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Facultad Politecnica - Universidad Nacional de Asuncion

Rol de las topoisomerasas de tipo II enla regulacion del superenrollamiento y el

pre-encadenamiento en intermediariosde replicacion de DNA

por

Victor Manuel Martınez Chamorro

Orientador: Dra. Marıa Jose Fernandez De Nestosa

Para la obtencion del tıtulo deMaster en Ciencias de la Computacıon

en elLaboratorio de Computacion Cientıfica y Aplicada - Facultad Politecnica

Universidad Nacional de Asuncion

03 de enero de 2014

Facultad Politecnica - Universidad Nacional de Asuncion

ResumenLaboratorio de Computacion Cientıfica y Aplicada - Facultad Politecnica

por Victor Manuel Martınez Chamorro

Durante la replicacion, las moleculas de DNA sufren cambios topologicos que afectansu superenrrollamiento, encadenamiento y anudamiento. Con el fin de entender mejorla funcion de las enzimas que controlan la topologıa del DNA durante la replicacion, seutilizo un abordaje multidiciplinario con tecnicas de biologıa molecular y simulacionescomputacionales para examinar un plasmido bacteriano con sus horquillas replicativasdetenidas tras haber replicado el 60% de la molecula. El DNA se aislo y se trato in

vitro con dos enzimas topoisomerasas de tipo II: topoisomerasa IV (Topo IV) y DNAgirasa. El efecto de estas enzimas sobre la topologıa de los intermediarios de replicacion(RIs) en presencia o ausencia de un agente intercalante se analizo mediante electroforesisbidimensional en geles de agarosa. Se realizaron simulaciones computacionales basadasen el metodo de Metropolis Monte Carlo (MC) con el fin de predecir la estabilidadtermodinamica de estas moleculas, donde la energıa elastica esta dada por potencialescuadraticos dependientes del desplazamiento angular de torsion y de doblado. Los resul-tados de las simulaciones incluyen la curva de energıa potencial en funcion del ındice deligamiento para determinar la energıa potencial que puede ser almacenada en la regionno replicada y la curva de energıa potencial en funcion de el numero de encadenami-ento para obtener la energıa que puede ser almacenada en la region ya replicada. Unavez obtenidas las curvas de energıa para superenrollamiento y encadenamiento se pudoestimar la conformacion mas estable para un RI bajo los efectos de ambos fenomenostopologicos. El metodo desarrollado en la presente tesis podrıa ser util para interpretarlas senales observadas en geles bidimensionales de agarosa.

Agradecimientos

Al Laboratorio de Computacion Cientıfica y Aplicada de la Facultad Politecnica de laUniversidad Nacional de Asuncion (San Lorenzo - Paraguay).Al Laboratorio de Biologıa Molecular de los Cromosomas del Centro de InvestigacionesBiologicas del CSIC (Madrid - Espana).A la Dra. Marıa Jose Fernandez De Nestosa, Dr. Christian Schaerer, Dr. BernardoSchvartzman, Dra. Dora B. Krimer y Msc. Jorge Cebrian por el apoyo, orientacion ymucha paciencia que me han brindado durante el proceso del desarrollo de esta Tesis.A mis amigos, Cristina Parra, Bernardo Seiferheld y Diego Noguera por su ayuda conla programacion y optimizacion de los algoritmos utilizados para esta Tesis.¡Muchas Gracias!

ii

INDICE GENERAL

Resumen i

Agradecimientos ii

Lista de Figuras vi

Sımbolos viii

1 Introduccion 11.1 Definicion del problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Originalidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.3 Relevancia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.4 Estructura de la obra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.5 Objetivos de la tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2 Marco biologico y matematico 52.1 Estructura de las moleculas de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.2 DNA en celulas procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 DNA en celulas eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Topologıa del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.4.1 Indice de ligamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.4.2 Indice de torsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.4.3 Indice de superenrollamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.4.4 Teorema de Calugareanu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.5 Propiedades topologicas del DNA: Superenrollamiento . . . . . . . . . . . 162.6 DNA topoisomerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.6.1 DNA topoisomerasas de tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.6.2 DNA topoisomerasas de tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.7 Encadenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.8 Anudamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242.9 Dinamica de los cambios topologicos durante la replicacion: topologıa de

los intermediarios de replicacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.9.1 Quiralidad y signo topologico de los RIs . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.10 La paradoja de la Topoisomerasa IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.11 Analisis de RIs mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa 32

iii

Contenidos iv

2.12 Agentes intercalantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3 Simulacion por el metodo de Monte Carlo 353.1 Simulacion computacional de la topologıa del DNA . . . . . . . . . . . . . 35

3.1.1 Simulacion para superenrrollamiento de DNA . . . . . . . . . . . . 363.1.1.1 Seleccion de numero de segmentos y rigidez de doblado . 383.1.1.2 Calculo de angulos de doblado . . . . . . . . . . . . . . . 393.1.1.3 Angulos de cruce y yuxtaposicion de segmentos del plasmido 393.1.1.4 Diametro efectivo en las simulaciones . . . . . . . . . . . 403.1.1.5 Calculo numerico del ındice de ligamiento . . . . . . . . . 413.1.1.6 Calculo numerico del ındice de superenrrollamiento . . . 42

3.1.2 Control del estado topologico en las conformaciones . . . . . . . . 433.1.3 Propiedades termodinamicas del superenrrollamiento y encadena-

miento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.1.4 Simulacion de moleculas de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4 Materiales y metodos 474.1 Parte experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.1.1 Estirpes bacterianas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474.1.2 Plasmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474.1.3 Condiciones de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474.1.4 Tratamiento de los plasmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.1.4.1 Digestion con Topoisomerasa IV . . . . . . . . . . . . . . 494.1.4.2 Digestion con DNA Girasa . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.1.5 Agente intercalante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494.1.6 Geles bidimensionales de agarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.2 Metodos de simulacion computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.1 Simulacion del supererrollamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . 504.2.2 Simulacion del encadenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5 Resultados 535.1 Resultados del analisis de RIs mediante electroforesis bidimensional en

geles de agarosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535.1.1 Analisis de los RIs del plasmido pBR322@AatII digerido con Topo

IV y DNA Girasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535.1.2 Analisis del plasmido pBR322@AatII digerido con Topo IV y DNA

Girasa en presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 565.1.3 Analisis del plasmido pBR322@AatII digerido con Topo IV y DNA

Girasa mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosaen presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5.1.4 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleParE10 digerido con DNA Girasa y Topo IV . . . . . . . . . . . . 59

5.1.5 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleparE10 digerido con DNA Girasa y Topo IV en presencia de clo-roquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

5.1.6 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleparE10 digerido con Topo IV y DNA Girasa mediante electro-foresis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquina 63

Contenidos v

5.2 Resultados de la simulacion computacional . . . . . . . . . . . . . . . . . 655.2.1 Simulacion de la region no replicada del intermediario de replicacion 655.2.2 Propiedades termodinamicas de la region no replicada . . . . . . . 685.2.3 Simulacion de la region ya replicada del intermediario de replicacion 705.2.4 Propiedades termodinamicas de la region ya replicada . . . . . . . 735.2.5 Comparacion de la variacion de entalpıa entre las regiones no re-

plicada y ya replicada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

6 Discusion 766.1 Rol de la Topo IV en la regulacion del superenrrollamiento y el pre-

encadenamiento de los intermediarios de replicacion . . . . . . . . . . . . 766.2 Rol de la DNA Girasa en la regulacion del superenrrollamiento y el pre-

encadenamiento de los intermediarios de replicacion . . . . . . . . . . . . 796.3 Simulacion computacional de las regiones no replicada y ya replicada de

un intermediario de replicacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 826.4 Coordinacion del superenrrollamiento y el pre-encadenamiento en condi-

ciones de equilibrio termodinamico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

7 Conclusion 87

A Anexo 89A.1 Algoritmos de base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

A.1.1 Un circulo cerrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89A.1.2 Un toroide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89A.1.3 Dos curvas encadenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.1.4 Linking number . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90A.1.5 Writhe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91A.1.6 Diametro efectivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

A.2 Simulacion del superenrrollamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93A.3 Simulacion del encadenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94A.4 Abstracts en congresos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

A.4.1 Wilheln Bernhard Workshop 23th . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96A.4.2 XXXVI Congreso SEBBM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97A.4.3 Banff International Research Station . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 99

LISTA DE FIGURAS

2.1 Estructura del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.2 Distintas formas topologicas del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3 Replicacion del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.4 Efecto topologico de la replicacion del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.5 Dos curvas vinculadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.6 El DNA considerado como una cinta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.7 Tipos de cruce y signo topologico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.8 Angulo solido y Wr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.9 Teorema de Calugareanu y cintas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.10 Conformaciones posibles para el DNA superenrollado . . . . . . . . . . . . 182.11 Modelo del mecanismo de accion de las topoisomerasas de tipo II . . . . . 212.12 Tipos de topoisomerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.13 Representaciones de diferentes formas de encadenados . . . . . . . . . . . 232.14 Ilustracion de la topologıa de intermediarios de replicacion . . . . . . . . . 262.15 Signos topologicos y sentido de giro para la topologıa del DNA . . . . . . 292.16 Signos topologicos y quiralidad de un CCRI representado con gomas

elasticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302.17 Topologıa de los signos y quiralidad de los cruces en los RIs . . . . . . . . 312.18 Formacion de una horquilla en retroceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.1 Modelo wormlike chain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.2 Yuxtaposicion y angulos de cruce en conformaciones plectonemicas . . . . 403.3 Diametro efectivo en funcion a la distancia entre vertices del modelo

wormlike chain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.4 Diagrama de un nudo trefoil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.1 Mapa del plasmido pBR322@AatII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 484.2 Parametros de simulacion de superenrollamiento . . . . . . . . . . . . . . 514.3 Parametros de simulacion de encadenamiento . . . . . . . . . . . . . . . . 52

5.1 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con Topo IV 555.2 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con DNA

Girasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 555.3 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con Topo

IV en presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 565.4 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con DNA

Girasa en presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 575.5 Electroforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquina

del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ digerido con Topo IV . 58

vi

Lista de figuras vii

5.6 Electroforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquinadel plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ digerido con DNA Girasa 59

5.7 Digestion con Topo IV del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 605.8 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con DNA

Girasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 615.9 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con Topo IV

en presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625.10 Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con DNA

Girasa en presencia de cloroquina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625.11 Electroforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquina

del plasmido pBR322@AatII de la estirpe parE10 digerido con Topo IV . 645.12 Electroforesis bidimensional en un gel de agarosa en presencia de cloro-

quina del plasmido pBR322@AatII de la estirpe termosencible parE10digerido con DNA Girasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

5.13 Grafico de la razon Wr/∆Lk con respecto al ∆Lk . . . . . . . . . . . . . 665.14 Grafico de angulos de cruce con respecto al ∆Lk . . . . . . . . . . . . . . 675.15 Probabilidad de aceptacion de los movimientos de prueba en funcion al

∆Lk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 675.16 Probabilidad de aparicion de nudos en funcion del ∆Lk . . . . . . . . . . 685.17 Conformaciones plectonemicas no anudadas . . . . . . . . . . . . . . . . . 695.18 Conformaciones obtenidas con diametro efectivo constante de 3 nm para

∆Lk = −20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 705.19 Propiedades termodinamicas de la region no replicada y su relacion con

el ∆Lk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 715.20 Variacion del writhe Wr con el numero de encadenamiento Ca . . . . . . 725.21 Comparacion entre el Wr inducido y el Ca obtenidos para esta obra y los

resultados de simulacion en la literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 725.22 Propiedades termodinamicas de la region ya replicada . . . . . . . . . . . 735.23 Variaciones de entalpıa de ambas regiones del RI . . . . . . . . . . . . . . 745.24 Comparacion de las variaciones de entalpıa de las regiones no replicada y

ya replicada de un RI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

6.1 Cuando dos distintos encadenados con cruces RH (+) se yuxtaponen entreellos pueden aparecer cruces LH (+) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

6.2 Simulacion computacional de un RI mediante el metodo Metropolis MonteCarlo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

Sımbolos

Lk Indice de ligamiento entre dos curvasLk0 Indice de ligamiento de una molecula circular de DNA relajado∆Lk Variacion del ındice de ligamiento de un topoisomero respecto a uno relajadoTw Indice de torsion de dos curvas entre sıTw0 Indice de torsion de una molecula circular de DNA relajado∆Tw Variacion del ındice de torsion de un topoisomero respecto a uno relajadoWr Indice de superenrollamiento de una curva∆Wr Variacion del ındice de superenrollamiento de un topoisomero respecto a uno relajadoσ Indice de ligamiento especıficoCa Numero de encadenamiento entre dos moleculas circulares de DNA.

viii

Capıtulo 1

Introduccion

1.1 Definicion del problema

Uno de los principales problemas que dificultan el estudio de la topologıa del DNA du-rante la replicacion es que in vivo existe un complejo proteico denominado replisomaque se encuentra unido a cada intermediario de replicacion. En teorıa este replisomaimpedirıa que el DNA pueda girar libremente en las horquillas de replicacion, lo quedificultarıa la difusion del superenrollamiento a traves de las mismas [1]. Sin embargo alaislar moleculas de DNA parcialmente replicadas ( intermediarios de replicacion, RIs)yeliminar todas las proteınas unidas a las mismas para su analisis por electroforesis o mi-croscopıa electronica, desaparecen las restricciones topologicas impuestas por la uniondel replisoma [1]. La eliminacion del replisoma permitirıa que, debido a la tensionacumulada, el DNA gire libremente en las horquillas de replicacion y el superenrollami-ento de la region no replicada podrıa migrar a la region ya replicada, dando lugar a laformacion de pre-encadenados. En estas condiciones in vitro, la topologıa de los RIscambia significativamente y no representa la que tenıa in vivo. Se ha observado queen los intermediarios de replicacion examinados in vitro, el sentido de los cruces delsuperenrollamiento de la region no replicada y del pre-encadenamiento de la ya repli-cada es opuesto. En otras palabras, mientras que el superenrollamiento de la region noreplicada es dextrogiro (RH, lo que es caracterıstico del superenrollamiento negativo),el entrelazado de las cromatidas hermanas en la region ya replicada es levogiro (LH, locual es caracterıstico del superenrollamiento positivo) [2]. Pero se ignora si esta confor-macion particular es exclusiva de las moleculas de DNA aisladas y examinadas in vitroo tambien ocurre in vivo. Queda por resolver como se coordinan el superenrollamientoy el pre-encadenamiento en un RI y que papel juegan las topoisomerasas de tipo II enla regulacion de la topologıa del DNA durante su replicacion.

1

Capitulo 1. Introduccion 2

En esta obra se presenta un estudio sobre el rol de las dos topoisomerasas de tipo II de E.coli en plasmidos bacterianos que contienen una horquilla de replicacion detenida. Porotro lado, se han simulado RIs para determinar la relacion entre el superenrollamientode la region no replicada y el encadenamiento de la region ya replicada en condicionesde equilibrio termodinamico.

1.2 Originalidad

El papel que cumplen las topoisomerasas en la regulacion del superenrollamiento y elencadenamiento que afecta a los plasmidos ha sido ampliamente estudiado, tanto ex-perimentalmente como mediante simulaciones computacionales [3] [4]. Sin embargo,sabemos poco acerca del rol que cumplen las topoisomerasas durante la replicacion delDNA plasmıdico y en la bibliografıa no existen precedentes en la simulacion de inter-mediarios de replicacion. En esta obra se presentan los resultados experimentales y desimulacion computacional sobre el efecto que tienen las topoisomerasas en la regulacionde la topologıa del DNA de los intermediarios de replicacion.

1.3 Relevancia

La topologıa del DNA afecta y a la vez se ve alterada por casi todos los procesos biologicosen los que el DNA participa en una celula viva: replicacion, transcripcion, reparaciony recombinacion. Las enzimas que se mueven a lo largo de una cadena de DNA, comoel DNA y RNA polimerasas, tienden a provocar la acumulacion de superenrollamientopor delante de su movimiento. Sin un mecanismo de control, esto harıa que el DNAacumulase un exceso de tension, lo cual serıa letal para las celulas. Las topoisomerasasalivian el estres torsional modificando la topologıa del DNA por escision y re-ligacion delas moleculas de DNA. Estas enzimas topoisomerasas son el blanco de un numero impor-tante de agentes antibacterianos como las quinolonas y aminocumarinas, actualmenteen uso clınico. Las topoisomerasas son tambien el blanco de varios de los farmacos masutilizados contra el cancer, entre los que se encuentran las camptotecinas, que impidenel desenrrollamiento del DNA por la topoisomerasa I y se emplean en tumores malignosque son resistentes a otras terapias. Casi todas las formas de cancer que se considerancurables mediante quimioterapia utilizan inhibidores especıficos de la topoisomerasa II,tales como los etoposidos, doxorrubicina, etc. En conjunto, estas observaciones refuerzanel potencial de topoisomerasas como dianas terapeuticas. Sin embargo, el conocimientoactual sobre la topologıa del DNA y la manera en que las topoisomerasas regulan los


cambios topologicos que tienen lugar durante la replicacion, la transcripcion, la repa-racion y la recombinacion sigue siendo muy limitado. En la presente obra se utilizo unabordaje multidisciplinario, con tecnicas de Biologıa Celular y Molecular y Simulacio-nes Matematicas para investigar el mecanismo de la accion de las topoisomerasas y lacoordinacion entre superenrollamiento y pre-encadenamiento durante la proloferacioncelular. Estamos convencidos de que la comprension de estos procesos es fundamen-tal a la hora de desarrollar nuevos antibioticos y drogas anticancerıgenas basadas eninhibidores especıficos de topoisomerasas.

1.4 Estructura de la obra

En los siguientes capıtulos de esta obra se presentan: en el segundo capıtulo una intro-ducion referente tanto a la parte biologica como al abordaje matematico de los temasestudiados; en el tercer capıtulo se describen los metodos computacionales utilizadospara la simulacion de los fenomenos topologicos de interes; en el cuarto capıtulo se de-tallan los materiales y metodos utilizados para obtener los resultados experimentales yel procedimiento estadıstico para el analisis de los resultados de simulacion; en el quintocapıtulo se presentan los resultados experimentales y de simulacion computacional; enel sexto capıtulo se hace una breve discusion de los resuldos obtenidos y en el septimocapıtulo se enumeran conclusiones. En el anexo se encuentran los algoritmos utiliza-dos para realizar las simulaciones ası como los resumenes de trabajos presentados encongresos internacionales.

