Análisis del anudamiento del ADN...
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Análisis del anudamiento del ADN intracelular Antonio Valdés Gutiérrez Aquesta tesi doctoral està subjecta a la llicència Reconeixement 4.0. Espanya de Creative Commons. Esta tesis doctoral está sujeta a la licencia Reconocimiento 4.0. España de Creative Commons. This doctoral thesis is licensed under the Creative Commons Attribution 4.0. Spain License.
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Análisis del anudamiento del ADN intracelular
Antonio Valdés Gutiérrez
Aquesta tesi doctoral està subjecta a la llicència Reconeixement 4.0. Espanya de Creative Commons. Esta tesis doctoral está sujeta a la licencia Reconocimiento 4.0. España de Creative Commons. This doctoral thesis is licensed under the Creative Commons Attribution 4.0. Spain License.
Tesis doctoral
Facultad de Biología
Departamento de Genética
Programa de Genética
ANALISIS DEL ANUDAMIENTO DEL ADN INTRACELULAR
Memoria presentada por Antonio Valdés Gutiérrez para optar al grado de
Doctor por la Universidad de Barcelona.
Este trabajo ha sido realizado bajo la dirección del Dr. Joaquim Roca
Unidad de Biología Estructural del Instituto de Biología Molecular de Barcelona (CSIC)
Barcelona 2018
Director de la tesis Tutor de la tesis Autor de la tesis
Joaquim Roca Bosch Pere Martínez Serra Antonio Valdés Gutiérrez
Barcelona, Diciembre de 2018
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“You can't always get what you want.
But if you try sometime you find
you get what you need”
(M. Jagger)
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A mis padres.
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Agradecimientos Ha sido largo el camino que me ha traído hasta aquí, y complicado de recorrer si no es por todas las personas que me he ido encontrando y me han ayudado de una forma u otra a disfrutar de él y a reencontrarlo en los momentos más confusos. La primera persona a quien querría dar las gracias es a Joaquim, por su confianza y permitirme trabajar en su laboratorio. Has sido más que un director de tesis, como escribió Lao Tze: “El verdadero maestro actúa sin acción y enseña sin palabras”. Gracias por tu formación y por enseñarme lo que realmente es esencial en la ciencia. Y a Pere, tutor de esta tesis, gracias por el seguimiento y tener la puerta de tu despacho siempre abierta para mí. Nací en Asturias y esta tierra siempre me ha contagiado un gran interés por la naturaleza; observando su costa nació mi pasión por la biología y por el misterio de lo vivo. Muchos profesores han contribuido a seguir cultivando mi interés en esta ciencia y a ellos también les debo mucho. En el instituto, Rafa, fuiste quien mejor me inculcó la idea de que toda la naturaleza está conectada. En la universidad, Freije, me trasmitiste pasión, curiosidad y espíritu crítico. De esta misma época también he de agradecer a Jose Antonio la oportunidad de realizar mi trabajo fin de máster con tu grupo y a Yaisel, por todas tus lecciones de cómo trabajar en un laboratorio que me acompañarán siempre. En Asturias tengo grandes amigos que de una forma diferente también han contribuido a que llegara hasta aquí y que siempre serán uno de los motivos por los que volver a casa. Gracias a Fer, que siempre me recuerdas lo importante que es pasárselo bien. A Omar que siempre me nutres de buena música y nuevas cervezas. Y sobre todo a Álvaro, mi hermano, un faro que enfoca a la vida. Desgraciadamente, creo que la mayoría de las cosas vividas juntos no pueden escribirse aquí. Durante los años en Barcelona me he cruzado con mucha gente que ha conseguido que esta gran ciudad ya forme parte de mí. De entre todos ellos quisiera agradecer en especial a Salva, sembraste la semilla de la afición a la montaña y me mostraste lugares maravillosos de Cataluña y un espíritu de compañerismo que espero poder transmitir allá donde vaya con la misma naturalidad que tú lo haces. A Gago, te has convertido en un verdadero amigo y confesor. A Luca, el italiano loco, que entre cerveza y cerveza me enseñaste que los átomos no son realmente bolas de colores con bolitas más pequeñas girando a su alredor. Y gracias al grupo de Tai Chi, hermanos de práctica con quienes he seguido cultivando este arte y especialmente a Joshu, maestro de caligrafía y autor de esta portada. Una de las personas más importantes durante mi etapa en Barcelona ha sido sin duda, Tito. Gracias a ti, a Mari Carmen, a Loren y a Irene. Nunca podré agradecer suficiente cómo me acogisteis en vuestra casa, habéis sido mi familia. Sin olvidar los libritos de Mari Carmen, ya famosos en el Parc Cientific. Mi paso por el PEBC, aunque breve, fue muy enriquecedor. Gracias a Puri por su confianza, además de los desayunos juntos, me ayudaste a empezar a crecer y a madurar como científico. Y gracias a Vicky, con quien compartí largos experimentos llenos de conversaciones y discusiones científicas que siempre echaré en falta.
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Dentro del IBMB también he encontrado grandes compañeros y científicos. Gracias a todo el laboratorio del Carme y Martí, siempre habéis compartido todo con generosidad y especialmente gracias a David, mago de las levaduras y enciclopedia de protocolos. Gracias a Iracema, por compartir tus habilidades en repostería y tus recomendaciones musicales, descubrir nuevos sonidos es uno de los mayores placeres. Y a Raquel, por las estimulantes conversaciones y tu espíritu científico. Gracias a Kim, por darme la oportunidad de hacer la estancia en tu laboratorio y por enseñarme que lo más importante siempre es saber cuál es la pregunta. Y a Johanna, que me acogiste y confiaste en mí desde el primer día, gracias por tu hospitalidad, mi estancia en Oxford habría sido completamente distinta sin ti. Dentro del laboratorio de Joaquim las gracias son infinitas. Gracias a Xavi, has sido mi mentor en el mundo de la topología, compartiré tu conocimiento allí donde vaya. A Ricky, energía motivadora, agradezco mucho tus consejos de cómo continuar en esta larga carrera científica, también me enseñaste bien la lección de que no se le puede ganar a un inglés bebiendo cerveza. A Ofelia, compañera del Norte y agradecido público de mi humor, me has hecho sentir más cerca de mi tierra. A Belén, por compartir conversaciones y consejos personales, por ser una gran fuente de cultura musical y cinéfila y porque gran parte de esta tesis te pertenece a ti también. A Joana, hemos recorrido todo este camino juntos, nos hemos quejado, nos hemos reído…y te has convertido en una gran amiga. Y a Silvia, que a pesar de haber llegado casi al final, te has quedado para siempre. Ni el Lab ni el barrio habrían sido lo mismo sin ti. A Susana, un ser de otro mundo capaz de conectar lo material y lo etéreo. Me has enseñado que la ciencia sin arte no tiene sentido y que la intuición es una herramienta poderosa que también hay que aprender a escuchar. Y por su puesto, un millón de gracias a toda mi familia, por haberme mostrado lo que es un hogar. A mis padres por vuestros sacrificios y por haberme apoyado siempre. Y en especial, por haberme regalado una infancia feliz sobre la que ahora puedo construir una vida sana. A Isa y Rosi por lo que me habéis aguantado y haber seguido siempre a mi lado. Por la educación y alimentar mi curiosidad desde pequeño. Y a Tanin y Elda, por haberme enseñado a tener paciencia y sobre todo por haberme mostrado siempre amor. Gracias a todos.
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Índice
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Prólogo ...................................................................................................................... 13
Introducción .............................................................................................................. 17
1. Estructura del ADN ....................................................................................... 19
2. Perspectiva histórica de la topología del ADN ............................................ 20
3. Topología del ADN ........................................................................................ 22 3.1. Parámetros para describir la topología del ADN .......................................... 23 3.2. La topología del ADN en la regulación del genoma ..................................... 27
4. Topoisomerasas ............................................................................................ 28 4.1. Topoisomerasas tipo IA ............................................................................... 29 4.2. Topoisomerasas tipo IB ............................................................................... 30 4.3. Topoisomerasas tipo II ................................................................................ 31 4.4. Principales funciones de las topoisomerasas .............................................. 34
5. Cromatina ...................................................................................................... 36 5.1. Estructura básica del nucleosoma ............................................................... 36 5.2. Organización superior de la fibra de nucleosomas ...................................... 37 5.3. Organización tridimensional de la cromatina en el núcleo ........................... 39
6. Interrelación entre cromatina, topología del ADN y topoisomerasas ........ 41
7. Anudamiento del ADN .................................................................................. 43 7.1. ¿Qué es un nudo? ....................................................................................... 44 7.2. Nudos de ADN ............................................................................................ 48 7.3. Métodos para la caracterización del anudamiento de ADN.......................... 50
8. Hipótesis de partida ...................................................................................... 54
Material y métodos ................................................................................................... 59
1. Materiales ...................................................................................................... 61 1.1. Anillos de ADN y Plásmidos ........................................................................ 61 1.2. Cepas bacterianas ...................................................................................... 62 1.3. Cepas de levadura ...................................................................................... 62
2. Técnicas generales de biología molecular .................................................. 62 2.1. Transformación de E. coli mediante electroporación ................................... 62 2.2. Obtención analítica y preparativa de plásmidos (miniprep y maxiprep) ....... 63 2.3. Cultivo de levadura ...................................................................................... 63 2.4. Transformación de Saccharomyces cerevisiae con ADN circular ................ 63
3. Técnicas de topología del ADN ................................................................... 64 3.1. Técnicas electroforéticas para el estudio de la topología del ADN............... 64 3.1.1. Análisis de Lk mediante electroforesis en gel 2D ......................................... 64 3.1.2. Análisis de anillos de ADN anudados mediante electroforesis en gel 2D..... 67 3.1.3. Transferencia del ADN (Southern), hibridación y detección de señales mediante quimioluminiscencia ................................................................................ 70 3.2. Preparación de muestras in vitro ................................................................. 70 3.2.1. Formación de nudos de ADN mediante incubación de plásmidos con un exceso de topoisomerasa II .................................................................................... 70
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3.2.2. Formación de nudos positivos y negativos de ADN mediante circularización de ADN ................................................................................................................... 71 3.2.3. Ajuste de la densidad de superenrollamiento negativo en los anillos de ADN 72 3.3. Preparación de muestras in vivo.................................................................. 73 3.3.1. Extracción del ADN de minicromosoma circular de S. cerevisiae ................ 73
Resultados ................................................................................................................ 75
1. Formación de nudos de ADN en cromatina eucariótica ............................. 77 1.1. Nudos de ADN en cromatina eucariota........................................................ 77 1.2. Los nudos en cromatina no son producto de la replicación del ADN ........... 80 1.3. La actividad de la topoisomerasa II mantiene activamente las fracciones de ADN anudado ......................................................................................................... 82 1.4. La probabilidad de anudamiento del ADN in vivo no incrementa proporcionalmente con la longitud de la fibra de cromatina ..................................... 84
2. Efectos del superenrollamiento del ADN en la formación nudos en la cromatina intracelular. ............................................................................................. 89
2.1. El superenrollamiento (+) y (-) del ADN afectan de manera diferente a la formación de nudos en la cromatina intracelular ..................................................... 89 2.2. El superenrollamiento (+) del ADN aumenta la probabilidad y complejidad de anudamiento del ADN ............................................................................................. 95 2.3. Los nudos de ADN se forman debido a la condensación de la cromatina inducida por el superenrollamiento (+) .................................................................... 97
3. Estudio de la quiralidad de nudos de ADN in vivo ................................... 101 3.1. Enfoque teórico para discernir la quiralidad de nudos de ADN mediante electroforesis. ....................................................................................................... 102 3.2. Quiralidad de los nudos de trébol de ADN generados in vitro. ................... 106 3.3. Quiralidad de los tréboles de ADN generados in vivo ................................ 110
Discusión ................................................................................................................ 113
1. Nudos de ADN en la cromatina eucariótica ............................................... 115
2. El superenrollamiento del ADN intracelular aumenta su probabilidad de anudamiento al compactarse la cromatina ........................................................... 123
3. Los nudos de ADN excluyen un plegamiento quiral de la fibra de nucleosomas in vivo ............................................................................................... 127
Conclusiones .......................................................................................................... 131
Bibliografía .............................................................................................................. 135
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Prólogo
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Prólogo
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La mayoría de las transacciones del genoma producen estrés topológico en el ADN,
que se reduce gracias a la acción de las topoisomerasas. Por ejemplo, durante la
transcripción y replicación del ADN, las topoisomerasas I y II cortan transitoriamente
las cadenas de ADN para poder pasar unas a través de otras y relajar así el
superenrollamiento del ADN producido por el avance de las polimerasas. Durante la
replicación del ADN la actividad de la topoisomerasa II es esencial, ya que elimina los
encadenamientos que se generan entre las cromátidas hermanas. Sin embargo, la
singular actividad de las topoisomerasas entraña también varios riesgos. Por un lado,
los cortes que producen en el ADN son potencialmente dañinos, lo que se ha
explotado como diana terapéutica. Por otro lado, su mecanismo de traspaso de
cadenas de ADN puede acabar enredando las moléculas de ADN intracelular y
producir encadenamientos entre cromosomas o dentro de un mismo cromosoma.
Desde los años 80, estudios in vitro han demostrado que el ADN puede anudarse. El
análisis de estos nudos ha sido muy útil para determinar propiedades físicas y
conformacionales del ADN. Desde entonces, varios estudios han demostrado que la
aparición de nudos de ADN es frecuente en plásmidos y cromosomas bacterianos. Sin
embargo, en células eucariotas la aparición de nudos en el ADN aún no ha sido
documentada. En este sentido, la hipótesis de partida de esta tesis es que, dada la
condensación del ADN en las fibras de cromatina y la abundante actividad de la
topoisomerasa II en el núcleo celular, la presencia de nudos de ADN en la cromatina
es muy probable. Si fuera así, la caracterización de esos nudos sería útil para desvelar
nuevos aspectos de la conformación y propiedades biofísicas de las fibras de
cromatina in vivo.
Esta tesis doctoral constituye un reto de investigación novedoso y original por dos
motivos. Primero, se trata del primer estudio sobre nudos de ADN en cromatina nativa
y abre, por lo tanto, un campo nuevo en el estudio de la topología del genoma en
eucariotas. Segundo, el tipo de experimentos y análisis realizados ha conllevado el
desarrollo de nuevas metodologías para el estudio de la topología del ADN
intracelular.
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Introducción
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Introducción
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1. Estructura del ADN
Una de las ideas seminales de la biología es que todos los organismos vivos están
formados por células que no aparecen de novo, sino que surgen del crecimiento y
división de células ya preexistentes, siendo el ADN el principal vehículo que transfiere
la información genética entre células madre e hijas.
El ADN, químicamente, se compone de dos cadenas de nucleótidos. Cada nucleótido
consiste en una pentosa (2’-desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada
(Adenina, Timina, Guanina o Citosina). Cada una de estas pentosas forma un enlace
fosfodiéster con los dos fosfatos adyacentes, uno a través de su hidroxilo 3’ y otro a
través del hidroxilo 5’. La esencia de la doble cadena de ADN es el emparejamiento
específico entre las bases complementarias de dos cadenas a través de puentes de
hidrógeno. Adenina empareja con timina, y guanina se empareja con citosina. La
secuencia de las cadenas de nucleótidos es lo que se conoce como estructura
primaria del ADN (Figura I1).
Las cadenas complementarias de nucleótidos se disponen en una orientación
antiparalela, en la que los pares de bases (pb) se apilan con un giro en sentido
dextrógiro de unos 36 grados con respecto al par anterior. Este apilamiento hace que
las dos cadenas apareadas configuren una doble hélice que gira en sentido dextrógiro
(Watson & Crick, 1953a), en cuyo interior hidrófobo se apilan las bases nitrogenadas y
en cuyo exterior hidrófilo se exponen las pentosas y fosfatos. Esta estructura helicoidal
es lo que se conoce como estructura secundaria del ADN (Figura I1).
En el modelo canónico de la doble hélice de ADN, conocido como forma B, cada
vuelta de la hélice incluye 10,5 pb, y tiene una longitud de 3,5 nm y diámetro
geométrico de 2,3 nm, aproximadamente. Sin embargo, estos parámetros fluctúan por
la termodinámica del ADN y varían según la secuencia de nucleótidos y el medio
físico-químico del ADN (fuerza iónica, pH, temperatura).
Introducción
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Figura I1. Estructura primaria (izquierda) y secundaria (derecha) de ADN (Buck, 2009).
La estructura secundaria del ADN proporciona cierta rigidez a la molécula, lo que se
traduce en una longitud de persistencia (Persistence Length o PL) relativamente
grande (PL = 50 nm = ~150 pb) en comparación a su diámetro (2-3 nm). Además de
doblarse, la doble hélice del ADN se puede estirar y retorcer respecto a su eje
longitudinal, lo que se estudia en el ámbito de la física mediante módulos de
estiramiento y de torsión. Si bien la conformación en doble hélice confiere estabilidad
estructural al ADN, también supone un problema cuando hay que separar las dos
hebras durante los procesos de transcripción y replicación.
2. Perspectiva histórica de la topología del ADN
La determinación de la estructura del ADN (Watson & Crick, 1953a) es, sin duda, uno
de los mayores logros científicos del siglo XX. Sin embargo, inmediatamente se vieron
las consecuencias que acarrearía una estructura en doble hélice: al estar las dos
cadenas entrelazadas, éstas deberían desenrollarse antes de separarse; “una
cantidad considerable de desenrollamiento sería necesario; […] aunque es difícil
imaginar cómo estos procesos pueden ocurrir sin que todo se enrede, no creemos que
este problema sea insuperable” (Watson & Crick, 1953b). Un año más tarde, Delbrück
Introducción
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propuso una solución a este problema con el llamado “modelo de ruptura y reunión”,
en donde una hebra se corta para que la otra hebra pase a través de la brecha antes
de que ésta vuelva a sellarse (Delbrück, 1954). Delbrück incorporó esta idea a un
complicado modelo de la replicación del ADN que finalmente resultó no ser del todo
correcto. Sin embargo, sí que intuyó correctamente el mecanismo que permitiría
solucionar los problemas topológicos derivados de la estructura de doble hélice del
ADN.
Cuando a principios de los años 60 varios grupos estudiaban las moléculas de ADN de
poliomavirus, se observaron dos formas de ADN que presentaban diferente velocidad
de sedimentación. Ambas formas (I y II) eran moléculas circulares de ADN de doble
hebra. La forma mayoritaria (I) poseía un coeficiente de sedimentación mayor,
presentaba mayor resistencia a la desnaturalización (ya fuera por temperatura o pH), y
una vez desnaturalizada, las hebras no se separaban una de la otra. La solución a
este enigma vino a través de microscopía electrónica. Las imágenes mostraban que
las moléculas de la forma I estaban retorcidas formando muchos cruces, mientras que
las moléculas de la forma II eran mayoritariamente anillos relajados. Con esta
información, Vinograd y sus colaboradores propusieron en 1965 que la forma I era una
forma superenrollada del ADN debido a la tensión helicoidal entre las dos hebras de la
doble hélice. Por el contrario, la forma II tenía uno o varios cortes de cadena sencilla
(nicks) y carecía, por tanto, de tensión helicoidal (Vinograd et al., 1965). Este trabajo
puede considerarse el primero en el campo de la topología del ADN. La mayoría de
estudios sobre topología del ADN se centraron entonces en el ADN del fago λ de
Escherichia coli, que es una molécula lineal pero con extremos cohesivos que
permiten cerrar la molécula en forma de anillo (Hershey et al., 1963). Estos anillos de
ADN se convertían en moléculas covalentemente cerradas in vivo o tras incubarlos
con ligasas de ADN in vitro. Este tipo de estudios permitieron calcular la periodicidad
helicoidal o helical repeat del ADN en disolución (10.5 pares de bases por giro
helicoidal) y su variación con la temperatura y fuerza iónica del medio (Wang, 1969;
Wang, 1979). También permitieron medir los cambios en la estructura del ADN
producidos por la interacción de otras moléculas. Por ejemplo, cada molécula de
bromuro de etidio desenrolla aproximadamente 26 grados la doble hélice de ADN
cuando se intercala entre sus bases (Wang, 1974a).
En 1971, se produce otro descubrimiento seminal en el campo de la topología del
ADN. Cuando un lisado de células de E. coli infectadas se dejó olvidado a temperatura
ambiente, en vez de a 4ºC, James Wang observó que la mayoría de anillos del fago λ
no estaban superenrollados como se esperaba, sino que estaban relajados (Wang,
Introducción
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2009). La actividad responsable de eliminar el superenrollamiento (o relajar el ADN)
fue aislada y resultó ser una única proteína (Wang, 1971). Esta enzima, nombrada ω,
era capaz de producir roturas transitorias en las hebras de ADN, alterar su topología, y
posteriormente religar la rotura, exactamente como predijo Delbrück. La proteína ω fue
la primera topoisomerasa identificada. Desde entonces, la búsqueda de
topoisomerasas creció y se descubrieron en todos los procariotas y eucariotas (Gellert
et al., 1976a, Liu y Wang, 1978). Simultáneamente se observó que las topoisomerasas
desempeñaban papeles vitales en el metabolismo del ADN, incluida la replicación
(Champoux y Dulbecco, 1972; Wang, 1971), la transcripción (Wang, 1973) y la
recombinación (Kikuchi y Nash, 1979).
A pesar de todos los hallazgos logrados desde 1953, muchas preguntas sobre cómo
se regula la topología del ADN intracelular y la actividad de las topoisomerasas in vivo
siguen abiertas. Si bien la topología del ADN subyace en casi todos los procesos
cromosómicos, hay pocos grupos especializados en este campo. Por el contrario, otro
tipo de estudios han sido de interés para muchos grupos ya que las topoisomerasas
son una importante diana farmacológica por su capacidad de producir daño en el ADN.
3. Topología del ADN
En el caso de las moléculas cortas de ADN lineal, la separación de las dos cadenas se
produce fácilmente gracias a la libre rotación de los extremos de la doble hélice. Sin
embargo, cuando las moléculas de ADN son circulares o muy largas, separar las dos
hebras de ADN trae consigo problemas topológicos. Los genomas consisten en
moléculas de ADN extraordinariamente largas, que se pliegan formando bucles (loops)
mediante complejos proteicos y que topológicamente se comportan como un dominio
cerrado o circular de ADN (Mirkin, 2001). En general, cualquier segmento de ADN
donde no se permita o se dificulte la rotación axial de sus extremos es un dominio
cerrado con restricciones topológicas. Estas restricciones pueden definirse
matemáticamente debido a la analogía de las cadenas de ADN con curvas cerradas
en espacios tridimensionales.
