2 sobre la proliferación celular. (a) Tratamientos

con Jagged-2 recombinante de ratón; (b) Tratamientos con Notch-1 recombinante de humano. Además, se muestran el testigo

negativo (medio basal) y el testigo positivo (medio con EGF [10 ng/ml]). Todos los experimentos se llevaron a cabo en

condiciones de bajo suero. Se incluye una fotografía representativa del experimento en cajas de 24 pozos y la cantidad de

repeticiones biológicas por experimento, se utilizaron pozos con únicamente células alimentadoras como control basal del

color. Las cajas se procesaron según la metodología de tinción con rodamina B. En los gráficos de barras las líneas de error

indican la desviación estándar calculada entre repeticiones biológicas y el color muestra la concentración del tratamiento

(entre más claro, menor es la concentración). Finalmente, se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de

Tukey para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco. En (a) tanto 200 ng/ml como el control

proliferativo (c/EGF) son significativamente diferentes al resto de las barras, además existe una diferencia significativa entre

la dosis de 100 ng/ml y 10 ng/ml, el resto de las comparaciones pareadas no fueron significativas. En (b) no hubo diferencias

estadísticamente significativas.

*

* *


73

recombinantes de humano (rhDLL-1) y de rata (rrDLL-1) no tuvieron efecto significativo respecto a los

cultivos control (resultados que no se muestran). Cabe señalar que el comportamiento observado al

estimular a las células con el ligando Jagged-2 es similar al descrito previamente en nuestro laboratorio

para Jagged-1 (Mata-Lozano, 2012). En ese caso, Jagged-1 inhibió de manera dependiente de la

concentración la proliferación de las células epiteliales corneales al estimular la expresión del

programa de diferenciación, y alcanzando un 70% de inhibición cuando las células se estimularon con

200 ng/ml de este ligando (Mata-Lozano, 2012).

Con base en estos resultados, en los experimentos subsecuentes se analizaron los cambios en

la expresión de los elementos de interés gracias a los estímulos de las poblaciones celulares con 200

ng/ml de cada una de estas proteínas recombinantes (rmJagged2, rhNotch1, rrNotch1 y rrJagged1).

7.4.1 Los ligandos y receptores de la vía de Notch, modulan la expresión de Prdm16 y no así

la expresión de BAF250a,b /Arid1a,b y BAF200/Arid2.

Considerando que la activación de la vía de Notch promueve la diferenciación terminal de la

epidermis (Blanpain, Lowry, Pasolli, & Fuchs, 2006; Lowell, Jones, Le Roux, Dunne, & Watt, 2000;

Rangarajan et al., 2001), así como la diferenciación del epitelio corneal cuando éste es activado por

Jagged1 (Djalilian et al., 2008; Mata-Lozano, 2012) es posible que esta vía participe el establecimiento

del destino celular (Vauclair et al., 2007), y regule a la población de células troncales de la córnea (Li

et al., 2007). Por ello, nos planteamos establecer el efecto de la estimulación de la vía de Notch por el

receptor Notch soluble o sus ligandos sobre la expresión de componentes específicos del complejo de

remodelación de cromatina BAF y sobre la expresión de las metiltransferasas de histonas. Para ello,

las células RCE1(5T5) se estimularon, a partir del primer día después de la siembra con 200ng/ml de

rrNotch-1, rhNotch-1 ó Jagged-1 (ver Métodos). Cultivos paralelos, se suplementaron con medio basal

sin ningún aditivo o con medio suplementado con 10 ng/ml de EGF. Cuando los cultivos estuvieron

preconfluentes (4to día de cultivo), se extrajo el RNA total, y se determinó por RT-qPCR (ver Materiales

y Métodos), la expresión de los mensajeros que codifican a las proteínas Arid1a/BAF250a,

Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200 y a la metiltransferasa de histonas Prdm16. Para correlacionar los

niveles de estos mensajeros con el grado de diferenciación de los cultivos, también se determinó la

expresión del factor de transcripción Pax6, postulado como gen maestro del programa de

diferenciación del epitelio corneal (Garcia-Villegas et al., 2009; Sasamoto et al., 2016), y de la


74

citoqueratina 3 (KRT3), cuya expresión está ligada al fenotipo terminal (T. Chen et al., 1997; Schermer

et al., 1986).

Figura 31 Cambios en la expresión de RNAm de (a)Pax6 y (b)K3 promovidos por las formas recombinantes solubles de

Notch-1 y Jagged-1. Después de 4 días, se extrajo el RNA de cultivos paralelos tratadas con 200 ng/ml de Notch-1 de rata

(rrNotch-1), Notch-1 de humano (rhNotch-1), y Jagged-1 de rata (rr-Jagged-1). Los controles correspondientes consistieron en

células cultivadas en presencia de 10 ng/ml de EGF, o medio basal sin aditivos (s/EGF). Se cuantificó la expresión por RT-qPCR

y se normalizó al medio basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de Tukey

para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que compara dos barras. Las

barras representan los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas. Los colores indican los

diferentes tratamientos.