1.5 Objetivos de la tesis

Durante la replicacion del DNA, la apertura de la doble helice por la DNA helicasa tiendea provocar la acumulacion de estres torsional por delante de la horquilla replicativa. Sinun mecanismo de control, este exceso de tension impedirıa el avance de la horquilla dereplicacion. Este desbalance energetico entre las regiones no replicada y ya replicada deun RI provoca un intercambio de energıa entre ambas regiones y, por ende, un cambioen el superenrollamiento y pre-encadenamiento. En el presente trabajo nos propusimoscomprender mejor la coordinacion entre superenrollamiento y pre-encadenamiento du-rante la replicacion del DNA mediante el estudio de las propiedades termodinamicas delas regiones no replicada y ya replicada de moleculas de DNA parcialmente replicadas.

Los objetivos concretos de este trabajo fueron:1-Determinar el papel de las topoisomerasas de tipo II de E. coli sobre la topologıa de


los intermediarios de replicacion en presencia o ausencia de cloroquina.2-Estudiar el efecto de una inhibicion especıfica de la topoisomerasa IV sobre la topo-logıa de los intermediarios de replicacion.3-Caracterizar la coordinacion entre el superenrollamiento y el pre-encadenamiento du-rante la replicacion del DNA.4-Estudiar la topologıa de un intermediario de replicacion mediate simulacion computa-cional.5-Analizar el equilibrio termodinamico en los intermediarios de replicacion mediante si-mulacion computacional.

Capıtulo 2

Marco biologico y matematico

2.1 Estructura de las moleculas de DNA

Segun el modelo de Watson y Crick, el DNA (acido desoxirribunocleico) es una doblehelice constituida por dos cadenas de polinucleotidos complementarias y antiparalelas[5] . En el, esta contenida la informacion genetica para el funcionamiento del organismoal que pertenece. Se trata de un polımero compuesto por varias unidades mas simples,unidas entre sı, llamadas nucleotidos (estos se representan con las letras A,T,G,C). Cadanucleotido esta constituido por un azucar, llamado desoxirribosa, una base nitrogenada(A,T,G,C, que brinda su identidad al nucleotido) y un grupo fosfato que sirve para unirun nucleotido con el siguiente. La doble helice esta formada por dos polinucleotidos, queestan unidos entre sı por puentes de hidrogeno entre las bases nitrogenadas. Cada parde bases se expresa con la unidad pb y la longitud de la cadena se mide en terminos delnumero de pb. La doble helice de DNA tiene un diametro de entre 2.2 y 2.6 nm y haceuna revolucion completa en torno a su eje imaginario cada 10.5 nucleotidos, teniendo estauna longitud de 3.4 nm [6]. La Figura 2.1 muestra una representacion de un segmentode una molecula de DNA .

2.2 DNA en celulas procariotas

Basandonos en la organizacion de las estructuras celulares, todas las celulas vivientes pu-eden ser divididas en dos grandes grupos: Procariotas y Eucariotas. Animales, plantas,hongos y protistas poseen todos celulas de tipo eucariota. Solo las bacterias (eubacte-rias y arqueobacterias) tienen celulas de tipo procariota. Se llama procariota las celulassin nucleo celular definido, es decir, cuyo material genetico se encuentra disperso enel citoplasma, reunido en una zona denominada nucleoide. Hay dos tipos de DNA en

5

Capitulo 2. Marco biologico y matematico 6

Figura 2.1: Doble helice de DNA. Se presenta una ilustracion esquematica dondecon los pares de bases nitrogenadas (A-T y C-G) en el centro de la estructura cuyosbordes estan constituidos por esqueletos de azucar-fostato. Imagen modificada tomada

de http://zlgc.seu.edu.cn/

las bacterias; el cromosomico y el plasmıdico, este ultimo formado por moleculas pe-quenas y circulares de DNA extracromosomico que poseen mecanismos de replicacionindependientes. La ventaja de poseer un plasmido es que puede contener genes de re-sistencia a antibioticos, tolerancia a metales, toxicos, sıntesis de enzimas, etc. En lascepas bacterianas, inicialmente estudiadas, se encontro por microscopıa electronica quehabıa un unico cromosoma covalentemente cerrado y circular (CCC) [6]. Los plasmidosbacterianos tambien son moleculas circulares. Estudios posteriores demostraron que al-gunas bacterias tienen multiples cromosomas circulares y que muchas de ellas tienencromosomas y plasmidos lineales [6].

2.3 DNA en celulas eucariotas

En una celula eucariota el material genetico suele estar encerrado en un organo de lacelula llamado nucleo. Pueden contener varios cromosomas lineales, es decir, con los ex-tremos libres. Las celulas eucariotas son mas complejas que las procariotas, conteniendolas primeras varios organulos especializados para cumplir alguna funcion vital para lacelula. Algunos organulos de las celulas eucariotas tambien tienen su propio DNA. Dosejemplos son las mitocondrias y los cloroplastos de las celulas vegetales, que poseen unDNA circular covalentemente cerrado (CCC) [7].


2.4 Topologıa del DNA

La topologıa es una rama de las matematicas que estudia las propiedades de un cuerpoque no varıan cuando este se deforma. El descubrimiento de la estructura en doblehelice del DNA llevo inmediatamente a preguntarse como se producirıa la separacion delas hebras entrelazadas para permitir la replicacion de la molecula y puso en evidenciael hecho de que durante la replicacion surgen problemas topologicos [8][9]. En 1965,Vinograd y colaboradores observaron al microscopio electronico que el DNA del virusdel polioma podıa encontrarse tanto en forma lineal como circular y que estos ultimospodıan presentar distintas formas (relajados o enrollados sobre sı mismos) [10]. A estasmoleculas con misma longitud y pero distinta forma, asociadas a la topologıa del DNA(de los CCCs mas concretamente) se las denomina topoisomeros [10](Figura 2.2). Poste-riormente esta observacion se extendio a todas las moleculas de DNA circulares de doblecadena [11]. La observacion de que en todos los seres vivos el DNA esta superenrollado,junto con el descubrimiento de las enzimas1 encargadas de modificar la topologıa in vivo[12], sentaron las bases de una nueva disciplina dentro de la Biologıa Molecular que sedenomino “Topologıa del DNA” [13]. La topologıa del DNA ejerce un papel reguladorsobre funciones celulares esenciales, como la replicacion, transcripcion, reparacion y re-combinacion. La replicacion es el fenomeno que provoca mas cambios en la topologıa delas moleculas de DNA (Figura 2.3). Esto es debido a que la maquinaria encargada decopiar el DNA abre la doble helice, induciendo tensiones en toda la molecula. Esto seilustra en la Figura 2.4.

1Una enzima es una molecula de naturaleza proteica que cataliza reacciones quımicas, siempre quesean termodinamicamente posibles (http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima).


Figura 2.2: Micrografia electronica del DNA aislado del virus del polioma. a)Moleculas relajadas. b) Moleculas enrrolladas sobre sı mismas Tomada de Vinograd

et. al., 1965.

La expresion matematica que mejor describe la topologıa del DNA de un dominio cerradoes el llamado ındice de ligamiento o Linking number (Lk). Es un invariante topologicoque esta definido a su vez por dos variables geometricas: el ındice de torsion o Twist

(Tw) y el ındice de superenrollamiento o Writhe (Wr).

2.4.1 Indice de ligamiento

Para comprender la relacion del ındice de ligamiento con las moleculas CCCs de DNA re-pasaremos brevemente su definicion. A continuacion, recurrimos a una definicion basadaen fenomenos de electromagnetismo; suponga que tenemos un lazo cerrado, represen-tado por la curva C, que a su vez es descrita por el vector de posicion r, que describecada punto de la curva, en un marco de referencia O, mediante un parametro t. El lazotransporta una corriente electrica I en la direccion en la que la curva C es recorrida porr.

Segun la Ley de Biot-Savart, el campo magnetico en el espacio vacıo creado por estelazo cerrado en cualquier punto r’ en el marco de referencia O tiene un valor,

B = µoI

4π

∮C

(r’− r)× dr‖r’− r‖3 , (2.1)


Figura 2.3: Replicacion semiconservativa del DNA. En la horquilla de replicacion lascadenas parentales (azul) se separan para permitir la sıntesis de las cadenas nacientes

(verdes). Imagen modificada tomada de http://zlgc.seu.edu.cn/

donde µ0 es la permeabilidad del espacio libre. La Ley de Ampere nos dice que la integraldel campo magnetico a lo largo de una curva cerrada C’, descrita por el vector r’ conparametro t’, es proporcional a la corriente total que cruza por el lazo cerrado.

∮C′

B · dr’ = µoItotal. (2.2)

Si las curvas C y C’ estan vinculadas como se muestra en la Figura 2.5 entonces lacorriente total que pasa a traves del lazo C’ es igual a un multiplo entero n de lacorriente I, donde este entero es un invariante topologico igual al numero de veces queC pasa a traves de C’, Itotal = nI.

Introduciendo (2.1) en (2.2)


Figura 2.4: Representacion del efecto topologico de la replicacion en el DNA. a)Una molecula no replicada con ındice de torsion en estado normal. b) El avance de lahelicasa durante la replicacion induce tension por delante del replisoma, en la zona no

replicada, provocando cambios en la topologıa de toda la molecula.

Figura 2.5: Dos curvas vinculadas. El ındice de ligamiento Lk define el numero devinculos entre dos curvas

∮C′

(µoI

4π

∮C

(r’− r)× dr‖r’− r‖3

)· dr’ = µonI. (2.3)

Reordenando y simplificando nos queda,

n = 14π

∮C′

∮C

((r’− r)× dr‖r’− r‖3

)· dr’. (2.4)

Este invariante n es el Indice de ligamiento o Linking number Lk [14].


Una molecula de DNA circular, por su naturaleza de doble helice, se asemeja a doscurvas vinculadas entre sı. Se puede decir que la doble helice de DNA circular toma laforma de dos curvas encadenadas una en torno a la otra, tantas veces como la cantidadde vueltas completas de la doble helice hay en la molecula. Es posible calcular el Lkconociendo la longitud N de la molecula y dividiendola por la longitud de una vueltacompleta de la helice h, y de esta forma se tiene que Lk=N/h.

Si en la molecula circular no existe ninguna tension torsional ademas de la intrınseca asu estructura molecular se dice que esta relajada. En condiciones de relajamiento, unamolecula de longitud N tendra una longitud de repeticion de doble helice h0 y su ındicede ligamiento, al que llamaremos Lk relajado (Lk0), tendra el valor Lk0=N/h0.

2.4.2 Indice de torsion

Teniendo en cuenta la estructura de doble helice de las moleculas de DNA, se puedeconsiderar a sus dos cadenas complementarias como los bordes de una cinta. Asumiendoesto, hay una propiedad denominada ındice de torsion o Twist (Tw), que describe elretorcimiento de esta cinta en torno al eje que pasa a lo largo de la molecula. Se presentana continuacion algunas caracteristicas propias de las cintas y su retorcimiento tomadasde Klenin et. al. 2000 [15]:

Dada una curva cerrada C, caracterizada por el vector de posicion a(t), que no tieneintersecciones consigo misma, podemos construir una cinta. Uno de los bordes de estacinta sera la curva C, el otro borde estara constituido por los puntos de una curva C’,cuyos puntos estaran dados por:

b(t) = a(t) + εu(t), (2.5)

donde ε determina el ancho de la cinta y puede ser tan pequeno como se desee. El vectoru(t) es un versor normal a la curva C en el punto a(t), que apunta al punto b(t) sobrela curva C’.

Si en un sistema de coordenadas ortogonales fijo, xyz, el vector posicion a esta dado porel parametro t como; a(t)=x(t)ı + y(t) + z(t)k , donde las funciones x(t), y(t) y z(t)son continuas y tienen derivada segunda (equivale afirmar que C es una curva suave),entonces podemos definir al vector tangente unitario de a en el punto caraterizado porel parametro t como:

T =da(t)dt∥∥∥da(t)dt

∥∥∥ . (2.6)


Este vector tiene siempre la misma direccion del vector velocidad, que es sencillamenteda(t)dt y donde la rapidez es, por definicion, el modulo del vector velocidad. Ademas de

un plano de infinitos vectores normales a T hay un vector que tiene la particularidad deapuntar siempre en la direccion en la que C presenta curvas mas pronunciadas, es decir,hacia la direccion de mayor curvatura, este vector es conocido como el vector normalprincipal unitario:

n =dT(t)dt∥∥∥dTdt

∥∥∥ . (2.7)

Se define la curvatura en el punto dado por el vector posicion a(t) como:

κ =

∥∥∥dTdt

∥∥∥∥∥∥dadt

∥∥∥ . (2.8)

El vector u normal con el que se genera cada punto de la cinta en la ecuacion (2.5) nonecesariamente es igual al vector normal principal como se muestra en la cinta de laFigura 2.6.

Figura 2.6: Cinta creada a partir de las curvas C y C ′. Se observa la diferencia entreel vector normal principal n y el vector generador de la cinta b.

Todas las curvas expuestas hasta ahora pueden ser parametrizadas mediante su propialongitud de arco, s:

s =∫ t

0

√x′(u)2 + y′(u)2 + z′(u)2du =

∫ t

0

∥∥∥∥da(u)du

∥∥∥∥ du. (2.9)

Esta parametrizacion tiene la caracterıstica de que la rapidez es constante e igual a 1,es decir, ‖da(s)

ds ‖ = 1 [16]. Consecuencia de esta propiedad son las siguientes expresiones


de los vectores tangente y normal unitario:

T = da(s)ds

; (2.10)

n = 1κ

dT(s)ds

. (2.11)

Respecto a la cinta descripta con aterioridad, el valor medio de rotacion de la curva C’en torno a la curva C es llamado ındice de torsion o Twist (Tw). Respecto a la moleculade DNA, el Tw indica el numero de veces que las dos cadenas complementarias danuna vuelta alrededor del eje axial de la doble helice. Para obtenerlo basta con medirla rotacion infinitesimal del vector generador de la curva b en torno al vector tangenteunitario de a, T, para un determinado valor del parametro s, el cual es el parametrolongitud de arco y en el resto de esta exposicion s sera este parametro. La expresion

T× u = dads× u, (2.12)

nos da un vector unitario normal a T. Al haber una variacion en el parametro de ds,el versor u ha variado en du, apuntando ahora en otra direccion. Si el vector du es nonulo entonces siempre tendra una direccion distinta a la de da

ds × u. Una medida de lamagnitud de la rotacion es entonces(

dads× u

)· du, (2.13)

y dado que cada rotacion es levogira o dextrogira, el signo de la rotacion esta dado porel signo que tiene este producto escalar. La suma de todas las rotaciones es entonces unpromedio ponderado si se divide por la maxima rotacion angular de 2π radianes. Ası,integrando sobre toda la curva C, el ındice de torsion esta dado por la expresion

Tw = 12π

∫C

(dads× u

)· du. (2.14)

Para el DNA en estado relajado el Tw es igual al numero total de vueltas completas dela doble helice, esto es, en el estado relajado se tiene Tw0=Lk0.

2.4.3 Indice de superenrollamiento

El ındice de superenrollamiento o Writhe (Wr) de las moleculas de DNA, una de laspropiedades topologicas mejor estudiadas, es una medida de la torsion del eje axial dela doble helice sobre sı mismo. Mide el numero de veces que el eje de la doble helice se


pliega sobre sı mismo respecto a un plano o, de modo mas intuitivo, es la medida delenrrollamiento de la doble helice sobre sı misma [15].

Para comprender mejor este concepto podemos recurrir al estudio de como se comportael eje de la doble helice considerandolo como una curva cerrada en el espacio [15]. Parauna curva C hay ciertos puntos del espacio, denominados puntos de proyeccion u obser-vacion, desde donde la curva parece cruzarse sobre sı misma. Esto es, en el cruce de dossegmentos de la curva, el mas cercano al punto de proyeccion parece pasar por encimadel que esta mas alejado.

Hay dos tipos de cruce que se pueden llegar a diferenciar desde cualquier punto deproyeccion, los Positivos (antihorario) y los Negativos (horario) (Figura 2.7). Desdeun punto de proyeccion podemos asignar un valor numerico a un cruce, w = 1 si esantihorario y w = −1 si es horario . Al sumar todos los valores de w para la direccionde proyeccion elegida obtenemos un numero entero llamado Writhe direccional (WrD)[15].

Figura 2.7: Tipos de cruce entre segmentos de curvas. a) Cruce Positivo. b) CruceNegativo.

El WrD es un entero pero puede no tener el mismo valor para todos los puntos deproyeccion. Podemos definir el Writhe Wr como el valor promedio del writhe direccionalWrD desde todos los posibles puntos de proyeccion.


Figura 2.8: Angulo solido generado por dos segmentos de una curva. El angulo solidodΩ definido por todos los puntos de proyeccion desde los cuales los segmentos de curva

dr1 y dr2 se cruzan entre sı.

Dados dos segmentos muy pequenos de la curva C, dr1 y dr2, que comienzan en lospuntos r1 y r2 respectivamente, estos segmentos parecen cruzarse entre sı en un angulosolido2 como el que se muestra en la Figura 2.8.

Para conocer este angulo solido debemos proyectar el area del paralelogramo formadopor dr1 y dr2 sobre la esfera de radio ‖r1 − r2‖. Esto lo hacemos haciendo la proyecciondel vector dS = dr1 × dr2 sobre el vector unitario:

r = (r1 − r2)‖r1 − r2‖

. (2.15)

Ası, el area sobre la esfera de radio r = ‖r1 − r2‖ en la que se ve una interseccion entrelos segmentos estudiados esta dada por:

r · dS = (r1 − r2)‖r1 − r2‖

· (dr1 × dr2) . (2.16)

El angulo solido dΩ se obtiene dividiendo (2.16) por el radio cuadrado r2 de la esfera,para obtener el area sobre una esfera unitaria:

dΩ = r · dSr2 , (2.17)

2El angulo solido es aquel que cubre un objeto visto desde un punto de observacion y corresponde ala zona del espacio limitada por una superficie conica (http : //es.wikipedia.org/wiki/angulosolido).


o de manera equivalente:

dΩ = (r1 − r2) · (dr1 × dr2)‖r1 − r2‖3

. (2.18)

Cada dΩ tiene un signo que depende del tipo de cruce y un valor asociado a cuantoespacio ocupa del area de la esfera unitaria. Para conocer el promedio ponderado sedebe dividir por el area total de la esfera unitaria, 4π.

