ANÁLISIS DE LEGIONELLA, CUANTIFICACIÓN DE VIABLES POR BIOLOGÍA MOLECULAR (v‐qPCR): 

UNA REALIDAD

Marta Brull FontserèAlbert Manero Camps

Mina Pública d’Aigües de Terrassa, SA

Mina Pública d’Aigües de Terrassa, SA

Presentación

1842 constitución de la empresa  1998 Certificación UNE‐EN ISO 9002 (y posterior ISO 9001) 1999 Creación de la Fundación Mina  2000 Certificación UNE‐EN ISO 14.001 2001 Verificación Reglamento (CE) EMAS 761/2001 2002 Acreditación UNE‐EN ISO 17025 ENAC (Laboratorio) 2002‐2012 Ampliación Alcance Certificaciones 2012 Sello Europeo de Excelencia en la Gestión Empresarial 

EFQM 400+ 2014 Renovación Sello EFQM 400+

HISTORIA

Calidad Analítica: Fiabilidad y precisión.

Anterior a 1950 primer Laboratorio de control 1976 ‐1985 Ampliación Técnicas Analíticas 1986 Establiment Tècnic Auxiliar de la Junta de Sanejament

(actual ACA) 1992‐1999 Técnicas Instrumentales 1996 Registro Laboratorios de Salud Ambiental y 

Alimentaria – Registro Laboratorio DARP Generalitat de Catalunya

1998 Creación Unidad de Microbiología 2002 Acreditación por ENAC 2004 Técnicas de Biología Molecular

CRONOLOGIA

Proteger la Salud de las PersonasGarantía Sanitaria del Agua de ConsumoControl de Calidad del Agua

Métodos

Marco legal

Real Decreto 865/2003

ISO 11731 Parte 1

Decret 352/2004

Artículo 28: métodos oficialmente aprobados o 

recomendados internacionalmente

Guías Ministerio

ISO 11731 Parte 1

Métodos

Métodos

RT PCR Inmunodetección

ISO 11731

SubjetividadISO 11731

Limitaciones

ISO 11731

Sin tratamiento Tratamiento ácido Tratamiento térmico

NO DETERMINABLE

“La abundante presencia de flora interferente no permite realizar la detección i cuantificación de Legionella”

Limitaciones

ISO 11731

Sin tratamiento Tratamiento ácido Tratamiento térmico

NO CONCLUYENTE

“La abundante presencia de flora interferente puede haber enmascarado la posible presencia de colonias de Legionella, pudiendo tratarse de un resultado falso negativo”

Limitaciones

ISO 11731

Sin tratamiento Tratamiento ácido Tratamiento térmico

RECUENTO A LA BAJA

Recuperación baja

ISO 11731

NT 32 ENAC

PRECISIÓN

EXACTITUD RECUPERACIÓN

E. coli, coliformes, C. perfringens…

65‐85%

Legionella ISO 11731

20‐30%

qPCR Sondas TaqMan

Patrones ADNq‐PCR

Recta patrónq‐PCR

Cuantificaciónq‐PCR

Muestra positiva

Cuantificaciónq‐PCR

q‐PCR

Muestra negativa

Normalización qPCR

NF T 90‐471: Détection et quantification des Legionella et/ou L. pneumophila par concentration et amplification génique par PCR‐RT.

ISO/TS 12869: Water quality ‐ Detection and quantification of Legionella spp. and/or L. pneumophila by concentration and genic amplification by quantitativepolymerase chain reaction (qPCR).

Desinfección perfecta

q‐PCR positivo

ISO 11731 positivo

q‐PCR positivo

ISO 11731 negativo

Muestra real

PMA / EMA

Ethidiummonoazide EMAPropidiummonoazide PMA

PMA / EMA

Viability qPCR

Diseño experimental

Eficiencia PMA

4,2 log

Eficiencia PMA

4,2 log

Concentración PMA. Temperatura y tiempo de contacto. Características de la Fotoactivación. Tamaño del amplicón. Uso de tampones.

Factores eficiencia PMA

2,7 log 4,2 log

Pendiente qPCR i V‐qPCR: niveles de alerta recomendados para valorar el riesgo.

V‐qPCR

Pros:• Rapidez• Sensible• Específico• Diferencia viables=riesgo sanitario• …

Contras:• No se aísla la bacteria, no serotipado.• Precio reactivos PCR (no PMA).• Personal altamente cualificado.• Interferencias fotoactivación PMA• …

Publicaciones V‐qPCR

Cada método proporciona diferentes informaciones y en muchos escenarios no presentan una buena correlación.

Es importante conocer los pros y contras de cada método para hacer correcta interpretación de resultados (valorar riesgo sanitario real).

Cada método será más o menos adecuado según el objetivo, la matriz, etc...

Conclusiones

Legionella España 

Viability PCR

Muchas graciasamanero@aiguesdeterrassa.commbrull@aiguesdeterrassa.com