(b)

(a)

(b)


75

Como se observa en la Figura 31, el tratamiento con la forma soluble del receptor de Notch-1

de rata o de humano disminuyó significativamente la expresión de Pax6 en un 50% respecto a los

cultivos control estimulados con EGF o que no recibieron ningún estímulo (Figura 31a). En contraste,

el tratamiento con estas formas solubles promovió la expresión de la citoqueratina 3 (KRT3), cuyos

niveles fueron superiores a los encontrados en los cultivos no tratados (cambio no significativo) y 4

veces superiores comparados con la muestra estimulada con EGF (diferencia significativa) (Figura 31b).

Por otro lado, Jagged1 promovió una ligera disminución (no significativa) en la expresión de Pax6 y de

KRT3 respecto al control que no recibió tratamiento alguno (Figura 31a y b). Es importante señalar que

la estimulación con 10 ng/ml EGF provocó una disminución del 50% en la expresión de KRT3, como se

ha reportado previamente tanto a nivel de mensajero como de proteína; mientras que no tuvo efecto

en la expresión de Pax6 (Figura 31a y b). Posteriormente, también se examinó el efecto de estimular

con 200 ng/ml de rrNotch-1, rhNotch-1 o rrJagged-1, sobre la expresión de los mensajeros que

codifican a Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b, Arid2/BAF200, proteínas que determinan la identidad

de los complejos BAF y PBAF.

Figura 32 Cambios en la expresión de RNAm de Arid1a/BAF250a, Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 promovidos por las

formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1. 4 días después de la siembra, se extrajo el RNA de cultivos paralelos

tratados con 200 ng/ml de la proteína recombinante soluble correspondiente. Los controles consistieron en cultivos paralelos


76

suplementados con medio basal que contenía o no 10 ng/ml de EGF. Se cuantificó la expresión de Arid1a/BAF250a,

Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 por RT-qPCR y se normalizó utilizando como referencia a los cultivos mantenidos en medio

basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida por una prueba de Tukey para determinar

significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que compara dos barras. Las barras representan

los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas. Los colores indican los diferentes

tratamientos. Para Arid1b/BAF250b y Arid2/BAF200 no se probaron los tratamientos con rrNotch-1.

Como se aprecia en la Figura 32, ninguno de los tratamientos, provocó diferencias

significativas en la expresión de los mensajeros que codifican a estas proteínas en comparación con el

control suplementado con medio basal sin aditivos, o el control suplementado con EGF (Figura 32).

Estos resultados sugieren que estas subunidades no responden directamente a la estimulación de la

vía de Notch. Considerando que estas subunidades son estructuralmente necesarias para que se

ensamblen los complejos remodeladores de cromatina (Clapier & Cairns, 2009), es factible descartar

que los complejos BAF/PBAF se encuentren bajo el control de la vía de Notch.

Por otro lado, considerando que en experimentos anteriores PRDM16 fue la metiltransferasa

de histonas más abundante y con cambios más dramáticos durante el crecimiento y diferenciación de

las células RCE1(5T5), analizamos si la expresión del mensajero que codifica para esta enzima se

modifica por la estimulación con las formas recombinantes solubles rrNotch-1, rhNotch-1 o rrJagged-

1. De manera interesante, mientras la estimulación de las células con EGF promovió un aumento no

significativo, de un 50% en la expresión de PRDM16 (ver Figura 33), la adición de rrNotch1, incrementó

cerca de 25 veces la expresión de la metiltransferasa de histonas (Figura 33). De manera similar, un

aumento de alrededor de 18 veces se obtuvo cuando se utilizó la forma soluble de Notch humana

(rhNotch1; Figura 33, P<0.005). Este resultado contrasta con los cultivos estimulados con la forma

soluble del ligando Jagged-1, en donde no se observó cambio significativo (Figura 33). Estos resultados

apoyan la posibilidad de que las metiltransferasas de histonas son reguladas por la vía de NOTCH, lo

cual sugiere que el contacto célula-célula desencadena modificaciones en la heterocromatina

constitutiva y, por lo tanto, altera la disponibilidad transcripcional de secuencias genéticas específicas.


77

Figura 33. Cambios en la expresión de los RNAm de Prdm16 y marcadores de diferenciación K3 y Pax6 promovidos por las

formas recombinantes solubles de Notch-1 y Jagged-1. 4 días después de la siembra, se extrajo el RNA de cultivos paralelos

tratadas con 200 ng/ml de rrNotch-1, rhNotch-1 y rrJagged-1. Los controles correspondientes consistieron en cultivos

paralelos mantenidos con (medio basal, o suplementados con medio al que se le añadieron 10 ng/ml de EGF. Se cuantificó la

expresión por RT-qPCR y se normalizó al medio basal (s/EGF). Posteriormente se realizó un ANOVA (p-valor < 0.005) seguida

por una prueba de Tukey para determinar significancia estadística por pares la cual se indica con asterisco sobre la línea que

compara dos barras. Las barras representan los promedios más la desviación estándar de al menos 3 repeticiones biológicas.

Los colores indican los diferentes tratamientos.

La comparación entre los resultados obtenidos para los distintos genes (Figura 33) sugiere que las

metiltransferasas de histonas aumentan su expresión cuando se inicia el proceso de diferenciación, o

bien, cuando las células son estimuladas con agentes que promueven cambios en la expresión del

estado diferenciado posteriores al contacto celular. En contraste, los complejos BAF no parecen

modificarse bajo las diferentes condiciones ensayadas.