Como los segmentos dr1 y dr2 pertenecen ambos a la curva C, sus puntos iniciales, r1 yr2, deben ambos describir la curva C. Entonces hay que recorrer la curva C dos veces,mediante dos vectores de posicion r1 y r2 distintos, es decir, construidos con un distintoparametro. El ındice de superenrollamiento Wr es dado por:

Wr = 14π

∮C

∮C

((r1 − r2)× dr2‖r1 − r2‖3

)· dr1. (2.19)

2.4.4 Teorema de Calugareanu

Volviendo a considerar la cinta creada por las curvas C y C’, donde C esta representadapor el vector posicion a(s), y la curva C’ esta generada por b(s) = a(s) + εu(s), setiene que el ındice de ligamiento, Lk, esta dado por la expresion denominada Teoremade Calugareanu, que tiene la forma:

Lk = Wr + Tw, (2.20)

donde, como antes, el Wr corresponde al eje central de la curva (o eje central de lacinta) y Tw es la torsion de sus bordes (Figura 2.9) [17][18][14].

2.5 Propiedades topologicas del DNA: Superenrollamiento

Hemos visto que el Lk se relaciona con el Tw y con el Wr mediante el Teorema deCalugareanu. Estas propiedades son exclusivas de dominios topologicos cerrados, puestoque si los extremos de la doble helice estuvieran libres cualquier tension estructuralinterna carecerıa de efecto ya que las dos cadenas de polinucleotidos podrıan rotar sobresı mismas liberando dicha tension en los extremos [19]. Por lo tanto, el Wr solo tienelugar en moleculas CCCs o en moleculas lineales fijadas a membranas u otros elementosproteicos de tal manera que una region de las mismas, aunque sean lineales, se comportancomo dominios topologicamente cerrados. Las moleculas CCCs son tıpicas del genoma


Figura 2.9: El teorema de Calugareanu para una cinta. El Tw esta definido parauna cinta, sus bordes son dos curvas con un determinado valor de Lk y el Wr queda

definido por un eje que pasa a lo largo de la cinta.

de bacterias, plasmidos, mitocondrias, cloroplastos y muchos virus. Se cree que el DNAde los cromosomas eucarioticos esta organizado en bucles o lazos en cuya base el DNAesta unido covalentemente a un esqueleto proteico por lo que estos bucles constituirıandominios topologicos cerrados equivalentes a los CCCs [20].

Por convenio, se dice que el Wr es negativo (-) en el caso de las superhelices dextrogiras(que van en el sentido opuesto a las agujas del reloj) y positivo (+) en el de las levogiras(que van en el sentido de las agujas del reloj). El ∆Wr es la diferencia entre el Wr deuna molecula y el Wr de una conformacion plana, la cual tiene Wr nulo. En la granmayorıa de los seres vivos las moleculas de DNA presentan un ∆Wr (-) [21][22][23][24][25][26], aunque existen algunas excepciones como es el caso de las bacterias termofilasdel genero Archaea, cuyo DNA presenta un ∆Wr (+) que se incrementa con el aumentode la temperatura [27].Se han descrito dos conformaciones para el DNA superenrollado denominadas plec-tonemica y toroidal (vease Figura 2.10). El superenrollamiento plectonemico es un tipode conformacion en la que el eje axial del DNA sigue una trayectoria superhelicoidal al-rededor de otro segmento de la misma molecula; dicho de otro modo, la doble helice delDNA esta enrollada alrededor de otra parte de la misma molecula formando una helicede orden superior [6]. El DNA purificado y en solucion presenta un superenrollamientoplectonemico [28]. El superenrollamiento toroidal es un tipo de conformacion del DNAsuperenrollado en donde el eje axial de la molecula sigue una trayectoria superhelicoidalalrededor del eje de un toro imaginario, esto es, la doble helice del DNA esta enrollada


Figura 2.10: Conformaciones posibles el DNA superenrollado. a) Forma toroidal. b)Forma plectonemica. Tomada Tomada de Schvartzman and Stasiak, 2004.

alrededor de un toro formando una helice de orden superior [6]. El DNA de los organis-mos eucariotas, enrollado alrededor de los nucleosomas, presenta un superenrollamientotoroidal que favorece la condensacion del DNA necesaria para su empaquetamiento den-tro del nucleo [28]. Existen ademas modelos que explican la union del DNA, en suconformacion toroidal, a la superficie de muchas proteınas [6]. La tension impuesta alanadir vueltas adicionales en la helice del DNA se distribuye entre el Tw y el Wr, esdecir, ambas variables se compensan entre sı dando como resultado un valor invariantede Lk. El Lk solo puede cambiar cuando se producen roturas en el DNA [29], las cualespueden ser de cadena sencilla o de cadena doble y que en cualquier caso dan como resul-tado la eliminacion del Wr ya que permiten que una o ambas cadenas del polinucleotidogiren la una sobre la otra liberando la tension en los extremos. Cuando hablamos deniqueo (del ingles nicking) del DNA in vitro, nos referimos a roturas de cadena sencillaque convierten una molecula CCC en una molecula abierta y relajada llamada OC, estoes, un DNA circular de doble cadena que contiene una rotura en el enlace fosfodiesteren una de las dos cadenas.


2.6 DNA topoisomerasas

En todo dominio topologico cerrado de DNA los procesos de replicacion, recombinaciony transcripcion alteran el Tw y el Wr pero no el Lk. Para alterar el Lk in vivo las celulasdisponen de unas enzimas especializadas denominadas topoisomerasas. Estas enzimasestan presentes en todos los seres vivos y crean roturas transitorias en el DNA queayudan a resolver los problemas topologicos [20][22] [11][13]. Estas roturas transitoriasen el DNA van acompanadas de la formacion de un enlace fosfodiester entre un residuoactivo de tirosina presente en la enzima y un grupo fosfato de uno de los extremosde la cadena de DNA interrumpida. La topologıa de la molecula de DNA puede sermodificada durante el tiempo que se mantenga ese enlace. Finalmente, el enlace serompe y la enzima vuelve a unir los extremos rotos del DNA [11].

Todas las topoisomerasas son capaces de eliminar el Wr (-), pero solo algunas puedeneliminar tambien el Wr (+). En base a su mecanismo de accion las topoisomerasas seclasifican en dos grandes grupos: tipo I y tipo II, segun corten una o las dos hebras dela doble helice del DNA, respectivamente [11] [13][29].

2.6.1 DNA topoisomerasas de tipo I

Estas enzimas se clasifican en topoisomerasas de tipos IA y IB sobre la base de susecuencia de aminoacidos (AA) y mecanismos de accion. Las de tipo IA cortan unahebra simple y pasan la otra hebra a traves de la hebra resultante para luego sellar laruptura (mecanismo de pasaje de la hebra). Las topoisomeras de tipo IB actuan por unmecanismo mas sencillo, la rotacion del DNA en el sitio de corte transitorio. De estaforma cambian el Lk en valores de +/- 1 [30].

Las topoisomerasas de tipo I bacterianas solo son capaces de relajar el Wr (-). Haydos tipos de topoisomerasas de tipo I en E. coli: la Topoisomerasa I (Topo I) [12] y laTopoisomerasa III (Topo III) [31]. Ambas pertenecen al subtipo IA y solo son capacesde relajar Wr(-).

Las topoisomerasas de tipo I de las celulas eucariotas, en cambio, son capaces de relajartanto el Wr (-) como el (+). En Saccharomyces cerevisiae se conocen dos topoisomera-sas de este tipo: la Topo I [32] que realiza un papel fundamental durante la transcripciony la Topo III [11] que podrıa estar implicada en el desencadenamiento del DNA juntocon la helicasa Sgs1 [33]. No obstante, se ha demostrado que en ausencia de Topo III elWr del DNA no esta afectado de forma notable [34].


2.6.2 DNA topoisomerasas de tipo II

Estas enzimas cortan ambas hebras de la doble helice del DNA y transportan otra doblehelice a traves de la que esta interrumpida para finalmente volver a unir los extremoscortados [11]. De esta forma hacen que el Lk cambie en valores de +/- 2 [35][36]. Lastopoisomerasas de tipo II, que estan funcional y estructuralmente conservadas entreeucariotas y procariotas, actuan como dımeros3 y de un modo dependiente de ATP(Adenotrintrifosfato) [37] [38]. Se dividen a su vez en dos subfamilias: las de tipo IIA ylas de tipo IIB [11][13]. Las topoisomerasas de tipo IIA son las que estan mejor carac-terizadas. Se encuentran tanto en procariotas como en eucariotas y poseen estructurassimilares [31][38][11]. Estas enzimas catalizan el paso de una doble helice de DNA atraves de otra doble helice mediante un mecanismo denominado de dos puertas [31]. Suestructura es similar a la de una tenaza o pinza abierta, dentro de la cual se situa ladoble helice de DNA que sera cortada y que constituye el denominado segmento G (delingles gate). Tras la union de ATP, la pinza se cierra capturando una segunda doblehelice de DNA, denominada segmento T (del ingles transported) [36], que hara pasara traves de la rotura transitoria producida en el segmento G y sera expulsada de laenzima por el lado opuesto al que entro [36][31]. Este mecanismo de accion permite aestas enzimas realizar cambios topologicos en el DNA que son esenciales para la celuladurante la replicacion y la segregacion cromosomica [13]. El mecanismo de accion deeste tipo de topoisomerasas se muestra en la figura 2.11.

En E. coli existen dos topoisomerasas de tipo II: la DNA girasa [32] y la TopoisomerasaIV (Topo IV) [39][40]. La DNA girasa fue la primera topoisomerasa de tipo II descubi-erta y es la unica conocida capaz de introducir Wr (-) en el DNA [32]. Por ello, estatopoisomerasa de tipo II es el blanco de un gran numero de agentes antimicrobianos, en-tre los que se destacan por su importancia los derivados de las quinolonas. Su estructuraconsiste en un heterotetramero compuesto por dos subunidades GyrA y dos subunidadesGyrB. Las subunidades GyrA estan implicadas en la union al DNA y en la introduccionde roturas transitorias en la doble helice, mientras que las subunidades GyrB son lasresponsables de la actividad ATPasa. La DNA girasa mantiene la densidad de Wr (-)necesaria para la iniciacion de la replicacion y la transcripcion del DNA. Ademas, estaenzima participa en la fase de elongacion de la replicacion y la transcripcion contri-buyendo a la eliminacion del Wr (+) que se genera por delante de las horquillas debidoa la accion de las helicasas. De este modo, evita la acumulacion de estres torsional, locual podrıa eventualmente detener ambos procesos.

3En biologıa un dımero es una proteına compuesta por dos subunidades. En un homodımero las dossubunidades son identicas, y en un heterodımero son diferentes (http://es.wikipedia.org/wiki/Dımero)).


La Topo IV bacteriana [39] es tambien un heterotetramero cuyas subunidades ParCy ParE son homologas de GyrA y GyrB, respectivamente. In vivo, la Topo IV estaespecializada en eliminar el encadenamiento que surge entre las cromatidas4 hermanasdurante y despues de la replicacion del DNA [41][42] [43][44]. La topoisomerasa IV escapaz de relajar tanto Wr(-) como Wr(+), pero actua de modo mucho menos eficienterelajando Wr negativo. Las topoisomerasas de tipo II de eucariotas son capaces derelajar tanto elWr (-) como el (+), pero son incapaces de introducirWr (-). Por ejemplo,la unica topoisomerasa de tipo II conocida en S. cerevisiae es la Topoisomerasa II(Top2) y esta implicada fundamentalmente en la correcta segregacion de las cromatidashermanas [45][46].

Figura 2.11: Modelo del mecanismo de accion de las topoisomerasas de tipo II [36].

En la figura 2.12 se muestra una tabla con distintos tipos de topoisomerasas, tanto deorganismos procariotas como eucariotas.

4La cromatida es una de las unidades longitudinales de un cromosoma duplicadohttp://es.wikipedia.org/wiki/Cromatida.


Figura 2.12: Distintos tipos de topoisomeras encontrados en organismos procariotasy eucariotas [6].

2.7 Encadenamiento

En topologıa del DNA, el termino encadenado alude a la union topologica de dos o masmoleculas circulares de DNA, entrelazadas como si se tratase de los eslabones de unacadena. El DNA encadenado ha sido observado en diversos sistemas biologicos tantoprocariotas como eucariotas. En 1967 se observaron por primera vez, mediante micros-copıa electronica, moleculas encadenadas de DNA en mitocondrias de celulas humanas.Posteriormente se encontraron tambien encadenados en mitocondrias de tripanosomascuyo DNA es una estructura compacta, denominada cinetoplasto (kinetoplast DNA;kDNA)y que consiste de cientos de moleculas encadenadas [47]. Por otro lado, se hademostrado la aparicion de encadenados como productos o como intermediarios en pro-cesos de recombinacion [31] ası como la formacion y resolucion de encadenados in vitro.La formacion de encadenados es una de las consecuencias topologicas de la replicaciondel DNA tanto en celulas procariotas como eucariotas. Se han observado encadenados


Figura 2.13: Representaciones de diferentes formas de encadenados con numero deencadenamiento Ca = 1. a) Dos moleculas con rotura de cadena sencilla n (OCs)encadenadas. b) Dos moleculas encadenadas donde una de ellas tiene una rotura decadena sencilla n (OC) y otra esta covalentemente cerrada (CCC). c) Dos moleculas

encadenadas covalentemente cerradas (CCCs) (Martınez-Robles et. al., 2009).

en el DNA del virus SV40 [48][49], tambien en la levadura Saccharomyces cerevisiae,pero fundamentalmente se han estudiado en plasmidos bacterianos.

Existen tres tipos de encadenados: los de tipo A o CatA, en los que las dos moleculas deDNA circular estan niqueadas y, por tanto, relajadas (ambas son OCs); los de tipo B oCatB en donde solo una de las dos moleculas esta niqueada (OC), mientras que la otraesta covalentemente cerrada y puede albergar Wr (CCCs); y los de tipo C o CatC, en losque ambas moleculas encadenadas estan covalentemente cerradas, pudiendo albergar Wr

(CCCs). Estos ultimos son el tipo de encadenado mas abundante in vivo (Figura 2.12).Ademas, existen dos parametros topologicos para definir los encadenados: el parametron, que es el numero de cruces que presentan las moleculas encadenadas al proyectarlassobre el plano; y el numero de encadenamiento, Ca, cuyo valor es siempre la mitadde n [3]. La gran cantidad de encadenados con alto Ca que se acumulan al inhibir latopoisomerasas de tipo II pone en evidencia que son estas las encargadas de eliminar elencadenamiento en el DNA [50][51][52][53]. En E. coli la Topo IV desencadena el DNA in


vivo [40][41] y recientemente se ha demostrado que elWr (-) ayuda al desencadenamientopor parte de esta enzima [3]. En S. cerevisiae la encargada de desencadenar es la Top2[43][44].

2.8 Anudamiento

Tan pronto como se descubrieron las topoisomerasas se reparo en la posibilidad de quese formen nudos en el DNA. Estos pueden surgir de cualquier proceso que impliqueroturas de las cadenas de DNA (incluyendo replicacion, transcripcion, recombinacion yreparacion) y, de no ser eliminados, sus efectos resultarıan devastadores para la celula[54][42] [55][56]. El anudamiento es pues otra de las propiedades topologicas del DNA[14] y, al igual que sucede con el Wr, solo tiene lugar en dominios topologicos cerrados.

En 1976, James Wang y colaboradores fueron los primeros en observar nudos en moleculasde DNA circular de cadena sencilla del bacteriofago λ tratadas con una proteına de E.coli entonces llamada ω y que luego resulto ser la Topo I (Liu et. al., 1976). Posterior-mente, se observo la formacion de nudos en DNA de doble cadena como consecuencia dela actividad de la topoisomerasa de tipo II del fago T4 (Liu et. al., 1980) y de la DNAtopoisomerasa II de Drosophila (Hsieh, 1983). Ademas, se demostro que la Topo I deE. coli es tambien capaz de formar nudos en DNA de doble cadena, siempre y cuandoeste tenga una pequena region de cadena sencilla [57][58]. Asimismo, otros estudios invitro demostraron la formacion de nudos en DNA de doble cadena por parte de enzimasimplicadas en procesos de recombinacion, como la resolvasa Tn3 (Wasserman y Cozza-relli, 1985; Wasserman et. al., 1985), codificada por el transposon del mismo nombre enbacterias, y la integrasa Int del bacteriofago λ (Griffith y Nash, 1985; Spengler et. al.,1985).

En cuanto al anudamiento in vivo, se observo la formacion de nudos de manera naturalen el DNA de doble cadena de la capside de los bacteriofagos P2 y P4 (Liu et. al., 1981;Liu y Davis, 1981). No obstante, la informacion sobre el anudamiento del DNA in vivo

sigue siendo escasa; de ahı que resultara sorprendente el descubrimiento de plasmidosbacterianos con horquillas de replicacion detenidas y anudadas. Los RIs con burbujasanudadas fueron, en prinicipio, descritos en plasmidos de E. coli con dos orıgenes dereplicacion ColE1 enfrentados y en plasmidos con un origen de replicacion ColE1 y unabarrera para el progreso de la horquilla de replicacion [59][60] [56][61][62][63]. Aun hoydıa se desconoce con exactitud que papel juega el anudamiento durante la replicacion.En E. coli se sabe que la Topo IV es la topoisomerasa encargada de desanudar el DNAin vivo [42].