Introducción
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Figura I2. La separación de las hebras de una doble hélice conlleva estrés topológico cuando no es
posible la libre rotación de los extremos.
3.1. Parámetros para describir la topología del ADN
Uno de los parámetros fundamentales para describir la topología de un dominio de
ADN es su número de enlace (linking number o Lk). Lk describe el número de veces
que dos curvas cerradas se entrelazan entre sí. En una molécula de ADN circular,
donde cada cadena de la doble hélice es una curva cerrada en el espacio, Lk es
necesariamente un número entero y positivo (siendo la doble hélice dextrógira) (Figura
I3). Lk es un invariante topológico, puesto que que no se altera por las deformaciones
geométricas de las cadenas de ADN. Lk puede alterarse sólo si se cortan una o ambas
cadenas (Bates y Maxwell, 2005).
Figura I3. Valores de número de enlace entre dos curvas cerradas (Diaz-Ingelmo, 2014).
Introducción
24
Sin embargo, aunque Lk es invariante mientras no se corte el ADN, su valor puede
descomponerse matemáticamente en la suma de dos magnitudes que varían con la
geometría, el número de torsión (Tw) y el número de enrollamiento (Wr) (White, 1969):
Lk = Tw + Wr
El valor de Tw indica el número de vueltas de las hebras de ADN alrededor del eje
central de la doble hélice, por tanto, indica el paso de hélice (helical pitch) o número de
pb para completar una vuelta (Bates & Maxwell, 2005). Cuando toda la molécula de
ADN se encuentra sobre un plano, Tw = Lk. Por su parte, el valor de Wr es una
medida de las desviaciones no planares del eje central de la doble hélice. El valor de
Wr se puede calcular promediando el número de veces que el eje central se cruza
sobre sí mismo tras proyectarlo en múltiples planos del espacio (Roca J., 2011). Como
Lk es invariante, cualquier cambio de Tw es compensado por una variación opuesta de
Wr, y viceversa.
Figura I4. Equivalencias entre Tw y Wr (Voet & Voet, 2004)
El valor de Lk en el ADN equivale también al cociente N/h, siendo N el número de pb
de la molécula y h el número promedio de pb por paso de la doble hélice. El valor h del
ADN varía según su entorno experimental (iones, pH, temperatura…), según su
secuencia de bases y sus interacciones con otras moléculas. Cuando una molécula de
ADN adopta su conformación de mínima energía (ho) en un medio fisiológico (0.2 M
Introducción
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NaCl, pH 7, 37 ºC), ho es aproximadamente 10,5 y el valor de Lk se denomina Lko
(Wang, 1979; Peck & Wang, 1981). Sin embargo, esto no significa que todas las
moléculas tengan el valor de Lko en esas condiciones. Cuando se circulariza una
molécula de ADN, el valor de ho fluctúa con la oscilación termodinámica de la
molécula, lo que genera una distribución gaussiana de valores enteros de Lk cuyo
centro es Lko. Por este motivo, las moléculas circulares de ADN suelen formar una
pequeña escalera de topoisómeros cuando se resuelven mediante electroforesis en
geles de agarosa (Figura I5). En muchos casos, el valor Lko (o de mínima energía)
puede no ser un número entero y, por tanto, no coincidir con un topoisómero concreto.
En tal caso, el topoisómero más cercano a Lko (el íntegro más cercano al centro de la
distribución de Lk) se denomina Lkm.
Figura I5. Distribución de topoisómeros en gel de agarosa (arriba) y cuantificación de las intensidades de
las bandas correspondientes a topoisómeros individuales (abajo) (Bates & Maxwell, 2005).
En los sistemas biológicos, el valor de Lk del ADN es generalmente más pequeño que
el de Lko. Esta diferencia se denomina diferencia de enlace (ΔLk = Lk-Lko). La
magnitud de ΔLk puede relativizarse respecto al tamaño de la molécula del ADN
mediante la diferencia específica de enlace o densidad superhelicoidal (σ), tal que
σ = ΔLk/ Lko. En las células eucariotas y eubacterias, σ tiene un valor medio de -0.05 y
-0.06, respectivamente (Bauer, 1978). Es decir, que respecto a Lko (ADN desnudo y
relajado), las moléculas de ADN in vivo presentan un déficit del 5-6% en el valor de Lk.
Introducción
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Los cambios de ΔLk implican cambios en el valor de Tw y Wr, tal que:
∆Lk = ∆Tw + ∆Wr
La energía libre asociada a estas deformaciones del ADN en forma de ∆Tw y/o ∆Wr
pueden estar estabilizadas mediante interacciones del ADN con proteínas u otros
ligandos. Por ejemplo, en cada nucleosoma se estabilizan aproximadamente 0.2
unidades de Tw y -1.45 unidades de Wr, lo que explica que el ADN tenga un ∆Lk
cercano a -1.25 por nucleosoma (Segura et al. 2018). Por el contrario, si los cambios
de ∆Tw y ∆Wr no están estabilizados, el ADN se encuentra entonces bajo "tensión
helicoidal" (Th). Cuando Th es negativa (σ < 0), decimos que el ADN adquiere
superenrollamiento negativo. Cuando Th es positiva (σ > 0) las moléculas de ADN
adquieren un superenrollamiento positivo. La tensión helicoidal provoca que la
molécula de ADN se repliegue espontáneamente formando un plectonema (un bucle
retorcido sobre sí mismo). En los plectonemas de ADN, los valores de ∆Tw y ∆Wr
compensan, respectivamente, un 25% y 75% del valor de ∆Lk aproximadamente.
Figura I6. (A) Signo de un cruce según su orientación. (B) Conformaciones solenoidales y plectonémicas.
La deformación plectonémica es espontánea en el ADN desnudo (tal como ocurre al retorcer un tubo de
goma). La deformación solenoidal requiere un soporte físico para estabilizarse, tal como serían los
octámeros de histonas u otros complejos ADN-proteína.
A
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3.2. La topología del ADN en la regulación del genoma
La biología del ADN no está determinada únicamente por los elementos que
reconocen e interactúan con secuencias específicas de nucleótidos, sino por la
energía asociada al estado topológico de esas secuencias (Corless & Gilbert, 2016).
Como se mencionó anteriormente, el ADN de la mayoría de organismos vivos tiene
una densidad superhelicodal negativa, lo que favorece el desenrollamiento localizado y
temporal de la doble hélice de ADN, facilitando el acceso a polimerasas de ARN y
ADN, y su posterior avance. El superenrollamiento del ADN facilita también el
acercamiento de regiones distantes del genoma, lo que tiene un efecto importante en
la regulación de la expresión génica mediante elementos que pueden encontrarse a
gran distancia (enhancers y silencers) de los elementos regulados (Vologodskii &
Cozzarelli, 1996).
Por otro lado, la mayoría de las actividades del genoma producen a su vez cambios en
la topología del ADN. Estas actividades alteran los valores de Lk, de Tw o de Wr
(Figura I7). Para manipular el Lk es necesario cortar una o las dos hebras del ADN y
religarlas. Las enzimas especializadas en esta tarea son las topoisomerasas de ADN.
El Tw y Wr son generalmente alterados por cualquier elemento que interaccione con el
ADN. El ejemplo más característico es el del nucleosoma, cuya formación estabiliza
superenrollamiento negativo del ADN, como se explica más adelante.
El Tw y Wr del ADN in vivo se ven también alterados de manera extrema y muy
dinámica por los motores moleculares que fuerzan la rotación axial del ADN, tales
como la replicación o la transcripción (Bates & Maxwell, 2005). La velocidad de avance
de las polimerasas de ADN en las horquillas de replicación en eucariotas ha sido
estimada en 15–30 pb/s (Sekedat et al., 2010), lo que significa que la doble hélice rota
sobre sí misma tres veces por segundo por delante de la horquilla de replicación. La
velocidad es aún mayor en el caso de la transcripción, donde la ARN Pol II avanza 70
pb/s in vivo (Darzacq et al., 2007). Otro tipo de motor molecular que podría incluirse
como factor que altera la disposición espacial y superenrollamiento de la doble hélice
son los complejos SMC (structural maintenace of chromosomes). Recientemente se ha
observado in vitro que la condensina (un complejo SMC) se desplaza a una velocidad
superior a 1000 pb/s para formar un “loop” de ADN, lo que se ha propuesto como
proceso clave en la organización del genoma (Ganji M. et al., 2018). El estrés de
torsión generado por todos estos motores moleculares puede amortiguarse hasta
Introducción
28
cierto punto mediante la plasticidad de la cromatina, pero después tiene que reducirse
mediante la acción de las topoisomerasas.
Figura I7. Factores que alteran el estado topológico del ADN in vivo.
4. Topoisomerasas
Las topoisomerasas constituyen una familia de enzimas cuyo mecanismo general tiene
dos propiedades. Por un lado, cortan y sellan las hebras de ADN mediante reacciones
de transesterificación, formando transitoriamente un intermediario covalente entre un
hidroxilo de tirosina y un fosfato del ADN. Su otra propiedad común es que permiten el
paso del otro segmento de ADN entre los extremos de las hebras transitoriamente
escindidas (Figura I8).
Las topoisomerasas se clasifican en dos categorías. Las de tipo I producen roturas
transitorias en una cadena de ADN, mientras que las de tipo II actúan como
homodímeros para escindir temporalmente las dos cadenas de la doble hélice. A su
vez las de tipo I se dividen en clase IA o IB, dependiendo de su mecanismo de acción
y la polaridad 3' o 5' del enlace covalente entre el ADN y el enzima (Figura I8).
Lk = Tw + Wr
- Cromatina (nucleosomas)
- Motores moleculares
- Topoisomerasas
- Transcripción - Replicación - SMC’s
Introducción
29
Figura I8. Tipos de topoisomerasas según el mecanismo de corte de las cadenas de ADN.
4.1. Topoisomerasas tipo IA
Las topoisomerasas tipo IA actúan en hebras simples de ADN formando el
intermediario covalente entre una tirosina de su centro activo y el extremo 5´-fosfato
del ADN. Ésta fue la primera actividad topoisomerasa descubierta por Wang en 1969.
A través del corte pasan otras cadenas simples de ADN, de modo que pueden
encadenar o desencadenar, anudar o desanudar moléculas de hebra simple. Con este
mecanismo también pueden relajar parcialmente el ADN de doble cadena, siempre y
cuando encuentren regiones de hebra sencilla. Esto ocurre cuando el ADN tiene
tensión helicoidal negativa (Lk<Lko), lo que facilita la separación de las hebras del ADN
(Kirkegaard & Wang, 1985) (Figura I9). Sin embargo, las topoisomerasas tipo IA no
pueden relajar tensión helicoidal positiva (Lk>Lko), que dificulta la separación de las
dos hebras de la doble hélice.
El enzima más representativo de esta subfamilia es la topoisomerasa I de E. coli
(Wang, 1971). Tiene un peso molecular de 97 kDa y su principal función es reducir los
excesos de tensión helicoidal negativa en la bacteria. Todos los procariotas presentan
enzimas homólogos a la topoisomerasa I de E. Coli. También pertenece a esta
subfamilia la topoisomerasa III presente en todos los eucariotas (Wallis et al, 1989).
Aunque la topoisomerasa III es muy similar estructuralmente a la topoisomerasa I de
E. coli, su actividad relajadora es más débil. La topoisomerasa III actúa principalmente
sobre segmentos de ADN de cadena simple expuestos, por ejemplo, durante los
procesos de recombinación y replicación (Wallis et al., 1989; Kim & Wang, 1992).
Introducción
30
Figura I9. Mecanismo de acción de las topoisomerasas tipo IA. Permite reducir la tensión helicoidal
negativa del ADN, sin llegar a una relajación completa (Lko) (Roca., 2011).
4.2. Topoisomerasas tipo IB
Las topoisomerasas tipo IB actúan sobre ADN de doble cadena y escinden una de las
hebras, es decir, producen un "nick" transitorio. El intermediario covalente durante la
escisión ocurre entre la tirosina del centro activo y el grupo 3´-fosfato de la cadena
escindida. El enzima permite entonces que el otro extremo de la cadena pueda rotar
alrededor de la hebra no escindida (McCoubrey & Champoux, 1986). Tras una o varias
rotaciones, el enzima sella de nuevo la doble hélice del ADN. Mediante este
mecanismo las topoisomerasas tipo IB relajan completamente las moléculas de ADN
con tensión helicoidal positiva y negativa (Figura I10). Producen así distribuciones de
Lk virtualmente centradas en Lko (Champoux et al, 1990). La enzima tipo IB más
representativa de este grupo es la topoisomerasa I presente en todas las células
eucariotas. Su peso molecular varía entre 95 y 135 kDa según el organismo (Eng et
al., 1989; Lynn et al. 1989). Otro enzima bien caracterizado de este grupo es la
topoisomerasa I de los Pox virus (Vaccinia virus) (Shuman & Moss, 1987), que
comprende solamente el dominio mínimo necesario para la actividad relajadora
(32 kDa).
Introducción
31
Figura I10. Mecanismo de acción de las topoisomerasas tipo IB. Permite relajar completamente la tensión
helicoidal positiva y negativa del ADN generando distribuciones térmicas de Lk centradas en Lko (Roca.,
2011).
4.3. Topoisomerasas tipo II
A diferencia de las tipo IA y B, las topoisomerasas tipo II son homodímeros funcionales
y dependen de un cofactor energético (ATP). Escinden simultáneamente las dos
hebras del ADN, tal que los extremos 5´-fosfato del ADN quedan covalentemente
unidos a dos tirosinas del centro activo, y transportan otra doble cadena a través del
corte (Hsieh, 1990). Este mecanismo les permite invertir cualquier entrecruzamiento
entre dos dobles hélices de ADN.
Diferentes estudios mecanísticos y estructurales han permitido elucidar su sofisticado
mecanismo de transporte (Figura I11). Cada mitad de topoisomerasa tipo II consta de
tres dominios muy conservados evolutivamente que corresponden a 3 compuertas: el
dominio ATPasa o N-gate, el dominio de unión-escisión del ADN o DNA-gate y el
dominio pivote o C-gate (Figura I11). Además, presenta un dominio C-terminal que
está menos conservado (Corbet & Berger, 2004). El primer paso en el ciclo de
transporte es la unión del segmento de ADN a escindir (segmento G) en el dominio
DNA-gate quedando este segmento de doble hélice perpendicular al eje binario del
Introducción
32
enzima. La unión de ATP en los dominios ATPasa provoca que la N-gate se cierre
(Roca & Wang, 1992). Este cierre permite que otra doble hélice de ADN (segmento T)
pueda ser capturada hacia el interior del enzima. En tal caso, el segmento T es
empujado a través de la escisión que el enzima produce en el segmento G (Roca &
Wang, 1992). Tras este paso, el segmento T puede salir a través de la C-gate, con lo
que el segmento T habrá cruzado el segmento G y habrá atravesado completamente
la interfaz dimérica del enzima (Roca & Wang, 1994; Roca et al., 1996).
Alternativamente, el segmento T puede retroceder y salir de nuevo por la N-gate, con
lo que no se habrá producido ningún cambio topológico (Martínez-García et al., 2013).
Figura I11. Mecanismo de acción de las topoisomerasas tipo II. Una vez el segmento G (rojo) se ha unido
al enzima, el segmento T (naranja) es capturado y pasado a través del segmento G en un proceso ATP
dependiente. Para completar el ciclo de transporte, el segmento T debe salir ahora por el lado opuesto del
enzima. Alternativamente, el segmento T puede retroceder, cancelándose así el efecto del transporte
(Martínez-García et al., 2013).
Las topoisomerasas tipo II se subdividen en IIA y IIB, siendo las de tipo IIA las más
representativas. Dentro del tipo IIA, cabe destacar la topoisomerasa II esencial en
todas las células eucariotas y la topoisomerasa IV esencial en eubacterias (Kato et al.,
1990). Las topoisomerasas II y IV transportan segmentos T a través de segmentos G
para llevar la topología del ADN a la conformaciones de equilibrio termodinámico o
Introducción
33
incluso a conformaciones aún más simplificadas (Rybenkov et al., 1997). Cuando los
segmentos están en moléculas de ADN distintas, el resultado es un encadenamiento o
desencadenamiento de las moléculas de ADN, según sea la concentración local de
segmentos de ADN. En cambio, cuando los segmentos están en la misma molécula, el
resultado puede ser un cambio de +/- 2 unidades en el valor de Lk, según se invierta
un cruce negativo o positivo, respectivamente (Figura I12). Esto les permite relajar
eficientemente el superenrollamiento negativo o positivo del ADN. Alternativamente,
estando los dos segmentos en la misma molécula, las topoisomerasas II y IV pueden
producir también un anudamiento o desanudamiento de la molécula de ADN, según
sea la concentración y disposición espacial de los segmentos de ADN.
Figura I12. El transporte de un segmento de doble hélice a través de otro puede dar lugar a conversiones
topológicas intramoleculares (enrollamiento y anudamiento del ADN) y conversiones intermoleculares
(encadenamiento del ADN).
Un enzima especial del tipo IIA es la girasa de ADN presente en las eubacterias
(Gellert et al., 1976). A diferencia de las anteriores, la girasa transporta selectivamente
segmentos T que forman un bucle positivo con un segmento G contiguo (Figura I13).
En consecuencia, la girasa reduce el valor de Lk en 2 unidades en cada ciclo de
transporte. Esta selectividad permite a la girasa generar Th (-) a partir de un ADN
relajado o con Th (+), es decir, relaja superhelicidad positiva y genera superhelicidad
Introducción
34
negativa. La girasa es por tanto ineficiente para relajar superhelicidad negativa y/o
alterar el encadenamiento o anudamiento de moléculas de ADN.
Figura I13. Las topoisomerasas II y IV invierten indistintamente cruces de ADN producidos por
superenrollamiento negativo o positivo pudiendo relajar completamente el ADN. La girasa, en cambio,
interacciona con bucles positivos y los invierte a negativos, es decir, relaja superenrollamiento positivo e
introduce superenrollamiento negativo en la molécula de ADN (Roca, 2011).
4.4. Principales funciones de las topoisomerasas
Dada la ubicuidad de los problemas topológicos del ADN, el papel de las
topoisomerasas guarda muchos paralelismos entre eucariotas y procariotas (revisado
en Champoux, 2001; Wang, 2002; Roca, 2011). Durante la transcripción del ADN se
genera Th(+) y Th(-) por delante y por detrás de las polimerasas de ARN,
respectivamente. Esto ocurre porque la doble hélice de ADN se ve forzada a rotar
durante la progresión del complejo de transcripción. De modo análogo, el avance de
las horquillas de replicación genera Th(+) por delante de las polimerasas de ADN
(Figura I14). Las topoisomerasas reducen la tensión helicoidal para facilitar el progreso
de la maquinaria de transcripción y replicación. En eubacterias, la topoisomerasa I
(tipo IA) relaja Th(-), la girasa relaja la Th(+) y la topoisomerasa IV relaja ambas. En
eucariotas, tanto la topoisomerasa I (Tipo IB) como la topoisomerasa II participan
relajando Th (+) y (-).
Introducción
35
Por otro lado, durante la replicación del ADN las nuevas dobles hélices tienden a
quedar entrecruzadas por detrás de las horquillas de replicación, (Figura I14) lo que
causa que las cromátidas recién replicadas presenten encadenamientos entre ellas. La
topoisomerasa IV en eubacterias y la topoisomerasa II en eucariotas son esenciales
para eliminar estos encadenamientos y para que se lleve a cabo una segregación
correcta de los cromosomas durante la división celular. Aparte de eliminar los
problemas topológicos generados durante la transcripción y replicación del ADN, las
topoisomerasas juegan un papel esencial en mantener unos niveles de Th concretos
que regulan la actividad del genoma. En eubacterias, el inicio de la replicación y la
activación de muchos genes depende de Th(-), que es modulada por la acción
conjunta de la girasa, topoisomerasa I y IV. La Th(-) es también determinante para
configurar la arquitectura de los cromosomas bacterianos (Hattfield & Benham, 2012;
Travers & Muskhelishvili, 2005).
Figura I14. Problemas topológicos del ADN comunes en procariotas y eucariotas que deben solucionar
las topoisomerasas. El avance de la maquinaria de transcripción genera tensión helicoidal (+) y (-) por
delante y detrás de la polimerasa de ARN, respectivamente. El avance de las horquillas de replicación
genera tensión helicoidal (+) por delante y ocasiona encadenamientos entre los dúplex recién replicados
por detrás.
Introducción
36
5. Cromatina
5.1. Estructura básica del nucleosoma
En los sistemas biológicos, el ADN no existe como un polímero lineal desnudo y
desordenado, sino que se encuentra plegado y organizado mediante la unión a
proteínas, dando lugar a estructuras complejas conocidas como fibras de cromatina.
En los organismos eucariotas, la cromatina reduce la longitud del ADN varios órdenes
de magnitud. Al formar esta estructura, las células organizan la disposición espacial
del ADN dentro del núcleo, estableciendo regiones de mayor y menor accesibilidad
que permiten regular la actividad genética.
La unidad estructural básica de la cromatina es el nucleosoma. En este complejo ADN-
proteína de simetría binaria, aproximadamente 147 pb de ADN completan cerca de 1,7
vueltas en sentido levógiro sobre un octámero de histonas (Richmond et al., 1984). El
octámero está formado por un tetrámero central (histonas H3 + H4)2, flanqueado por
dos dímeros (histonas H2A + H2B)1+1. Esta estructura, considerada habitualmente
como el nucleosoma canónico, fue corroborada tras su cristalización por Luger et al.
(1997). Los nucleosomas se forman a lo largo de las moléculas de ADN de forma
periódica, separados por segmentos linker (30 a 90 bp), formando así una fibra similar
a un collar de cuentas (Figura I15).
Figura I15. (A) Estructura del nucleosoma a partir de estudios cristalográficos (Luger et al. 1997). (B)
Valores de ΔLk, ΔTw y ΔWr que definen la topología del ADN en el nucleosoma (Segura et al. 2018).
Introducción
37
El enrollamiento del ADN alrededor del octámero de histonas produce marcados
cambios en el valor de ΔTw y ΔWr de la doble hélice. A partir de la estructura
cristalizada, y otros estudios bioquímicos, se ha calculado que cada nucleosoma
deforma el ADN con +0.2 unidades de Tw y -1.45 unidades de Wr aproximadamente,
lo que implica que cada nucleosoma debería estabilizar un ∆Lk cercano a -1.25 (Bates
& Maxwell, 2005). Sin embargo, desde los años 80 se ha estimado experimentalmente
un valor ∆Lk de -1 por nucleosoma. Esta discrepancia entre el valor de ∆Lk teórico y el
observado dio lugar a la denominada “paradoja del número de enlace” (Linker number
paradox). Esta paradoja ha sido resuelta recientemente mediante un nuevo enfoque
experimental con cromatina nativa, que ha demostrado un valor de -1.26 unidades de
∆Lk estabilizadas por cada nucleosoma in vivo (Figura I15) (Segura et al. 2018).