78


79

8 DISCUSIÓN

Hasta ahora, numerosos estudios de diferentes grupos de investigación permitieron establecer

que la diferenciación del epitelio corneal es controlada por una compleja red de factores de

transcripción entre los que destaca Pax6, que funciona como un gen maestro que determina la

expresión de todo el programa de diferenciación (Garcia-Villegas et al., 2009; Kitazawa et al., 2017;

Sasamoto et al., 2016a). Sin embargo, la evidencia acumulada también sugiere que otros mecanismos

de control operan para generar características mucho más finas del fenotipo terminalmente

diferenciado y la correcta expresión del fenotipo terminal (Adhikary et al., 2005, 2004; Banks et al.,

1999; T. Chen et al., 1997; Gingras et al., 2003). Como parte de esta regulación fina existen preguntas

que aún no somos capaces de contestar. ¿Por qué la expresión del fenotipo terminalmente

diferenciado se puede modificar con distintos factores? ¿Cómo algunas colecciones o grupos de genes

se inactivan de manera coordinada y otros se encienden siguiendo secuencias específicas? ¿Por qué la

determinación hacia un linaje específico es irreversible? ¿La estructura tridimensional del genoma

participa activamente en la regulación de la expresión genética? ¿Quién programa a las células

troncales hacía un fenotipo terminal, los factores de transcripción maestros, los complejos

remodeladores que modifican la capacidad transcripcional del genoma, o ambos?

Hasta ahora, los resultados de diferentes grupos hacen evidente que los procesos de

diferenciación y de desarrollo no sólo se deben a la existencia de un programa predeterminado

genéticamente. Por el contrario, dependen de una serie de mecanismos que, sin modificar la secuencia

del genoma, modifican su capacidad de expresión; a estos mecanismos se les conoce como procesos

epigenéticos. De manera importante, su estudio se encuentra en una fase de crecimiento exponencial

y se enfoca en la arquitectura y remodelado de la cromatina, en las modificaciones covalentes de

histonas y en la metilación de secuencias del material genético, considerando la localización nuclear

de las secuencias disponibles para su transcripción (revisado por Cremer, 2001 y Shchuka et al., 2015).

Dado que la modificación epigenética es necesaria para la progresión de la diferenciación, y

tomando en cuenta que en células epiteliales la configuración temporal de los complejos

remodeladores de cromatina y la actividad de los mecanismos de modificación covalente de la

cromatina no están descritos, en este trabajo iniciamos el estudio de la regulación epigenética de la

proliferación y la diferenciación del epitelio corneal de mamífero. Con este propósito decidimos

analizar la expresión de los componentes de los complejos remodeladores de la cromatina BAF y PBAF,

cuya participación en procesos de diferenciación neuronal, cardiaca, entre otros; ha sido demostrada


80

(Ho et al., 2009; Kaeser et al., 2008; Yoo & Crabtree, 2009). También estudiamos la expresión de las

metiltransferasas de histonas Prdm3 y Prdm16, y cómo las expresiones de estos componentes de los

procesos epigenéticos se modulan por la activación de la vía de señalización dependiente de Notch.

Los resultados obtenidos muestran que los componentes de los complejos remodeladores de la

cromatina y las metiltransferasas de histonas se expresan a lo largo del crecimiento y la diferenciación

en cultivo, con un máximo de expresión evidente cuando las células alcanzan el estado de confluencia

e inician la formación de un epitelio estratificado entre los días 5 y 6 de cultivo (ver Figura 34). Este

máximo en expresión coincide con la rápida disminución en la expresión del mensajero que codifica

para el factor de proliferación Np63 (Castro-Muñozledo et al., 2017), y resultados de este trabajo) y

el aumento del mensajero que codifica para el factor de transcripción homeótico Pax6 (Garcia-Villegas

et al., 2009 y resultados de este trabajo). Además, con base en el análisis bioinformático del

transcriptoma donde se compararon las tres etapas de diferenciación de las células; durante esta fase

de transición (al día 6 de cultivo) se detectó el aumento en la expresión de al menos 628 genes y la

disminución de otros 1195, todos ellos cambios previos a la expresión del fenotipo terminal (Ortiz-

Melo, et al., datos no publicados). Esto sugiere que esta etapa debe ser crucial para la restructuración

tridimensional de la cromatina y, por lo tanto, la modificación de la accesibilidad de la maquinaria de

transcripción a secuencias específicas cuya modificación de la expresión conlleva probablemente a la

expresión del fenotipo diferenciado. Por ello, los resultados anteriores nos permiten sugerir que los

complejos remodeladores y las metiltransferasas de histonas analizadas en este trabajo, desempeñan

una función fundamental durante el proceso de diferenciación del epitelio corneal, principalmente en

esta etapa de transición en la que las células quedan programadas hacia el fenotipo diferenciado.

Nuestro análisis muestra que los complejos remodeladores de cromatina existen en todas las

etapas del desarrollo, presentando al menos las subunidades básicas BAF170, BAF155 y BAF47, que

forman el núcleo básico de los complejos BAF/PBAF (Clapier & Cairns, 2009). Los resultados

demuestran también que coexisten varias configuraciones de los complejos, ya que las células de

epitelio corneal expresan de manera simultánea, con patrones de expresión diferenciales,

subunidades mutualmente excluyentes como las ATPasas y las proteínas ARID (Euskirchen et al., 2012).