2.9 Dinamica de los cambios topologicos durante la repli-cacion: topologıa de los intermediarios de replicacion

En la gran mayorıa de los seres vivos para que se inicie la replicacion semiconservativa5

del DNA este debe estar negativamente superenrollado. De este modo se facilita la sepa-racion de las cadenas parentales que seran usadas como molde por las DNA polimerasasdurante la replicacion [64](Marians et. al., 1986; Funnell et. al., 1987; Kanaar y Cozza-relli, 1992). Una vez que la iniciacion ha tenido lugar, la elongacion es llevada a cabopor un complejo multiproteico denominado replisoma. Actualmente se cree que no es elreplisoma el que avanza sino que es el DNA el que pasa a traves de el [50]. Por delantedel replisoma se encuentra la DNA helicasa, una proteına hexamerica responsable de laapertura de la doble helice parental. Esa apertura genera una tension topologica queda lugar a ∆Wr(+) por delante de la horquilla de replicacion [65]. Este Wr(+) debeser eliminado o de lo contrario se acumularıa impidiendo el avance de la horquilla dereplicacion, pues para facilitar la replicacion el DNA debe tener ∆Wr(-). Por ejemplo,en bacterias, la DNA Girasa introduce Wr(-) por delante (hacia la region no replicada)de la maquinaria de replicacion para compensar el Wr(+) que genera el avance de lahorquilla [11][50] [66]. Pero la accion de la DNA girasa no es suficiente para anular eseWr(+) debido a que la procesividad de las helicasas generando Wr(+) por delante de lahorquilla de replicacion es significativamente mayor que la de la DNA Girasa introduci-endo Wr(-) [67]. En estadios tempranos de la replicacion, cuando la region no replicadaes suficientemente grande, serıan varias las DNA topoisomerasas que se podrıan unira esa region y su funcionamiento en serie podrıa conseguir la introduccion de un nivelsuficiente de Wr(-). Sin embargo, a medida que la replicacion progresa disminuye lalongitud de la region no replicada por lo que cada vez habrıa menos espacio fısico parala union de las topoisomerasas al DNA en la region no replicada. Champoux y Been pro-pusieron un modelo que asume que durante la replicacion el superenrollamiento positivo(Wr(+)) podrıa migrar de la region no replicada a la ya replicada y distribuirse en es-tas dos regiones del intermediario de replicacion (RI), de manera que las topoisomerasaspodrıan actuar eliminando la acumulacion de Wr(+), tanto por delante como por detrasde la horquilla [68]. Esta hipotesis es la que actualmente cuenta con mayor aceptaciony propone que durante la replicacion son varias las topoisomeras que cooperarıan paracompensar el Wr(+) generado en la region no replicada como consecuencia del avancede la horquilla de replicacion. En 1998, Peter y colaboradores confirmaron, empleandomicroscopıa electronica, la difusion del Wr a traves de la horquilla de replicacion in

5En la replicacion semiconservativa se originan dos moleculas de ADN, cada una de ellas compuestade una hebra de el ADN original y de una hebra complementaria nueva. En otras palabras el ADN seforma de una hebra vieja y otra nueva. Es decir que las hebras existentes sirven de molde complementarioa las nuevas (http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm)


vivo y llamaron pre-encadenados a los cruces de las cromatidas hermanas en la regionya replicada para distinguirlo del Wr de la region aun no replicada [67]. El nombre aludeal hecho de que los pre-encadenados daran lugar a moleculas encadenadas al finalizar lareplicacion [51] [63][67][68]. Es importante destacar que para que el superenrollamientopueda difundirse a traves de la horquilla de replicacion los dobles helices de la region yareplicada deben ser capaces de girar libremente una alrededor de la otra en la horquillade replicacion (Figura 2.13). En E. coli, la DNA Girasa introducirıa Wr(-) mientrasque la Topo IV se encargarıa de eliminar el Wr(+) generado en la region no replicadacomo consecuencia del avance de la horquilla de replicacion. Por otro lado la Topo IVtambien eliminarıa el pre-encadenamiento por detras de la horquilla una vez que el Wr

haya migrado de la region no replicada a la ya replicada. Esto explicarıa por que laprogresion de las horquillas de replicacion esta totalmente impedida solo cuando ambastopoisomerasas de tipo II estan mutadas [69][50].

Figura 2.14: Ilustracion de la topologıa de intermediarios de replicacion. a) RIcompletamente relajado con una rotura de cadena sencilla en la region no replicada. b)Molecula CCRI parcialmente replicada con supernerrollamiento positivo en la regionno replicada. Ya que las cadenas nacientes (rojo) tiene extremos libres, estas puedenrotar sin restricciones en torno a sus cadenas parentales (flecha roja A). Entonces lascadenas hermanas no pueden albergar superenrollamiento. c) Si las horquillas puedengirar (flecha azul B) permite la migracion de un superenrollamiento Left − handedpositivo a la region ya replicada, creandose un pre-encadenamiento Right − handed.Las cadenas parentales estan en verde y azul, mientras que las nacientes estan en rojo

[? ].


2.9.1 Quiralidad y signo topologico de los RIs

La quiralidad y los signos topologicos en los intermediarios de replicacion puede presen-tar diversos aspectos. Para comprender la topologıa de estas moleculas se analizan lossignos topologicos de los cruces que muestre la molecula desde algun punto de proyeccionu observacion, y los signos dependen de la orientacion de la molecula, si esta es anali-zada como una curva. En la Figura 2.14 se muestra una manera de diferenciar los signostopologicos tratando a las moleculas como curvas orientadas. Dicho signo depende delsentido en que debe girar el segmento dirigido que pasa por arriba para superponersecon el que pasa debajo; si se gira en sentido horario el signo es negativo y es positivoen caso contrario. De acuerdo al sentido en que la molecula esta enrollada en torno sueje imaginario, es decir su quiralidad, las moleculas se clasifican en dextrogiras o Right-handed(RH) y levogiras o Left-handed(LH) (Figura 2.14 b).En una molecula con conformacion plectonemica se tiene signo topologico negativo sila molecula esta enrrollada en forma dextrogira, y signo topologico positivo si esta enr-rollada en forma levogira. Sin embargo en un intermediario de replicacion los signosy la quiralidad pueden presentarse de diversas formas. Curiosamente, en un RI consuperenrollamiento negativo in vitro la doble helice de la region no replicada se enrrollasobre sı misma en sentido dextrogiro (RH(-)) mientras que las cadenas de la region yareplicada se enrrollan sobre sı mismas en sentido levogiro (LH(-)) [70]. Lo contrarioocurre en el caso del superenrollamiento positivo con sentido levogiro. Resumiendo,al pasar el superenrollamiento de la region no replicada a la ya replicada lo hace conquiralidad opuesta pero conservando el signo topologico. Los ejemplos de estos cambiosse muestran en la Figura 2.15, en la que se representa a un RI por medio de gomaselasticas. En la Figura 2.16 a se muestra un modelo de intermediario de replicacion in

vivo propuesto por Jorge B. Schvartzman et. al., en el cual las cadenas nacientes de laregion ya replicada no pueden superenrollarse pero sı pueden girar una alrededor de laotra, introduciendo pre-encadenamiento [? ]. La migracion de cruces LH(+) de la regionno replicada provoca la introduccion de pre-encadenados con cruces RH(+) en la regıonya replicada, los cuales seran eliminados por la Topo IV. Al terminar la replicacion lospre-encadenamientos que no fueran eliminados por la Topo IV se transformaran en en-cadenamientos entre las cromatidas hermanas. En el caso de RIs obtenidos in vitro

a partir de bacterias que expresan (que producen) Topo IV, estas presentarıan crucesRH(-) en la region no replicada debido al superenrollamiento negativo y cruces LH(-) enlos pre-encadenados de la region ya replicada. Estos se formarıan como consecuencia dela difusion del Wr(-) luego de la desproteinizacion, es decir, la eliminacion del replisomaque impide la difusion del superenrollamiento negativo (Figura 2.16 b). Sin embargo,en RIs obtenidos de bacterias que no expresan Topo IV, la region no replicada se enr-rollarıa en forma RH(-) y la ya replicada en forma RH(+) (Figura 2.16 c). En este caso


no se producirıa la migracion del Wr(-) despues de la desproteinizacion debido a que,en ausencia de Topo IV, se producirıa una gran acumulacion de pre-encadenados concruces RH(+). Este cambio en la quiralidad pero no en el sentido del cruce se ha obser-vado en transcion de la conformacion toroidal a la plectonemica [14]. In vivo, durantela replicacion el replisoma es una barrera que mantiene las dos regiones del RI comodominios topologicos cerrados [? ]. En esta etapa el Wr(-) de la region no replicada nopuede pasar a la region ya replicada, sin embargo sı puede pasar el Wr(+) intruducidopor la helicasa que abre la horquilla de replicacion [? ].


Figura 2.15: Nomenclatura de signos topologicos y sentido de giro para la topologıadel DNA. a) El signo topologico se obtiene observando la orientacion de la curva en uncruce. b) El sentido de giro de una curva en torno a un eje imaginario que pasa por su

eje define su quiralidad


Figura 2.16: Signos topologicos y quiralidad de un CCRI representado con gomaselasticas. a) Si se introducen cruces RH(-) en la region no replicada se forman crucesLH(-) en la region ya replicada. a) La introduccion de cruces LH(+) en la region no

replicada induce la formacion de cruces RH(+) en la region ya replicada.

2.10 La paradoja de la Topoisomerasa IV

Se ha encontrado que la Topo IV es muy eficiente eliminando cruces LH, tales comolos que se encuentran en moleculas con Wr(+) [34]. Esta observacion explica como esque la Topo IV remueve eficientemente el superenrollamiento positivo que se acumulafrente a la horquilla de replicacion y, al mismo tiempo, es practicamente inactiva con res-pecto al superenrollamiento negativo necesario para el progreso de la horquilla. Por otrolado estudios previos muestran que la Topo IV puede desencadenar pre-encadenados y


Figura 2.17: Topologıa de los signos y quiralidad de los cruces en los RIs. a) In-termediario de replicacion CCRI de una estirpe que en la que actua la Topo IV invivo donde las cadenas nacientes son incapaces de rotar libremente una en torno a laotra en las horquillas de replicacion para liberar tension negativa desde la region noreplicada. b) CCRI de una estirpe en la que actua la Topo IV in vitro despues de ladesproteinizacion. La region no replicada se enrrolla en forma Right Handed con signonegativo y la region ya replicada se enrrolla en forma Left Handed con signo negativo.c) CCRI de una estirpe deficiente en Topo IV in vivo despues de la desproteinizacion.La region no replicada se enrrolla en forma Right Handed con signo negativo y la regionya replicada de forma Right Handed pero con signo positivo (Schvartzman and Stasiak

2004).

encadenados con quiralidad RH(±), a pesar de no ser eficiente relajando moleculas supe-renrolladas con cruces RH(-). Como sea, estas observaciones hacen aun mas misteriosala cuestion de como los cruces RH(+) de dos moleculas encadenadas pueden ser remo-vidos eficientemente por la Topo IV. La solucion a esta paradoja aun no esta resuelta [?]. Se han propuesto varios modelos para responder a esta cuestion, sin embargo ningunoha sido confirmado in vivo. Una solucion parcial para este problema fue propuesto apartir del estudio de moleculas relajadas, las cuales fueron trenzadas una en torno a laotra en sentido RH, igual que en los pre-encadenados y encadenados [34]. Cuando semantenıan estiradas por una alta fuerza de tension estas trenzas no eran relajadas por laTopo IV. Sin embargo cuando la fuerza de tension disminuıa a niveles comparables conlos que se encuentran en celulas vivas, las trenzas decrecen su energıa elastica formandoenrrollamientos de orden superior con cruces LH. Estos cruces LH eran eficientementereconocidos y servıan como sustrato para que la Topo IV separe las moleculas. Esto


mismo podrıa ocurrir durante el desencadenamiento de moleculas con elevado numerode encadenamiento Ca. Por otro lado algunos autores sugieren que la Topo IV es capazde eliminar eficientemente encadenados dextrogiros in vitro en moleculas de DNA tanaltamente encadenadas que los cruces dextrogiros modifican su geometrıa angular y seconvierten en cruces levogiros, constituyendo ası un sustrato adecuado para la Topo IV[71].

2.11 Analisis de RIs mediante electroforesis bidimensionalen geles de agarosa

Esta tecnica fue utilizada originalmente para separar intermediarios de recombinacionramificados de moleculas lineales [72] y posteriormente fue adaptada para analizar RIslineales. Actualmente la electroforesis bidimensional en geles de agarosa es una de lasherramientas mas frecuentemente empleadas en el mapeo de orıgenes de replicacion[73][74] [75] [76] [77], terminos [60][61] y barreras para el progreso de las horquillas[78][79] [80]. Ademas, permite resolver las distintas formas topologicas que puedenadoptar los CCCs [72] [81] [82] y ha demostrado ser la herramienta mas idonea para laidentificacion de moleculas de DNA lineales con una burbuja interna anudada [59][83][84]. La posibilidad de anadir un agente intercalante durante la primera y/o la segundadimension aumenta aun mas su poder de resolucion [85].

La electroforesis bidimensional en geles de agarosa se basa en que la movilidad electro-foretica de una molecula de DNA en un gel de agarosa depende no solo su tamano sinotambien de su forma, de la concentracion de agarosa presente en el gel y de la fuerzadel campo electrico al que se somete dicha molecula. Ajustando todos estos parametros,es posible separar los RIs y el resto de moleculas de DNA ramificadas de las moleculasno replicadas. En lıneas generales, en un gel bidimensional la primera dimension trans-curre en condiciones de bajo voltaje y bajo porcentaje de agarosa en el gel. En estascondiciones se minimiza el efecto de la estructura tridimensional de las moleculas sobresu movilidad electroforetica y las mismas se separan fundamentalmente en funcion de sumasa. En cambio, la segunda dimension transcurre en condiciones de alto voltaje y altoporcentaje de agarosa potenciando ası la influencia de la estructura tridimensional delas moleculas sobre su movilidad. En estas condiciones, las moleculas ramificadas tienenmenor movilidad que las moleculas lineales de igual masa. De esta forma, es posibleanalizar mezclas de poblaciones de moleculas con distintas masas y formas.


2.12 Agentes intercalantes

Los agentes intercalantes son sustancias capaces de alterar el retorcimiento de la doblehelice del DNA. Las moleculas de estos agentes intercalantes tienen una estructura pla-nar, usualmente policıclica y aromatica que se puede insertar entre dos pares de basesde una doble helice de DNA. Esta insercion causa un cambio en el ındice de torsion(Tw) de la molecula de DNA, resultando en una disminucion del numero de repeticioneshelicoidales de la molecula, es decir, una disminucion en el Tw. Los agentes intercalantesno alteran el ındice de ligamiento (Lk) de moleculas CCCs. Si se tiene una moleculade DNA con un determinado ındice de superenrollamiento Wr(-) (por ende ∆Lk < 0 y∆Tw < 0), conforme aumenta la concentracion del agente intercalante en el medio, seproduce una disminucion en el Tw. De la ecuacion ∆Lk = ∆Tw+Wr se deduce que si el∆Lk se mantiene constante entonces el Wr debe aumentar. Es decir, conforme aumentala concentracion del agente intercalante, el Wr aumenta hasta alcanzar el valor Wr = 0,que corresponde a moleculas relajadas. Un estudio de un plasmido en estas condicionesmediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa demuestra que estas moleculasadquieren la movilidad electroforetica de de moleculas OCs. Si la concentracion delagente intercalante sigue aumentando entonces los plasmidos adquieren Wr > 0, y vanrecuperando movilidad electroforetica. Entre los agentes intercalantes que producen esteefecto se encuentran el bromuro de etidio (EtBr) y la cloroquina. Debido a que, conlas concentraciones de EtBr normalmente utilizadas en electroforesis (1 µg/mL) el DNAesta saturado y todas las moleculas CCCs adquieren mucho Wr(+) y no pueden sepa-rarse, por razones practicas, se utiliza cloroquina, la cual se une debilmente al DNApermitiendo una mejor separacion de los topoisomeros.En intermediarios de replicacion, que cuentan con una region no replicada con un ci-erto grado de Wr(-) y una region ya replicada con un determinado numero de pre-encadenamientos, la presencia de un agente intercalante tiene un efecto distinto. Unaumento en la concentracion del agente intercalante elimina el Wr(-), a continuacion laregion no replicada adquiere Wr = 0 y, consecuentemente, pierde el pre-encadenamientoen la region ya replicada haciendo que la molecula tenga la misma movilidad que un RIrelajado, es decir, que un AccRI (Accumulated RI). A partir de este punto un aumentoen la concentracion del agente intercalante no permite que la region no replicada ad-quiera Wr > 0 y recupere movilidad electroforetica, sino que la molecula se mantienecon la movilidad de las moleculas AccRIs. Esto se debe a que en las horquillas de repli-cacion las cadenas nacientes cuentan con extremos libres de cadena sencilla (solamentelas moleculas parentales se hallan unidas a la region no replicada) y una vez que el RIse relaja, un aumento en la concentracion del agente intercalante hace que las cadenasnacientes se unan entre sı (ya que son cadenas complementarias) y formen un cuartobrazo en la horquilla de replicacion. Este cuarto brazo es llamado horquilla en retroceso


(o chicken foot por su aspecto cuando se observa con microscopıa de fuerza atomica oelectronica).Los aumentos posteriores en la concentracion del agente intercalante hacenque en lugar de introducir Wr(+), la horquilla en retroceso aumente su longitud y elRI se mantenga en estado relajado. La horquilla en retroceso se forma solo en una delas horquillas de replicacion [86]. En la Figura 2.17 se muetra un esquema de un RIuna horquilla en retroceso en un intermediario de replicacion. Los agentes intercalantespueden extraerse mediante dilucion de manera a reducir su concentracion y hacer quelas moleculas vuelvan a adquierir su topologıa original.

Figura 2.18: Formacion de una horquilla en retroceso. a) Una concentracion suficientede agente intercalante es capaz de llevar a un RI a un estado relajado. c) Al aumentarla concentracion del agente intercalante se forma una horquilla en retroceso en una delas horquillas de replicacion. Las cadenas parentales estan en verde y azul, las cadenas

nacientes se representan en rojo.

Capıtulo 3

Simulacion por el metodo deMonte Carlo

3.1 Simulacion computacional de la topologıa del DNA

Las simulaciones computacionales de conformaciones recurren a metodos simplificados dela estructura de las moleculas de DNA, debido a la gran complejidad de las mismas. Losmetodos de dinamica molecular no son apropiados debido al gran numero de nucleotidos(del orden de 103 en los plasmidos) que conforman una doble helice de DNA, si es queesta debe ser suficientemente grande para tener el tamano de un plasmido. Por estarazon la mayorıa de las simulaciones de las conformaciones de DNA son hechas por elmetodo de Monte Carlo (MC). En su sentido mas general, el metodo de MC simulapropiedades de un sistema utilizando algun metodo que implica numeros aleatorios yprobabilidad. En el sentido mas especıfico de simulaciones moleculares, se desarrollanmodelos de conformacion de una molecula de DNA que se pueden utilizar para calcularenergıa y a continuacion se utilizan cambios aleatorios en la conformacion para probar lasenergıas de un conjunto de conformaciones, ya sea con el fin de encontrar la conformacionmas estable o para generar un conjunto de conformaciones posibles. El metodo especıficousado en la mayorıa de los estudios de DNA, ası como en muchos otros, fue desarrolladopor Metropolis y colaboradores en 1953 [6][87]. A partir de una conformacion inicialse calcula su energıa inicial E1, luego, se induce un cambio conformacional aleatorio enel modelo para dar una nueva conformacion de prueba y se calcula una nueva energıaE2. La conformacion de prueba es aceptada inmediatamente si tiene una energıa masbaja que la del predecesor (E2 < E1), pero si la energıa es mayor, la conformacion seacepta al azar, con una probabilidad P que depende exponencialmente de la diferenciade energıa entre las dos conformaciones:

35

Capitulo 3. Simulacion por el metodo de Monte Carlo 36

P = e(E1−E2)

kbT . (3.1)

Esto representa la probabilidad de que una conformacion determinada con E1 < E2 seaaceptada bajo las condiciones termicas indicadas. Si se acepta la conformacion de pru-eba, se utiliza como la base para la generacion de una nueva conformacion. Si se rechaza,la conformacion anterior se utiliza para el siguiente paso. De esta manera, despues demuchas conformaciones de prueba, tıpicamente cientos de miles, las simulaciones con-vergen a conformaciones de una distribucion termica de las moleculas estables. Estosmetodos fueron aplicados por primera vez para una conformacion circular de DNA porLe Bret y Vologodskii et al. [88][89][90][91].