En la cromatina se encuentra también un abundante número de proteínas no-histonas.
Son proteínas que regulan la forma y composición de la fibra, como son los
ensambladores y modificadores de histonas, factores reguladores de la transcripción y
proteínas SMC (como cohesinas, condensinas o el complejo SMC5/6). La
topoisomerasa II es también abundante, lo que ha hecho pensar en un posible papel
estructural de esta proteína, anclando el ADN a estructuras nucleares durante la
interfase (Saiatoh & Laemmli, 1993) y estabilizando la condensación los cromosomas
durante la metafase (Bojanowski et al., 1998).
5.2. Organización superior de la fibra de nucleosomas
La reconstrucción de fibras de nucleosomas con ADN y proteínas histonas in vitro en
condiciones de baja salinidad produce la mencionada estructura del “collar de cuentas”
o “beads-on-a-string”, también conocida como fibra de 10 nm. Los modelos más
clásicos proponen que esta fibra de nucleosomas se pliega formando una estructura
de orden superior de 30 nm. Experimentos basados en microscopía electrónica y
cristalografía de rayos-X de fibras de cromatina reconstruidas in vitro han sugerido dos
modelos de plegamiento para formar esa fibra de 30 nm: el modelo solenoidal y el
modelo zig-zag (Figura I16). El modelo solenoidal tiene un diámetro de 33 nm con 6
nucleosomas cada 11 nm a lo largo del eje de la fibra (Robinson et al., 2006). El
modelo de zig-zag tiene un diámetro aproximado de 28 nm con 5 ó 6 nucleosomas
cada 11 nm del eje de la fibra (Song et al., 2014). A su vez, los modelos clásicos
Introducción
38
proponen que esta fibra de 30 nm se pliega de nuevo en superestructuras helicoidales
mayores hasta formar los cromosomas mitóticos (Belmont et al., 1989 & 1994).
Sin embargo, las fibras de cromatina de 30 nm y superiores nunca han sido
observadas in vivo. Técnicas microscópicas combinadas con técnicas de tinción, como
FISH, proporcionan imágenes de dominios irregulares de cromatina en células
individuales (Wiggins et al., 2010), con diferentes dinámicas (Bronstein et al., 2009), y
co-localización variable con otros elementos nucleares. Más recientemente, la
nanoscopía de alta resolución está permitiendo visualizar las fibras de cromatina in
vivo. La cromatina parece una cadena desordenada de gránulos de 5 a 24 nm que se
agrega formando dominios complejos de diferente tamaño y densidad (Ou et al.,
2017).
Introducción
39
Figura I16. (A) Modelos clásicos de plegamiento de la fibra de nucleosomas, son modelos más regulares
que proponen la estructura de la fibra de 30 nm. (B)Modelos actuales de plegamiento de la fibra de
nucleosomas, modelos basados en experimentos in vivo que proponen un plegamiento irregular.
5.3. Organización tridimensional de la cromatina en el núcleo
La organización espacial de las fibras de cromatina, es decir, su disposición
tridimensional dentro del núcleo celular, forma una compleja jerarquía de relaciones
funcionales y dinámicas que cambian dependiendo del tipo celular y del momento del
ciclo (Bonev B & Cavalli G, 2016). Sin embargo, a pesar de los avances metodológicos
Introducción
40
en las últimas dos décadas, tenemos aún una comprensión limitada de los
mecanismos moleculares que determinan la organización espacial de los genomas y
su función.
El posicionamiento de los nucleosomas a escala genómica se puede conocer en
detalle gracias al desarrollo de chips de ADN y de técnicas de secuenciación masiva
(Pugh & Jiang, 2009). Por otro lado, se han desarrollado técnicas de captura de
conformación de la cromatina (3C, 4C, Hi-C), que miden cuantitativamente las
frecuencias de contactos espaciales entre distintos sitios (loci) genómicos (Dekker et
al., 2002; Simonis et al., 2006; Lierberman-Aiden et al., 2009) y permiten generar
modelos de organización espacial de la cromatina. Utilizando Hi-C, la variante con más
resolución, se han observado regiones cromosómicas de tamaño de 0,1 a 1 megabase
(Mb), en las cuales las interacciones locales de la cromatina son más frecuentes que
en la media. Estas regiones se bautizaron con el nombre de topological associated
domains (TADs) (Dixon et al. 2012). Los TADs se observan en diferentes especies, y
varían dependiendo del tipo y del momento del ciclo celular. A nivel funcional, los
TADs han sido propuestos como una unidad básica en la macro-organización del
genoma y juegan un papel fundamental en la coordinación y regulación de la
expresión génica (Jin et al. 2013).
El avance y mejora de las técnicas de captura de conformación de la cromatina han
permitido postular la presencia de asas de cromatina (loops domains) de una longitud
media de 185 kilobases (kb) en diferentes especies y tipos celulares. Estos loops
tienen una marcas epigenéticas características y en sus puntos de anclaje se han
identificado proteínas características (proteínas CTCF, cohesinas, topoisomerasas
II,…) (Rao et al. 2014). Estos loops parecen regular la distancia entre promotores y
sus regiones reguladores distantes (enhancers), jugando, por tanto, un papel
fundamental en la regulación de la expresión génica. Recientes experimentos con Hi-C
y microscopía de células individuales (single-cell) han mostrado que tanto los TADs
como los loop domains son estructuras muy dinámicas (Hansen et al. 2018). Para
explicar la formación y dinámica de los loops se ha postulado el llamado modelo de
“loop extrusion”. En este modelo, los complejos SMC son reclutados a una región con
una proteína CTCF y comienzan a extrudir un loop de ADN hasta encontrar otra
molécula CTCF con orientación convergente a la primera, formado así un loop domain.
En estas regiones también está presente la topoisomerasa II, pero aún no se sabe qué
papel juega en este escenario (Hansen et al. 2018; Sanborn et al., 2015) (Figura I17).
Introducción
41
Figura I17. Formación de loops en el genoma mediante el modelo de loop extrusion (Fudenberg et al.,
2016).
A pesar de los avances en el estudio de la arquitectura y organización de la cromatina
en el rango de 0,1 – 1 Mb, los mecanismos moleculares que juegan un papel más
decisivo en la regulación genómica tienen lugar en la escala de <20 kb de ADN.
Desafortunadamente, todavía no hay técnicas que permitan visualizar las
interacciones espaciales y la trayectoria del ADN dentro de la cromatina con una
resolución de pocas kilobases. Sin embargo, en esa pequeña escala, muchos
aspectos de la arquitectura y dinámica de la cromatina in vivo pueden deducirse a
partir del análisis de la topología del ADN. Un ejemplo son los cambios de estructura
de la cromatina producidos por el superenrollamiento del ADN y su relajación mediante
topoisomerasas durante la transcripción.
6. Interrelación entre cromatina, topología del ADN y topoisomerasas
En las células eucariotas, el estado topológico del ADN resulta de la interrelación entre
la estructura de la cromatina, sus actividades motoras y la actividad de las
Introducción
42
topoisomerasas (Roca J., 2011). Por ejemplo, aunque ambas topoisomerasas I y II
pueden relajar indistintamente ADN con Th(-) y Th(+), se ha observado una
especialización de estas enzimas cuando el ADN está organizado en fibras de
cromatina (Figura I18). Mientras la topoisomerasa I es más eficiente relajando ADN
desnudo, donde la rotación axial del dúplex puede ser rápida, la topoisomerasa II es
eficiente relajando fibras de nucleosomas. Ello indica que las fibras de nucleosomas
dificultan la rotación axial del ADN pero facilitan, en cambio, la yuxtaposición de
segmentos de ADN para la actividad de la topoisomerasa II (Roca & Wang, 1996;
Salceda et al., 2006).
Otra especialización de estas enzimas, parte de que la topoisomerasas I y II no
presentan ninguna preferencia para relajar Th(-) y Th(+) cuando el ADN está desnudo
(Roca & Wang, 1996; Salceda et al., 2006). Sin embargo, en fibras de cromatina, la
topoisomerasa II es más eficiente relajando Th(+) que Th(-). Esta preferencia indica
que las fibras de cromatina se deforman de manera diferente según acomodan Th(+)
o (-). Experimentos in vitro mediante pinzas magnéticas han demostrado que la Th(+)
acorta rápidamente la fibra de cromatina e invierte la quiralidad de las vueltas del ADN
en el nucleosoma, pasando de levógiras a dextrógiras (Bancaud et al. 2006). Ambos
tipos de deformaciones implican un incremento en el Wr del ADN con la formación de
nuevos cruces (+), que son sustratos ideales para la actividad de la topoisomerasa II.
En cambio, la Th(-) en el ADN cromatinizado no produce un efecto comparable de
acortamiento de la fibra (Bancaud et al., 2006). La fibra de cromatina acomoda la Th(-)
estabilizando el enrollamiento levógiro del ADN alrededor de los nucleosomas y, en
vez de reducir su valor de Wr, reduce principalmente el valor de Tw en las regiones de
ADN internucleosomal (DNA linker). Por tanto, con Th(-) no se forman tantos
entrecruzamientos de ADN necesarios para la actividad de la topoisomerasa II. El
modelo de la Figura I18 ilustra las conformaciones que adoptaría la cromatina bajo
Th(-) y (+) durante la transcripción del ADN y su efecto en la actividad de las
topoisomerasas I y II.
La distinta capacidad de las topoisomerasas I y II para relajar cromatina, y su distinta
eficiencia para relajar la tensión helicoidal (+) o (-), explica porque la Th(+) se relaja
más rápidamente que la Th(-) en la cromatina (Fernández et al., 2014). Puesto que
durante la transcripción del ADN, se generan simultáneamente y de manera simétrica
Th(+) y Th(-), su relajación asimétrica puede ser muy relevante. Se ha propuesto que,
dado que las células eucarióticas no tienen una girasa para generar directamente Th(-
), una relajación asimétrica de Th(+) y Th(-) durante la transcripción permite mantener
Introducción
43
la Th(-) durante más tiempo y favorecer así la apertura de la doble hélice del ADN en
regiones específicas de los genomas eucariotas (Fernández et al., 2014).
Figura I18. La tensión helicoidal (+) y (-) del ADN produce conformaciones distintas de la cromatina
eucariota, que a su vez condicionan la eficiencia relajadora de las topoisomerasas. Durante la
transcripción del ADN, Th(+) y Th(-) se generan a la misma velocidad, sin embargo, las topoisomerasas
relajan más rápidamente la Th(+) que la (-). Como resultado, Th(-) persiste en determinadas regiones sin
necesidad de una actividad girasa (Fernández et al., 2014).
7. Anudamiento del ADN
El campo de la topología del ADN in vivo se ha centrado principalmente en el estudio
de la tensión helicoidal y superenrollamiento del ADN y sus efectos en la expresión
génica y la arquitectura de los cromosomas. También se ha estudiado en detalle cómo
Introducción
44
se eliminan los encadenamientos entre las moléculas hermanas de ADN tras el
proceso de replicación y sus efectos en la segregación y estabilidad de los
cromosomas. Sin embargo, un aspecto de la topología del ADN mucho menos
estudiado es su capacidad de anudamiento.
7.1. ¿Qué es un nudo?
Generalmente se sabe lo que es un nudo, al menos de forma intuitiva. Sin embargo,
desde un punto de vista matemático, una definición sencilla, aunque no estrictamente
formal, sería: un nudo es una curva cerrada sin intersecciones irreducibles dentro de
un espacio tridimensional. Por intersecciones irreducibles se indica que no pueden
eliminarse a base de deformar la curva (estirar, encoger, doblar, retorcer). Sólo
pueden modificarse cortando y pegando segmentos de la curva, tal que ésta pueda
pasar de una forma de anudamiento a otra.
Bajo esta definición de nudo, el primer caso posible es la ausencia de nudo, que
corresponde con una curva cerrada o anillo que carece de intersecciones irreducibles.
Este caso (ausencia de nudo) se llama nudo trivial (01). A partir de aquí, el primer nudo
real posible aparece cuando hay 3 intersecciones irreducibles, ya que es imposible
formar un anillo anudado con solo 1 o 2 intersecciones. Al nudo simple de 3
intersecciones (denominado 31 o trébol) le siguen el nudo de 4 cruces (41), dos
posibles formas de nudo con 5 cruces (51, 52), tres posibles formas con 6 cruces, y
siete posibles formas con 7 cruces... (Figura I19). Esta progresión aumenta de modo
exponencial, llegándose a miles de formas de nudos distintos cuando se consideran
anillos con más de 10 intersecciones irreducibles. El número de intersecciones o
cruces irreducibles se traduce en el concepto de "complejidad de un nudo".
Introducción
45
TrivialTrivial
Figura I19. Representación de nudos de complejidad creciente, desde 0 hasta 7 cruces irreducibles.
Se dice que un nudo es "primo" cuando no puede descomponerse como la suma de
dos nudos más simples (no triviales). Se dice que un nudo es “compuesto” si se puede
describir como la suma de dos o más nudos primos (Figura I20).
Figura I20. Composición de nudos primos 41 y 31 para formar un nudo compuesto de 7 cruces.
Otro concepto importante es el de quiralidad, lo que guarda relación con el signo
topológico (+) o (-) de las intersecciones del nudo. Por ejemplo, el nudo trébol es quiral
y por tanto podemos diferenciar entre la forma 31(+) y 31(-), es decir, una forma con
tres entrecruzamientos (+) y otra con tres (-), que equivale a su imagen especular. Sin
Introducción
46
embargo el nudo de cuatro cruces 41 es aquiral, ya que este nudo y su imagen
especular siempre tienen dos entrecruzamientos (+) y dos (-).
Figura I21. Quiralidad del nudo 31. Una forma tiene 3 entrecruzamientos (+) y la otra 3 (-), que es su
imagen especular.
En relación al signo (+) o (-) y geometría de los entrecruzamientos de un nudo, se
puede determinar también el valor Wr de cada forma anudada. El nudo trivial tiene
Wr=0, ya que todo su contorno puede acomodarse sobre una superficie (plana o
curva). El nudo aquiral de cuatro cruces 41 también tiene Wr=0, ya que el Wr de los
dos entrecruzamientos (+) se compensa con el de los dos (-). Los demás nudos tienen
valores Wr específicos, no necesariamente proporcionales a la complejidad del nudo
(Tabla I1).
Introducción
47
Nudo Wr medio
31 3.47
41 0
51 6.31
52 4.59
61 1.18
62 2.89
63 0
71 9.13
75 7.48
77 0.54
81 2.37
815 8.02
Tabla I1: Valores de Wr de diferentes nudos (Braser et al., 2013)
Un último concepto útil es el número de desanudamiento (unknotting number), que
indica el mínimo número de inversiones de cruces que hay que hacer para convertir un
nudo en el nudo trivial (ausencia de nudo). Por ejemplo, los nudos del tipo twist (como
el 52 y 72), que consisten en una región retorcida en forma plectonémica que se cierra
enlazando sus dos extremos, tienen número de desanudamiento igual a uno, ya que
se deshacen al invertir el cruce de sus extremos (Figura I22). Ocurre lo mismo con los
nudos 31 y 41. En cambio, los nudos de tipo toroidal (como el 51 y 71) tienen los
números de desanudamiento más elevados (Figura I22).
Introducción
48
Figura I22. Unknotting number. Al invertir los cruces indicados (círculo rojo) se deshace totalmente el
nudo.
Después de comprender lo que es un nudo desde el punto de vista topológico resulta
fácil ver su relación con el ADN debido a la similitud entre un círculo que se entrecruza
en el espacio y una molécula circular o dominio cerrado de ADN, donde pueden
formarse o invertirse cruces de ADN mediante la acción de topoisomerasas y otros
mecanismos.
7.2. Nudos de ADN
Los nudos de ADN pueden formarse en moléculas de hebra simple y de doble hebra.
Nos centraremos aquí en los nudos de doble hebra, ya que es la forma más común de
la molécula del ADN y de más interés en el desarrollo de esta tesis. Estos nudos
pueden formarse mediante tres mecanismos: durante la circularización de una
molecula lineal de ADN, mediante la acción de las topoisomerasas tipo-2 sobre
dominios cerrados de ADN, y mediante procesos de recombinación intramolecular.
La circularización de moléculas lineales de ADN in vitro puede llevar a la formación de
nudos de ADN (Shawn & Wang, 1993; Rybenkov et al., 1993). La probabilidad de
anudamiento al cerrar un círculo de ADN en disolución libre refleja el equilibrio de
conformaciones termodinámicas de la molécula de ADN. La probabilidad de
anudamiento en estas condiciones depende principalmente de la longitud de la
molécula (a mayor longitud mayor probabilidad de anudamiento). También depende de
las condiciones del medio, especialmente de la concentración de iones (monovalentes
Introducción
49
o divalentes) y policationes (por ejemplo espermina o espermidina) que afectan la
flexibilidad del ADN facilitando o no el acercamiento de segmentos de ADN. El análisis
de los nudos producidos mediante circularización in vitro junto con simulaciones
computacionales de anudamiento de polímeros (Kamenetskii et al., 1975) han
permitido calcular así parámetros biofísicos del ADN en disolución. Por ejemplo, de
este modo se ha calculado que el diámetro efectivo de la doble hélice del ADN es de 5
nm (Shaw y Wang, 1993; Rybenkov et al., 1993).
Un caso especial de anudamiento por circularización del ADN se da en los virus que
contienen moléculas lineales de ADN con extremos cohesivos. Por ejemplo, el
genoma del bacteriófago P4 consiste en una molécula de ADN lineal de 10 – 11,5 kb,
con extremos cohesivos de 16 pb. Tras la extracción del ADN de la cápside de estos
virus se observan moléculas de ADN altamente anudadas (Liu & Davis, 1981). La
caracterización de estos nudos, junto con simulaciones de formación de nudos de
polímeros en volúmenes restringidos, indicó que estos nudos se forman durante una
circularización accidental del ADN dentro de la cápside del fago (Arsuaga et al., 2002).
El análisis de estos nudos permitió demostrar que el ADN viral no se encuentra
empaquetado al azar dentro de la cápside, sino que sigue una trayectoria ordenada
altamente quiral (Arsuaga et al., 2005).
Mediante su mecanismo de inversión de entrecruzamientos de ADN, las
topoisomerasas de tipo-2, (topoisomerasas II y IV) son capaces de formar o deshacer
nudos en dominios cerrados de ADN (Liu et al., 1980). Estudios in vitro han mostrado
que estos nudos son abundantes y complejos cuando la probabilidad de yuxtaposición
de segmentos intra-moleculares de ADN es elevada. Esto ocurre cuando el ADN está
superenrollado y/o hay proteínas unidas u otros agentes que condensan la molécula
(Hsieh, 1983; Wassermann & Cozzarelli, 1991; Roca et al., 1993). Por otro lado,
cuando las moléculas de ADN anudadas se descondensan y se incuban de nuevo con
topoisomerasas II o IV, estas enzimas reducen entonces la fracción de moléculas
anudadas, incluso hasta valores inferiores a los del equilibrio termodinámico
(Rybenkov et al., 1997).
Finalmente, el ADN puede anudarse también durante procesos de recombinación
intramolecular. El análisis de los nudos producidos por distintas recombinasas, ha
permitido descubrir la orientación de los segmentos de ADN en el momento de la
reacción (Wasserman & Cozzarelli, 1985). Por otro lado, analizando los nudos
producidos por recombinasas expresadas in vivo se pudo demostrar de que el
Introducción
50
superenrollamiento negativo del ADN en bacterias forma plectonemas en lugar de
solenoides (Spengler et al. 1985).
Los anteriores mecanismos de formación de nudos de ADN pueden operar in vivo. Sin
embargo, el estudio de nudos in vivo está muy poco desarrollado. En bacterias, se han
encontrado nudos en plásmidos, especialmente cuando la actividad de las
topoisomerasas está alterada (Shishido et al., 1987; Ishii et al., 1991). También se ha
observado la formación de nudos de ADN en las burbujas de replicación de plásmidos
bacterianos cuando se bloquea la horquilla de replicación (Sogo et al., 1999;
Olavarrieta et al. 2002). Se sabe que estos nudos están producidos y son
eventualmente eliminados por la topoisomerasa IV, pero no se conoce su significado ni
qué provoca su formación. En el caso de células eucariotas, la existencia de nudos de
ADN nunca ha sido documentada. Experimentos in vitro han mostrado que los nudos
de ADN pueden interferir con el ensamblaje de nucleosomas y la transcripción del
ADN (Rodríguez-Campos, 1996; Portugal & Rodríguez-Campos, 1996). Por lo tanto,
se asume en general que el ADN eucariótico debe estar esencialmente libre de nudos.
7.3. Métodos para la caracterización del anudamiento de ADN
La detección y caracterización de nudos de ADN no es algo experimentalmente
sencillo debido a la gran variedad de topoisómeros posibles que se pueden formar.
Hay dos métodos para analizar nudos de ADN: la electroforesis en geles de agarosa y
la microscopía electrónica. En ambos casos es necesario cortar una hebra de la doble
hélice del ADN (hacer un nick), con el fin de eliminar toda la tensión helicoidal de la
molécula. Así se evita confundir los topoisómeros de ADN anudados con los
superenrollados.
El primer parámetro en el estudio de nudos de ADN es saber qué fracción de una
muestra de ADN está anudada, es decir, conocer la probabilidad de anudamiento (KP).
La electroforesis del ADN en un gel de agarosa es el método más sencillo y eficaz
para separar las moléculas anudadas y desanudadas, lo que permite calcular KP. Esto
es posible ya que la velocidad de una molécula circular de ADN en un gel depende de
su compactación y todo nudo, hasta el más sencillo (el 31), es más compacto que la
forma desanudada. Así, todas las formas anudadas adquieren una velocidad mayor
que la forma desanudada (nudo trivial). Además, cuanto más complejo es el nudo,
mayor es la compactación de la molécula de ADN. Existe entonces una correlación
Introducción
51
entre la distancia de migración electroforética y el número de cruces irreducibles de los
nudos de ADN. De un modo más exacto, la velocidad de un nudo en un gel guarda
relación lineal con su número promedio de cruces (Average Crossing Number o ACN)
(Stasiak et al., 1998) (Figura I22). El ACN es el promedio de cruces visibles al
proyectar en todas las direcciones posibles la trayectoria de un polímero (por ejemplo,
ADN). El ACN es parecido, pero no equivalente, al número de cruces irreducibles de
cada nudo. La electroforesis consigue, de este modo, separar los nudos en base a su
número de cruces irreducibles, pero también los nudos que, con el mismo número de
cruces irreducibles, difieren ligeramente en el ACN. Por ejemplo, debido a pequeñas
diferencias en la geometría de sus cruces, el nudo 51 (torus) y el 52 (twist) tienen
valores ACN distintos, y pueden por tanto llegar a separarse en una electroforesis
suficientemente larga. Lo mismo ocurre con el nudo 71 (torus) y el 72 (twist) (Figura
I23).