Estas variaciones en la expresión de las subunidades, junto con los reportes que describen los distintos

ensamblajes de subunidades y la participación de los diferentes complejos en procesos de

diferenciación de acuerdo con el contexto tisular y de etapa de desarrollo (Ho et al., 2009; Krasteva

et al., 2012, 2017; Lessard et al., 2007; Masliah-Planchon et al., 2014) nos permiten especular acerca


81

de la abundancia y composición de los diferentes complejos BAF/PBAF posibles a lo largo de la

proliferación y diferenciación del epitelio corneal.


0 2 4 6 8 10 12

Nú

me

ro d

e c

élu

las

105

106

107

No. de células E

xp

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ión

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lati

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a)

0

2

4

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8

10

12

Arid2 / BAF200Arid1b / BAF250b

Arid1a / BAF250a

Brg1 / SMARCA4

Brm / SMARCA2

BAF45a / PHF10

Figura 34 Perfil general de expresión de los mRNA que codifican para las subunidades de los complejos remodeladores de

cromatina BAF y PBAF. La modificación de la expresión se normalizó tomando como 1 la expresión al día 3 de cultivo para

cada uno de los genes analizados. Se utilizaron los mismos datos que para las gráficas individuales mostradas en resultados,

pero se ajustaron para utilizar la misma escala en todos los datos. Además, se incluye en línea punteada el conteo de células

en cada día de cultivo en escala logarítmica y la flecha indica el día en el que las células llegan a confluencia.

Tal es el caso de BAF45a, Brg1 y Arid1a/BAF250a, subunidades con cinéticas similares, con

niveles de expresión máxima al día 5 de cultivo y que alcanzan magnitudes similares (2 veces los niveles

basales) lo que podría indicar que estas subunidades se expresan formando parte del mismo complejo

en células proliferativas. Esta combinatoria es similar a la reportada para el complejo esBAF, que es

indispensable para la autorrenovación y pluripotencia de las células troncales embrionarias,

probablemente gracias a que puede interaccionar con factores de transcripción como Oct4 y Sox2 (Ho

et al., 2009). Es de notarse que estas tres subunidades, después de alcanzar su máxima expresión

sufren un decremento hasta niveles menores a los basales, hecho que es evidente para Brg1 y

Arid1a/BAF250a, cuya expresión concuerda con los niveles de proteína detectados por western blot.


82

Por otro lado, la configuración que incluye a BAF45a, Brg1 y Arid1a/BAF250a concuerda con

reportes individuales en los que cada una de estas subunidades se expresa en células con alta

capacidad proliferativa (Lessard et al., 2007), como ocurre para BAF45a en progenitores neurales

(Bachmann etal., 2016), en células troncales hematopoyéticas (Krasteva et al., 2012, 2017) y en células

troncales embrionarias de ratón (Ho et al., 2009), donde contribuye al mantenimiento de la capacidad

proliferativa de las mismas (Banga, Peng, Dasgupta, Palejwala, & Ozer, 2009; Krasteva et al., 2017; C.

Li et al., 2012; W. Li et al., 2007). Además, su expresión disminuye a medida que avanza el programa

de diferenciación, probablemente para ser reemplazada por otra proteína de su familia, como se ha

visto durante el desarrollo neural, donde es sustituida por BAF45b/c (Lessard et al., 2007). De la misma

manera, Brg1 aparece en células troncales neurales (Matsumoto et al., 2006) y en el folículo piloso

(Xiong et al., 2013), donde se le atribuyen funciones que contribuyen a la regeneración tisular y al

mantenimiento del carácter troncal. De manera importante, en tejidos oculares, Brg1 interacciona con

PAX6; esta interacción contribuye a iniciar el programa de diferenciación del cristalino (He et al., 2010;

Yang et al., 2006) así como también ocurre durante la neurogénesis en el ratón (Ninkovic et al., 2013),

al permitir a la maquinaria de transcripción el acceso a genes específicos de tipo celular. En nuestro

sistema experimental observamos esta interacción en los experimentos de inmunoprecipitación (ver

resultados); siendo interesante encontrar una fuerte asociación de Brg1 con Pax6 aun cuando la

expresión de Pax6 en las etapas tempranas de cultivo es baja en comparación con etapas posteriores.

Más aún, en epidermis de ratón, el gen Brg1 es blanco directo del factor de transcripción p63 y su

interacción permite la remodelación del complejo de diferenciación epidermal (EDC) a un sitio de la

eucromatina, de manera previa a la expresión completa de los genes de este complejo; que a su vez

también está regulada por Brg1 (Mardaryev et al., 2014). En conjunto, esta evidencia podría indicar la

existencia de una cascada de señalización que involucre al menos a estos tres elementos y que da

como resultado el inicio del programa de diferenciación en su etapa más temprana. Contrario a esta

teoría, cabe mencionar que existe la posibilidad de que no exista esta inducción directa de Brg1 por

p63, tanto en el epitelio corneal como en nuestro modelo, ya que p63 completa no se expresa en este

tipo epitelial y sólo se encuentran las isoformas truncadas (Di Iorio et al., 2005; Kawasaki et al., 2006)

cuyas interacciones aún no están caracterizadas. A pesar de ello, esta evidencia destaca a Brg1 como

un probable responsable del inicio del programa de diferenciación del epitelio corneal.