3.1.1 Simulacion para superenrrollamiento de DNA

Para la simulacion de las propiedades termicas y conformacionales de moleculas cir-culares de DNA se deben tener en cuenta ciertas propiedades intrınsecas del tipo demoleculas que se quiere representar. Dos propiedades muy importantes para la simu-lacion son el diametro de la molecula y la rigidez en funcion de su longitud. Debido ala carga electrica negativa del DNA, dos segmentos separados se repelen entre sı. Lafuerza repulsiva depende de la concentracion de iones del medio en el que se encuentrala molecula. A la distancia mınima a la que pueden estar dos segmentos distintos demoleculas de DNA, a causa de la repulsion electrica, se le llama diametro efectivo ycorresponde al mismo diametro de la doble helice [6]. El diametro y la longitud de lamolecula definen un volumen denominado volumen excluido.Una molecula de DNA se puede cerrar y formar un cırculo solamente si su longitud esun multiplo entero de su longitud de repeticion helicoidal, y la energıa necesaria paradoblar la molecula en un cırculo es menor mientras mayor es la longitud total de esta. Laflexibilidad de la molecula de DNA se describe normalmente por un parametro llamadola longitud de persistencia, a, que describe la escala de longitud sobre la que la rigidezde la helice de DNA es importante [6][91]. Se puede definir la longitud de persistenciacomo la longitud sobre la que existe una cierta correlacion entre la direccion inicial yfinal de la helice. Despues de una distancia de una longitud de persistencia a, debidoal movimiento termico, la desviacion media del eje de la helice a partir de su direccioninicial sera un radian, y despues de dos longitudes de persistencia, 2a, ya no habra corre-lacion entre las direcciones inicial y final, con un angulo medio de deflexion alrededor del90o. El valor 2a tambien se conoce como la longitud estadıstica Kuhn [6][91]. El valorde la longitud de persistencia esta directamete relacionado con la rigidez de doblado dela molecula y con la temperatura absoluta del medio. Otra caracterıstica importante de


una conformacion simulada de superenrrollamiento, ademas de su diametro efectivo ysu rigidez de doblado, es la variacion de su Lk con respecto a una conformacion relajada∆Lk0, esta variacion es llamada ∆Lk.

El modelo que se utiliza en esta obra para simular al DNA es conocido como wormlikechain, en el que molecula esta representada por una serie de segmentos rectos de longitudconstante [90][91]. Si se asigna a cada segmento de la curva una distancia mınima a laque se le permite estar de otro segmento, entonces se puede suponer que la curva esahora un cilindro o tubo impenetrable. Para emular un plasmido la curva de segmentosrectos debe ser cerrada y con un numero finito de segmentos. El metodo de MetropolisMC demanda adquirir un valor de energıa para cada conformacion de prueba creada. Laenergıa potencial elastica en la molecula simulada tendra dos componentes: una energıaelastica de doblado, Eb y una energıa elastica de torsion, Et. La energıa de dobladoesta asociada al angulo que existe entre dos segmentos de la curva en las que estos sonaproximadamente rectos. Para un modelo en el que el eje de una molecula de DNA estacompuesta con N segmentos rectos, la energıa de doblado esta dada por:

Eb = kbTαN∑i=1

θ2i , (3.2)

donde la sumatoria se extiende a todas las uniones entre los segmentos rıgidos, kb es laconstante de Boltzman, T es la temperatura absoluta (297 K), θi es el desplazamientoangular (en radianes) del segmento i relativo al segemento i + 1 y α es la constante derigidez de doblado [91]. La figura 3.1 nos muestra los el modelo wormlike chain consus angulos de doblado correspondiente y el tipo de movimientos de prueba utilizadosen esta Tesis.

Figura 3.1: Modelo wormlike chain para la simulacion del DNA. a) Se representa a lamolecula como usa susecion de segmentos rigidos, los cuales cuentan con los angulos dedoblado θ entre dos segmentos consecutivos. b) Los movimientos de prueba utilizadossobre el modelo wormlike chain son rotaciones rıgidas en un angulo ϕ de todos los

segmentos que se encuentran entre los puntos m1 y m2.


La energıa de tosion, Et, es una funcion cuadratica de la variacion del Tw de la cadenarespecto a la configuracion con Lk0 (Lk de la molecula relajada), ∆Tw0. No se computa∆Tw directamente porque el Tw es una propiedad de la estructura de doble helice delDNA, la cual no esta incluido en el modelo wormlike chain. De todas formas, para unacadena cerrada el ∆Tw puede ser calculado utilizando el Teorema de Calugareanu:

∆Tw = ∆Lk −∆Wr. (3.3)

Si se considera al DNA como una cinta, en su estado relajado la conformacion tiendea ser circular, lo cual corresponde a un Wr0 nulo, por esto la ecuacion anterior puedetomar la forma ∆Tw = ∆Lk−Wr. Ası la energıa elastica de torsion puede ser expresadacomo:

Et = 2π2C

L(∆Lk −Wr)2, (3.4)

donde C es la constante de torsion de la molecula y L es su longitud total [90].

Entonces, si se quiere calcular la energıa potencial elastica total de una molecula circularde DNA, con un determinado valor de ∆Lk, es necesario conocer el valor de su Wr paracada conformacion de prueba.

3.1.1.1 Seleccion de numero de segmentos y rigidez de doblado

La eleccion del numero de segmentos para la simulacion de la molecula con el modelowormlike chain se relaciona con la cantidad de longitudes de Kuhn contenidas a lo largode la longitud del plasmido. La relacion entre el numero de segmentos N , y la cantidadde longitudes de Kuhn n contenidas en la molecula es N = kn [91]. El numero k, serelaciona con la rigidez de doblado α mediante

k = 1+ < cosθ >

1− < cosθ >, (3.5)

donde

< cosθ >=∫ π

0 cosθsenθe−αθ2

dθ∫ π0 senθe

−αθ2dθ. (3.6)


Las integrales son calculadas de forma numerica y el valor de α es utilizado al calcularla energıa en la ecuacion (3.2)[90][91].

3.1.1.2 Calculo de angulos de doblado

En el modelo wormlike chain la energıa de doblado depende de los angulos entre todoslos segmentos consecutivos, como lo indica la ecuacion (3.2). Si la curva esta representadapor una sucesion finita de puntos ri = (x(i), y(i), z(i)), entonces el angulo de dobladodel segmento definido por los puntos ri y ri+1 y el segmento definido por los puntos ri+1

y ri+2 esta dado por

θi = arccos( (ri+2 − ri+1) · (ri+1 − ri)‖(ri+2 − ri+1)‖‖(ri+1 − ri)‖

). (3.7)

3.1.1.3 Angulos de cruce y yuxtaposicion de segmentos del plasmido

La presencia de un cruce entre dos segmentos de un plasmido depende del punto deobservacion, sin embargo, cuando dos segmentos se encuentran lo suficientemente cer-canos entre sı, para que una topoisomerasa de tipo II pueda actuar sobre ellos, entoncesdecimos que hay una yuxtaposicion entre ambos segmentos.En las simulaciones realizadas, se produce una yuxtaposicion cuando la distancia D en-tre los ejes axiales de dos segmentos cumple con la condicion defectivo < D ≤ 2defectivo,donde defectivo es el diametro efectivo de la molecula.En nuestro modelo del plasmido, el mismo esta representado por una curva cerrada ori-entada. Esa orientacıon define el signo de los cruces topologicos que muestre la curvapara un determinado punto de proyeccion. Como antes, si la curva esta representadapor una sucesion finita de puntos ri = (x(i), y(i), z(i)), entonces el angulo de cruce enuna yuxtaposicion entre los segmentos cuyos puntos iniciales son ri y rj esta dado por

ξ = arccos( (rj+1 − rj) · (ri+1 − ri)‖(rj+1 − rj)‖‖(ri+1 − ri)‖

) (3.8)

Un algoritmo encargado de la busqueda de yuxtaposiciones en una curva definida porun conjunto de vectores r1, ...ri, ...rN puede correr en tiempo polinomial O(N2) Enuna conformacion plectonemica, a causa del la orientacion intrinseca de las curvas, losangulos de cruce tienden a ser obtusos. Esto se ilustra en la Figura 3.2.


Figura 3.2: Yuxtaposicion y angulos de cruce en conformaciones plectonemicas. Sinimportar el tipo de estructura plectonemica el angulo de cruce es obtuso.

3.1.1.4 Diametro efectivo en las simulaciones

En la simulacion con Metropolis MC, con el modelo wormlike chain, podemos asignarvalores infinitos de energıa potencial elastica a una conformacion que tenga dos verticesde segmentos cualesquiera separados a una distancia menor o igual al diametro efectivodefectivo. Esta simple restriccion permite que tres vertices consecutivos puedan estara una distancia casi tan pequena como defectivo sin violar dicha restriccion. Una con-formacion resultante podra entonces tener segmentos ”puntiagudos o angulosos”. Unamejor restriccion, implementada para esta obra, sugiere que el diametro efectivo defectivosea una funcion de la diferencia D = ‖(ri+1 − ri)‖ que hay entre dos ındices de verticescualesquiera

defectivo(D) = A(1 + (D − 1)3e1−D) (3.9)

donde A es una constante igual al valor de diametro efectivo entre dos segmentos muyalejados. Esta funcion varia con D, tal como muestra la figura 3.3. En condicionesfisiologicas el diametro efectivo entre segmentos distales de una molecula de DNA sueleser de 3 nm [3].


Figura 3.3: Dependencia del diametro efectivo defectivo con la distancia D entrevertices en el modelo wormlike chain.

Un algoritmo encargado de la verificacion del diametro efectivo en una curva de finidapor un conjunto de vectores r1, ...ri, ...rN puede correr en tiempo polinomial O(N2)y la implementacion de ese algoritmo en para esta Tesis se puede observar en el AnexoA.1.6.

3.1.1.5 Calculo numerico del ındice de ligamiento

Para calcular la energıa potencial elastica de torsion del DNA basta con usar la ecuacion(3.4). Sin embargo, tambien es util tener en cuenta la forma de calcular numericamenteel Lk. El ındice de ligamiento segun (2.4) es

Lk = 14π

∮C′

∮C

((r’− r)× dr‖r’− r‖3

)· dr’

(3.10)

De la ecuacion (2.4) se puede inferir que si dos curvas estan definidas por los vectores deposicion, r y r’ y la distancia entre dos segmentos consecutivos esta dada por b = ri+1−riy por b’ = r’j+1 − r’j , entonces el Lk de las dos curvas se puede calcular para N

segmentos mediante:

Lk = 14π

N∑i=1

N∑j=1

((r’j − ri)× b‖r’j − ri‖3

)· b’.

(3.11)


Ya que ri = (xi, yi, zi), rj = (xj , yj , zj), b = (xi+1 − xi, yi+1 − yi, zi+1 − zi) y b’ =(xj+1−xj , yj+1− yj , zj+1− zj), el producto vectorial mixto ((r’j − ri)×b) ·b’ se puedecalcular como un determinante de 3× 3. Si renombramos a la diferencia (r’j − ri) comoRji = (Rji1, Rji2, Rji3) tendremos que:

(Rji × b) · b′ = Det

Rji1 Rji2 Rji3

b1 b2 b3

b′1 b′2 b′3

La implementacion de un algoritmo que calcule la sumatoria doble 3.11 debe correr entiempo polinomial O(N2).

3.1.1.6 Calculo numerico del ındice de superenrrollamiento

De la ecuacion (2.19)

Wr = 14π

∮C

∮C

((r1 − r2)× dr2‖r1 − r2‖3

)· dr1. (3.12)

podemos obtener la siguiente formula

Wr = 14π

N∑i=1

N∑j=1

((rj − ri)× bi‖rj − ri‖3

)· bj .

(3.13)

Tambien podemos denotar a la diferencia (rj − ri) como Rji, pudiendo luego calcular elproducto vectorial mixto como:

(Rji × bi) · bj = Det

Rji1 Rji2 Rji3

bi1 bi2 bi3

bj1 bj2 bj3

A diferencia del calculo del Lk, el calculo del Wr requerirıa que se recorra la mismacurva dos veces, por ello se mide el angulo solido entre dos segmentos dos veces. Paradisminuir el tiempo de computo del Wr entonces se puede recorrer la curva solo una vezy luego se multiplica el resultado por dos. Esto se logra haciendo que la segunda sumacomienze desde i, quedando la formula como:


Wr = 12π

N∑i=1

N∑j=i

((rj − ri)× bi‖rj − ri‖3

)· bj

(3.14)

Los algoritmos que calculen las sumatorias dobles 3.13 o 3.14 deben correr en tiempopolinomial O(N2).

3.1.2 Control del estado topologico en las conformaciones

El estado topologico de una conformacion con superenrrollamiento puede ser descritono solo por su valor de ∆Lk, sino tambien por la presencia de nudos. Una forma deverificar la presencia de nudos es mediante la utilizacion del polinomio de Alexanderpara nudos. Dicho polinomio es un invariante de nudos descubierto en 1923 por JamesWaddell Alexander [92]. La version original del polinomio parte de la representacion deun nudo mediante un diagrama bidimensional o un grafo. Una proyeccion plana de unnudo con n cruces genera un diagrama con n+ 2 regiones, a cada region se le asigna unındice. No existe una indicacion especial para asignar los ındices a las regiones. Una delas asignaciones posibles se muestra en la Figura 3.3, donde ri indica las regiones y ci

indica los puntos cruce del diagrama de nudo.

Figura 3.4: Diagrama de un nudo trefoil donde se muestran las distintas regiones ri

y los cruces ci

Es posible asignar una serie de ecuaciones a un diagrama de nudo. Supongase que enun cruce ci las regiones se llaman rj , rk y rm en el sentido inverso al movimiento de lasmanecillas del reloj y se asigna rj y rk a las regiones que estan marcadas con un punto.Por lo tanto, la ecuacion de un cruce ci es:

ci(r) = xrj − xrk + rl − rm.

(3.15)


De acuerdo a lo anterior las ecuaciones del diagrama de la Figura 3.3 son:

c1(r) = xr2 − xr0 + r3 − r4 = 0.

c2(r) = xr1 − xr0 + r2 − r4 = 0.

c3(r) = xr3 − xr0 + r1 − r4 = 0.

(3.16)

Estas ecuaciones de un diagrama determinan su estructura. Con estas ecuaciones segenera la matriz de coeficientes, con n filas y n+ 2 columnas, donde las filas representanlos cruces y las columnas representan las regiones. Ası, la matriz de coeficientes M delejemplo (Figura 3.3) queda como sigue

M =

x 0 x 1 −1x 1 0 x −1x x 1 0 −1

Si se reduce la matriz M a una matriz cuadrada eliminando las dos columnas consecutivasde ındices p y p+1, el determinante de la matriz restante M0 sera independiente de lasdos columnas eliminadas, dentro de un factor de la forma ±xn. El determinante obtenidoes el llamado polinomio de Alexander y es un invariante para nudos. En la matriz M,removiendo las primeras dos columnas el determinante resultante es

Det

x 1 −10 x −11 0 −1

= −x2 + x− 1

Si se eliminan las dos ultimas filas el determinante resulta ser

Det

x 0 x

x 1 0x x 1

= −x3 + x2 − x

Se observa que estos dos resultados difieren solamente en un factor ±xn. El resultadoobtenido para este nudo, que es conocido como trefoil (trebol) tiene entonces el polinomiode Alexander ∆(x) = x2 − x + 1. Este es el nudo mas simple que existe. El valor delpolinomio de Alexander para una curva sin nudos (unknot) es ∆(x) = 1.Para obtener el polinomio de Alexander para curvas mas complejas en esta obra serecurre al mismo algoritmo utilizado por Vologodskii y colaboradores [90].


3.1.3 Propiedades termodinamicas del superenrrollamiento y encade-namiento

Un sistema se encuentra en estado de equilibrio termodinamico cuando no es capazde cambiar de estado espontaneamente, o, sus variables macroscopicas como presion,temperatura y composicion toman un valor constante, independiente del tiempo. Elequilibrio es aquel estado al cual tiende espontaneamente un sistema [93]. Para ello hade encontrarse simultaneamente en equilibrio termico (la temperatura en todos los pun-tos del sistema es la misma), mecanico (la presion en todos los puntos del sistema es lamisma) y quımico (la composicion quımica es la misma en todos los puntos del sistema).Por otro lado, es indispensable que todas las fuerzas en el sistema esten balanceadas[93].La energıa libre es un potencial termodinamico, una funcion de estado extensiva, que de-termina la condicion de equilibrio y espontaneidad para una reaccion quımica (a presiony temperatura constantes). La entalpıa H de un sistema y entropıa S definen la energıalibre del mismo mediante G = H −TS, donde T es la temperatura absoluta del sistema[93]. La variacion de energıa libre para un proceso termodinamico toma la forma

∆G = ∆H − T∆S. (3.17)

En su estado relajado, una plasmido tendra un valor de Wr cercano a cero. En lasimulacion con el modelo wormlike chain siempre se tendra una energıa de dobladodistinta de cero, en el estado de equilibrio. Se definen la entalpıa en este modelo deDNA como la diferencia entre la energıa potencial elastica total para un valor dado de∆Lk y el valor de la energıa potencial elastica en estado relajado [90]:

H(∆Lk) = E(∆Lk)− E(∆Lk0). (3.18)

En el caso de que se tengan moleculas relajadas, con ∆Lk = 0, proponemos la si-guiente definicion de la entalpia en funcion al numero de encadenamientos, Ca, comoH(Ca) = E(Ca)− E(Ca0), donde Ca0 es la ausencia de encadenamiento.

La variacion de energıa libre que debe introducir una topoisomerasa para cambiar elındice de ligamiento de una molecula, desde Lk0 hasta adquirir cierto valor de ∆Lk es

∆G(σ) ∼= 13LRTσ2, (3.19)


donde L es la longitud de la molecula, R es la constante de los gases, T la temperaturaabsoluta y σ es denominado ındice de ligamiento especıfico y esta dado por σ = ∆Lk

Lk0[6].