Figura I23. Electroforesis de nudos de ADN (círculos con nicks) en un gel de agarosa. La gráfica muestra
la relación lineal entre el Average Crossing Number (ACN) y la movilidad electroforética (Vologodskii et al.,
1998).
Como ya se comentó antes, uno de los estudios más extensos de nudos de ADN se
llevó a cabo en bacteriófagos (Arsuaga et al., 2002; 2005). Para realizar estos trabajos
se desarrolló un método de electroforesis bidimensional de alta resolución (Trigueros
et al 2001). En la primera dimensión, a bajo voltaje, se separan los nudos respecto a
Avera
ge
Cro
ssin
g N
um
be
r (A
CN
)
Introducción
52
su ACN. En la segunda dimensión, a alto voltaje, se separan poblaciones de nudos
primos y compuestos con el mismo número de cruces, y se evita su solapamiento de
los nudos con los fragmentos lineales de ADN (Figura I24).
Figura I24. Análisis de nudos de ADN mediante electroforesis bidimensional de alta resolución. (A) El
ADN (círculos con nicks) fue extraído de bacteriófagos P4. I: Primera dimensión a voltaje bajo (de arriba a
abajo). II: Segunda dimensión a voltaje alto (de izquierda a derecha). 0: nudo trivial, L: moléculas de ADN
lineales, K: poblaciones de ADN anudado. (B) Área ampliada del gel con población de nudos. En el arco
principal las poblaciones de nudos primos que tienen de tres a nueve cruces están indicadas (3 – 9). Se
puede ver un segundo arco, resuelto en la segunda dimensión, en el que aparecen subpoblaciones de
nudos compuestos de seis a nueve cruces y se indican (6’ – 9’).
Aparte de la probabilidad y complejidad de un nudo, una característica importante, por
la información que puede aportar, es su quiralidad. Es decir, cómo distinguir un nudo
de su imagen especular (Figura I21). Dado que las dos imágenes especulares de
cualquier nudo producen una compactación idéntica y un mismo ACN, es imposible
discernir la quiralidad de un nudo mediante la electroforesis de moléculas circulares
relajadas (con nick). La quiralidad de un nudo se tiene que descubrir mediante la
Introducción
53
visualización del signo topológico de sus cruces irreducibles con microscopía
electrónica (Lynn y Crisona, 1999). Este procedimiento es complejo. Primero, se
requiere purificar las moléculas de ADN anudadas y recubrirlas después con proteína
Rec-A antes de examinarlas con el microscopio. Esto permite distinguir en cada cruce
qué segmento de ADN pasa por encima y cuál por debajo (Figura I25). Tras procesar
una gran cantidad de imágenes de nudos individuales, se puede hacer un análisis
semicuantitativo de su quiralidad. Sin embargo, en la mayoría de muestras biológicas,
las moléculas anudadas representan una pequeña fracción del total de ADN y no
pueden purificarse. Por tanto, se puede examinar la probabilidad y la complejidad de
los nudos mediante electroforesis, pero difícilmente su quiralidad.
Figura I25. Imágenes de microscopía electrónica de moléculas anudadas de ADN, una vez purificadas y
recubiertas de proteína Rec-A (Kimura et al., 1999).
Introducción
54
8. Hipótesis de partida
Actualmente, existe la suposición general de que el ADN en células eucariotas se
encuentra libre de nudos. Sin embargo, la existencia de nudos de ADN en eucariotas
nunca ha sido testada experimentalmente. En este sentido, la hipótesis de partida de
esta tesis es que, dada la condensación de ADN en las fibras de cromatina y la
abundante actividad de la topoisomerasa II en el núcleo celular, la presencia de nudos
de ADN en la cromatina es muy probable.
Para testar esta hipótesis, utilizaremos el sistema modelo de nuestro laboratorio, que
son minicromosomas circulares de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En estudios
previos hemos utilizado estos minicromosomas con diferentes elementos estructurales
y funcionales para estudiar cómo el superenrollamiento del ADN generado durante la
transcripción afecta a la conformación de la cromatina in vivo (Salceda et al., 2006;
Fernández et al., 2014). Utilizando este mismo sistema, llevaremos a cabo el primer
estudio de anudamiento del ADN intracelular.
La caracterización de estos nudos puede proporcionar nuevos conocimientos sobre las
propiedades biofísicas de la cromatina in vivo, sobre su conformación y distintos
grados de condensación, y sobre la trayectoria espacial del ADN en escalas de pocas
kilobases.
55
Objetivos
56
Objetivos
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1. Comprobar la existencia de nudos de ADN en minichromosomas circulares de
S. Cereviseae, calcular su probabilidad y analizar el patrón de anudamiento.
2. Determinar cómo cambia la probabilidad de anudamiento en función de la
longitud del ADN, elementos de la cromatina, y los procesos de transcripción y
replicación del ADN.
3. Determinar cómo afecta el superenrollamiento del ADN intracelular a la
probabilidad de anudamiento.
4. Desarrollar un método que permita determinar la quiralidad de nudos de ADN
sin necesidad de purificarlos.
5. Analizar la quiralidad de los nudos de ADN formados in vivo en E. coli y S.
cerevisiae.
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Material y métodos
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Material y métodos
61
1. Materiales
1.1. Anillos de ADN y Plásmidos
Figura M1. Tamaño y configuración genética de los minicromosomas de levadura analizados en esta
tesis. YRp3, YRp4, YRp401, YEp24, YCp50, YEp13 y YRp21 fueron amplificados como plásmidos
bacterianos en E. coli. YRp1 y YRp2, que no llevan secuencias bacterianas, fueron construidos por
circularización de fragmentos lineales de ADN generados por amplificación PCR (Díaz-Ingelmo et al.,
2015) Los minicromosomas fueron transfectados a células de S. cerevisiae por electroporación. El
plásmido de 2-micras era endógeno de las cepas de levadura usadas.
Material y métodos
62
1.2. Cepas bacterianas
DH5α (fhuA2 lac(del)U169 phoA glnV44 Φ80' lacZ(del)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1
thi-1 hsdR17) fue la cepa bacteriana usada para la transformación y la obtención
analítica o preparativa de plásmidos. Las bacterias se cultivaron en medio LB (sin o
con ampicilina) en base sólida (placas de agar) o base líquida preparadas según
protocolos estándar (Sambrook et al., 1989).
1.3. Cepas de levadura
Las cepas JCW25, JCW26, JCW27 y JCW28 derivan de la cepa FY251 (MATa his3-
D200 leu2-D1 trp1-D63 ura3–52) y se diferencian por sus mutaciones en los genes
TOP1 y/o TOP2. JCW25 (TOP1 TOP2) es FY251. JCW26 (TOP1 top2–4) lleva una
mutación termosensible (Prolina821 a Glicina) en el gen TOP2 (Thomas et al., 1991).
Esta mutación inactiva la actividad topoisomerasa II cuando las células se incuban a
más de 30 ºC. JCW26 fue construida mediante reemplazo génico (Rothstein, 1983).
JCW27 (∆top1 TOP2) y JCW28 (∆top1 top2–4) se construyeron a partir de JCW25 y
JCW26, respectivamente, mediante un sistema "hit-and-run" que eliminó la secuencia
genómica del gen TOP1 (Roca et al., 1992).
2. Técnicas generales de biología molecular
2.1. Transformación de E. coli mediante electroporación
El ADN (plásmido con gen de resistencia a ampicilina) se microdializó frente a agua
mediante filtros de nitrocelulosa (MILLIPORE® VSWP01300) durante 20 min. El ADN
se añadió en frío a 50 µl de bacterias competentes DH5α, preparadas según
protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). La mezcla se transfirió a una cubeta de
electroporación de 0.2 cm y se sometió a choque eléctrico en un electroporador
(Micropulser Electroporator BIO-RAD®) configurado a 25 µF y 2.2 kV. Acto seguido,
las células se resuspendieron en 1 ml de LB, se incubaron 1 hora a 37 ºC y se
sembraron en placas de LB con ampicilina.
Material y métodos
63
2.2. Obtención analítica y preparativa de plásmidos (miniprep y maxiprep)
Para comprobar la correcta electroporación de las células de E. coli, las colonias
transformantes se cultivaron en 3 ml de medio líquido hasta saturación, los plásmidos
se solubilizaron por lisis alcalina de las células y se purificaron mediante el Plasmid
Extraction Mini-Kit de Favorgen®. Para la obtención de plásmidos a gran escala
(>0.5 mg de plásmido a partir de 500 ml de cultivo) se utilizó Plasmid Maxi Kit de
Quiagen®.
2.3. Cultivo de levadura
Las cepas de levadura se cultivaron en medio YP (Yeast Peptone; 1.1% extracto de
levadura, 2.2% bacto-peptona y 0.0055% adenina), suplementado con 2% de glucosa
(YPD) o 2% rafinosa/galactosa (YPRaff) y en algunos casos se utilizó medio selectivo.
Todos ellos preparados en base sólida (placas de agar) o líquida según protocolos
estándar (Sambrook et al., 1989).
2.4. Transformación de Saccharomyces cerevisiae con ADN circular
La transformación de levadura con plásmidos (producidos en bacteria) o con otros
anillos de ADN (fabricados in vitro) se llevó a cabo mediante electroporación. Para ello,
cultivos en fase de crecimiento exponencial de S. cerevisiae que alcanzaron OD600 ~1,
se enfriaron en hielo durante 5 min para detener su crecimiento. Las células se
sedimentaron, se lavaron con H2OmQ estéril y después con sorbitol 1 M (4 ºC).
Aproximadamente 100 µl de células se diluyeron en un volumen de sorbitol 1 M y
estos 200 µl se mezclaron con 10 µl de ADN. La mezcla se transfirió a cubetas de
0.2 cm y se sometió a choque eléctrico en un Micropulser Electroporator BIO-RAD®
utilizando los ajustes recomendados para levaduras. Las células se diluyeron con
800 µl adicionales de sorbitol 1 M y se sembraron en placas de medio selectivo.
Material y métodos
64
3. Técnicas de topología del ADN
3.1. Técnicas electroforéticas para el estudio de la topología del ADN
3.1.1. Análisis de Lk mediante electroforesis en gel 2D
La electroforesis en geles de agarosa permite separar las moléculas de ADN lineales y
circulares en función de su masa (número de pares de bases) y separa también las
moléculas circulares según su topología (grado de compactación proporcional a ∆Wr).
En el caso de moléculas lineales, la movilidad electroforética correlaciona
inversamente a su longitud. En el caso de las moléculas circulares, un mayor grado de
superenrollamiento incrementa el valor absoluto de ∆Wr y tiende a incrementar su
velocidad de migración. La electroforesis permite separar así los distintos
topoisomeros que forman una distribución térmica de Lk. Sin embargo, la velocidad de
migración no diferencia el signo positivo o negativo de ∆Wr, ya que el grado de
compactación es el mismo. Para saber el signo se añaden cantidades precisas de
intercalantes de ADN, como cloroquina, en el tampón de electroforesis (Figura M2).
Estos intercalantes reducen el Tw del ADN y, dado que Lk no varía en los círculos
covalentemente cerrados, provocan un incremento positivo del Wr. Comparando la
movilidad del ADN en ausencia o presencia de moléculas intercalantes puede
deducirse entonces si ∆Wr (o ∆Lk) entre distintos topoisómeros es positivo o negativo.
Éste es el principio de los geles bidimensionales, en los que se utiliza una baja y una
alta concentración de intercalante en la primera y segunda dimensión,
respectivamente. Como resultado, los topoisómeros individuales se distribuyen a lo
largo de un arco similar al ilustrado en la Figura M3 (Hanai & Roca, 1999).
Material y métodos
65
Figura M2. Esquema del efecto de un intercalante en la movilidad electroforética de distribuciones de Lk. En el panel superior, topoisomeros con superenrollamiento negativo (∆Wr<0) son más compactos y migran más rápido que el ADN relajado (∆Wr=0) o con cortes (nick). Al añadir intercalante durante la electroforesis, se reduce el Tw y estas moléculas de ADN covalentemente cerradas lo compensan incrementando el Wr. En consecuencia migran más despacio. En el panel inferior, topoisomeros cercanos a Lkº (distribucion relajada, ∆Wr=0) migran cercanos al ADN con cortes (nick). Al añadir intercalante, se reduce el Tw y estas moléculas de ADN lo compensan incrementando el Wr, que en este caso pasa a ser Wr>0. En consecuencia, adquieren mayor velocidad en el gel que la molécula con cortes (nick).
Material y métodos
66
Figura M3. Separación de topoisómeros superenrollados mediante electroforesis 2D. En el esquema, los topoisómeros (puntos negros) se sometienron a electroforesis sin intercalante durante la primera dimensión y con intecalante durante la segunda dimensión. El Apex I indica el topoisómero que tuvo el menor Wr, y por lo tanto la velocidad más baja, durante la primera dimensión. La unión del intercalante (rectángulos), aumentó el Wr de este topoisómero de manera que migró más rápido en la segunda dimensión. Apex II indica el topoisómero superenrollado negativamente en origen, que se convirtió en el topoisómero más lento en la segunda dimensión debido a que la unión del intercalante cambió su Wr a casi cero. Anillos de ADN con nicks (N) y ADN lineal (L).
Para observar la distribución Lk de los plásmidos y anillos de ADN analizados en esta
tesis, se realizó una electroforesis bidimensional, cargando 10 µl de muestra en un gel
de agarosa en TBE (89 Tris-borate, 2mM EDTA). Las condiciones de electroforesis
(concentración de agarosa, voltaje y tiempo) se ajustaron al tamaño de cada
minicromosoma y se especifican en la tabla M1.
Las distribuciones de Lk se analizaron como se describió previamente en (Diaz-
Ingelmo et al., 2015). ΔLk se calculó contando el número de Lk topoisómeros que se
extienden desde el centro de la distribución problema de Lk hasta el centro de la
distribución de Lk del ADN relajado.
Material y métodos
67
3.1.2. Análisis de anillos de ADN anudados mediante electroforesis en gel 2D
Tal como se explicó en la introducción, la actividad intramolecular de la topoisomerasa
II (topo II) puede invertir un cruce producido por superenrollamiento del ADN o, bien,
invertir un cruce para dar lugar al anudamiento o desanudamiento de una molécula
circular de ADN (Figura M4A). Tras introducir un nick en las moléculas de ADN, la
tensión helicoidal se disipa porque el dúplex puede pivotar alrededor de la hebra
intacta. Pero los nudos permanecen. Los nudos atrapados en los anillos de ADN
pueden visualizarse por electroforesis en geles de agarosa ya que se mueven más
rápido que los anillos no anudados (Figura M4B). Sin embargo, la identificación de
anillos de ADN anudados mediante electroforesis de una dimensión es ambigua
debido a que la migración de los nudos puede solapar con la posición de fragmentos
lineales de ADN. Cuando se examinan muestras heterogéneas de ADN, por ejemplo
de extractos celulares, abundantes fragmentos de ADN genómico suelen enmascarar
los nudos de ADN. Este problema se resuelve haciendo una electroforesis
bidimensional (2D) de alta resolución (Trigueros et al., 2001) (Figura M4C). En la
primera dimensión, a bajo voltaje, la velocidad de migración de las moléculas
anudadas correlaciona con la complejidad del nudo (el número de cruces irreducible
del nudo) (Stasiak et al., 1996). Por tanto, en relación con la posición del anillo no
anudado que tiene cero cruces (nudo trivial), las posiciones que corresponden con uno
y dos cruces están vacíos porque el nudo más sencillo tiene tres cruces (nudo trébol o
31) (Figura M4C). Poblaciones de nudos de mayor complejidad forman una escalera
que empieza con el 31 seguido por el nudo de cuatro cruces (41), dos nudos de cinco
cruces (51 y 52), y así en adelante. En la segunda dimensión el gel se gira en dirección
ortogonal y la electroforesis se hace a alto voltaje. En estas condiciones, la escalera
de moléculas anudadas se retrasa en relación a la diagonal de fragmentos lineales (L),
lo que permite la identificación inequívoca y la cuantificación de las poblaciones
individuales de nudos (Figura M4C).
Material y métodos
68
Figura M4. Identificación de nudos de ADN por electroforesis 2D. (A) Interconversión de formas
no anudadas (arriba) y anudadas (abajo) de ADN circular de doble hebra por actividad de la
topo II (circulo). (B) El gel de agarosa muestra un plásmido de ADN de 4.4 kb antes (carril 1) y
después de ser incubado con un exceso de topo II para favorecer la formación de nudos (Kn)
(carril 2). Después de la reacción, las muestras de ADN se trataron con una endonucleasa
productora de nicks para eliminar los superenrollamientos. (C) La muestra del carril 2 se cargó
en un gel de agarosa 2D. En la primera dimensión (de arriba a abajo) se separan los tipos de
nudos por su número de cruces irreducibles (*). En la segunda dimensión (de izquierda a
derecha) los fragmentos lineales de ADN (L) se separan de la escalera de nudos (Kn). Los
puntos en el gel que corresponden a los nudos 31, 41, 51, y 52 están indicados. Las condiciones
del gel 2D están descritas en Material y métodos.
Para observar la presencia de nudos en los plásmidos y anillos de ADN de esta tesis,
se trataron 40 µl de muestra con endonucleasa productora de nicks Nt.BstNBI (NEB).
Las condiciones de electroforesis (concentración de agarosa, voltaje y tiempo) se
ajustaron al tamaño de cada minicromosoma y se especifican en la tabla M1.
Las poblaciones de nudos individuales se cuantificaron usando el software ImageJ en
señales no saturadas obtenidas de diluciones seriadas (1, 0.1, 0.01, 0.001) de las
muestras cargadas en los geles 2D. La abundancia relativa de las poblaciones
individuales de nudos se calculó respecto a la cantidad total de anillos de ADN
desanudados y anudados.
*
Material y métodos
69
Electroforesis de distribuciones de
Lk
Gel de agarosa de 20 x 20 cm
Electroforesis de nudos de ADN
Gel de agarosa de 20 x 20 cm
ADN (kb) 1ª
Dimensión
Cloroquina
0.6 µg/mL
2ª
Dimensión
Cloroquina
3.0 µg/mL
1ª
Dimensión
2ª
Dimensión
Agarosa
(w/v)
Voltios x
tiempo
Voltios x
tiempo
Agarosa
(w/v)
Voltios x
tiempo
Voltios x
tiempo
YRp1
(1.5 kb)
2 % 40V x 24h 100V x 4h 2 % 40V x 24h 200V x 3h
YRp2 (2
kb)
1.8 % 65V x 15h 100V x 4h 1.8 % 65V x 15h 165V x 3h
YRp3
(3.2 kb)
1.2 % 65V x 15h 100V x 4h 1.2 % 65V x 15h 150V x 3h
YRp4
(4.4 kb)
0.7 % 50V x 16h 70V x 4h 0.9 % 33V x 42h 150V x 3h
2-micras
(6.3 kb)
0.6 % 22V x 42h 90V x 4h 0.6 % 22V x 42h 125V x 3h
YEp24
(7.8 kb)
YCp50
(7.9 kb)
0.6 % 22V x 42h 90V x 4h 0.45 % 22V x 42h 125V x 4h
YEp13
(10.7 kb)
YRp21
(11.7 kb)
0.4 % 20V x 42h 90V x 4h 0.4 % 33V x 42h 125V x 4h
Tabla M1. Condiciones para las electroforesis 2D.
Material y métodos
70
3.1.3. Transferencia del ADN (Southern), hibridación y detección de señales mediante quimioluminiscencia
Los minicromosomas circulares de S. cerevisiae representan una pequeña fracción del
ADN celular. Por ejemplo, de 10 ml de cultivo (OD600 ~ 1) contienen cerca de 30 µg
de ADN genómico y 1-3 ng de minicromosomas centroméricos. Para su visualización
tras las electroforesis es necesaria la transferencia de las moléculas de ADN desde su
posición en el gel de agarosa a una membrana (Southern Blot) y su posterior
detección mediante hibridación con una sonda que emita una señal.
Para el Sothern blot, el gel se equilibró sucesivamente con una solución de
depurinización que fragmenta el ADN (HCl 0.25 N, 10 min), una solución de
desnaturalización (NaOH 0.5 N, NaCl 1.5 M, 30 min) y una solución de
renaturalización (NH4OAc 1 M, NaOH 0.02 N, 30 min). El ADN se transfirió por
capilaridad durante >4 horas a una membrana de Nylon (Amersham Hybond-N+, GE
Healthcare®). El ADN transferido se fijó covalentemente a la membrana mediante la
irradiación UV (1200 µJ) de un aparato Stratalinker®.
Para la detección del ADN transferido se utilizó el sistema de quimioluminiscencia
AlkPhos Direct de GE Healthcare®, que permite detectar <1 pg de ADN mediante una
sonda de hibridación. En este sistema, la sonda se conjuga directamente a una
fosfatasa alcalina termoestable. Tras la hibridación, la fosfatasa actúa sobre un
reactivo (CDP-Star®) que al descomponerse emite luz visible.
3.2. Preparación de muestras in vitro
3.2.1. Formación de nudos de ADN mediante incubación de plásmidos con un exceso de topoisomerasa II
1 µg de topoisomerasa II de S. cerevisiae purificada como se describe en Díaz-
Ingelmo, 2014, se incubó con 1 µg del plásmido YRp4 superenrollado negativamente
en un volumen de 0.1 mL con 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mg/ml albúmina de suero
bovino (BSA), 10 mM 2-mercaptoetanol, 4% (vol/vol) glicerol, 20 mM KCl, 20 mM
MgCl2 y 2 mM espermidina. Finalmente, se añadió AMPPNP (Merck), análogo de ATP
no hidrolizable, a una concentración final de 2mM y la mezcla se incubó a 30 ºC
durante 5 min. La reacción se paró añadiendo fenol y se precipitó el ADN con EtOH.