Por otra parte, conforme avanza la diferenciación, en la etapa transición observamos que el

día 6 de cultivo las subunidades Brm y Arid2/BAF200 sufren cambios similares en su expresión,

alcanzando niveles aproximadamente 10 veces superiores a los iniciales; mientras que


83

Arid1b/BAF250b aumenta hasta alcanzar un nivel 5 veces la expresión detectada inicialmente. Estos

incrementos contrastan con el cambio que hemos discutido para Brg1, Arid1a/BAF250a y BAF45a,

cuyos incrementos no son mayores a 2 veces los niveles basales detectados al inicio de la fase de

crecimiento exponencial.

Los estudios realizados para cada una de las proteínas estudiadas relacionan su expresión con

características propias de células proliferativas o bien, de células terminalmente diferenciadas, que en

su mayoría concuerdan con nuestros resultados en el modelo de células RCE1(5T5). Así pues, a ARID1A

se le atribuye una función represora de genes asociados a la diferenciación (Singh & Archer, 2014), y

al control que restringe la autorrenovación y proliferación en células troncales (Gao et al., 2008).

Además de que modula la ocupación de Brg1 y es crucial para prevenir la hiperacetilación de la

cromatina limitando así la expresión inadecuada de genes durante la diferenciación cardiaca (Singh &

Archer, 2014). En contraste, se considera que la función de ARID1B es activadora (Inoue et al., 2011;

Nagl et al., 2007), ya que es indispensable para la progresión del ciclo celular (Flores-Alcantar et al.,

2011; Inoue et al., 2011; Nagl et al., 2007) y favorece la transcripción (Nagl et al., 2007). Finalmente,

ARID2 (formando parte del complejo PBAF) contribuye a mantener la identidad celular y a activar la

expresión genética tejido-especifica, como por ejemplo en osteoblastos (Xu et al., 2012). Estos datos

se reflejan en nuestros resultados, donde ARID1B/BAF250B y ARID2/BAF200 son posteriores a

ARID1A/BAF250A, en esta etapa de transición, probablemente para apoyar la correcta progresión

hacia el fenotipo diferenciado, a la vez que se limitan la proliferación.

Para el caso de las ATPasas, la expresión que observamos concuerda con lo reportado para

fibroblastos de embrión de ratón, donde BRG1 se mantiene constante durante el proceso de

diferenciación, mientras que BRM también se incrementa hasta 10 veces respecto a las células

troncales (Reyes et al., 1998). Al igual que en el caso de la familia Arid, BRM y BRG1 poseen funciones

parcialmente redundantes (Willis et al., 2012; Wilson et al., 2014) siendo intercambiables, aunque en

los complejos remodeladores de cromatina se encuentran en equilibrio, ya que si se elimina una de las

ATPasas la otra se sobreexpresa, o bien, si se sobreexpresa alguna se reduce la expresión de la otra

(Reyes et al., 1998). Por ello, los resultados sugieren que BRM puede reemplazar a BRG1 en los

complejos remodeladores de las células diferenciadas en el epitelio estratificado (día 10 de cultivo).

Estas células deben presentar una predominancia de complejos PBAF, gracias a la abundancia de la

subunidad característica Arid2/BAF200 la cual sólo puede interaccionar con Brg1.


84

Por otra parte el aumento considerable en la expresión de Arid1b/BAF250b sugiere que ésta

proteína puede está formando complejos a partir del día 6 en cultivo con cualquiera de las dos ATPasas

BRG1 o BRM, ya que esta subunidad puede interaccionar con ambas (Gresh et al., 2005). Su actividad

es contrastante según el modelo, en células HeLa su inducción causa la limitación del crecimiento

celular y la acumulación de células en fase G0/G1, activa a p21 regulando a la baja a c-myc (Inoue et al.,

2011); también se requiere para diferenciación temprana del cerebro (Flores-Alcantar et al., 2011); y

por otro lado la inactivación de ARID1b en células troncales embrionarias causa una reducción de su

proliferación y un ciclo celular anormal (Yan et al., 2008). De manera adicional, probablemente en

células diferenciadas existen configuraciones poco abundantes como las de forma

Ard1a/BAF250a+BRM observada en la coinmunoprecipitación. Estas configuraciones concuerdan con

otras reportadas para células terminalmente diferenciadas, en donde es más común encontrar

complejos BRM/ARID1A en promotores reprimidos, en contraste con promotores activos donde se

asocian principalmente complejos BRG1/ARID1B (Flores-Alcantar et al., 2011).