3.1.4 Simulacion de moleculas de DNA

Se manejaron moleculas de DNA plasmidico con horquillas de replicacion detenidas, esdecir, intermediarios de replicacion (RIs), con una region no replicada y una region yareplicada. Uno de los principales problemas que dificultan el estudio de la topologıade los RIs es que in vivo existe un complejo proteico denominado replisoma que seencuentra unido a el RI. Como se explico anteriormente, la union del replisoma a los RIsen las horquillas de replicacion actuarıa como una barrera regulando la difusion de latension torsional entre las regiones no replicada y ya replicada. Sin embargo, al aislar elDNA y eliminar todas las proteinas unidas al mismo (para su analisis por electroforesiso microscopıa electronica) desaparecen las restricciones topologicas impuestas por launion del replisoma. Esto hace que el DNA pueda girar libremente en las horquillas,permitiendo la libre difusion del superenrrollamiento a traves de las mismas. En elpresente trabajo, valiendonos de esta ”separacion”en dominios topologicos entre la regionno replicada y la ya replicada, se simularon RIs compuestos por dos partes: i) la regionno replicada que se comporta como una molecula con un determinado valor de ∆Lk, yii), la ya replicada como dos moleculas encadenadas, con un determinado valor de Ca y∆Lk = 0.

Debido a que in vitro la regıon ya replicada esta permanentemente relajada, debido a laeliminacion del proteosoma, se puede simular el encadenamiento sin superenrrollamiento.En condiciones controladas de laboratorio, el plasmido tratado se encuentra almacenadoa presion y temperatura constante. Considerando a cada intermediario de replicacioncomo un sistema de dos partes, la region ya replicada y la no replicada, y asumiendoque no interactua con el medio circundante, entonces existe equilibrio termodinamicoen el sistema. De esta forma, cada exceso de energıa en una region pasara a la otra enforma de variacion de entalpıa. Mecanicamente, un exceso de energıa en la region noreplicada inducira que algunos cruces de esta region pasen a la region ya replicada enforma de mas pre-encadenamiento. De forma opuesta, un exceso de energıa en la regıonya replicada inducira una perdida del pre-encadenamiento y la introduccion de nuevoscruces en la regıon no replicada.

Capıtulo 4

Materiales y metodos

4.1 Parte experimental

4.1.1 Estirpes bacterianas

Las estirpes de E. coli utilizadas en este trabajo fueron:

DH5αF’: [F’/ endA1 hsdR17 (r−k , m+k ) supE44 thi-1 λ- recA1 gyrA96 (nalr) relA1

deoR ∆(lacZYA-argF)-U169 φ80dlacZ∆M15].

parE10: W3110 [parE10 recA], [94]. Cedida por el Dr. Ian Grainge. Si se cultiva a 43o

C es deficiente en TopoIV.

4.1.2 Plasmidos

pBR322@AatII (4449 pb): Contiene la secuencia terminadora de la replicacion TerE enel sitio AatII de pBR322. Debido a la posicion del terminador respecto al origen, eneste plasmido se acumulan RIs con la horquilla detenida cuando ha alcanzado el 60 porciento de su replicacion. Por tanto, los RIs acumulados contienen una burbuja internay su masa es 1.60 veces la masa del plasmido no replicado.

4.1.3 Condiciones de cultivo

Los cultivos en medio lıquido de las estirpes se realizaron en LB (triptona %, extracto delevadura 0.5%, cloruro sodico 1%, pH 7.5) a 37oC con agitacion orbital (250 rpm). Parala seleccion de transformantes se utilizo ampicilina (Roche) a 75µg/ml , tetraciclina a12.5 µg/ml (Sigma). Los cultivos en medio solido se realizaron en placas Petri con LB al

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Capitulo 4. Materiales y metodos 48

Figura 4.1: Mapa del plasmido pBR322@AatII. A: Mapa en donde se indica la po-sicion y orientacion del origen ColE1 (flecha verde) y del terminador TerE (en rojo) asıcomo los sitios de corte de las enzimas de restriccion utilizadas. En el interior del mapase muestra la posicion y orientacion los genes que confieren resistencia a ampicilina(flecha azul a la izquierda) y tetraciclina (flecha azul a la derecha), y del gen rop (flechanegra). B: Esquema del RI que se acumula cuando la horquilla se detiene al llegar alterminador. En azul y verde se representa la doble helice parental y en rojo las cadenas

nacientes (Virginia Lopez et. al.)

que se anadio agar al 2%. Las placas se incubaron invertidas entre 16 y 18 horas a 37oCen estufa. La densidad celular en los cultivos se determino midiendo la densidad opticaen un espectrofotometro a 600 nm (OD600) frente a un blanco que contenıa el medio LBsin celulas bacterianas. Las estirpes bacterianas se conservaron diluidas al 50% en unasolucion de glicerol (glicerol 65%, MgSO4 0.1 M, Tris-HCl 0.025 M, pH8.0) a -20oC ya -80oC. La inhibicion de la Topo IV en la estripe parE10 (con mutacion termosensibleen el gen parE) se llevo a cabo creciendo los cultivos a la temperatura permisiva (30oC)hasta alcanzar la fase exponencial e incubandolos despues a la temperatura restrictiva(43oC) a distintos tiempos y con agitacion orbital.

4.1.4 Tratamiento de los plasmidos

Los plasmidos se trataron con distintas topoisomerasas de estudio en esta obra antes dela electroforesis en geles bidimensionales de agarosa, en presencia o en ausencia de clo-roquina. En algunos de estos tratamientos estuvieron acompanados de distintas formascon agentes intercalantes.


4.1.4.1 Digestion con Topoisomerasa IV

Para el estudio de la topologıa de los RIs del plasmido pBR322@AatII (de la estirpeDH5αF’ y parE10) en presencia de TopoIV, la muestra de DNA (0.2µg/mL) se incubocon Topo IV (3030U

mL ) durante 30 minutos a una temperatura de 37oC en presencia oausencia de cloroquina (40 µg/mL).La digestion se detuvo utilizando proteinasa K durante 30 minutos a una temperaturade 37oC y luego el plasmido se almaceno a 4oC.

4.1.4.2 Digestion con DNA Girasa

Para el estudio de la topologıa de los RIs del plasmido pBR322@AatII (de la es-tirpe DH5αF’ y parE10) en presencia de DNA Girasa, la muestra de DNA plasmıdico(0.2µg/mL). Se incubo con DNA Girasa (1530U

mL ) durante 30 minutos a una temperaturade 37oC.Las muestras se incubaron con DNA Girasa a 37oC durante 30 minutos en presencia oen ausencia de cloroquina (40 µg/mL).La digestion con Girasa se detuvo utilizando proteinasa K durante 30 minutos a unatemperatura de 37oC y luego el plasmido se almaceno a 4oC.

4.1.5 Agente intercalante

Como agente intercalante se utilizo cloroquina. En todos los casos se trabajo una con-centracion de cloroquina de 40 µg/mL.

4.1.6 Geles bidimensionales de agarosa

El analisis de DNA se realizo mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa.Esta tecnica, en la que tanto el tamano como la forma de una molecula de DNA influyenen su movilidad electroforetica, se realizo siguiendo el protocolo descrito originalmentepor Brewer y Fangman [? ].

La primera dimension se realizo en geles de agarosa a una concentracion de 0.4% deagarosa SeaKem LE en tampon TBE 1x y se corrio a 0.9 V/cm durante 25 horas atemperatura ambiente. Luego se llevaron a cabo las segundas dimensiones en geles de1% de agarosa SeaKem LE en tampon TBE 1x que se corrieron a 5 V/cm durante 10horas a 4oC.


En aquellos casos en los que se estudio la influencia de un agente intercalante, se utilizocloroquina durante la primera y la segunda dimension, tanto en el gel de agarosa comoen el tampon TBE 1x de la cubeta de electroforesis.

4.2 Metodos de simulacion computacional

4.2.1 Simulacion del supererrollamiento

En condiciones en las que el plasmido representado no esta replicando (monomero), ti-ene una longitud de 4449 pb. Los intermediarios de replicacion tienen una masa de 1.6xrespecto a las formas no replicadas, es por esto que la region no replicada tiene una longi-tud de 1780 pb (605 nm), que representa el 40% de la longitud del plasmido no replicado.

Como conformacion inicial se tiene un polıgono regular de N lados o vertices. Paragrandes valores de N podemos considerar al polıgono como un circulo. Una vez quese ha calculado la energıa inicial E0 se realizan los movimientos de prueba sobre laconformacion inicial para ejecutar el metodo de Metropolis Monte Carlo. La funcion deenergıa potencial para las conformaciones es

E = kbTαN∑i=1

θ2i + 2π2C

L(∆Lk −Wr)2 (4.1)

donde kb es la constante de Boltzman, T es la temperatura absoluta, θi es el anguloentre el segmento i y el i + 1, α es la rigidez de doblado, C la rigidez de torsion y L

la longitud de la cadena en pb. En la expresion (4.1) esta especificado el valor de Lkque debe alcanzar el plasmido simulado. El valor de Wr cambia en cada movimiento deprueba. Los movimientos de prueba se producen mediante un movimiento de rotacionrıgida que se logra tomando aleatoriamente dos vertices de segmentos , A y B, en elmodelo wormlike. Todos los puntos P contenidos entre A y B son rotados en tornoa un eje que pasa por A y B en un angulo aleatorio ϕ. El punto P ′ resultante de larotacion de P es

P ′ = [n.(P −A)]n + cos(ϕ)[(P −A)− [n.(P −A)]n]± sin(ϕ)[n× (P −A)] (4.2)

donde n es el vector que apunta desde el punto A hasta el punto B, n = (B−A)‖B−A‖ . En

forma contraproducente estos movimientos de movimientos de rotacion rıgida permitenque dos segmentos se crucen o atraviesen entre sı, provocando la aparicion de nudos enmuchos casos. Los nudos son detectados mediante el algoritmo basado en la busqueda


del polinomio de Alexander de la conformacion. El algoritmo para obtener el superenr-rollamiento es presentado en el anexo A.2Se represento la region no replicada mediante el modelo worm like, con 180 segmentos,diametro efectivo con A=3 nm (ecuacion 3.9), rigidez de torsion C = 4, 50.10−19 J.pb,constante de doblado α = 7.4965, temperatura absoluta T = 297 K.Se realizaron simulaciones de 100 formas no anudadas para cada topoisomero desde∆Lk = −1 hasta ∆Lk = −20, con 105 movimientos de prueba en cada simulacion.Las simulaciones fueron realizadas con MATLAB, en un computador de doble nucleo,con procesador Pentium de 2.13 GHz. En la figura 4.2 mostramos una tabla con losparametros utilizados para la simulacion del supenrrollamiento.

Figura 4.2: Parametros constantes utilizados en la simulacion del superenrollamiento.

4.2.2 Simulacion del encadenamiento

Cada molecula naciente de la region ya replicada tiene una longitud de 2670 pb (939nm), que representa el 60% de la longitud del plasmido no replicado.Como conformacion inicial para cada simulacion se utilizaron toroides encadenados.Estos se obtuvieron creado dos toroides con el mismo centro, ambos de radios R y r,desfasados un angulo β que produzca la mayor separacion entre las curvas y amboscon un numero de vueltas coincidente con el numero de encadenamientos que se deseasimular. Sobre esta conformacion inicial se realizan cambios de conformacion con losmovimientos de rotacion rıgida. Se busca mantener durante toda la simulacion el mismonumero de encadenamiento y relajar el encadenado, hasta que ambas moleculas tenganel menor valor posible de Wr para un determinado Ca.La funcion de energıa potencial para cada molecula relajada (∆Lk = 0) encadenadaindependiente y para cada conformacion de prueba es

E = kbTαn∑i=1

θ2i + 2π2C

L(Wr)2 (4.3)

donde kb es la constante de Boltzman, T es la temperatura absoluta, θi es el anguloentre el segmento i y el i+ 1, α es la rigidez de doblado, C la rigidez de torsion y L la


longitud de la cadena en pb. El calculo de la energıa es independiente del numero deencadenamiento (Ca).Representamos la region no replicada mediante el modelo worm like, con 180 segmentos,diametro efectivo con A=3 nm (ecuacion 3.9), rigidez de torsion C = 4, 50.10−19 J.pb,constante de doblado α = 4.8010, temperatura absoluta T = 297 K.Se realizaron simulaciones de 10 formas relajadas (∆Lk = 0) para cada encadenadodesde Ca = 0 hasta Ca = 20, con 105 movimientos de prueba en cada simulacion.Las simulaciones fueron realizadas con MATLAB, en un computador de doble nucleo,con procesador Pentium de 2.13 GHz. En la figura 4.2 mostramos una tabla con losparametros utilizados para la simulacion del encadenamiento.

Figura 4.3: Parametros constantes utilizados en la simulacion del encadenamiento.

Capıtulo 5

Resultados

La presente obra se centra en el estudio de los cambios topologicos en moleculas de DNAparcialmente replicadas y el papel que juegan las topoisomerasas en la coordinacionentre superenrrollamiento y pre-encadenamiento durante la replicacion del DNA. Comomodelo de estudio se utilizo el plasmido pBR322@AatII con las horquillas de replicaciondetenidas en la secuencia terminadora TerE y el origen de replicacion unidireccionalColE1. El bloqueo de las horquillas de replicacion conduce a la acumulacion de RIscuya masa es 1.6 veces la de la molecula no replicada. Para analizar la topologıa delos RIs se combino la electroforesis bidimensional en geles de agarosa con simulacionescomputacionales de moleculas de DNA.

5.1 Resultados del analisis de RIs mediante electroforesisbidimensional en geles de agarosa

5.1.1 Analisis de los RIs del plasmido pBR322@AatII digerido conTopo IV y DNA Girasa

Durante la replicacion del DNA tanto la Topo IV como la DNA Girasa actuan en lasregiones no replicada y ya replicada para compensar el Wr(+) generado por el avance dela horquilla replicativa. Con el fin de estudiar la actividad de las DNA topoisomerasas detipo IIA de E. coli sobre la topologıa de los RIs, se digirio el plasmido pBR322@AatII conTopo IV o DNA Girasa. Como control se utilizo el plasmido intacto. En los plasmidosaislados y desproteinizados de la estirpe DH5αF’ existe superenrrollamiento negativo detipo RH(-) en la regıon no replicada y pre-encadenados LH(-) en la region ya replicada(Figura 2.13 b). En primer lugar se analizaron las formas intactas de los RIs del plasmidopBR322@AatII crecido en celulas de la estirpe DH5αF’ de E. coli para comprobar la

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Capitulo 5. Resultados 54

acumulacion de moleculas parcialmente replicadas con horquillas de replicacion deteni-das en TerE. En las Figuras 5.1 a y 5.2 a se observa la inmunodeteccion correspondientejunto con un esquema interpretativo. La senal que aparece en el angulo inferior derechocorresponde a moleculas superenrrolladas no replicadas, las CCCs. Estas pueden sufrirroturas tanto durante la corrida de la primera dimension del gel como en el transcursode la primera y la segunda dimension, apareciendo un rastro horizontal y vertical, res-pectivamente. Estos rastros hacen que los CCCs formen un angulo recto con sus formasniqueadas (moleculas con una ’rotura’ de cadena sencilla), las OCs. Tanto las CCCscomo los OCs corresponden a monomeros, es decir, moleculas que no estan replicando.En la inmunodeteccion se observan ademas senales que forman un arco continuo de to-poisomeros y que corresponden a intermediarios de replicacion covalentemente cerrados(CCRIs). El arco se extiende de la parte superior izquierda de la inmunodeteccion hastala zona inferior atravesando la linea horizontal de las OCs. En dicho arco se observaque las formas mas abundantes corresponden a moleculas muy torsionadas (con mayormovilidad electroforetica). La senal del extremo superior izquierdo del arco correspondea la acumulacion de intermediarios de replicacion relajados (AccRIs).En la Figura 5.1 b se presenta la inmunodeteccion y el esquema correspondiente delplasmido digerido con Topo IV. En el centro se observa un grupo de senales que cor-responden a moleculas no replicadas que han perdido movilidad electroforetica debidoa la eliminacion Wr(-). En el extremo superior izquierdo se observa ademas una senalque corresponde a RIs relajados (AccCRIs) y que confirma que la Topo IV relajo com-pletamente las poblaciones de RIs. Este resultado confirma que la Topo IV es capazde eliminar el Wr(-) pero no puede relajar completamente moleculas de DNA con altosniveles de superenrrollamiento negativo. Por otro lado, la Topo IV relaja completa-mente la poblacion de moleculas parcialmente replicadas. En la inmunodeteccion y elesquema correspondiente al tratamiento con DNA Girasa (Figura 5.2 b) se observa quelas moleculas no replicadas negativamente superenrrolladas (CCC) no cambian su movi-lidad electroforetica con respecto al control. En el arco correspondiente a las moleculasparcialmente replicadas se observa un cambio en la movilidad electroforetica y la distri-bucion de las senales con respecto al control, lo cual se corresponderıa con una dismi-nucion de la tension torsional. Este resultado demuestra que la DNA Girasa es capaz derelajar parcialmente intermediarios de replicacion con pre-encadenamiento LH(-) perono cambia la movilidad electroforetica de las moleculas no replicadas con altos nivelesde Wr(-).


Figura 5.1: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con Topo IV.a) Inmunodeteccion obtenida mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosadel plasmido intacto y esquema interpretativo correspondiente. b) Inmunodeteccion ob-tenida mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa del plasmido digeridocon Topo IV y su esquema representativo correspondiente. Las senales correspondien-tes a los intermediarios de replicacion se representan como puntos de color rojo y las

moleculas no replicadas como puntos negros.

Figura 5.2: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con DNAGirasa. a) Inmunodeteccion obtenida mediante electroforesis bidimensional en gelesde agarosa del plasmido intacto con su esquema interpretativo correspondiente. b)Inmunodeteccion obtenida mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosadel plasmido digerido con DNA Girasa y su esquema representativo correspondiente.Las senales correspondientes a los intermediarios de replicacion se muestran en color

rojo y las moleculas no replicadas en negro.


Figura 5.3: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con Topo IVen presencia de cloroquina. Inmunodeteccion y su esquema interpretativo. Los inter-mediarios de replicacion se representan con puntos rojos y las moleculas no replicadas

con puntos negros.

5.1.2 Analisis del plasmido pBR322@AatII digerido con Topo IV yDNA Girasa en presencia de cloroquina

En el experimento anterior pudimos comprobar que tanto la Topo IV como la DNA Gi-rasa son capaces de relajar, aunque en distinta medida, RIs conWr(-) y pre-encadenamientoLH(-). Con el objeto de comprobar el efecto de la introduccion de Wr(+) sobre la activi-dad de las topoisomerasas, decidimos llevar a cabo digestiones en presencia de un agenteintercalante. La cloroquina es una molecula planar de pequeno tamano que se intercalaentre las bases nitrogenadas de la doble helice, provocando un desenrrollamiento de lasmoleculas con Wr(-). Ese desenrrollamiento hace que adquieran un Wr=0. Sin embargo,a partir de ese momento, la incorporacion de cantidades crecientes de cloroquina haceque los plasmidos adquieran Wr(+). En moleculas de DNA parcialmente replicadas yaisladas in vitro, el tratamiento con altas concentraciones de cloroquina induce la for-macion de horquillas en retroceso, es decir, el apareamiento de las cadenas nascientes enla region ya replicada (Figura 2.14).