Material y métodos
71
3.2.2. Formación de nudos positivos y negativos de ADN mediante circularización de ADN
El plásmido YRp4 se cortó con el enzima de restricción de corte único Hind III y se
purificó en gel el DNA lineal resultante de 4.4 kb. Se circularizaron 2 µg del ADN lineal
mediante tratamiento con T4 ligasa de fago (NEB) a 16 ºC durante 6 h en un volumen
de reacción de 0.2 mL conteniendo 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mg/ml (BSA), 10 mM
2-mercaptoetanol, 1 mM ATP, 4% (vol/vol) glicerol, y 10 mM MgCl2. La reacción se
paró añadiendo fenol y se precipitó el ADN con EtOH. Se cargó una alicuota
directamente en un gel de electroforesis para verificar que la mayoría de las moléculas
de ADN estaban covalentemente cerradas y el resto de la alicuota se cargó después
de un tratamiento con con la endonucleasa Nt. BstNBI (NEB) productora de nicks
(Figura M5A). La misma muestra de anillos de ADN tratados con la endonucleasa se
cargó en un gel de electroforesis 2D para el análisis cuantitativo de la formación de
nudos (Figura M5B).
Figura M5. Formación de tréboles tras circularización de ADN lineal con T4 ADN ligasa. (A) El gel de agarosa teñido con bromuro de etidio muestra el plásmido YRp4 de 4.4kb superenrollado negativamente (carril 1) y después de la linealización con el enzima de restricción de corte único Hind III (carril 2). Las moléculas lineales se circularizaron tratándolas con ADN ligasa del fago T4 (NEB) (carril3). Tras confirmar que la mayoría de las moléculas de ADN se cerraron covalentemente como se indica mediante la distribución gaussiana de los topoisómeros Lk relajados en el carril 3, el ADN se trató con la endonucleasa Nt. BstNBI (NEB) para producir nicks (carril 4). La electroforesis 1D se realizó en gel de agarosa al 0,9% en tampón TBE (Tris-borato 100 mM, pH 8,3, EDTA 2 mM) a 40 V durabte 16 h. La posición de las formas del plásmido superenrolladas (S), lineal (L), relajada (R) y tratada con la
Material y métodos
72
endonucleasa (N) están indicadas. (B) La mancha del gel 2D muestra los mismos anillos de ADN con nick obtenidos anteriormente (carril 4). La electroforesis se realizo en gel de agarosa al 0,9% en tampón TBE en la primera dimensión (de arriba abajo, 33 V, 42 h) y la segunda dimensión (de izquierda a derecha, 150 V, 3 h). En estas condiciones de electroforesis, el nudo de trébol se retrasa con respecto a la diagonal de formas lineales (L), permitiendo así un análisis cuantitativo. La circularización de un plásmido de ADN de 4,5kb con ADN T4 ligasa produjo aproximadamente un 0,85% de nudos de trébol.
3.2.3. Ajuste de la densidad de superenrollamiento negativo en los anillos de ADN
Anillos de ADN de 4,4 kb covalentemente cerrados fueron incubados con
topoisomerasa I de Vaccinia virus (Shuman & Moss,1987) a 25º C durante 15 min a
una concentración final de ADN de 100 µg/mL en un tampón de relajación de ADN
(Tris-HCL 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl 8 mM, EDTA 1 mM, 2-mercaptoetanol 7 mM),
conteniendo las concentraciones de difosfato de cloroquina (Merck) que están
indicadas en la Figura M6. Los mismos productos de ADN se obtuvieron al cortar el
ADN con la endonucleasa Nt-BstNBI (NEB) y al religar luego con ADN ligasa del fago
T4 (NEB) en presencia de las mismas concentraciones de cloroquina. Las reacciones
se pararon añadiendo dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% y proteinasa K a 100
pg/mL, y las mezclas se incubaron a 60 ºC durante 1 h previamente a la extracción
con fenol y precipitación con etanol del ADN. Las muestras se cargaron en un gel de
electroforesis 1D para comprobar los valores de Lk (Figura M6).
Material y métodos
73
Figura M6. Reducción del valor de Lk del ADN mediante relajación con topoisomerasa I en presencia de cloroquina. La electroforesis (de arriba a abajo) se llevó a cabo en gel de agarosa al 1% en tampón TBE (Tris-borato 100 mM, pH 8,3, EDTA 2 mM) a 60 V durante 16 h. Los anillos de ADN relajados en ausencia de cloroquina adquirieron unos pocos superenrollamientos positivos durante la electroforesis, mientras que las concentraciones crecientes de cloroquina produjeron moléculas negativamente superenrolladas que incrementaba su movilidad en el gel. Las concentraciones de cloroquina de 200 a 300 µg/mL produjeron escaleras de topoisómeros superenrollados negativamente adecuados para resolver las dos formas quirales del nudo de trébol superenrollado.
3.3. Preparación de muestras in vivo
3.3.1. Extracción del ADN de minicromosoma circular de S. cerevisiae
Para conocer el valor del número de enlace (Lk) de los minicromosomas circulares de
S. cerevisiae en su estado nativo (in vivo) es esencial que el método de extracción de
ADN evite posibles modificaciones del Lk durante el proceso. El paso de hélice más
estable del ADN (hº) cambia con la temperatura, de modo que Lkº se reduce al
incrementarse la temperatura (la doble hélice tiende a desenrollarse).
Aproximadamente, por cada grado centígrado de cambio, los pares de bases
contiguas rotan 0.011 grados. En consecuencia, el número de enlace (Lkº) de un
mismo ADN circular desnudo, de 1500 pb relajado a 4 ºC y a 37 ºC difiere en 1,5
unidades (33 x 0.011 x 1500 = 544.5 grados). Los cambios de temperatura producidos
durante la manipulación de los cultivos de levadura y la presencia de las
topoisomerasas intracelulares durante la lisis celular, pueden producir desviaciones del
Lk de los minicromosomas.
Para evitar alteraciones del Lk, antes de iniciar la extracción del material genético, las
levaduras en cultivo se fijaron de forma instantánea al añadir un volumen frío (-20 ºC)
de etanol:tolueno (ToKill) (EtOH 95%, Tris HCl pH 8.8 20 mM, Tolueno 28 mM, EDTA
5 mM). Esta fijación detiene toda actividad enzimática y "congela" por tanto el valor de
Lk de los minicromosomas in vivo. Para ello, cultivos de 20 ml de levadura creciendo
en fase exponencial (OD600 ~ 0.8-0.9) se fijaron súbitamente añadiendo un volumen a
-20 ºC de ToKill. Las células se sedimentaron, lavaron y resuspendieron en 400 µl de
TE (Tris HCl pH 7 10 mM, EDTA 1 mM). Se transfirieron a un tubo cónico de 1.5 ml
(tipo eppendorf) al que se añadió un volumen de bolas de vidrio (GlassBeads Sigma®)
y un volumen de fenol. La lisis mecánica de las células se llevó a cabo mediante
agitación en un aparato FastPrep® durante 10 s en potencia 5. La fase acuosa del
lisado se incubó con un exceso de RNAsa durante 10 min y se re-extrajo con un
Material y métodos
74
volumen de cloroformo. Los ácidos nucleicos (principalmente ADN) se precipitaron con
etanol absoluto y se resuspendieron en 50 µl de TE.
75
Resultados
76
Resultados
77
1. Formación de nudos de ADN en cromatina eucariótica
1.1. Nudos de ADN en cromatina eucariota
Para examinar la presencia de nudos de ADN in vivo, se usaron células de S.
cerevisiae transformadas con distintos minicromosomas circulares (Figura M1). Las
células se cultivaron hasta fase exponencial y rápidamente se fijaron con la solución
ToKill a -20oC, tal como se describió en Material y Métodos. Esta fijación inactiva las
topoisomerasas y evita posibles alteraciones de la topología de los minicromosomas
durante la extracción de ADN (Díaz-Ingelmo et al., 2015). Una parte de las muestras
de ADN extraído se cargó en un gel 2D con cloroquina para examinar el número de
enlace (Lk) de los minicromosomas. El resto de las muestras se trataron con
endonucleasa y se cargaron en un gel 2D de alta resolución para detectar la presencia
de nudos de ADN. En ambos tipos de electroforesis, el ADN de los geles se transfirió
a membranas, que se hibridaron posteriormente con sondas específicas para los
minicromosomas como se describe en Material y Métodos. La figura R1 muestra los
resultados obtenidos con células conteniendo el minicromosoma YRp4 (4.4kb). Este
minicromosoma presenta in vivo una distribución gaussiana de Lk. La comparación de
las distribuciones de Lk del ADN de YRp4 in vivo y la del mismo ADN relajado in vitro
muestran que el minicromosoma in vivo tiene una diferencia de número de enlace
(ΔLk) de -22 (Figura R1A). Como se indica en anteriores estudios (Salceda et al.,
2006), este ΔLk es coherente con la presencia de unos 20 nucleosomas y la
estabilización de ΔLk≈-1 por nucleosoma (Simpson et al., 1985), ya que la densidad
nucleosomal el cromatina de levadura es aproximadamente 1 nucleosoma/200 pares
de bases (Yuan et al., 2005).
Una vez eliminado mediante nicks el superenrollamiento del ADN de YRp4, se
reveló la presencia de nudos (Figura R1B). Se observó el nudo 31 seguido de una
escalera de nudos de cada vez más complejidad. Nudos con más de ocho cruces
fueron detectables después de una exposición larga de las membranas (Figura R1B).
Se confirmó que esta escalera estaba formada sólo por nudos DNA de doble hebra
porque se redujo al incubar la muestra con topo II (Figura R1C). Sin embargo, no se
produjo ningún cambio al tratar la muestra con topo I (Figura R1C). La probabilidad de
anudamiento (KpCHR) de YRp4 resultó ser 0.025 (2.5% de moléculas anudadas).
Resultados
78
Se llevaron acabo experimentos análogos con otros minicromosomas circulares
de levadura, tales como el plásmido endógeno 2-micras (6.3 kb), el plásmido YEp24
(7.8 kb) y el plásmido centromérico YCp50 (7.9 kb) (Figura R2A). Estos
minicromosomas presentaron una probabilidad de anudamiento (KpCHR) comparable a
la de YRp4 (KpCHR entre 0.02 y 0.03) y una patrón de complejidad de nudos similar
(Figura R2B).
Figura R1. Los minicromosomas de levadura contienen nudos complejos de ADN. (A) El gel 2D muestra
las distribuciones del número de enlace (Lk) del minicromosoma YRp4 in vivo y del YRp4 relajado in vitro.
La diferencia de Lk se calculó como la distancia (unidades de ΔLk) entre los centros de ambas
distribuciones de Lk a través del arco de topoisómeros Lk. (B) Análisis de nudos de ADN del
minicromosoma YRp4. La muestra anterior de ADN in vivo de YRp4 se trató con endonucleasa y se cargó
en un gel 2D como se describe en la Figura M4C. Los carriles del gel muestran diluciones 1:1 y 1:10 de la
muestra. Los paneles de izquierda a derecha muestran, respectivamente, exposiciones cortas (2 min) y
largas (100 min) del Southern-Blot. Los puntos del anillo no anudado (N), ADN lineal (L) y de los nudos
(Kn) con números de cruces entre 3 y 8 están indicados. (C) El resultado de la incubación de la muestra
de ADN de YRp4 con topoisomerasa I (TOPO I) y topoisomerasa II (TOPO II) de levadura.
Resultados
79
Figura R2. Probabilidad de anudamiento de diferentes minicromosomas circulares de levadura. (A) Las
distribuciones de Lk (Lk) y los tipos de nudos (Kn) del plásmido 2-micras de levadura y los
minicromosomas YCp50 y Yep24. Las condiciones de los geles 2D están descritas en Material y Métodos
(Tabla M1). (B) La probabilidad de anudamiento total y la probabilidad de los nudos 31, 41, 51+52, y de los
tipos de nudos de 6 a 8 cruces (Kn 6, Kn 7, Kn 8) en YRp4, YCp50, Yep24 y el plásmido 2-micras de
levadura. Las gráficas muestran la media y la ±SD de tres experimentos.
Resultados
80
1.2. Los nudos en cromatina no son producto de la replicación del ADN
Los minicromosomas YRp4, YEp24, YCp50 y el plásmido endógeno 2-micras
difieren en el número de copias y tienen diferentes orígenes de replicación y unidades
de transcripción (Figura M1). La similitud en la probabilidad de anudamiento y en el
patrón de complejidad de los nudos de estos distintos minicromosomas sugiere que
los nudos no están relacionados con actividades del ADN, como replicación y
transcripción, ó con la presencia de elementos específicos de cromatina, como
centrómeros. Consistente con esto, se observó que la KpCHR no cambia cuando los
cultivos de levadura pasan de fase exponencial a fase estacionaria y quiescente
(Figura R3A). Por lo tanto, los valores de KpCHR no correlacionaron con la abundancia
relativa de células replicando (Figura R3B).
A continuación se examinó la formación de nudos en levaduras mutantes de
topoisomerasas. Las fracciones de nudos no presentaron cambios significativos en
células carentes de topo I (Δtop1) o en células con actividad topo II reducida (top2-ts)
(Figura R4A y R4B). Una vez inactivada la topo II, se acumularon minicromosomas
encadenados durante la replicación. Estos encadenamientos migran como estructuras
compactadas en los geles 2D usados para el análisis del Lk (Figura R5B). Después de
introducir nicks en el ADN, los encadenamientos produjeron una escalera de
topoisómeros que difieren en el número de encadenamiento (Figura R5B). Incluso en
estas condiciones, la fracción de moléculas anudadas no se alteró significativamente,
lo que corroboró que los nudos observados no son un subproducto de la replicación
del ADN (Figura R4C).
Resultados
81
Figura R3. Los nudos de cromatina se forman independientemente de la proliferación celular y la
replicación del ADN. (A) Se recogieron muestras de células con el minicromosoma YRp4 durante el
crecimiento exponencial (OD 0.5 y 1.0) durante el cambio a la fase estacionaria (OD 2.5 y 4) y durante la
fase quiescente (OD > 6). Se muestra el contenido de ADN celular (1n, 2n), las distribuciones de Lk (Lk) y
los tipos de nudo (Kn) de YRp4 presentes en cada muestra. (B) Comparación de valores de KpCHR y la
abundancia de células replicando (2n/1n) (media y ±SD de tres experimentos).
Resultados
82
Figura R4. Formación de nudos en cepas de levadura mutantes de topoisomerasas. (A y B) Distribución
de Lk (Lk) y tipos de nudos (Kn) de YRp4 presentes en células wt, mutantes Δtop1 y top2-ts antes (26ºC)
y después de la inactivación de la topoisomerasa II durante 2 horas (35ºC). Encadenamientos replicativos
(Cat) están indicados en los geles de análisis de Lk y de nudos. (C) Valores de KpCHR (media y ±SD de
tres experimentos) en células wt, mutantes Δtop1 y top2-ts.
1.3. La actividad de la topoisomerasa II mantiene activamente las fracciones
de ADN anudado
Los resultados anteriores sugieren que la probabilidad de anudamiento de los
minicromosomas en levadura refleja una propiedad general de la estructura de la
cromatina in vivo. Si fuera así, la existencia de nudos podría verse alterada forzando
Resultados
83
un cambio estructural en la población de minicromosomas, por ejemplo, activación de
la transcripción. Para testar esta hipótesis, se utilizó el minicromosoma YRp401 (8.1
kb), que porta el gen LacZ bajo el promotor inducible pGAL1 (Figura M1). Se examinó
la formación de nudos en YRp401 antes y después de la inducción de la transcripción
(Figura R5). Cuando pGAL1 estaba reprimido en medio con glucosa, YRp401 tuvo una
KpCHR de 0.027, una probabilidad de anudamiento comparable a la del plásmido
endógeno 2-micras presente en las mismas células. Sin embargo, cuando el promotor
pGAL1 se activó en medio conteniendo galactosa, la KpCHR de YRp401 se redujo
cuatro veces, y cuando la transcripción se reprimió en medio conteniendo glucosa otra
vez, se recupero el valor KpCHR inicial de este minicromosoma. La siguiente pregunta
fue si este proceso de desanudamiento y anudamiento estaba catalizado por la
actividad de la topo II. Para ello, se repitió el mismo experimento en la cepa mutante
topo2-ts, en la cuál se inhibió la topo II antes de la activación de pGAL1 (Figura R5).
En estas condiciones, la transcripción del gen LacZ se elevó y reprimió de forma
similar, como indicó la actividad beta-galactosidasa extraída de las células. Sin
embargo, los procesos de desanudamiento y anudamiento no ocurrieron. Estos
resultados indicaron que la formación y la resolución de los nudos de ADN es un
proceso dinámico que se basa en la actividad la topoisomerasa II y que el estado
estacionario de los nudos refleja un rasgo general la cromatina in vivo, posiblemente
su equilibrio conformacional.
Resultados
84
Figura R5. Los nudos de cromatina son eliminados y reconstruidos por la topoisomerasa II. Los geles 2D
comparan la formación de nudos en el minicromosoma YRp401, que porta pGAL1:LacZ. Los
experimentos se llevaron a cabo en cepas TOP2 y cepas top2-ts, y se contrastaron los nudos producidos
en YRp401 y el plásmido endógeno 2-micras. Se cogieron muestras de los cultivos de levadura durante el
crecimiento exponencial a 26ºC en medio conteniendo glucosa (glu), después se cambiaron 3 horas a
35ºC en medio conteniendo galactosa (GAL), y después de 3 horas se volvieron a cambiar a medio
conteniendo glucosa (glu). La transcripción de LacZ se controló mediante la actividad de la beta-
galactosidasa en lisados celulares. Las gráficas muestran la media y ±SD de dos experimentos.
1.4. La probabilidad de anudamiento del ADN in vivo no incrementa proporcionalmente con la longitud de la fibra de cromatina
Simulaciones computacionales han demostrado que la probabilidad de
anudamiento de una cadena flexible incrementa proporcionalmente con la longitud de
la cadena (Frank-Kamenetskii et al., 1975). Posteriores experimentos in vitro
corroboraron que la Kp del ADN durante su circularización en solución libre también
incrementa proporcionalmente con su longitud (Rybenkov et al., 1993; Shaw et al.,
1993). Aquí se quiso observar si esta dependencia con la longitud aparece también
Resultados
85
cuando plásmidos de ADN de diferentes tamaños se anudan al incubarlos con un
exceso de topo II in vitro como se detalla en Material y Métodos. Efectivamente
también se observó una correlación lineal entre la longitud y Kp del ADN (Figura R6).
Pero, curiosamente, esta correlación no parecía ocurrir in vivo en minicromosomas de
entre 4.4 y 7.9 kb, ya que todos ellos presentan valores similares de KpCHR (Figura
R2B). Así que se midió la KpCHR en un rango más amplio de tamaños de
minicromosomas (Figura M1).
Figura R6. Dependencia del tamaño del plásmido en el anudamiento de ADN mediado por topo II. (A)
Nudos de ADN producidos por un exceso de topo II en ADN desnudo de los plásmidos YRp2 (2 kb), YRp4
(4 kb), YEp24 (7.8 kb) y YRp21 (11.7 kb). Las reacciones se llevaron a cabo como se detalla en Material y
Métodos. Se recuperaron las muestras de ADN y se trataron con la endonucleasa BstNBI (NEB) y se
examinaron mediante electroforesis bidimensional como se describe en la Tabla M1. Los puntos del anillo
no anudado (N), ADN lineal (L) y de los nudos (Kn) con números de cruces entre 3 y 9 están indicados.
(B) La gráfica muestra la fracción de moléculas anudadas producidas (%) por tamaño de plásmido (kb).
Por un lado, los minicromosomas de mayor tamaño YEp13 (10.7 kb) y YRp21
(11.7 kb) presentaron una KpCHR de ~0.028 (Figura R7A). Este valor aún era
Resultados
86
comparable a la KpCHR de minicromosomas de la mitad de longitud. En cuanto a la
complejidad de los nudos, YEp13 y YRp21 mostraron una escalera de nudos primos
similar a la encontrada en los minicromosomas de entre 4.4 y 7.9 kb. Sin embargo,
YEp13 y YRp21 presentaron una escalera de nudos compuestos adicionales (por
ejemplo 31+31 y 31+41), los cuales no se detectaron en los minicromosomas más
cortos. Estos nudos compuestos migraron en la primera dimensión de acuerdo a su
mínimo número de cruces, pero se movieron más rápido que los nudos primos en la
segunda dimensión (Figura R7A).
Se analizaron entonces los valores de KpCHR en minicromosomas más
pequeños y se observó que KpCHR se reducía drásticamente en tamaños <4 kb (Figura
R7B). Los minicromosomas YRp3 (3.2 kb) y YRp2 (2 kb) presentaron una KpCHR de
0.015 y 0.005, respectivamente. Su complejidad de nudos también se redujo. Se
distinguieron nudos de hasta siete cruces en YRp3, pero sólo se detectó el nudo 31 en
YRp2. Finalmente, no se encontró ningún nudo en YRp1 (1.4 kb), un minicromosoma
que resulta de la circularización del segmento genómico de levadura TRP1ARS1 y que
contiene siete nucleosomas (Thoma et al., 1984). Por tanto, KpCHR aumentaba
proporcionalmente con el tamaño de los minicromosomas en un rango de 2 a 5 kb. Sin
embargo, por encima de este tamaño, la pendiente de KpCHR se reducía cinco veces ya
que la formación de nudos apenas aumentaba en el rango de 5 a 12 kb (Figura R7C).
La Tabla R1 resume los valores KpCHR totales y de nudos de distinta complejidad
observados en los diferentes minicromosmas examinados.
Resultados
87
Figura R7. Dependencia de la probabilidad de anudamiento con la longitud de la cromatina. (A)
Distribuciones de Lk (Lk) y tipos de nudos (Kn) de los minicromosomas YEp13 (10.7 kb) y YRp21 (11.7
kb). La sobreexposición de los Southern-Blots muestra nudos compuestos de seis cruces (31+31) y de
siete cruces (31+41). (B) Distribuciones de Lk (Lk) y tipos de nudos (Kn) de los minicromosomas YRp1 (1.4
kb), YRp2 (2 kb), YRp3 (3.2 kb). Los puntos de ADN lineal (L), círculos no anudados (N) y el nudo de
trébol (31) detectados en YRp2 están indicados. Las condiciones de los geles 2D para el análisis del Lk y
los nudos en (A) y (B) se ajustaron para cada tamaño de ADN como se especifica en Material y Métodos
(Tabla M1). (C) Gráfica resumen de la probabilidad de anudamiento del ADN en los minicromosomas de
Resultados
88
levadura en el rango de tamaños de 1.4 a 11.7 kb. La gráfica muestra la probabilidad (media y ±SD de
tres experimentos) del total de todos los tipos de nudos (Total), del nudo de trébol (31) y de los nudos con
más de tres cruces (Kn > 3).