Estos cambios estructurales en los complejos proporcionan una funcionalidad específica, por

lo que al ubicar la expresión de mensajero que codifica para ambas ATPasas en la progresión de la

diferenciación en cultivo Brg1 parece contribuir al encendido del programa de diferenciación bajo el

control de p63 (véase más arriba), para después mantenerse constante como se ha observado en otros

modelos de diferenciación (Albini et al., 2015; Muchardt et al., 1998; Reyes et al., 1998), y favorecer la

expresión de BRM durante la transición. Puesto que los complejos que contienen BRM participan en

la activación de genes del fenotipo diferenciado debido a su efecto facilitador sobre la transcripción

global mediada por la RNA-Pol II (Armstrong et al., 2002). Cabe mencionar que, de manera adicional,

se observa un aumento de su expresión, en células situadas en G0 y en células inducidas a

diferenciación (Muchardt et al., 1998; Reyes et al., 1998). Este intercambio de ATPasas ocurre de la

misma manera durante la diferenciación muscular, donde BRG1 se requiere en etapas tempranas y

BRM es necesaria para la represión de la Ciclina D1 y el cese de la proliferación justo antes de la

activación de los genes específicos de músculo (Albini et al., 2015). Dicho intercambio es interesante

ya que ambas ATPasas establecen interacciones proteína-proteína con moléculas completamente

diferentes. Mientras que BRG1 interacciona con elementos de la gran familia de proteínas con dedos

de zinc, BRM interacciona con proteínas que contienen dos repetidos de anquirina. Entre éstas se

encuentran proteínas de la familia de NOTCH (Kadam & Emerson, 2003).


85

Al concretar todas estas observaciones podemos proponer un esquema con las

configuraciones de los diferentes complejos remodeladores de cromatina que probablemente están

favorecidas durante las tres etapas del proceso de diferenciación in vitro del epitelio corneal, que se

muestra en la Figura 35.

Figura 35 Configuraciones propuestas de los posibles complejos remodeladores BAF y PBAF en las diferentes etapas de la

diferenciación del epitelio corneal.

Finalmente, al analizar el efecto que tiene la estimulación de las células RCE1(5T5) con las

formas recombinantes solubles de Notch1 y ligandos solubles Jagged1/2 y Delta1, con el fin de

relacionar a esta vía con los fenómenos epigenéticos estudiados, se observaron resultados

contradictorios. Previamente se demostró que mientras Jagged1 estimula la diferenciación e inhibe la

proliferación, Notch-1 promueve la proliferación de la línea celular RCE1 (5T5) (Mata-Lozano, 2012).

Además, Notch participa en la proliferación y/o en la diferenciación del epitelio corneal (Djalilian et al.,


86

2008; Lu et al., 2012; Xin et al., 2010). Sin embargo, encontramos que el tratamiento con las formas

recombinantes solubles de Notch-1 de rata y de humano estimuló la diferenciación como lo sugiere la

expresión de la citoqueratina K3 ligada al fenotipo terminal (Schermer et al., 1986), al mismo tiempo

que estimuló la expresión de PRDM16. En contraste, un factor que promueve la proliferación y la

migración como el EGF, no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de esta metiltransferasa de

histonas, lo cual podría interpretarse como la activación de la metilación para reducir la disponibilidad

de secuencias específicas que deben apagarse para iniciar el programa de diferenciación. Por otra

parte, los elementos indispensables para el ensamble de los complejo BAF y PBAF, las proteínas ARID

no presentaron cambios significativos después de 4 días de tratamiento, hecho que podría

correlacionarse con el tiempo de cultivo en el que se obtuvo el RNA, donde normalmente sin

estimulación, las células todavía son proliferativas y no diferenciadas. En este aspecto, los resultados

obtenidos al intentar la activación de la vía de Notch no nos permitieron obtener resultados

concluyentes, por los que se necesita elaborar un mejor sistema de ensayo para analizar los efectos

de estas moléculas.

A pesar de ello, como lo indican los resultados, la activación de la vía en este sistema no influye

en la expresión de los componentes de estos complejos remodeladores. Por el contrario, es probable

que los complejos influyan sobre la expresión de receptores y ligandos de la vía de NOTCH, como se

observó en numerosos reportes (Armstrong et al., 2005; Kadam & Emerson, 2003; Leung et al., 2008;

X. Zeng et al., 2013). Así pues, el contacto célula-célula registrado gracias a la vía de NOTCH debe

ejercer un efecto sobre las metiltransferasas de histonas PRDM3 y 16, como se ha reportado para otros

sistemas. Esta relación es responsable de fijar destinos celulares específicos como ocurre durante de

la neurogénesis en el sistema nervioso central de mamífero (Horn et al., 2011; Kinameri et al., 2008);

o en el pardeamiento del tejido adiposo blanco (Bi et al., 2014). Además, Hamlet, una proteína

ortóloga a PRDM3 y PRDM16, cambia las respuestas transcripcionales a la vía de Notch multiplicando

la cantidad de destinos posibles durante el desarrollo de las neuronas del receptor olfatorio (ORN) en

Drosophila (Endo et al., 2012; Moore et al., 2002). Dicha evidencia concuerda con sus cinéticas de

expresión, donde la máxima expresión de ambas metiltransferasas se alcanza cuando se inicia la

disminución en el marcador de proliferación ∆Np63α y se presenta la expresión creciente del marcador

de diferenciación PAX6. Esta progresión pudiera estar relacionada con la preparación para fijar el

estado diferenciado de la cromatina, silenciando como heterocromatina a todo el material genético

que no sea parte de programa de diferenciación terminal (Pinheiro et al., 2012). Particularmente la

expresión de PRDM16 disminuye en los días posteriores al compromiso y se eleva cuando se forma un


87

epitelio estratificado maduro (10° día en cultivo), probablemente estructurando la heterocromatina

para mantener su arquitectura en las células que expresan el fenotipo diferenciado (Pinheiro et al.,