Luego de la digestion con Topo IV en presencia de cloroquina las muestras se analizaronmediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa y se obtuvo la inmunodeteccionde la Figura 5.3. No se observan diferencias significativas con respecto a la inmunode-teccion del plasmido digerido con Topo IV en ausencia de cloroquina (Figura 5.1 b). Aligual que en la inmunodeteccion de la muestra digerida en ausencia del intercalante, seobserva que una senal que corresponde a RIs relajados (AccRIs) en el extremo supe-rior izquierdo y un grupo de senales correspondientes a moleculas no replicadas que haperdido movilidad electroforetica en el centro de la imagen.


Figura 5.4: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ con DNAGirasa en presencia de cloroquina. Inmunodeteccion y su esquema interpretativo. Losintermediarios de replicacion se representan con puntos rojos y las moleculas no repli-

cadas con puntos negros.

Paralelamente, el plasmido se digirio con DNA Girasa en presencia del agente interca-lante y se analizo mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa, la inmu-nodeteccion y su esquema representativo se muestran en la Figura 5.4. En este casotampoco se observaron diferencias significativas con respecto al plasmido digerido enausencia de cloroquina (Figura 5.2 b). En ambos casos se observa una disminucion dela movilidad electroforetica junto con un cambio en la distribucion de las senales delarco de RIs, lo cual se corresponderıa con una relajacion parcial. Se observa ademasque las moleculas no replicadas (CCCs) no cambian su movilidad electroforetica. Enconjunto, estos resultados no nos permitieron determinar el efecto de la introduccion deWr(+) sobre la digestion con Topo IV o DNA Girasa puesto que la cloroquina no alterala procesividad de las mismas sobre los RIs.

5.1.3 Analisis del plasmido pBR322@AatII digerido con Topo IV yDNA Girasa mediante electroforesis bidimensional en geles deagarosa en presencia de cloroquina

Los geles bidimensionales del apartado anterior no nos permitieron distinguir efecto de laintroduccion de Wr(+) sobre los RIs relajados por la Topo IV y la DNA Girasa. Por ellodecidimos digerir las muestras con las topoisomerasas y luego analizarlas mediante elec-troforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquina. Como control seutilizo el plasmido intacto. En las Figuras 5.5 a y 5.6 a se muestra la inmunodeteccion y elesquema interpretativo correspondiente al control. En esta inmunodeteccion se observaun arco de senales en el extremo inferior derecho que, de acuerdo a la concentracionde cloroquina empleada, corresponderıa a moleculas no replicadas que han adquiridoWr(+). En el extremo superior izquierdo se observa una senal correspondiente a RIsrelajados con horquillas en retroceso. En la Figura 5.5 b se presenta la inmunodeteccion


Figura 5.5: Electroforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloro-quina del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ digerido con Topo IV. a)Inmunodeteccion del plasmido intacto con su esquema interpretativo. b) Inmunode-teccion del plasmido digerido con Topo IV acompanado de su esquema representativocorrespondiente. Las senales correspondientes a los intermediarios de replicacion se

representan en color rojo y las moleculas no replicadas se representan en negro.

correspondiente al plasmido digerido con Topo IV y analizado mediante electroforesisbidimensional en presencia de cloroquina (40µg/mL). En el extremo inferior derechose observa una senal correspondiente a moleculas no replicadas parcialmente relajadaspor la Topo IV que en presencia de altas concetraciones de cloroquina adquieren muchosuperenrrollamiento positivo, y aumentan su movilidad electroforetica. No se detectala poblacion de intermediarios de replicacion, posiblemente debido a ruturas de cadenasencilla en las horquillas de replicacion como consecuencia de la alta concentracion decloroquina empleada. Con las muestras de DNA digeridas con DNA Girasa y anali-zadas mediante un gel bidimensional de agarosa en presencia de cloroquina se obtuvola inmunodeteccion de la Figura 5.6 b. Se observa a todos los RIs concentrados en lazona de los AccRIs, lo cual se corresponde con la formacion horquillas en retroceso. Seobserva ademas un arco de senales formado por moleculas que han adquirido Wr(+)como consecuencia de la presencia de cloroquina durante la electroforesis.

En conjunto, estos resultados demuestran que la presencia de cloroquina durante laelectroforesis induce la formacion de horquillas en retroceso en los RIs previamenterelajados por la DNA Girasa. En el caso de los RIs previamente relajados por Topo IV,la elevada tension en el DNA inducida por el agente intercalante producirıa roturas enlas formas parcialmente replicadas.


Figura 5.6: Electroforesis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloro-quina del plasmido pBR322@AatII de la estirpe DH5αF’ digerido con DNA Girasa. a)Inmunodeteccion del plasmido intacto con su esquema interpretativo correspondiente.b) Inmunodeteccion del plasmido digerido con DNA Girasa acompanado de su esquemarepresentativo correspondiente. Las senales correspondientes a los intermediarios de re-plicacion se representan en color rojo y las moleculas no replicadas se representan en

negro.

5.1.4 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleParE10 digerido con DNA Girasa y Topo IV

Durante la replicacion del DNA en bacterias la Topo IV se encarga de eliminar el pre-encadenamiento generado en la region ya replicada como consecuencia de la difusion delWr(+) generado por el avance de la horquilla de replicacion. En ausencia de Topo IVse produce una acumulacion de pre-encadenados RH(+) que impiden la migracion delWr(-) de la region no replicada a la ya replicada (Figura 2.13 c).Con el objeto de analizar el efecto de la ausencia de la Topo IV sobre la capacidad de laDNA Girasa y la Topo IV para relajar los RIs in vitro, se aislaron plasmidos de la estirpeParE10, mutante termosensible para la Topo IV. Los mismos crecieron inicialmentecrecidas a la temperatura permisiva (30 C) y luego se incubaron a la temperaturarestrictiva (43 C) para inhibir la expresion de la Topo IV. Como control se utilizo elplasmido intacto. Tal como era de esperar en el plasmido intacto, en ausencia de TopoIV se produce una acumulacion de moleculas encadenadas (CatAs, CatBs y CatCs). Seobserva ademas el arco de senales correspondiente a la acumulacion de RIs (Figuras 5.7a y 5.8 a ) con distinto grado de estres torsional.

Tras la digestion del plasmido con Topo IV se obtuvo la inmunodeteccion de la Figura 5.7b. En el extremo superior izquierdo, se puede observar una senal correspondiente a RIsrelajados ası como la desaparicion de las senales correspondientes a las distintas familiasde encadenados. Se observa ademas un grupo de senales en el centro que corresponde


Figura 5.7: Digestion con Topo IV del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10.a) Inmunodeteccion del plasmido intacto y esquema interpretativo correspondiente. b)Inmunodeteccion del plasmido digerido con Topo IV y su esquema representativo cor-respondiente. Las poblaciones de RIs se representan como puntos rojos, las poblacionesde encadenados CatAs, CatBs y CatCs en celeste, lila y verde respectivamente y los

monomeros se representan con puntos negros.

a moleculas no replicadas negativamente superenrrolladas que han perdido movilidadelectroforetica. En conjunto estos resultados confirman la actividad desencadenante dela Topo IV ası como su baja efectividad para resolver superenrrollamiento negativo. Porotra parte se demostro que la Topo IV es tambien capaz de resolver completamente RIscon pre-encadenamiento RH(+).

En las muestras digeridas con DNA Girasa (Figura 5.8 b). Se observa que al igual que enel control, hay una acumulacion de las distintas familias de encadenados. Contrariamentea lo observado con la estirpe DH5αF’, la movilidad y distribucion del arco de senalesde los RIs no cambia con respecto al control (Figura 5.8 a). Por otro lado, tal como seconstato anteriormente, la movilidad de los monomeros con superenrrollamiento negativono se ve afectada por la accion de la DNA Girasa. Este resultado confirma que la DNAGirasa no es capaz de relajar moleculas no replicadas con SC(-) ası como tampocoactua sobre moleculas encadenadas. Al contrario de lo que se observa in vitro en losRIs de la estirpe DH5αF’, la DNA Girasa no relaja los RIs con una acumulacion depre-encadenamientos RH (+) aislados de la cepa mutante para la Topo IV.


Figura 5.8: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con DNAGirasa. a) Inmunodeteccion del plasmido intacto con su esquema interpretativo. b)Inmunodeteccion del plasmido digerido con DNA Girasa y su esquema representativo.Las poblaciones de RIs se preresentan compo puntos de color rojo, ası tambien seobservan las poblaciones de encadenados CatAs, CatBs y CatCs en celeste, lila y verde

respectivamente y los monomeros se representan con puntos negros.

5.1.5 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleparE10 digerido con DNA Girasa y Topo IV en presencia decloroquina

En el experimento anterior se demostro que la Topo IV desencadena moleculas replica-das y relaja intermediarios de replicacion con pre-encadenamientos RH(+). Tambien secomprobo que la DNA Girasa no es capaz de resolver pre-encadenados de RIs proveni-entes de una estirpe mutante para la Topo IV. Con el objeto de comprobar el efecto dela introduccion de Wr(+) en la actividad de estas topoisomerasas sobre los RIs con pre-encadenamientos RH(+) decidimos llevar a cabo digestiones en presencia de cloroquina.

Luego de la digestion con Topo IV en presencia del agente intercalante, las muestrasse analizaron mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa y se obtuvo lainmunodeteccion de la Figura 5.9. No se observan diferencias relevantes en la migracionde los RIs con respecto a la inmudeteccion de la Figura 5.7 b, que se obtuvo de la mismamanera a diferencia de que el plasmido no estaba bajo los efectos del agente intercalantedurante la digestion. En ambas inmunodetecciones las poblaciones de RIs se encuentranconcentradas en la zona superior izquierda. En ambas inmunodetecciones los monomerosestan agrupados en el centro. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en ausencia decloroquina donde se observa monomeros con Wr(-) parcialmente relajados por la TopoIV. En presencia del agente intercalante las formas no replicadas adquieren Wr(+) el


Figura 5.9: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con Topo IVen presencia de cloroquina. Inmunodeteccion y su esquema representativo. Los RIs se

representan en rojo y las moleculas no replicadas en negro.

Figura 5.10: Digestion del plasmido pBR322@AatII de la estirpe ParE10 con DNAGirasa en presencia de cloroquina. Inmunodeteccion y su esquema representativo. Los

RIs se representan en rojo y las moleculas no replicadas en negro.

cual se pierde al correr las muestras en ausencia de cloroquina.

Por otro lado el plasmido se digirio con DNA Girasa en presencia del agente interca-lante, y luego de correr una electroforesis bidimensional, se obtuvo la inmudeteccion quese muestra en Figura 5.10. En este caso tampoco fue posible observar ninguna diferenciasignificativa respecto a la inmunodeteccion obtenida tras tratar al plasmido con la DNAGirasa en ausencia de la cloroquina (Figura 5.8 b), pues todas las poblaciones de RIs,encadenados y monomeros se mantienen sin ningun cambio detectable.Todos estos resultados demuestran que la presencia de cloroquina durante la digestioncon Topo IV o DNA Girasa no altera la procesividad de las mismas sobre los RIs queprovienen de la estirpe de E. coli mutante para la Topo IV.


5.1.6 Analisis del plasmido pBR322@AatII de la cepa termosensibleparE10 digerido con Topo IV y DNA Girasa mediante electro-foresis bidimensional en geles de agarosa en presencia de cloro-quina

Los geles bidimensionales del apartado anterior no nos permitieron distinguir efecto quetiene la introduccion de Wr(+) sobre la relajacion de los RIs de la estirpe ParE10 dige-ridos con Topo IV y DNA Girasa. Por esta razon se decidio digerir las muestras con lastopoisomerasas y luego analizarlas mediante electroforesis bidimensional en geles de aga-rosa en presencia de cloroquina (40 µg/mL). Como control se utilizo el plasmido intactoanalizado mediante electroforesis bidimensional con un gel de agarosa en presencia de unagente intercalante, de esto se obtuvo la inmunodeteccion mostrada en las Figuras 5.11a y 5.12 a. Se puede apreciar las senales de las CCCs formando un arco desde la parteinferior derecha de la figura hasta la region de las OCs. La alta concentracion de cloro-quina provoca el retroceso de las horquillas en los y estos se agrupan en la region de losAccRIs. Las poblaciones de las distintas familias de encadenados aparecen muy difusas.A continuacion el plasmido se digirio con Topo IV y se analizo mediante electroforesisbidimensional en geles de agarosa en presencia de cloroquina. En la inmunodeteccion dela Figura 5.11 b se puede observar una senal en el extremo superior izquierdo, la mismacorresponde a RIs relajados con horquillas en retroceso. Las senales correspondientes aencadenados desaparecen y las moleculas no replicadas estan concentradas en la regionde los CCCs. Las mismas han sido previamente relajados de forma parcial por la TopoIV y luego han adquirido Wr(+) en presencia de cloroquina.

Despues de digerir al plasmido con DNA Girasa y luego de analizarlo mediante electro-foresis bidimensional en geles de agarosa en presencia del agente intercalante, se obtuvola inmunodeteccion de la Figura 5.12 b con su correspondiente esquema interpretativo.Los RIs con horquillas en retroceso se encuentran agrupados en la region de los AccRIs.Las poblaciones de encadenados se muestran difusas, a causa de presencia del agenteintercalante, y las moleculas no replicadas forman un arco en la region inferior.

Estos resultados demuestran que la concentracion de cloroquina utilizada en estos experi-mentos induce la formacion de horquillas en retroceso en los RIs con pre-encadenamientoRH(+) previamente digeridas con las topoisomerasas de tipo II de E. coli.


Figura 5.11: Inmunodeteccion obtenida mediante un electroforesis bidimensional engeles de agarosa en presencia de cloroquina del plasmido pBR322@AatII de la estirpeparE10 digerido con Topo IV. a) Inmunodeteccion de control obtenida del plasmido in-tacto con un esquema interpretativo correspondiente. b) Inmunodeteccion del plasmidodigerido con Topo IV acompanado de su esquema representativo. Las senales correspon-dientes a los intermediarios de replicacion se representan en color rojo y las moleculas

no replicadas se representan en negro.

Figura 5.12: Inmunodeteccion obtenida mediante una electroforesis bidimensionalen un gel de agarosa en presencia de cloroquina del plasmido pBR322@AatII de laestirpe termosencible parE10 digerido con DNA Girasa. a) Inmunodeteccion de con-trol obtenida del plasmido intacto con su esquema interpretativo correspondiente. b)Inmunodeteccion del plasmido digerido con DNA Girasa acompanado de su esquemarepresentativo correspondiente. Las senales correspondientes a los intermediarios de

replicacion se representan en color rojo y las moleculas no replicadas en negro.


5.2 Resultados de la simulacion computacional

Para comprender mejor la naturaleza conformacional de los RIs bajo condiciones deequilibrio termodinamico se realizaron simulaciones computacionales de las regiones noreplicada y ya replicada del plasmido pBR322@AatII con una horquilla de replicaciondetenida al alcanzar el 60% de su replicacion total. Valiendonos de la separacion del RIen dos dominios topologicos interconectados, los RIs se simularon como dos partes, laregion no replicada como una molecula con un determinado valor de ∆Lk y la regionya replicada como dos moleculas encadenadas relajadas (∆Lk = 0) con un determinadonumero de encadenamiento Ca.

5.2.1 Simulacion de la region no replicada del intermediario de repli-cacion

El plasmido no replicado tiene una longitud de 4490 pb por lo tanto a la region noreplicada, con una masa que es 0.4 veces la del plasmido, le corresponderıa una longi-tud de 1780 pb. Se realizaron 100 simulaciones de 100000 movimientos de prueba paratopoisomeros desde ∆Lk = 0 a hasta ∆Lk = −20. Con el fin de validar nuestra im-plementacion de modelo wormlike con el metodo Metropolis MC, nuestros resultadosse compararon con los que encontramos en la literatura. Primeramente se determino lacontribucion del Wr dentro del ∆Lk. En la Figura 5.13 se observa la razon Wr/∆Lken funcion del ∆Lk. Cada valor de Wr/∆Lk es el promedio de los 100 valores medidospara cada topoisomero. El promedio de todos los valores de Wr/∆Lk es 0.7 con unadesviacion estandar de 0.1. La alta dispersion del valor de Wr/∆Lk para los primerostres topoisomeros. Obviando los valores de Wr/∆Lk de estos primeros topoisomeros seobtiene el resultado Wr/∆Lk = 0.75 ± 0.03. Este resultado indica que en el estado deequilibrio termico el ındice de superenrrollamiento (Wr) tiende a un valor que corres-ponde al 75% de la variacion del ındice de ligamiento (∆Lk). El algoritmo utilizado paracalcular el Wr de una curva con N segmentos, la doble integral de lınea de Gauss, tieneun tiempo computacional del orden O(N2) y es mostrado en el anexo A.1.5. Nuestraimplementacion del algoritmo utilizado para calcular el Wr demora 6.2 × 10−3 s parauna curva de 180 segmentos y 24.6× 10−3s para 360 segmentos. Este resultado esta enconcordancia con el tiempo computacional teorico. Nuestra implementacion del algor-timo para crear conformaciones con cierto grado de superenrrollamiento con una curvade 180 segmentos requiere aproximadamente 8.2×10−3s para realizar un movimiento deprueba y calcular su energıa, diametro efectivo y Wr. Esto significa que crear una con-formacion con un determinado valor de ∆Lk requiere el 75% del tiempo computacionaltotal para calcular el Wr.


Figura 5.13: Grafico de la razon Wr/∆Lk con respecto al ∆Lk. Datos de 100simulaciones de 105 movimientos de prueba para topoisomeros desde ∆Lk = 0 a hasta

∆Lk = −20

Continuando con la validacion de nuestra implementacion del modelo wormlike chainpara la simulacion de moleculas superenrrolladas de DNA con el metodo de MetropolisMC se calculo el promedio de los angulos de cruce de para cada topoisomero y seelaboro un grafico de los angulos de cruce promedio de cada topoisomero en funciondel ∆Lk, tal como se muestra en la Figura 5.14. Teniendo en cuenta la alta dispersionde los angulos promedio de los primeros tres topoisomeros y si se tienen en cuenta lossiguientes 17 valores, se obtiene que el valor promedio del angulo de cruce sobre el totalde topoisomeros es de 140± 10 . Debido al elevado numero de movimientos de pruebautilizados en las simulaciones (movimientos de rotacion rıgida), del orden de 105, lacantidad de segmentos seleccionados para la rotacion disminuye conforme transcurrenlos movimientos de prueba, ası tambıen los angulos de rotacion disminuye para aumentarla probabilidad de aceptancion de las conformaciones. La probabilidad de aceptancionpara las corridas completas de todos los topoisomeros simulados se muestra en la Figura5.15, en ella se observa que la aceptacion disminuye conforme aumenta el ındice deligamiento del topoisomero.