Cromosoma Longitud
(Kb)
KpCHR Kn 3 Kn 4 Kn 5 Kn 6 Kn 7 Kn 8
YRp1 1,5 0,00
YRp2 2,0 0,52 0,50 0,02
YRp3 3,2 1,49 1,20 0,21 0,06 0,02
YRp4 4,4 2,31 1,72 0,39 0,12 0,05 0,02 0,01
2-micron 6,3 2,62 1,90 0,44 0,17 0,05 0,04 0,02
Yep24 7,8 2,72 1,95 0,46 0,18 0,08 0,04 0,01
YCp50 7,9 2,79 1,95 0,45 0,22 0,10 0,05 0,02
Yep13 10,7 2,89 2,10 0,40 0,23 0,09 0,05 0,02
YRp21 11,7 2,93 2,10 0,40 0,25 0,11 0,05 0,02
Tabla R1. Probabilidad de anudamiento de los minicromosomas de levadura. KpCHR:
Probabilidad de anudamiento total. Kn 3 a Kn 8: Probabilidad de los nudos de ADN con
diferente número de cruces (de 3 a 8).
Resultados
89
2. Efectos del superenrollamiento del ADN en la formación
nudos en la cromatina intracelular.
2.1. El superenrollamiento (+) y (-) del ADN afectan de manera diferente a la
formación de nudos en la cromatina intracelular
Como se explicó en la introducción, durante la transcripción del ADN se genera
superenrollamiento (+) y (-) en las regiones de cromatina por delante y por detrás de la
polimerasa de ARN, respectivamente. En minicromosomas circulares, el
superenrollamiento (+) y (-) del DNA producidos por transcripción se pueden cancelar
mutuamente. Sin embargo, en los cromosomas celulares este superenrollamiento no
se disipa tan fácilmente y tiene que ser relajado por topoisomerasas.
Para investigar el efecto del superenrollamiento en el anudamiento del ADN en
la cromatina intracelular, provocamos un acúmulo de superenrollamiento positivo
(S(+)) y supernenrollamiento negativo (S(-)) del ADN en minicromosomas circulares de
S. Cerevisiae tal como se describió en estudios anteriores de este laboratorio (Salceda
et al., 2006; Fernández et al., 2014). Brevemente, el S(-) se acumuló mediante la
inactivación térmica de la topo II en cepas mutantes top1 top2-4 (Fernández et al.,
2014). En esas condiciones, la preferencia en la relajación de S(+) por la actividad
residual de la topo II conduce a la acumulación del S(-) normalmente generado
durante la transcripción de ADN. Del mismo modo, el S(+) se acumuló inactivando la
topo II en la cepa top1 top2-4 que expresaba constitutivamente TopA, la
topoisomerasa tipo-1A de E.coli (Salceda et al., 2006). En esas condiciones, la
topoisomerasa bacteriana es la única topoisomerasa activa y relaja selectivamente el
S(-) generado durante la transcripción del ADN, lo que permite el acúmulo de S(+)
(Figura R8).
Resultados
90
Figura R8. Actividades de la topoisomerasa que modulan el superenrollamiento del ADN en la
cromatina intracelular. Topo I y topo II relajan el superenrollamiento (+) y (-) del ADN generado
delante y detrás del complejo de transcripción. Como se explica con detalle en la Introducción,
la topo I es más eficiente relajando zonas de ADN desnudo, cerca de la ARN polimerasa (azul), donde la
rotación axial del dúplex puede ser rápida. Sin embargo, el mecanismo de inversión de cruces de ADN de
la topo II se realiza en los cruces de ADN formados dentro de la fibra de nucleosomas y relaja
principalmente S(+). En las células de levadura, la expresión exógena de la TopA relaja sólo el S(-) y, por
tanto, conduce a la acumulación de S(+) cuando las topo I y topo II están inactivas.
El gel de electroforesis 2D en la figura R9A (arriba) muestra el típico patrón de
topoisómeros de ADN obtenido una vez fijada la topología del ADN del
minicromosoma circular YRP4 en las cepas top1 top2-4 y top1 top2-4 TopA+. Como
se describió en Material y Métodos, los topoisómeros se distribuyen a lo largo de un
arco en el cuál su valor de Lk incrementa en el sentido de las agujas del reloj (Figura
M5).
En ausencia de superenrollamiento (carriles 1 y 3), la distribución de Lk tiene valor
negativo respecto al ADN desnudo debido a los superenrollamientos negativos
estabilizados por los nucleosomas nativos, tal como se explicó en los experimentos de
la Figura R1. En este estado, la acumulación de S(-) se evidencia por un
desplazamiento de la distrubición de Lk en un sentido contrario a las agujas del reloj
(carril 2) mientras que el S(+) produce un desplazamiento en el sentido de las agujas
del reloj (carril 4).
Resultados
91
Para evaluar la presencia de nudos de ADN, incubamos las mismas muestras
analizadas en la Figura R9 (arriba) con la endonucleasa que produce nicks y las
examinamos en otra electroforesis en gel 2D. Tal como muestra la figura R9 (abajo), el
acumulo de S(-) no se asoció a un cambio significativo en la formación de nudos. Sin
embargo, el acumulo de S(+) se asoció a un gran aumento de intensidad de las
señales de anudamiento.
Figura R9. Superenrollamiento (-) y (+) del ADN y probabilidad de anudamiento del ADN en
cromatina intracelular. Formas superenrolladas y anudadas del ADN del minicromosoma
circular de levadura YRp4 (4.5 kb), en células top1 top2-4 a 26 ºC (carril 1) y después de
incubarlas 120 min a 37 ºC (carril 2); y en células top1 top2-4 TopA+ a 26 ºC (carril 3) y tras
incubarlas 120 min a 37 ºC (carril 4). Los paneles de arriba corresponden a electroforesis 2D
para analizar la distribución de Lk y fueron llevados a cabo tal como se detalla en Material y
Métodos. El esquema (derecha arriba) ilustra el desplazamiento de la distribución de
topoisómeros Lk (puntos blancos) una vez acumulado S(+) y S(-). N, anillos de ADN con nick.
L, moléculas de ADN lineal. Los paneles de abajo muestran las mismas muestras que los
carriles 1-4 una vez tratado el ADN con la endonucleasa Nt.BstNBI (NEB). La electroforesis 2D
para detectar los nudos se llevó a cabo tal como se detalla en Material y Métodos. El esquema
Resultados
92
(derecha abajo) indica la posición de poblaciones de nudos ADN (puntos blancos) según su
número de cruces irreducibles ascendente (kn#). El nudo de trébol (31), el nudo de cuatro
cruces (41) y los dos nudos de cinco cruces (51 y 52) están indicados. N, anillos de ADN no
anudados. L, moléculas de ADN lineales.
Al calcular la probabilidad de anudamiento (Kp) del minicromosoma YRP4 en células
top1 top2-4 y top1 top2-4 TopA+ (Figura R10A), se observó que antes de la
acumulación de superenrollamiento en el ADN, Kp era de aproximadamente 0,025, un
valor similar al observado previamente en minicromosomas en cepas TOP1 TOP2
(Figura R1). Cuando el minicromosoma acumuló S(-), el valor de Kp no cambió. Sin
embargo, la Kp aumentó aproximadamente 10 veces cuando se acumuló S(+) (Figura
R10A).
Para corroborar que todas las poblaciones de ADN que aumentaban eran formas
anudadas, se incubaron las muestras de ADN con topo I y topo II in vitro. Como se
esperaba, la topo I no produjo ningún cambio, mientras que la topo II convirtió la
población de nudos (kn) en anillos no anudados (N) (Figura R11B).
Los experimentos anteriores indicaron que la inactivación de la topo II en las células
top1 top2-4 TopA+ produce la acumulación de S(+) y de moléculas de ADN
anudadas. Para descartar que este aumento de la Kp pudiera ser consecuencia de la
expresión de TopA, se examinó la formación de nudos en células TOP1 TOP2 con y
sin TopA. Claramente, la expresión de TopA no producía el incremento de Kp (Figura
R10C).
Resultados
93
Figura R10. Efecto del superenrollamiento (+) del ADN en la probabilidad de anudamiento del
ADN en cromatina intracelular. (A) Kp del ADN en células top1 top2-4 y top1 top2-4 TopA+
tras la inactivación de la topoisomerasa II (26ºC a 37ºC). (B) Efecto in vitro de las actividades
de topo I y topo II en nudos de ADN producidos tras la acumulación de S(+) (carril 4 en Figura
R9). (C) Efecto de la expresión de TopA en la formación de nudos. El ADN extraído de células
TOP1 TOP2 con y sin TopA (carriles 1 y 2) se analizó como en la figura R10.
De igual modo, para excluir que los cambios de Kp observados no se debieran a una
singularidad del minicromosoma YRp4 (el minicromosoma de 4.4 kb analizado en la
Figura R10), realizamos experimentos análogos con otros constructos, como el
plásmido endógeno 2-micras y el minicromosoma YEp24. En todos los casos, el S(-)
tuvo poco efecto en Kp, mientras que el S(+) se asoció a un incremento de Kp de unas
10 veces, tal como en YRp4 (Figura R11).
Resultados
94
Figura R11. Anudamiento de distintos minicromosomas circulares de levadura tras la
acumulación de S(-) y S(+). Cepas de levadura conteniendo el plásmido endógeno 2-micras
(6.3 kb) y transformadas con el minicromosoma circular YEp24 (7.8 kb). El ADN total fue
extraído de células top1 top2-4 a 26 ºC (carril 1) y después de incubarlas 120 min a 37 ºC
(carril 2); y en células top1 top2-4 TopA+ a 26 ºC (carril 3) y tras incubarlas 120 min a 37 ºC
(carril 4). Los paneles de arriba corresponden a electroforesis 2D para analizar la distribución
de Lk y fueron llevados a cabo tal como se detalla en Material y Métodos. Los paneles de abajo
muestran las mismas muestras que los carriles 1-4 una vez tratado el ADN con la
endonucleasa Nt.BstNBI (NEB). La electroforesis 2D para detectar los nudos se llevó a cabo tal
como se detalla en Material y Métodos. Lk, distribución de número de enlace de topoisómeros
de ADN. (-)S y (+)S, ADN con un alto grado de superenrollamiento negativo y positivo,
respectivamente. Kn, formas de ADN anudado. N, círculos de ADN no anudados. L, moléculas
de ADN lineal. Las gráficas muestran la probabilidad de anudamiento del ADN de los
minicromosomas 2-micras y YEp24 tras la acumulación de S(-) y S(+) (media y SD de dos
experimentos).
Resultados
95
2.2. El superenrollamiento (+) del ADN aumenta la probabilidad y complejidad de anudamiento del ADN
Para corroborar que la formación de nudos era consecuencia del S(+), se comparó la
tasa de acumulación de moléculas superenrolladas (+) con la tasa de moléculas
anudadas recogiendo muestras en diferentes momentos después de la inactivación de
la topo II (Figura R12A). Como se esperaba, se observó que la Kp aumentaba
rápidamente tan pronto como empezaban a acumularse moléculas con S(+), pero no
antes. Sin embargo, el rápido incremento de Kp no era paralelo con la continua
acumulación de moléculas con S(+). La fracción de moléculas anudadas alcanzaba un
máximo (Kp aproximadamente de 0,25) 30 min después de la inactivación de la topo II,
cuando no más del 50% de los minicromosomas estaban con S(+) (Figura R12B).
Estas diferentes cinéticas de acumulación eran explicables al considerar que el S(+) y
el anudamiento de los minicromosomas se producen por mecanismos distintos. Una
vez inactivada térmicamente la topo II en las células top1 top2-4 TopA+, sólo el S(-)
generado durante la transcripción es relajado por la TopA. Esta relajación asimétrica
puede continuar hasta que prácticamente todos los minicromosomas acaban con S(+).
En cambio, los valores de Kp resultan del equilibrio de anudamiento y desanudamiento
del ADN mantenido por la actividad de la topo II. Cuando empieza a acumularse S(+),
la actividad residual de la topo II permite que la Kp aumente rápidamente. Pero cuando
la topo II queda completamente inactivada (tras unos 30 min) la actividad de
anudamiento y desanudamiento se para, mientras S(+) puede seguir acumulándose.
En este sentido, si consideramos que Kp era aproximadamente de 0,25 cuando sólo un
50% de minichromosomas estaban con S(+), la Kp real producida por S(+) sería
cercana a 0.5 (Figura R12B).
Resultados
96
Figura R12. Correlación entre S(+) y el incremento en la probabilidad de anudamiento. (A)
Células de levadura top1 top2-4 TopA+ transformadas con el minicromosoma YRp4 crecieron
a 26 ºC, y se extrajeron muestras en diferentes tiempos (min) tras incubarlas a 37 ºC. La
electroforesis 2D para examinar la acumulación de S(+) (panel superior) y el incremento en la
formación de nudos (panel inferior) en YRp4 se llevó a cabo como se detalla en Material y
Métodos. N, círculos de ADN no anudados. L, moléculas de ADN lineal. Lk, topoisómeros de
número de enlace. (+)S, ADN superenrollado positivamente. Kn#, número de cruces
irreducibles de ADN anudado. (B) Gráfica de la acumulación de ADN superenrollado (rojo) y la
probabilidad de anudamiento del ADN en relación con el ADN total (verde oscuro) y con las
fracciones de S(+) (verde claro).
Finalmente, se examinó si el S(+) de la cromatina alteraba también la complejidad de
los nudos producidos. Para ello se comparó la abundancia relativa de las poblaciones
de nudos de diferente valor de kn# antes y después de la acumulación de S(+) (Figura
R13A). En ambas condiciones, el nudo de trébol (31) fue la forma predominante y la
abundancia de los nudos más complejos disminuyó al aumentar su valor de kn#. Sin
embargo, mientras que el nudo 31 representó >70% de las moléculas anudadas en la
cromatina relajada, la cantidad relativa del nudo 31 fue del 45% en la cromatina con
S(+) con el consiguiente aumento de los nudos más complejos (kn# >3). Por lo tanto,
Resultados
97
el aumento de Kp inducido por S(+) se basaba en buena parte en un aumento de
nudos complejos (Figura R13B).
Figura R13. Correlación entre S(+) y el incremento en la complejidad de anudamiento. (A)
Gráfica de la probabilidad de poblaciones individuales de nudos de kn# = 3 a 9 en ausencia de
S(+) (azul) y una vez acumulado S(+) (naranja) en relación con el ADN total. (B) Aumento
relativo de las poblaciones individuales de nudos de kn# = 3 a 7 una vez acumulado S(+).
2.3. Los nudos de ADN se forman debido a la condensación de la cromatina inducida por el superenrollamiento (+)
Simulaciones computacionales de cadenas poliméricas aleatorias demuestran que la
compresión aumenta notablemente la probabilidad y complejidad del anudamiento
(Arsuaga et al., 2002; Micheletti et al., 2008). Por tanto, se planteó la hipótesis de que
la condensación de la cromatina impulsada por el S(+) produciría el gran aumento del
anudamiento del ADN. Para testar esta hipótesis, se inició una colaboración con el
grupo del Dr. Cristian Micheletti (SISSA, Trieste) para realizar simulaciones
computacionales de formación de nudos en cromatina y examinar el efecto de la
condensación. Para obtener un modelo representativo de fibras de nucleosomas, se
generaron primero conformaciones aleatorias de anillos de N esferas (nucleosomas)
de diámetro D conectadas por segmentos rectos infinitamente delgados y de longitud
L, de modo que la distancia entre los centros de dos esferas consecutivas era igual a
Resultados
98
D+L. La Figura R14 muestra la probabilidad de formación de nudos en función de D/L
en anillos de 25 esferas. A continuación, con esta simulación, se vió que la
probabilidad de anudamiento del ADN de los minicromosomas que contienen
alrededor de 25 nucleosomas (por ejemplo, YRp4) en ausencia de S(+) in vivo (Kp
0,02) coincidía con un ratio D/L de 0,47. Satisfactoriamente, este ratio D/L estaba
dentro de las dimensiones posibles de las fibras nucleosomales, es decir,
nucleosomas de 10 nm de diámetro separados pos regiones linker de 20-25 nm de
promedio.
Figura R14. Probabilidad de anudamiento (Kp) de configuraciones aleatorias de anillos de N =
25 esferas de diámetro D conectadas por segmentos rectos infinitamente delgados y de
longitud L, de modo que la distancia entre los centros de dos esferas consecutivas es igual a
D+L. La Kp de la cromatina relajada in vivo (Kp ≈ 2) se interpola y coincide con un ratio D/L de
0,47.
Utilizando como referencia el modelo de "collar de perlas" anterior como equivalente a
la fibra de nucleosomas, se generaron millones de conformaciones aleatorias. Se
comprobó entonces el impacto de la compresión de los collares en la formación de
nudos. Para este fin, se establecieron varios valores de radio de giro (Rg2) de las
Resultados
99
configuraciones generadas al azar por computación y se calcularon las probabilidades
de anudamiento de cada una considerando solo aquellas con un Rg2 máximo (es decir,
ocupando un volumen máximo). La figura R15A muestra la probabilidad de
anudamiento calculada con los valores de Rg2, siendo el valor promedio de la
distribución de probabilidad Rg2 = 1 y su Kp = 0,02. Como se esperaba, la probabilidad
de anudamiento aumentó exponencialmente al aumentar la compactación. El valor de
Kp de aproximadamente 0,2 producido por el S(+) observada in vivo se alcanzó
cuando los valores de Rg2 eran 2-3 veces más pequeños que el promedio de Rg
2 de
las conformaciones no compactadas. A continuación, se calculó el enriquecimiento
relativo de poblaciones individuales de nudos (Kn#3, 4 y 5) para los diferentes niveles
de compresión y se compararon con los datos in vivo (mostrados en la Figura R13B)
Como muestra la figura R15B, los enriquecimientos de los nudos de Kn#3, 4 y 5
producidos por el S(+) se generaban con niveles de compresión similares,
aproximadamente 2 veces más pequeños que el Rg2 promedio. Los datos de las
simulaciones apoyaban pues que los nudos de ADN observados en la cromatina son
el resultado de la inversión aleatoria de cruces de ADN por la actividad de la topo II, y
que el incremento en la formación y complejidad de los nudos producida por el S(+)
del ADN era consecuente a una substancial compactación de la fibra nucleosomal
(Figura R16).
Figura R15. Simulaciones computacionales sobre el efecto de la condensación en la
probabilidad de anudamiento del ADN en fibras de cromatina. (A) Valores de Kp del modelo de
Resultados
100
referencia de la fibra nucleosomal (N = 25, D/L = 0,47) en función del radio de giro (Rg2) de las
configuraciones aleatorias. El radio de giro promedio de todas las configuraciones se normaliza
como Rg2 = 1. Cada punto calcula el valor de Kp de esas configuraciones con un radio de giro
por debajo el un valor de corte (max Rg2). Los valores de Kp observados in vivo en la cromatina
relajada (Kp = 0,02) y en la cromatina con S(+) (Kp ≥0,2) se interpolan para obtener su
correspondiente Rg2. (B) Enriquecimiento relativo de los tipos de nudos de Kn# = 3, 4 y 5 en
función de los valores de corte del radio de giro (max Rg2). Los enriquecimientos relativos de
los tipos de nudo de Kn# = 3, 4 y 5 observados in vivo (Kp de cromatina S(+)/Kp de cromatina
relajada) son interpoladas para obtener su Rg2 correspondiente.
Figura R16. Resumen del modelo de la probabilidad de anudamiento del ADN mediada por la
actividad de la topo II en cromatina relajada (Rg2 = 1; Kp ≈ 0,02) y cromatina condensada por
S(+) (Rg2 ≤ 0,5; Kp ≥ 0,2).
Resultados
101
3. Estudio de la quiralidad de nudos de ADN in vivo
En los capítulos anteriores se ha descrito como la electroforesis en geles de agarosa
permite determinar la probabilidad de anudamiento del ADN y caracterizar la
complejidad de los nudos. La movilidad de los anillos de ADN en el gel depende de su
compactación global. Por consiguiente, tras introducir nicks en el ADN para eliminar la
contribución del superenrollamiento a la compactación molecular, las moléculas de
ADN anudadas exhiben una velocidad en el gel que se correlaciona linealmente con la
complejidad del nudo (Figura R17). En estas condiciones, cualquier nudo produce una
compactación del ADN idéntica a su imagen especular. Por lo tanto, es imposible
distinguir por este medio las dos formas quirales de cada nudos. Por ejemplo, el trébol
de tres cruces negativos posee idéntica movilidad que del trébol de tres cruces
positivos (Figura R17). Hasta ahora el único método para determinar la quiralidad de
los nudos de ADN era visualizar el signo topológico de sus cruces mediante
microscopía electrónica (Lynn y Crisona, 1999). Como ya se explicó en la introducción,
este es un método complejo y no se puede aplicar para analizar nudos de ADN
producidos en cromatina intracelular. Anteriormente, en esta tesis, hemos visto que los
minicromosomas circulares que contienen nudos de ADN representan una pequeña
fracción (<0.03%) del contenido de ADN intracelular, lo que hace imposible su
purificación y posterior manipulación. Esto nos dirigió a desarrollar un procedimiento
alternativo que nos permitiera determinar su quiralidad.
Resultados
102
Figura R17. Movilidad de las dos formas quirales de un nudo en moléculas covalentmente abiertas
(con nick). El Southern-blot del gel 2D muestra el ADN del minicromosoma YRp4 extraído in vivo y
después de ser tratado con la endonucleasa Nt.BstNBI (NEB) para eliminar el superenrollamiento y así
con ello la distribución de topoisómeros Lk. Las condiciones de electroforesis están descritas en Material y
Métodos (Tabla M1). Como las moléculas anudadas retenían su compactación molecular después de
tratarlas con la endonucleasa, éstas se mueven más rápido que las formas no anudadas que contienen
nicks (0), y su velocidad correlaciona linealmente con la complejidad del nudo. Las posiciones de los
nudos conteniendo de 3 a 7 cruces irreducibles de ADN (kn) están indicadas. Ya que cualquier nudo tiene
la compactación idéntica que su imagen especular, mediante este método no es posible distinguir los
nudos de trébol con tres cruces negativos de los tréboles con tres cruces positivos.
3.1. Enfoque teórico para discernir la quiralidad de nudos de ADN mediante
electroforesis.