2012). Por otro lado, es de destacarse que la expresión PRDM16 es precedida ligeramente por la de

PRDM3 (máxima al 5to día de cultivo), lo que sugiere que ambas proteínas tienen funciones que sólo

se sobrelapan de manera parcial (Ding et al., 2013; Pinheiro et al., 2012). Este aumento de PRDM3, tan

temprano en el proceso de diferenciación, podría estar relacionado con su participación en la

regulación de otros fenómenos como la proliferación celular como fue descrito previamente (Hoyt

et al., 1997; Morishita, 2007; Yuasa et al., 2005). Además, la expresión de PRDM3 disminuye a niveles

menores a los basales el día 10 de cultivo, cuando el epitelio ya está estratificado, lo cual sugiere que

el mantenimiento de las marcas de heterocromatina constitutiva es responsabilidad de PRDM16 para

el caso del epitelio corneal.

Con respecto a CTBP2 a pesar de que funciona como parte del complejo silenciador de las

metiltransferasas PRDM (Stankiewicz et al., 2014) no observamos un patrón de expresión que

correlacione con su actividad. Podría ser que los cambios durante el desarrollo no modifiquen la

transcripción del gen, aunque la proteína correspondiente se regule diferencialmente a través de

mecanismos postraduccionales, o bien que su transcripción dependa de elementos que no ligados a

los cambios que ocurren durante la diferenciación, o alternativamente, simplemente se utilicen otras

proteínas de la misma familia como CTBP1, que participa en la vía de NOTCH (Bray, 2006; Schwanbeck,

2015). Sin embargo, necesitaríamos evaluar dicha interacción para resolver su mecanismo más a

fondo.


88

9 PERSPECTIVAS A continuación, esta investigación puede ampliarse por tres direcciones concretas que

requieren distintas metodologías. Inicialmente se pude profundizar en la caracterización de los

complejos en las distintas etapas de la diferenciación en la línea celular e inclusive en tejido primario,

utilizando metodologías de purificación bioquímica adicionales, por ejemplo; utilizando gradientes de

glicerol combinados con secuenciación de proteínas como se realizó para otros modelos (Cigall Kadoch

et al., 2013), además de completar las cinéticas y coinmunoprecipitación de proteínas mostradas aquí.

Esto permitiría identificar a detalle el intercambio de subunidades en estos complejos junto con la

configuración predominante en cada población celular de tal manera que esta información se pueda

correlacionar con las funciones individuales atribuidas a cada subunidad.

Por otro lado, podría explorarse más a fondo la relación de los elementos epigéneticos

estudiados a nivel de regulación genética y vías de señalización con factores de transcripción como

p63 y Pax6 que son indispensables para la diferenciación del epitelio. Por ejemplo, por medio de la

exploración de secuencias consenso de la interacción Pax6-Brg1, o dentro de las secuencias de las

subunidades de los complejos y las metiltransferasas de histonas que les permitan ser controladas por

estos factores de transcripción y otros relevantes. También, la exploración por medio de secuenciación

masiva para identificar la participación de los complejos en la transcripción de algo similar al complejo

de diferenciación epidermal (EDC) (Botchkarev, 2015, 2017; Mardaryev et al., 2014), en córnea.

Finalmente, hace falta profundizar acerca de la participación de las metiltransferasas de

histonas en la vía de NOTCH, observamos que esta vía puede controlar de alguna manera la expresión

de Prdm16, hace falta explorar de primera instancia si ocurre algo similar para Prdm3 y ¿quién es

responsable de esta interacción? ¿cuáles son los receptores de la vía ligados directamente a la

modificación? ¿qué efectos conlleva esta modificación?, se espera una interacción regulatoria con

estos elementos en la toma de decisiones en la diferenciación, como se ha visto para otros modelos

(Schmucker & Hassan, 2012) por lo tanto se debe explorar si ocurre algo similar en la diferenciación

del epitelio corneal. Donde es posible que intervengan distintos complejos remodeladores de la

cromatina.


89

10 CONCLUSIONES

Durante la diferenciación, la línea celular de epitelio corneal de conejo RCE1 (5T5) expresa los

complejos remodeladores de la cromatina BAF y PBAF y a las metiltransferasas de histonas PRDM16 y

PRDM3, con patrones que sugieren su participación en la transición que ocurre cuando las células

llegan a confluencia e inician la expresión del fenotipo terminal. Se comprobó que estos complejos

presentan todas las subunidades núcleo, subunidades identificadoras y ATPasas que los constituyen.

Es probable que, durante la diferenciación se presente el cambio y/o sustitución de subunidades,

permitiendo la expresión específica de tejido, y el apagado de genes que participan en otras funciones

celulares no esenciales para la especialización del tejido.

De manera importante, se comprobó la existencia de interacciones entre elementos del complejo

remodelador de cromatina y el factor de transcripción PAX6, que aparentemente funciona como gen

rector de la expresión de todo el programa de diferenciación. Esta interacción fue específica hacia la

ATPasa Brg1 y puede ser esencial para el inicio del proceso de desarrollo.

Por otra parte, establecimos un posible modelo de transición entre las tres etapas de

diferenciación distinguidas en nuestro laboratorio, en las que pueden asignarse algunas funciones a

cada uno de los complejos existentes en cada etapa. Observamos cómo la expresión de los complejos

no está dirigida por la vía de NOTCH lo cual sugiere que el detonante de su expresión es más temprano

a la confluencia y está involucrado con p63. Por el contrario, las metiltransferasas de histonas Prdm3

y 16 se encuentran bajo el control de esta vía. Lo cual implicaría que su expresión es posterior a la

llegada a confluencia, cuando las células sufren la polarización de sus receptores membranales; estos

cambios estructurales podrían estar detonados por la misma remodelación de la cromatina.

Finalmente, concluimos que estos complejos son sumamente importantes en la transición entre

estados celulares y no sería sorprendente que tuvieran una función biológica importante en la

dirección del proceso de diferenciación al controlar la expresión de elementos como los receptores de

la vía de NOTCH, y por lo tanto permitir la expresión del fenotipo epitelial terminal.

Como se puede apreciar, este trabajo es el inicio del abordaje de un proceso extremadamente

complejo. Más que resolver preguntas, hemos abierto un panorama que requiere el determinar qué

otras subunidades del complejo de remodelación de cromatina se encuentran en el epitelio corneal,

así como hace necesario el conocer las relaciones cuantitativas entre cada uno de los componentes de

los complejos y sus relaciones con el resto de los elementos en este sistema.


90

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ABSTRACT :, 5(January).


102

12 MATERIAL SUPLEMENTARIO

12.1 Apéndice 1

Para realizar el seguimiento de la población celular se realizó el conteo de células cada día a

partir del día 2 por medio de la tripsinización de cajas de cultivo de 35 mm de diámetro y conteo en

cámara de Neubauer posterior a la eliminación de las células alimentadoras (hasta el día 5) con verseno

(PBS 1x + EDTA 0.02% (p/v)) según los métodos habituales del laboratorio.

Numero de células vs. días de cultivo (Log10)


0 2 4 6 8 10 12

Nú

me

ro d

e c

élu

las

105

106

107

No. de células

Figura suplementaria 1 Progresión de la división celular (días de cultivo celular vs. número de células). Se muestra el valor

promedio de al menos 3 cajas cultivas en paralelo, las barras indican su desviación estándar correspondiente. La flecha indica

el día en el que las células alcanzaron confluencia.

Según los mismos métodos descritos en la Sección 8.1 se caracterizó la expresión de los

marcadores de diferenciación conocidos para la línea celular: Pax-6 (Garcia-Villegas et al., 2009) y el

marcador de proliferación de células epiteliales ∆Np63α (Pellegrini et al., 2001).

El factor de transcripción p63, es un conocido indicador de células proliferativas. Inicialmente

se propuso como un marcador de células troncales epidermales; además, el estudio de la distribución

de sus isoformas en el epitelio ocular (Kawasaki et al., 2006) mostró que únicamente las isoformas sin

región de transactivación (∆Np63) se encontraban en el epitelio y que específicamente la ∆Np63α que

tiene su máxima expresión en el nicho de células troncales del epitelio corneal; la sección basal del


103

limbo. Donde es responsable al menos en parte de la capacidad proliferativa y potencial migratorio de

las células troncales (Di Iorio et al., 2005; Robertson et al., 2009). Por lo cual, esperamos que las células

que son positivas para dicho factor se encuentran en un estado proliferativo. Por otro lado, PAX6 es

un factor de transcripción esencial para el desarrollo de tejidos que incluyen a los ojos, sistema

nervioso central y glándulas endocrinas en vertebrado e invertebrados (Simpson & Price, 2002) El

aumento en la expresión de PAX6 está relacionado a la progresión de la diferenciación del epitelio

corneal y se encuentra rio arriba de la expresión de las citoqueratinas 12/3, par relacionado con la

diferenciación terminal de la córnea (Sasamoto et al., 2016a).

Observamos que las proteínas utilizadas como controles Pax6 y ∆Np63α son adecuadas para

contrastar la progresión de la diferenciación con expresión de las proteínas de los complejos y

metiltransferasas de histonas involucradas ya que muestran el patrón de expresión reportado

anteriormente (Garcia-Villegas et al., 2009).


0 2 4 6 8 10 12

Nú

me

ro d

e c

élu

las

105

106

107

No. de células

Ex

pre

sió

n d

e P

ax

6 y

p6

3a

lfa

(N

orm

aliz

ad

a)

0

1

2

3

4

5

6

Pax6 (n=5)

p63alfa (n=4)

Figura suplementaria 2 Expresión de RNAm de ∆Np63α (azul) y PAX6 (rojo) en la diferenciación del epitelio corneal (RCE-

5T5). Se realizó el cultivo celular y a partir del día 3 de cultivo se extrajo RNA diariamente, se preparó cDNA y se realizó la RT-

qPCR con las sondas correspondientes. Se grafico la expresión genética posterior al cálculo del 2-∆∆Ct tomando como referencia

su expresión basal en el día 3 y PR-P0. Los puntos indican el valor promedio, las barras indican su desviación estándar

correspondiente, “n” indica el número de repeticiones biológicas consideradas. La flecha indica el día en el que las células

alcanzaron confluencia. Se incluye la progresión de la división celular en escala logarítmica en línea punteada.

Análisis de la expresión de metiltransferasas de histonas ...

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