Cuando los anillos de ADN de doble hebra que contienen un nudo están
covalentemente cerrados (no tienen nicks), las moléculas de ADN conforman una
distribución de número de enlace (Lk). Por tanto, las moléculas anudadas pueden
adquirir diferentes grados de superenrollamiento que contribuyen también a la
compactación de ADN y su movilidad en el gel. En estas condiciones, Shaw y Wang
(1997) observaron que el superenrollamiento del ADN cambia levemente la
conformación espacial de las dos formas quirales de los nudos 31 y, por tanto, su
Resultados
103
comportamiento electroforético. Shaw y Wang observaron que el superenrollamiento
negativo hacía que los topoisomeros Lk de tréboles con cruces negativos migraran
ligeramente más rápido que el de los tréboles con cruces positivos, mientras que el
superenrollamiento positivo producía el efecto opuesto. En consecuencia, después de
una larga electroforesis, las dos formas quirales del nudo 31 llegaban a separarse en
un doblete para cada valor de la distribución Lk del ADN superenrollado (Figura R18).
Figura R18. Movilidad electroforética de las dos formas quirales del nudo 31 en ADN superenrollado. El
esquema ilustra las observaciones de Shaw y Wang (1997) sobre la movilidad electroforética de las dos
formas quirales del nudo 31 con superenrollamiento negativo y positivo. Las moléculas de ADN
superenrolladas forman una distribución de topoisómeros de ADN (Lk), en la cuál las dos formas quirales
del nudo 31 se separan en un doblete para cada valor de Lk. Cuando el DNA está superenrollado
negativamente durante la electroforesis (izquierda), el trébol negativo en cada doblete migra por delante
del trébol positivo. Cuando el ADN está superenrollado positivamente (derecha) ocurre el efecto opuesto.
Para observar el doblete de las formas quirales del nudo 31, Shaw y Wang purificaron
primero en gran cantidad tréboles de ADN (producidos in vitro y con nicks)
extrayéndolos de un gel. Después ajustaron el superenrollamiento del ADN y lo
cargaron en la electroforesis. Si no se purificaran, las señales de los tréboles
quedarían enmascaradas por las moléculas de ADN no anudadas y las formas de
ADN lineal. Por tanto, este procedimiento no era aplicable a muestras biológicas que
contienen cantidades pequeñas de moléculas anudadas, lo que imposibilita su
purificación. Para superar este problema, consideramos la posibilidad de que las
Resultados
104
distribuciones de Lk de anillos de ADN anudados y no anudados se pudieran separar
entre sí mediante electroforesis bidimensional (2D) en presencia de cloroquina (Roca
et al., 1993). Esto era posible porque el desenrollamiento del ADN mediante
intercalantes modifica la compactación molecular producida por el superenrollamiento
(Hanai & Roca, 1996), pero no modifica la compactación producida por el
anudamiento. Como resultado, estudios previos (Roca et al., 1993) ya habían
mostrado que los anillos de ADN que contienen un nudo forman un arco de
topoisómeros Lk distinto al formado por los anillos no anudados. Según la complejidad
del nudo, el arco de Lk se mueve más rápido en la primera y en la segunda dimension
de la electroforesis (Figura R19).
Figura R19. Separación de las distribuciones de Lk de ADN anudado y no anudado mediante
electroforesis 2D. El Southern-blot del gel 2D muestra un plásmido negativamente superenrollado de 3.2
kb que se incubó con un exceso molar de topoisomerasa II para promover la formación de nudos de ADN
como se describe en Material y Métodos. La electroforesis se llevó a cabo en un gel de agarosa al 1% en
tampón TBE (100mM Tris-borato, pH 8.3, 2mM EDTA) más 0.2 y 2 µg/ml de difosfato de cloroquina
respectivamente en la primera (de arriba abajo, 60V, 16h) y en la segunda dimensión (de izquierda a
derecha, 60V, 8h). El esquema de colores indica la posición en el gel de la distribución de Lk del plásmido
no anudado y de los plásmidos anudados que contienen nudos de 3, 4, 5 y 6 cruces irreducibles.
Combinando las observaciones anteriores de Shaw & Wang (1997) y Roca et al.
(1993), se pensó en un método electroforético 2D capaz de resolver las dos formas
quirales del nudo 31 sin necesidad de purificarlos. Para empezar, la superhelicidad de
los anillos de ADN presentes en una muestra debería ajustarse, de tal manera que
Resultados
105
formen una escalera de topoisómeros Lk superenrollados negativamente durante la
primera dimensión de la electroforesis. Este ajuste podría lograse modificando los
valores de Lk del ADN con topoisomerasa I antes de la electroforesis ó incluyendo una
concentración apropiada de cloroquina durante la primera dimensión del gel. Los
topoisómeros Lk superenrollados negativamente deberían correr entonces en una
larga primera dimensión de la electroforesis, de modo que las dos formas quirales del
nudo 31 se resolvieran en un doblete para cada valor de Lk, tal como hicieron Shaw &
Wang (1997). En este punto, los dobletes no serían visibles, ya que estarían tapados
por formas no anudadas del ADN y fragmentos lineales, generalmente abundantes en
las muestras biológicas. Se continuaría entonces con una segunda dimensión, que
contendría una concentración de cloroquina que neutralice la compactación del ADN
producida por los superenrollamientos negativos. Como resultado, los anillos
anudados y no anudados con distintos valores de Lk que tenían una compactación
similar en la primera dimensión, adquirirán una movilidad diferente en la segunda
dimensión. El doblete de los nudos trébol de ADN debería entonces hacerse visible
para la cuantificación (Figura R20).
Figura R20. Estrategia para discernir la quiralidad de los nudos de trébol directamente mediante
electroforesis a partir de muestras complejas de ADN. El esquema de la izquierda muestra como después
de correr una larga primera dimensión en una electroforesis (>70h de arriba abajo), los topoisómeros
negativamente superenrollados con un trébol negativo migran ligeramente por delante que los que poseen
un trébol positivo (Shaw y Wang. 1997). Un doblete de formas quirales se resuelve con cada valor de Lk
de los anillos de ADN. Sin embargo, este doblete está enmascarado por los topoisómeros Lk de las
moléculas de ADN no anudadas. El esquema de la derecha muestra el resultado después de correr la
Resultados
106
segunda dimensión (de izquierda a derecha) en presencia de una concentración adecuada de cloroquina.
Debido al la intercalación de la cloroquina en el ADN, el paso de hélice del ADN (Tw) disminuye y el
número de enrollamiento (Wr) aumenta (se hace menos negativo o mas positivo). La conformación de
moléculas de ADN durante la primera dimensión (moléculas azules) cambia de este modo durante la
segunda dimensión (moléculas rojas). Como resultado, moléculas anudadas y no anudadas que tenían
una compactación y movilidad similar en la primera dimensión, adquieren una velocidad diferente en la
segunda. Los dobletes de las formas quirales del nudo de trébol deberían verse entonces para su análisis
cuantitativo.
3.2. Quiralidad de los nudos de trébol de ADN generados in vitro.
Para probar el método descrito anteriormente, se examinó primero la pequeña fracción
de nudos de trébol que se forman normalmente tras la circularización de moléculas de
ADN lineales en solución libre como se detalla en Material y Métodos. Estudios previos
habían demostrado que cuando el ADN en disolución libre se circulariza al azar
produce cantidades equivalentes de las dos formas quirales de tréboles de ADN
(Shaw y Wang, 1997). Tras la circularización de una molécula de ADN de 4.4kb con
T4 ligasa, se obtuvo aproximadamente 0.85% de anillos conteniendo un nudo de trébol
(Figura M5). Luego se incubó el ADN circularizado con topoisomerasa I en presencia
de 250 µg/ml de cloroquina para producir las escaleras de topoisomeros de Lk
superenrollados negativamente y adecuadas para resolver las dos formas quirales del
nudo de trébol superenrollado. En Material y Métodos se describe como se calibraron
las concentraciones adecuadas de cloroquina (Figura M2).
La muestra de ADN circularizado y superrollado se analizó mediante electroforesis 2D
en gel de agarosa usando los parámetros que deberían exponer el doblete de los
tréboles de ADN (Figura R20). Como se muestra en el gel 2D de la Figura R21B, la
mayoría de los anillos de ADN de 4.5kb mostraron una distribución gausiana de
topoisómeros Lk superenrollados negativamente en la primera dimensión del gel.
Durante la segunda dimensión del gel en presencia de cloroquina, las moléculas
anudadas y no anudadas adquirieron una movilidad diferente y, como de esperaba, se
reveló un arco secundario más débil de topoisómeros Lk que contenían un nudo de
trébol. Tal como se deseaba, los topoisómeros Lk del trébol aparecieron como
dobletes. Ya que los dobletes tenían la misma intensidad, quedaba así demostrada la
presencia de igual cantidad de las dos formas quirales mediante este nuevo metodo
(Figura R21B).
Resultados
107
Figura R21. Quiralidad de los tréboles de ADN producidos in vitro mediante circularización de ADN lineal.
(A) Esquema de la producción de moléculas de ADN negativamente superenrolladas que contienen
fracciones iguales de las dos formas quirales del nudo de trébol. Tras la circularización de ADN lineal en
solución libre con T4 ADN ligasa, se introdujeron superenrollamientos negativos incubando el ADN con
topoisomerasa I en presencia de 250 µg/mL de cloroquina. (B) Southern blot del gel 2D del plásmido
YRp4 (4,5 kb) preparado como se describe en A. La electroforesis se llevó a cabo en gel de agarosa al
0,9% en tampón (Tris-borato 100 mM, pH 8,3, EDTA 2 mM). La primera dimensión del gel (de arriba a
abajo) se llevó a cabo a 80 V durante 70 h. La segunda dimensión del gel (de izquierda a derecha)
contenía 0,65 µg/mL de cloroquina y se llevó a cabo a 120 V durante 10 h. En la ampliacion del gel se
puede ver el doblete con las dos formas quirales del nudo de trébol. La gráfica muestra la probabilidad de
cada forma quiral del nudo de trébol.
Resultados
108
Ya que los tréboles de ADN estaban superenrollaron negativamente durante la primera
dimensión, la banda más rápida de cada doblete según Shaw & Wang debería
corresponderse con el trébol de cruces negativos. Para comprobar que esto era
correcto se hizo otro experimento. Se incubó un plásmido de 4.5kb superenrollado
negativamente con un exceso molar de topoisomerasa II y AMPPNP, tal como se
detalla en Material y Métodos. En estas condiciones, la topoisomerasa interconecta las
ramas plectonémicas del ADN superenrollado, lo que lleva a la formación de
abundantes nudos de trébol con cruces negativos (Figura R22A). En este caso, ya que
los nudos producidos ya estaban superenrollados negativamente, simplemente se
añadió una pequeña concentración de cloroquina durante la primera dimensión de la
electroforesis para resolverlos en una escalera de topoisómeros Lk. Como se muestra
en el gel 2D de la Figura R22B, las moléculas que contienen un nudo de trébol
formaron también un arco secundario de topoisómeros Lk. Sin embargo, en este caso,
casi toda la señal se concentró en la banda más rápida de cada doblete, confirmando
así que se trata de los tréboles de cruces negativos (Figura R22B).
Resultados
109
Figura R22. Quiralidad de los tréboles de ADN producidos in vitro mediante incubación de ADN
superenrollado negativamente con exceso de topo II. (A) Tras incubación de ADN negativamente
superenrollado con un exceso molar de topoisomerasa II, la adicción de AMPPNP (análogo de ATP no
hidrolizable) induce eventos de transporte de ADN en una sola etapa que enredan el ADN superenrollado.
(B) Southern blot del gel 2D del plásmido YRp4 (4,5 kb) preparado como se describe en A. La
electroforesis se llevó a cabo en gel de agarosa al 0,9% en tampón (Tris-borato 100 mM, pH 8,3, EDTA 2
mM). La primera dimensión del gel (de arriba a abajo) contenía 1 µg/mL de cloroquina y se corrió a 80 V
durante 70 h. La segunda dimensión del gel (de izquierda a derecha) contenía 5 µg/mL de cloroquina y se
corrió a 120 V durante 10 h. En la ampliación del gel se puede que casi toda la señal se concentró en la
banda más rápida, que corresponde con los tréboles de cruces negativos. La gráfica muestra la
probabilidad de cada forma quiral del nudo de trébol.
Resultados
110
3.3. Quiralidad de los tréboles de ADN generados in vivo
Una vez validado el método, se utilizó para conocer la quiralidad de los nudos de ADN
generados en células vivas. Al igual que lo demostrado en esta tesis con S. cerevisiae,
estudios previos habían demostrado que plásmidos de ADN extraídos de células de E.
coli también contienen pequeñas cantidades de nudos, mayoritariamente tréboles (Ishii
et al., 1991; Shishido et al., 1987). Es estos experimentos, los nudos se detectaron por
electroforesis de círculos de ADN tras introducir nicks pero no se pudo determinar su
quiralidad.
Por tanto, para esta tesis se transformaron células de E. coli y S. cerevisiae con el
plásmido YRp4 (4.4 kb), el cual puede replicarse en ambos sistemas celulares. Se
extrajo el ADN de las bacterias y levaduras como se describe en Material y Métodos,
se realizó la electroforesis 2D y se hibridó con sonda del plásmido YRp4. Las Figuras
R23 y R24 muestran los resultados. En ambos casos se puede observar un arco
secundario de moléculas de ADN que contienen el nudo de trébol en forma de doblete.
Sin embargo, en E. coli el 92% de los tréboles fueron negativos (Figura R23), mientras
que el número de tréboles positivos y negativos fue más equilibrado en el caso de S.
cerevisiae (Figura R24). Los resultados de E. coli indicaron un predominio de
quiralidad negativa en la trayectoria del ADN in vivo, que muy probablemente es reflejo
del superenrollamiento negativo no estabilizado que se mantiene habitualmente en la
cromatina bacteriana. Por el contrario, los resultados de S. cerevisiae revelaron la
ausencia de una quiralidad dominante en la trayectoria espacial del ADN en la fibra de
cromatina, ya que la mayoría del superenrollamiento negativo se encuentra
estabilizado por los nucleosomas.
Resultados
111
Figura R23. (A) Se recolectaron células de E. coli que contenían el plásmido YRp4 de 4.5 kb y se extrajo
su DNA para análisis electroforético en gel de agarosa. (B) Southern blot del gel 2D. La primera
dimensión del gel (de arriba abajo) contenía 1,5 µg/mL de cloroquina y se corrió a 80 V durante 70 h. La
segunda dimensión del gel (de izquierda a derecha) contenía 8 µg/mL de cloroquina y se corrió a 120 V
durante 10 h. En la ampliación del gel se puede ver el arco de las moléculas no anudadas Kn#0 y el arco
con los dobletes de tréboles Kn#3. (C) La gráfica muestra la probabilidad de cada forma quiral del nudo
de trébol.
Resultados
112
Figura R24. (A) Se recolectaron células de S. cerevisiae que contenían el mismo plásmido de 4.5 kb y se
extrajo su DNA para análisis electroforético. (B) Southern blot del gel 2D. La primera dimensión del gel
(de ariba abajo) contenía 1 µg/mL de cloroquina y se corrió a 80 V durante 70 h. La segunda dimensión
del gel (de izquierda a derecha) contenía 5 µg/mL de cloroquina y se corrió a 120 V durante 10 h. En la
ampliación del gel se puede ver el arco de las moléculas no anudadas Kn#0 y el arco con los dobletes de
tréboles Kn#3. (C) La gráfica muestra la probabilidad de cada forma quiral del nudo de trébol.
113
Discusión
114
Discusión
115
1. Nudos de ADN en la cromatina eucariótica
Esta tesis proporciona la primera evidencia de nudos de ADN en células eucarióticas.
Los resultados muestran que pequeñas cantidades de nudos están presentes en el
ADN intracelular independientemente de los elementos estructurales y funcionales de
la cromatina. Los nudos se forman independientemente del estado de proliferación
celular, aunque su abundancia se reduce transitoriamente durante la transcripción del
ADN de los minicromosomas circulares. En conjunto, los resultados sugieren que hay
una probabilidad generalizada de anudamiento del ADN de la cromatina y que es
resultado de la actividad de la topo II. Este descubrimiento no es sorprendente cuando
se considera la alta concentración de segmentos de ADN dentro de las fibras de
cromatina y la abundancia de actividad de topo II que puede pasar unos segmentos a
través de otros. Alternativamente, los nudos de ADN podrían ser causados por
procesos de recombinación. Esta posibilidad es inverosímil ya que los nudos
aparecerían entonces en secuencias homólogas del ADN, se asociarían inserciones o
deleciones y se crearían tipos específicos de nudos (Wasserman et al., 1985; Buck &
Flapan, 2007; Deibler et al., 2007).
Si los nudos producidos en el ADN intracelular son consecuencia de la
actividad aleatoria de la topo II, estos nudos deberían reflejar propiedades biofísicas y
conformacionales de la cromatina in vivo. En este sentido, una primera observación
interesante es que la probabilidad de anudamiento del ADN en cromatina eucariótica
(KpCHR) contrasta en varios aspectos con la probabilidad de anudamiento del ADN
durante la circularización de moléculas lineales de ADN en solución libre (KpDNA)
(Figura D1). El valor de KpDNA incrementa proporcionalmente con la longitud del ADN
(Figura D1, línea naranja), y su pendiente depende de la flexibilidad y diámetro
efectivo del ADN (Shaw & Wang, 1993; Rybenkov et al., 1993). La flexibilidad del ADN
desnudo viene dada por su longitud de persistencia (PL), la cuál es de unos 50 nm
(Hagerman, 1988). El diámetro efectivo del ADN (dE) depende del ambiente iónico. En
concentraciones de sal fisiológicas, dE es de 5nm (Shaw & Wang, 1993; Rybenkov et
al., 1993). En esta tesis se muestra que hasta un tamaño de minicromosoma de 4-5
kb, KpCHR incrementa de modo lineal (Figura R7) pero con una pendiente más
pronunciada que la del KpDNA (Figura D1, línea azul discontinua). Sin embargo, por
encima de 4-5 kb, la pendiente de KpCHR se reduce de forma abrupta y es menor que la
de KpDNA. Estas diferencias en las pendientes de Kp
CHR son más notables cuando, en
vez de considerar simplemente la longitud del ADN (desnudo o cromatinizado), se
Discusión
116
considera la longitud de contorno real de los minicromosomas, que es muchos más
corta ya que depende sólo de los segmentos de ADN inter-nucleosomales (Figura D1,
línea azul continua).
Figura D1. Comparación de la probabilidad de anudamiento del ADN desnudo en solución libre (línea
naranja) con la de fibras de nucleosomas (línea azul continua) en función de su longitud de contorno (nm).
La gráfica muestra los valores de cromatina contra la longitud total de ADN (línea azul discontinua) y
contra la longitud de fibra de nucleosomas de 10 nm estirada (línea azul continua).
La explicación más simple para la pendiente inicial de valores de KpCHR (< 4-5
Kb) es que la yuxtaposición de los segmentos intramoleculares de ADN in vivo es
mucho mayor que en el ADN en solución libre, y por consiguiente, la probabilidad de
formación de nudos mediada por topo II. La mayor yuxtaposición de segmentos
intramoleculares de ADN in vivo podría deberse a un superenrollameinto (positivo o
negativo) del ADN. Sin embargo, la distribución de Lk de los minicromosomas
analizados en cepas TOP1 TOP2 no mostró evidencia de superenrollamiento no
estabilizados que pudieran aumentar la yuxtaposición de segmentos del ADN (Figura
Discusión
117
R1). La explicación más fácil es que la mayor yuxtaposición de los segmentos de ADN
refleja simplemente la mayor flexibilidad de las fibras nucleosomales en comparación
con el ADN desnudo. En este sentido, estudios in vivo de formación de pequeñas
loops de ADN (Ringrose et al., 1999) y experimentos in vitro con moléculas
individuales (Hajjoul et al., 2013) han demostrado la mayor flexibilidad de las fibras de
nucleosomas, cuyo PL sería 10-20 nm (mientras que PL es 50 nm en el ADN desnudo).
En esta tesis se han calculado los valores de PL y dE aparentes de la fibra
nucleosomal in vivo. Para ello, los datos de anudamiento in vivo (KpCHR) se han
comparado con los de simulaciones previas de formación de nudos en cadenas
poliméricas aleatorias (Klein et al., 1988; Rybenkov et al., 1993). Considerando la
complejidad de los nudos (Figura D2A) y la probabilidad del nudo 31 (Figura D2B), se
encontró que la fibra de nucleosomas se anuda como una cadena polimérica aleatoria
con un dE de cero y una PL de 14 nm. Valores mayores de PL implicarían un valor de dE
negativos, como si los segmentos de ADN linker se atrajeran fuertemente en vez de
repelerse por fuerzas electroestáticas. Por el contrario, valores de dE cercanos al
diámetro geométrico del ADN (2 nm) implicarían valores de PL extremadamente bajos
(< 3 nm), menos de una vuelta de la doble hélice.
Discusión
118
Figura D2. (A) Abundancia relativa del nudo 31 y de los nudos de más de tres cruces (Kn > 3) como una
función de PL de una cadena delgada con una longitud de contorno de 380 nm (igual que el
minicromosoma YRp4). (B) Valores de PL y dE de una cadena simulada con una longitud de contorno de
380 nm que produciría el nudo 31 con una probabilidad de 0.017 (igual que el minicromosoma YRp4).
La alta flexibilidad y la capacidad de compactación de las fibras de
nucleosomas se deben principalmente a la alta movilidad del ángulo entre los
segmentos de entrada y salida del ADN nucleosomal (Bancaud et al., 2006). En
relación a esto, si los segmentos de ADN linker se comportaran como palos rígidos,
otra forma de interpretar cualitativamente los datos de KpCHR es considerar el mínimo
número de palos para formar un nudo (Huh & Oh, 2011). Este principio establece que
para formar el nudo 31 se requieren un mínimo de seis palos (Figura D3A). Este
Discusión
119
principio explicaría porque no se detectaron nudos en el minicromosomas YRp1 (1.4
kb) (Figura R7B), ya que tiene sólo siete nucleosomas y, por tanto, un número de
palos (linkers) cercano al mínimo teórico. Sin embargo, el nudo 31 se formó claramente
en el minicromosoma YRp2 (2 kb) ligeramente más grande y se produjeron nudos de
hasta siete cruces en el YRp3 (3.2 kb) (Figura R7B). Por tanto, en términos de
arquitectura de la cromatina, los datos de KpCHR apoyan los modelos de zig-zag ó
plegamiento intrincado de la fibra de nucleosomas (Dorigo et al., 2004; Song et al.,
2014), en los cuales los segmentos de ADN linker se cruzan entre sí con mayor
frecuencia que en los modelos de empaquetamiento solenoidal (Ghirlando &
Felsenfeld, 2008) (Figura D3B).
Figura D3. (A) Se requieren al menos seis palos para formar el nudo de trébol. (B) Yuxtaposición de
segmentos de ADN linker en los modelos solenoidal, zig-zag y plegamiento irregular de las fibras de
nucleosomas.
Finalmente, una pista adicional de que la formación de nudos de ADN está
favorecida por el plegamiento intrincado de la fibra de nucleosomas es la disminución
Discusión
120
de la fracción de nudos durante la transcripción de ADN en los minicromosomas
circulares (Figura R5). En estas condiciones, la cromatina se despliega localmente
(Konberg & Lorch, 1995) y los superenrollamientos positivo y negativo del ADN se
cancelan en minicromosomas circulares. Como resultado, la yuxtaposición de
segmentos de ADN debe reducirse y, por tanto, la probabilidad de anudamiento
(Figura D4).
Figura D4. El plegamiento intrincado de los grupos de nucleosomas favorece el anudamiento mediado
por la topo II intracelular. Las fracciones anudadas se reducen cuando los grupos de nucleosomas se
despliegan durante la transcripción de ADN.
La drástica reducción de la pendiente de KpCHR cuando el tamaño de los
minicromosomas supera las 4-5 kb (sobre 20 nucleosomas) fue llamativa y
probablemente de relevancia biológica. Simulaciones computacionales (Kamenetskii et
al., 1975), circularización de moléculas lineales de ADN en solución libre (Rybenkov et
al., 1993; Shaw & Wang, 1993), y el anudamiento de plásmidos de ADN in vitro
realizados en esta tesis con exceso de topo II (Figura R6) indican que la probabilidad
de anudamiento del ADN aumenta proporcionalmente con su tamaño. Por lo tanto,
algunos mecanismos deben evitar que KpCHR siga aumentando con el tamaño. De lo
contrario, se produciría un enredo masivo del ADN intracelular. Una posibilidad es que
esta inflexión se logre por la capacidad de la topo II para simplificar la topología del
ADN por debajo del equilibrio termodinámico (Rybenkov et al., 1997). En este sentido,
estudios previos in vitro indicaron que la topo II es menos eficiente en la simplificación
de la topología del ADN cuando la longitud de la molécula desnuda disminuye por
debajo de 2 kb (Trigueros et al., 2004). Una dependencia de longitud similar podría
explicar porque la topo II intracelular desanuda (simplifica los nudos) con mayor
Discusión
121
eficacia en los minicromosomas > 4-5 kb (cuya longitud de contorno equivale a 1-2
kb). La formación de nudos de ADN también podría minimizarse in vivo mediante otros
mecanismos que regulan la actividad de la topo II. Estudios más recientes in vivo
indican que la arquitectura de la cromatina (Fernandez et al., 2014) y la actividad de
condensinas (Sen et al., 2016; Piskadlo et al., 2017) podrían regular también la
capacidad de la topo II para invertir unos cruces y no otros.
Un mecanismo diferente que podría explicar la inflexión de la pendiente de
KpCHR descubierta en esta tesis es una transición en el modo de plegamiento de la fibra
de nucleosomas dependiente de la longitud. La arquitectura de la fibra de
nucleosomas es un tema muy debatido (Fussner et al., 2011; Luguer et al,. 2012;
Maeshima et al., 2014). Además de los modelos clásicos de empaquetamiento regular
y ordenado (Ghirlando & Felsenfeld, 2008; Felsenfeld, 2008; Dorigo et al., 2004; Song
et al., 2014) (Figura I16A), en los últimos años se han propuesto modelos de
plegamiento irregular y otras estructuras heteromórficas que incorporan gran
variabilidad en la longitud del ADN linker y en la orientación de los nucleosomas (Ricci
et al., 2015; Grigoryev et al., 2016; Maeshima et al., 2016) (Figura I16B). En esta tesis
se proponen varias transiciones conformacionales que podrían reducir el anudamiento
de ADN cuando un domino topológico de cromatina alcanza una longitud de unos 20
nucleosomas (Figura D5). Una posibilidad es que, por debajo de esa longitud, los
nucleosomas se agrupen en una estructura inestable y desordenada que puede ser
anudada por la topo II. Por encima de esta longitud, los nucleosomas pueden adoptar
una configuración más ordenada o compacta, que obstaculiza a la topo II para anudar
el ADN. Sin embargo, no existen evidencias experimentales que apoyen la idea de
este tipo de transición de plegamiento de las fibras de nucleosomas in vitro (Bancaud
et al., 2006; Maeshima et al., 2014).
Una segunda posibilidad que podría explicar la atenuación de formación de
nudos podría ser la fractalización de la estructura de la cromatina. En este sentido, los
resultados aquí presentados apoyan un modelo en el cual el modelo de “beads on a
string” de la fibra de nucleosomas de 10 nm reitera en el siguiente nivel de
organización, en el cual cada “bead” es un grupo de unos 20 nucleosomas (Figura
D5). Curiosamente, esta configuración fractal está en línea con recientes análisis de
High-C, que indican que la cromatina de levadura se pliega en dominios (TADs) de 10
a 50 nucleosomas (Hsieh et al., 2015). Según esta arquitectura, los minicromosomas
pequeños (< 4 kb) examinados en esta tesis comprenderían de un solo TAD, mientras
que los más grandes comprendían dos o más TADs. Este modelo explicaría también la
presencia de nudos compuestos (Figura I20) en los minicromosomas grandes. Si cada
Discusión
122
TAD puede anudarse independientemente, los minicromosomas con dos TADs
pueden tener dos nudos primos, tal como se observa in vivo (Figura R7A). Esta
configuración fractal está también en línea con las visualizaciones más recientes de
fibras de cromatina intracelular. Experimentos de nanoscopía de alta resolución
mostraron que la fibras de cromatina están formados por grupos heterogéneos de
nucleosomas (Ricci et al., 2015). Mediante tomografía EM se reveló que la cromatina
intracelular es una cadena granular desordenada de 5-24 nm de diámetro (Ou et al.,
2017). Por tanto, la atenuación de formación de nudos de ADN descrita en esta tesis
sería coherente también con una arquitectura fractal de la cromatina intracelular.
Figura D5. Modelo de arquitectura de la cromatina inferido a partir de la probabilidad de anudamiento del
ADN. La atenuación de la pendiente de formación de nudos podría deberse a la fractalización de la
estructura de la cromatina. Los resultados apoyan un modelo de “beads on a string” en el que cada “bead”
es un grupo de 20 nucleosomas.
Discusión
123
2. El superenrollamiento del ADN intracelular aumenta su probabilidad de anudamiento al compactarse la cromatina
Los resultados de esta tesis demuestran que el superenrollamiento positivo (S(+)) del
ADN en la cromatina intracelular aumenta notablemente (10-25 veces) la probabilidad
y complejidad de los nudos de ADN, mientras que tales efectos no ocurren con el
superenrollamiento negativo (S(-)) (Figura R9 y R11). Este aumento en la formación de
nudos no era predecible si se consideran modelos teóricos previos sobre la
interrelación entre el superenrollamiento del ADN, el anudamiento y la actividad de la
topoisomerasa. Simulaciones computacionales de cadenas poliméricas indican que el
superenrollamiento del ADN puede apretar nudos preformados, lo que facilitaría su
eliminación por las topoisomerasas de tipo 2 (Witz & Stasiak, 2009; Witz et al., 2011).
Asimismo, otras simulaciones indicaron que los motores moleculares que se
desplazan sobre el ADN (polimerasas, helicasas, complejos SMC) podrían empujar y
confinar los nudos preformados en pequeños dominios para facilitar su eliminación
(Witz el al., 2011). Por otro lado, como las topoisomerasas de tipo 2 tienen la
capacidad de simplificar la topologia del ADN hasta niveles por debajo de la
conformación de equilibro (Rybenkov et al., 1997) y esta capacidad se potenciaría en
cruces de ADN en forma de gancho (Buck & Zechiedrich, 2004), el ADN
superenrollado debería ser un sustrato ideal para favorecer el desanudamiento (Witz &
Stasiak, 2009; Witz et al., 2011). Claramente, ninguno de estos mecanismos parece
existir o ser efectivo para prevenir el aumento de la formación de nudos durante el
superenrollamiento del ADN intracelular.
La explicación más simple para el aumento de nudos de ADN descubierto en
esta tesis es que el superenrollamiento del ADN condensa la fibra de cromatina. En
este caso, estudios in vitro han demostrado que el aumento de la yuxtaposición de
segmentos de ADN intramoleculares, ya sea mediante superenrollamiento o mediante
agentes de condensación del ADN, aumenta notablemente la formación de nudos de
ADN por las topoisomerasas tipo 2 (Wasserman & Cozzarelli, 1991; Roca et al., 1993).
Simulaciones computacionales de cadenas poliméricas aleatorias también
demostraron que la condensación aumenta la probabilidad y complejidad de los nudos
(Arsuaga et al., 2002; Micheletti et al., 2008). Por este motivo, en esta tesis se
extendieron estas simulaciones de formación de nudos a un modelo simplificado de la
fibra de cromatina. Los resultados de las simulaciones fueron sorprendentemente
comparables a los obtenidos en los experimentos. Las simulaciones apoyan en primer
Discusión
124
lugar la idea de que los nudos de ADN observados in vivo surgen de eventos
aleatorios de inversiones de cruces de ADN mediados por la topo II. En segundo lugar,
las simulaciones demuestran que el aumento tanto de la probabilidad como de la
complejidad de los nudos inducida por S(+) puede generarse simplemente reduciendo
2-3 veces el radio de giro de un dominio de cromatina (Figura R15).
El aumento en la formación de nudos de ADN causado por la condensación de
la cromatina explicaría también los efectos diferenciales de S(+) y S(-). Manipulaciones
in vitro de fibras de nucleosomas han demostrado que el S(+) acorta más y más rápido
la fibra de nucleosomas que el S(-) (Bancaud et al. 2006). En otras palabras, S(+)
incrementa rápidamente la yuxtaposición de segmentos de ADN en fibras de
cromatina, mientras que el S(-) produce conformaciones menos condensadas. Esta
asimetría explica por qué la topo II relaja la cromatina con S(+) de manera más eficaz
que con S(-) (Salceda et al. 2006; Fernández et al., 2014). Los resultados de
anudamiento del ADN de esta tesis corroboran que esta asimetría en la respuesta
conformacional de la cromatina al S(+) y S(-) también ocurriría in vivo. Sin embargo,
no se puede descartar que otros mecanismos contribuyan a favorecer la formación de
nudos en la cromatina S(+). La actividad de las topoisomerasas tipo 2 puede ser
sensible a la curvatura y a la geometría de los ángulos de las yuxtaposiciones de ADN
(Corbett et al. 2005; McClendon et al. 2006). En ese sentido, estudios in vitro con ADN
desnudo han demostrado que la topo II anuda con mayor frecuencia los plásmidos
S(+) que los plásmidos S(-) (Roca, 2001). Una tendencia similar podría operar pues en
el ADN intracelular.
La acumulación de S(+) y S(-) en los minicromosomas circulares de levadura
usados en esta tesis se genera mediante la transcripción del ADN en cepas con
actividad topoisomerasa alterada (Giaever & Wang, 1988; Gartenberg & Wang, 1992).
En células normales TOP1 TOP2, S(+) y S(-) no se acumulan, ya que pueden ser
relajados y, sobre todo, por que se cancelan recíprocamente en los minicromosomas
circulares. Sin embargo, en los cromosomas celulares mucho mayores y lineales, S(+)
y S(-) no se pueden cancelar. Si no son relajados inmediatamente por las
topoisomerasas, S(+) y S(-) deben producir transitoriamente cambios importantes en la
conformación de la cromatina. Las polimerasas de ARN eucariotas transcriben con
velocidad de aproximadamente 100 pb/s, lo que significa que el ADN gira hasta 10
vueltas por segundo (Dundr et al., 2002). Por lo tanto, el alto grado de S(+) alcanzado
en los minicromosomas in vivo denota el límite inferior contra el cual la maquinaria de
transcripción es capaz de trabajar (Salceda et al., 2006). Al inducir S(+), los resultados
indican que la probabilidad de anudamiento del ADN aumenta hasta 0.2 (unas 10
Discusión
125
veces sobre el 0.02 que se encontró en cromatina relajada). Sin embargo, dado que la
acumulación de S(+) requiere la inactivación de la topo II, la probabilidad real de
formación de nudos de ADN inducida por S(+) podría ser cercana al 0.5 (unas 25
veces sobre el 0.02 que se encontró en cromatina relajada) si se calcula la fracción de
nudos respecto a la fracción de moleculas con S(+) (Figura R12B).
Se puede proponer entonces que, en condiciones normales, las ondas de S(+)
generadas frente a los complejos de transcripción condensan transitoriamente la
cromatina, lo que produce un aumento de la formación de nudos de ADN a través de
la actividad de la topo II. Tras la relajación del S(+) por medio de la actividad topo I y/o
topo II, los nudos de ADN formados también se reducen por la actividad de la topo II y
la transcripción puede continuar (Figura D6). Esta nueva visión del proceso es factible
ya que explica una rara observación en el transcriptoma de la células de levadura,
concretamente, que la inactivación de la topo II durante la transcripción de genes
largos produce el bloqueo de las ARN polimerasas (Joshi et al., 2012). Este
sorprendente resultado se atribuyó a una incapacidad de la topo I para relajar los
niveles crecientes de S(+) generados frente a los complejos de transcripción. Ahora
que sabemos que el S(+) dispara la formación de nudos, el resultado se interpreta de
otra manera. Probablemente, la topo I si que fue capaz de relajar la cromatina S(+),
pero no pudo eliminar las nudos que había producido la topo II y que bloqueaban la
progresión de las ARN polimerasas.
Discusión
126
Figura D6. Anudamiento de ADN y funciones de las topoisomerasas durante la transcripción de genes.
Las ondas de S(+) generadas durante la transcripción génica condensan la cromatina, lo que produce un
aumento simultáneo de la probabilidad de anudamiento del ADN por delante de los complejos de
transcripción. La relajación del S(+) ya sea por las actividades de la topo I o la topo II, reduce la
compactación de la cromatina y, por tanto, la probabilidad de anudamiento del ADN. Sin embargo, dado
que la topo I no puede eliminar los nudos de ADN, la inactivación de la topo II una vez formados los nudos
de ADN detendrá la progresión de la ARN polimerasa incluso si el S(+) está relajado. La actividad de la
topo II, es por tanto, esencial para ajustar el equilibrio de anudamiento/desanudamiento del ADN de
diferentes estados conformacionales de la cromatina.
Los nudos de ADN producidos por S(+) durante la transcripcion son transitorios
y no tienen una función aparente, ya que surgen como un efecto secundario reversible
de la actividad de la topo II. Sin embargo, estos resultados indican que cualquier
evento de condensación de la cromatina, impulsado por superenrollamiento u otros
mecanismos, puede promover el anudamiento del ADN mediado por la topo II. Por
ejemplo, los cromosomas mitóticos además de compactarse, se ha propuesto que
también sufren un acumulo de superenrollamiento positivo debido a la acción de las
condensinas y la topo II (Kimura et al. 1998; Baxter et al., 2011). Este escenario podría
aumentar la probabilidad de formación de nudos en los cromosomas mitóticos.
Curiosamente, estudios biofísicos han revelado que los cromosomas mitóticos están
Discusión
127
estabilizados por topologías sensibles a topo II en lugar de por un esqueleto proteico
continuo (Pope et al. 2006; Kawamura et al., 2010). Luego, es tentador especular que
estas topologías estabilizadoras de la cromatina condensada son nudos de ADN
regulados por topo II.
3. Los nudos de ADN excluyen un plegamiento quiral de la fibra de nucleosomas in vivo
Los resultados de la primera parte de esta tesis reflejaban una posible transición en el
modo de plegamiento de la fibra de nucleosomas dependiente de la longitud. En la
introducción ya se ha hablado de las posibles arquitecturas de las "fibras de 30 nm de
la cromatina" en base a los numerosos modelos que se han propuesto, tanto los
modelos más clásicos que plantean un modo de empaquetamiento ordenado
(Ghirlando & Felsenfeld, 2008; Felsenfeld, 2008; Dorigo et al., 2004; Song et al., 2014)
(Figura I16A), como los modelos de plegamiento irregular más actuales (Ricci et al.,
2015; Grigoryev et al., 2016; Maeshima et al., 2016) (Figura I16B).
Los nudos de ADN preservan la información topológica, su análisis ha sido útil
para inferir la conformación espacial del ADN en conjuntos biológicos tales como
complejos de condensina-ADN (Kimura et al., 1999) y cápsides virales (Arsuaga et al.,
2005). Así que, con respecto a los múltiples modelos de la supuesta fibra de 30 nm,
nos planteamos si un análisis más detallado de los nudos podría aclarar como se
pliega la fibra de nucleosomas in vivo.
Los modelos regulares más clásicos de plegamiento de la fibra de
nucleosomas, como los solenoidales o los modelos de superhélices en zig-zag,
presentan quiralidad. En esos modelos la trayectoria espacial del ADN sólo tiene dos
posibilidades: o es dextrógira (formando cruces positivos) o bien es levógira (formando
cruces negativos). Teniendo en cuenta esto, los nudos producidos in vivo deberían
capturar esa quiralidad produciendo, respectivamente, tréboles con cruces positivos o
negativos. Por el contrario, si la cromatina estuviera plegada siguiendo un modelo
irregular, al tratarse de una conformación aquiral, se observarían cantidades
comparables de ambas formas quirales del trébol de ADN (Figura D7).
Discusión
128
Figura D7. La quiralidad de los nudos de ADN puede capturar el modo de plegamiento de las
fibras de nucleosomas in vivo.
Hasta ahora el método habitual para discernir la quiralidad de los nudos de
ADN ha sido mediante microscopía electrónica. Este método requiere la purificación
de los nudos de ADN, recubrir la molécula con proteína RecA y analizar la imagen
microscópica de los nudos uno a uno para diferenciar la orientación de sus cruces y
así determinar su quiralidad (Crisona et al., 1994). Todo este proceso, además de ser
técnicamente tedioso, requiere una gran abundancia de moléculas anudadas, lo que lo
hace impracticable para muestras biológicas con una fracción pequeña de moléculas
anudadas. Además, ya que hay que analizar los nudos uno a uno, el método no
permite una cuantificación exacta de la quiralidad en una población general de
moléculas.
En esta tesis se ha desarrollado un nuevo método basado en electroforesis
bidimensional en gel de agarosa que permite la caracterización de la quiralidad de
nudos de ADN formados tanto in vitro como in vivo (Figuras R21-R24).
Aplicando este nuevo método, esta tesis ha descubierto que en los minicromosomas
circulares de S. cerevisiae, un 41% de tréboles son de quiralidad positiva y un 59% de
quiralidad negativa (Figura R24). Estos valores pueden significar dos cosas. Primero,
Discusión
129
podrían reflejar que hay dos tipos de arquitecturas ordenadas con diferente quiralidad
y que coexisten dentro de la célula. Segundo, o lo que es más probable, que las fibras
de nucleosomas se pliegan con una organización irregular y aquiral. Esta última
posibilidad encaja más con los modelos más actuales y basados en nanoscopía de
alta resolución (Ricci et al., 2015) o tomografía electrónica de la cromatina (Ou et al.,
2017) que muestran que la fibra de cromatina in vivo puede estar formada por clusters
o nanodominios heteromorfos de nucleosomas.
El método para discernir la quiralidad de los nudos de ADN en cualquier
muestra biológica desarrollado en esta tesis amplia la posibilidad de estudiar cómo los
elementos de la cromatina y las actividades enzimáticas alteran la trayectoria espacial
del ADN intracelular. A diferencia de otros enfoques que inspeccionan la arquitectura
de la cromatina intracelular, el análisis de la quiralidad de los nudos de ADN formados
de forma natural in vivo está libre de artefactos y captura información en escalas de
pocas kilobases. Algunas aplicaciones inmediatas del método incluyen la
caracterización de nudos asociados con actividades de plegamiento del ADN
(cohesinas, condensinas, remodeladores), elementos funcionales (centrómeros,
orígenes de replicación, enhancers), y marcas epigenéticas que dan forma y
dinamizan a la cromatina.
130
131
Conclusiones
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Conclusiones
133
1. Existen nudos en el ADN intracelular. Distintos minicromosomas circulares de
S. cerevisiae presentan nudos en su ADN con un 2-3% de probabilidad,
independientemente de los elementos estructurales de la cromatina y del
momento del ciclo celular.
2. La probabilidad de anudamiento del ADN intracelular es resultado de la
actividad de la topoisomerasa II. El patrón y complejidad de los nudos
formados sugiere una actividad aleatoria del enzima sobre los
entrecruzaminetos del ADN cromatinizado.
3. La probabilidad de anudamiento del ADN intracelular no es lineal con la
longitud del ADN o fibra de cromatina. La probabilidad es máxima en dominios
de 20-25 nucleosomas (4-5 kb) y tiende a atenuarse en dominios mayores.
Esta inflexión puede reflejar una transición globular-fibrilar o una fractalización
de la estructura de la cromatina.
4. Mientras la transcripción abre localmente la cromatina y reduce ligeramente la
probabilidad de anudamiento del ADN, el acúmulo de superenrollamiento
negativo por detrás del complejo de transcripción no altera significativamente el
anudamiento del ADN. Por el contrario, el superenrollamiento positivo
generado por delante del complejo de transcripción aumenta la probabilidad de
anudamiento del ADN hasta 10-25 veces, así como la abundancia de nudos
complejos.
5. El aumento en abundancia y la complejidad de los nudos inducida por
superenrollamiento positivo del ADN indica una marcada condensación de la
cromatina. Esta condensación y los nudos de ADN producidos explicaría por
que la actividad topo II permite evitar bloqueos de las polimerasas durante la
transcripción.
6. El nuevo método de electroforesis bidimensional desarrollado en esta tesis
permite el análisis cuantitativo de la quiralidad de pequeñas cantidades
tréboles de ADN presentes en muestras biológicas, sin necesidad de su
purificación.
7. Los minicromosomas de S.cerevisie presentan cantidades comparable de
tréboles de ADN con quiralidad positiva y negativa. Esta observación
descartaría, por tanto, una organización quiral y regular de las fibras de
nucleosomas nativas in vivo.
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