La aparicion de nudos a causa de los movimientos de prueba se identifico a partir delcalculo del polinomio de Alexander para cada conformacion y los datos obtenidos seutilizaron para calcular la probabilidad de que aparezcan conformaciones anudadas enfuncion de la variacion del ındice de ligamiento (∆Lk) de los topoisomeros. La relacionentre la probabilidad de anudamiento de las conformaciones y el ∆Lk en la simulacionse presenta en la Figura 5.16. Se observa que para los primeros topoisomeros no apa-recen nudos y que la probabilidad de que estos aparezcan aumenta casi de forma lineal


Figura 5.14: Grafico de angulos de cruce con respecto al ∆Lk. Datos de 100 si-mulaciones de 105 movimientos de prueba para topoisomeros desde ∆Lk = 0 a hasta

∆Lk = −20

Figura 5.15: Probabilidad de aceptacion de los movimientos de prueba en funcional ∆Lk. Datos de 100 simulaciones de 105 movimientos de prueba para topoisomeros

desde ∆Lk = 0 a hasta ∆Lk = −20


Figura 5.16: Probabilidad de aparicion de nudos en funcion del ∆Lk. Datos de 100simulaciones de 105 movimientos de prueba para topoisomeros desde ∆Lk = 0 a hasta

∆Lk = −20

conforme va aumentando el ındice de ligamiento (Lk).Los topoisomeros simulados presentan como conformacion estable la forma plectonemica,tanto simple como ramificada. Esto se puede apreciar para algunos topoisomeros en laFigura 5.17Se simularon tambien conformaciones con ∆Lk = −20 con una funcion de diametroefectivo constante de defectivo = 3 nm para cada par de segmentos en nuestra implemen-tacion del modelo wormlike chain. Algunos ejemplos de las conformaciones obtenidasse pueden apreciar en la Figura 5.18.

5.2.2 Propiedades termodinamicas de la region no replicada

Con el metodo de Metropolis MC se corrieron simulaciones con una cantidad de mo-vimientos de prueba que permitiera obtener una distribucion de topoisomeros en es-tado de equilibrio termodinamico y a continuacion se analizaron sus propiedades termo-dinamicas. Para cada topoisomero simulado se calculo el promedio de energıa potencialelastica (∆E) y se grafico en funcion del ∆Lk. Tal como se puede observar en la Fi-gura 5.19, existe una tendecia cuadratica de la energıa respecto al ∆Lk. Este resultadoconfirma que la energıa de cada topoisomero es mayor conforme aumenta su valor de∆Lk.

Los datos de energıa potencial elastica (∆E) se utilizaron para obtener los valores devariacion de entalpıa (∆H) para cada valor de ∆Lk. La ∆H se calculo tomando el valor


Figura 5.17: Conformaciones plectonemicas no anudadas obtenidas por simulacionpara topoisomeros con ∆Lk de valores -7, -10, -15 y -20. a) Formas plectonemicas

simples. b) Formas plectonemicas ramificadas.


Figura 5.18: Conformaciones obtenidas con diametro efectivo constante de 3 nm para∆Lk = −20.

de energıa del topoisomero con ∆Lk = 0 y sustrayendola de la energıa de los demastopoisomeros (mediante la ecuacion 3.18). Un grafico de los valores de ∆H en funciondel ∆Lk se muestra tambien en la Figura 5.19. Utilizando la ecuacion (3.19) se calculola energıa libre ∆G para cada topoisomero. En la Figura 5.19 se muestra la relacionentre la energıa libre (∆G) y el ∆Lk. En la figura se observa que la varicacion deentalpıa (∆H) y la energıa libre (∆G) toman valores similares para los primeros cuatrotopoisomeros. A partir de este punto los valores de ∆H disminuyen significativamenterespecto a los de ∆G. De acuerdo con la ecuacion (3.13), ∆G = ∆H−T∆S, el hecho deque la variacion de entalpıa (∆H) tenga un valor menor que la energıa libre (∆G) implicaque la variacion de entropıa (∆S) es negativa. Este resultado sugiere un menor grado dedesorden a medida que las moleculas adquieren un mayor grado de superenrrollamiento.

5.2.3 Simulacion de la region ya replicada del intermediario de repli-cacion

El plasmido no replicado tiene una longitud de 4490 pb, por lo tanto a cada moleculanasciente de la region ya replicada, cuya masa es 0.6 veces la del plasmido, le correspondeuna longitud de 2700 pb. Se realizaron 10 simulaciones de 100000 movimientos de pruebapara cada valor de encadenamiento con ∆Lk = 0, desde Ca = 1 a hasta Ca = 20. Paraello, con el objeto de estudiar la relacion entre el ındice de superenrrollameinto inducido


Figura 5.19: Propiedades termodinamicas de la region no replicada y su relacion conel ∆Lk. La energıa potencial elastica ∆E se muestra en lila, la variacion de entalpıa∆H en rojo, y energıa libre ∆G en azul. Datos de 100 simulaciones de 105 movimientos

de prueba para topoisomeros desde ∆Lk = 0 a hasta ∆Lk = −20

por el encadenamiento, se determino el valor de la variacion del Wr con respecto al Ca,tal como se muestra en la Figura 5.20. Cada valor de Wr es el promedio de los 10 valoresmedidos para cada numero de encadenamiento Ca. Se observo una alta correlacion cu-adratica entre Wr y Ca en nuestros resultados, mostrando estos un ındice de correlacionR2 = 0.9996. Estos resultados indıcan que a pesar de la condicion de encadenamientoentre las moleculas con ∆Lk nulo, estas mantienen un ındice de superenrrollamiento Wr

inducido en su estado de equilibrio termodinamico. Una comparacion entre los valoresde Wr vs Ca de nuestros resultados y los obtenidos por Vologodskii et. al. (Vologodskiiet. al. 1993) muestra claramente una gran discrepancia entre ambas simulaciones, talcomo se muestra en la Figura 5.21. Esto podrıa deberse, en parte, a diferencias en lalongitud de los plasmidos simulados en ambos trabajos.El tiempo computacional para la simulacion de encadenados con ∆Lk = 0, representadoscon N segmentos, demando la utilizacion de algoritmos de tiempo polinomial O(N2).Cada movimiento de prueba requirio el calculo del Wr para dos curvas, demorandoesto 6.4× 10−3s, y tambien se requirio el calculo del Lk asociado a las dos curvas paraverificar el numero de encadenamientos entre estas, demorando ası 6.4 × 10−3s. La re-alizacion de un movimiento de prueba se efectuo en 15.2 × 10−3s, por lo que nuestraimplementacion del algoritmo para crear curvas encadenadas relajadas invierte 84% deltiempo computacional total en el calculo del Wr y el Lk.


Figura 5.20: Variacion del writhe Wr con el numero de encadenamiento Ca. Datosde 10 simulaciones de 105 movimientos de prueba para cada valor de encadenamiento

con ∆Lk = 0, desde Ca = 1 a hasta Ca = 20.

Figura 5.21: Comparacion entre el Wr inducido y el numero de encadenamiento Caobtenidos para esta obra (azul y asteriscos) y los resultados de simulacion de Vologodskii

(rojo y signo positivo) (Vologodskii et. al. 1993).


Figura 5.22: Propiedades termodinamicas de la region ya replicada. La curva violetarepresenta la energıa potencial elastica ∆E de una sola molecula naciente y la curvanegra es la energıa potencial elastica total ∆ET otal de la region ya replicada. En azul semuestra la variacion de entalpıa de una sola molecula y en rojo la variacion de entalpıatotal de la region ya replicada. Datos de 10 simulaciones de 105 movimientos de prueba

para cada valor de encadenamiento con ∆Lk = 0, desde Ca = 1 a hasta Ca = 20.

5.2.4 Propiedades termodinamicas de la region ya replicada

Se calculo el promedio de energıa potencial elastica (∆E) para cada encadenado y segrafico en funcion del Ca, como se puede observar en la Figura 5.22. La correlacioncuadratica entre ∆E y Ca tiene un ındice de correlacion de R2 = 0.9881, que es menorque el ındice de correlacion R2 = 0.9996 existente entre el Wr inducido y Ca (figura5.20). La energıa total de la region ya replicada debe ser el doble de la energıa de unasola de las moleculas y la obtuvimos, precisamente, tomando el doble valor de los valoresde energıa de una sola curva (Figura 5.22). En este grafico tambien se pueden constatarlos bajos valores de energıa de los primeros encadenados. En la misma figura tambiense muestra la variacion de entalpıa, tanto para una molecula solo como para las dosencadenadas (la variacion de entalpıa total de la region ya replicada).

5.2.5 Comparacion de la variacion de entalpıa entre las regiones noreplicada y ya replicada

Con el fin de comprobar la existencia algun balance energetico entre las regiones ya repli-cada y no replicada, sus respectivos valores de variacion de entalpıa (∆H) se graficaronjuntos. Basandonos en la relacion Wr/∆Lk = 0.75 ± 0.03 obtenida a partir los datos


Figura 5.23: Variaciones de entalpıa de ambas regiones del RI. La ∆H de la region noreplicada (en rojo) se grafica respecto al Wr y la ∆H de la region ya replicada (negro)

con respecto al Ca.

para la regıon no replicada de la Figura 5.13 se muestran en funcion al Wr en lugar del∆Lk. En la representacion grafica se utilizo el mismo eje de abscisas para el Wr y elCa asumiendo que una variacion de una unidad en el Wr (una vuelta completa de ladoble helice respecto a su eje en la regıon no replicada) equivale a un cambio en unaunidad del Ca (un encadenamiento en la region ya replicada)[? ]. La determinacion delas variaciones de entalpıa (∆H) en funcion del Wr para la regıon no replicada y enfuncion del Ca para la region ya replicada se presenta en la Figura 5.23, donde podemosapreciar que ambas variaciones de entalpıa son similares (condicion para el equilibriotermodinamico) y de eso se deduce que el numero de cruces (Wr) de la region no repli-cada es muy cercano al numero de encadenamiento Ca de la region ya replicada

Paralelamente, se compararon entre sı las variaciones de entalpıa de las regiones no repli-cada y ya replicada. En la Figura 5.24 se puede constatar que hay equilibrio energeticocuando el numero de cruces en la region no replicada es muy similar al numero de pre-encadenamientos en la regıon ya replicada. Un ajuste lineal entre la energıa almacenadaen la region ya replicada y la almacenada en la region no replicada muestra que entreellas existe un ındice de correlacion R2 = 0.9893. El ajuste se muestra en la Figura5.23. Estos resultados sugieren que, bajo la condicion de equilibrio termodinamico entreambas regiones de un RI, el ındice de superenrrollamiento en la region no replicada esnumericamente muy cercano al numero de pre-encadenamientos en la region ya repli-cada.


Figura 5.24: Comparacion de las variaciones de entalpıa de las regiones no replicaday ya replicada de un RI. Ajuste lineal que muestra la correlacion existente entre las

entalpıas en simulacion computacional.

Capıtulo 6

Discusion

En la presente obra nos propusimos comprender el papel que juega cada topoisomerasaen la regulacion de la topologıa del DNA a lo largo del proceso replicativo. Durante lareplicacion del DNA las helicasas generan superenrrollamiento positivo por delante dela horquilla replicativa. El exceso de Wr(+) que se genera por el avance del replisomapodrıa migrar de la region no replicada a la ya replicada, dando lugar a la formacionde pre-encadenados, que al terminar la replicacion, se convertirıan automaticamente enencadenamiento de las dos cromatidas resultantes. La comprension de esta interaccionentre superenrrollamiento y pre-encadenamiento es una cuestion clave para resolver laParadoja de la Topo IV. Nuestros estudios experimentales utilizando plasmidos bacte-rianos como modelo junto con electroforesis bidimensional han puesto de manifiesto losdistintos roles desempenados por las topoisomerasas de tipo II de E. coli en la regulacionin vitro del superenrrollamiento y pre-encadenamiento en intermediarios de replicacioncon una horquilla de replicacion detenida. Paralelamente, hemos realizado simulacionescomputacionales con el metodo de Metropolis Monte Carlo para estudiar la dinamica delos cambios topologicos durante la replicacion del DNA. Los resultados obtenidos nospermitieron determinar la energıa potencial de las regiones no replicada y ya replicaday predecir el estado topologico de un RI en condiciones de equilibrio temodinamico

6.1 Rol de la Topo IV en la regulacion del superenrrolla-miento y el pre-encadenamiento de los intermediariosde replicacion

El analisis de la digestion de los RIs con Topo IV nos permitio comprobar que esta relajacompletamente los RIs con pre-encadenados LH(-). Por otra parte, nuestros resultados

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Capitulo 6. Discusion 77

confirman que la Topo IV relaja fundamentalmente el superenrrollamiento positivo delas formas no replicadas pero tambien relaja, aunque con menor eficacia, el superenr-rollamiento negativo. Se ha demostrado que la Topo IV relaja el superenrrollamientopositivo hasta 20 veces mas rapido que el negativo [64]. Ensayos in vitro sugieren quela Topo IV reconoce la quiralidad de los cruces LH(+) y que esta relajacion asimetricadel superenrrollamiento resulta principalmente de diferencias en la procesividad de laenzima [95] [96]. Se ha observado que la capacidad de la Topo IV para discriminar entreel superenrrollamiento positivo y negativo depende del dominio C-terminal (CTD) dela subunidad ParC de la enzima [97]. En un estudio reciente, Vos et. al. presentaronresultados de una diseccion sistematica de residuos claves del dominio CTD, donde sedemuestra que cada una de las cinco regiones de dicho dominio contribuyen diferenci-almente a la discriminacion del sustrato por la Topo IV [97]. Uno de los hallazgos massignificativos es que la region cinco (blade 5) inhibe especıficamente la relajacion delsuperenrrollamiento negativo. Paralelamente, se ha demostrado que MukB, una con-densina bacteriana, interacciona fısicamente con la region cinco del dominio CTD de laTopo IV estimulando la relajacion del DNA con superenrrollamiento negativo [98] [99][100]. Se ha sugerido que mediante la estabilizacion del superenrrollamiento negativo,MukB facilitarıa la formacion de nudos por la Topo IV y que, de esta manera la inte-raccıon de MukB-Topo IV podrıa jugar un rol en la organizacion de los cromosomas.El hecho de que la Topo IV halla podido relajar totalmente los RIs aislados in vitro

indica que esta enzima puede haber actuado sobre la region ya replicada, resolviendolos pre-encadenamientos LH(-), una accion que no es propia de la Topo IV pues estu-dios previos demuestran que esta enzima se especializa en cruces LH(+). Por otro lado,hemos constatado que la Topo IV tambien relaja las formas parcialmente replicadascon cruces RH(-) en la region no replicada y cruces RH(+) en la region ya replicadadel plasmido pBR322@AatII obtenido de bacterias en las que se inhibio la accion dela Topo IV. Los plasmidos obtenidos de la estirpe parE10, deficiente en Topo IV, pre-sentan ademas una acumulacion de moleculas encadenadas que tienen cruces RH(+).La digestion con Topo IV resuelve completamente estos encadenamientos, tal como sehabıa observado previamente [3]. Cabe destacar que ninguno de estos tipos de crucees el sustrato preferido por esta enzima. Por otro lado, cabe la posibilidad de que laTopo IV tambien relaje cruces en la region no replicada de los RIs. Esto provocarıa undesbalance energetico entre las regiones no replicada y ya replicada del RI, causando lamigracion del pre-encadenamiento de la region ya replicada a la region no replicada, locual resultarıa en la relajacion del intermediario de replicacion.

Un estudio previo de Stone et. al. propone que la Topo IV actua de acuerdo al arreglogeometrico de cada yuxtaposicion de dos segmentos de DNA. Sus resultados demuestran


que la Topo IV relaja preferentemente los cruces LH(+) (Stone et. al. 1994). Los pre-encadenados con cruces LH(-), generados despues de la desproteinizacion de los RIs,podrıan ser reconocidos y eliminados por la Topo IV. Pero, como podrıa la Topo IVresolver los pre-encadenados y los encadenados con cruces RH(+) producidos tanto invivo como en ausencia de Topo IV? (fig 2.13). Esto es lo que se conoce como la paradojade la Topo IV. Se han propuesto varios modelos teoricos para resolver esta cuestion peroninguno se ha confirmado experimentalmente in vivo. Una propuesta para explicar comodesencadena los pre-encadenamientos y los encadenamientos RH(+) es que en moleculascon elevados niveles de encadenados RH(+) se produce un estres torsional que pliega elencadenado sobre sı mismo causando la aparicion de una superhelice con cruces LH quefavorece la accion de la Topo IV [97] [? ]. Cuando la enzima ya relajo la molecula losuficiente, es decir, ya no se produce una superhelice con cruces LH, la elasticidad dela misma favorecerıa la aparicion de una conformacion geometrica que facilita la accionde la enzima. De esta manera, la Topo IV terminarıa de desencadenar las moleculashermanas a pesar de que no serıan inicialmente el sustrato ideal para la enzima. Otrapropuesta consiste en que dos moleculas encadenadas se encuentran y se yuxtaponen detal manera que la Topo IV encuentra en esa yuxtaposicion un sustrato favorable parasu accıon (figura 6.1) [? ] .

La cloroquina es un agente intercalante del DNA que induce Wr(+) a elevadas con-centraciones. A la concentracion de cloroquina empleada en el presente trabajo, losplasmidos, que estan negativamente superenrrollados, primero pierden su Wr(-) y luegoadquieren Wr(+). Esto es lo que ocurrio con las formas monomericas no replicadas.Pero las formas parcialmente replicadas no pueden adquirir Wr(+) porque este da lugaral retroceso de las horquillas de replicacion [3][56][86]. El resultado del analisis de ladigestion con Topo IV del plasmido de la estirpe DH5αF’ en presencia de cloroquina nonos permitio distinguir el efecto de la introduccion de Wr(+) en la procesividad de laTopo IV. En presencia de 40 µg/mL de cloroquina la Topo IV tendrıa como sustratoplasmidos ya relajados con horquillas en retroceso, siendo innecesaria la accion de estatopoisomerasa. Luego de correr la muestra en una electroforesis bidimensional en gelesde agarosa en ausencia cloroquina se constato que la Topo IV relajo los RIs, obteni-endose resultados similares a los de las muestras digeridas en ausencia de cloroquina.Exactamente el mismo fenomeno se observo en el analisis de la digestion con Topo IVde plasmidos provenientes de la estirpe termosensible parE10. En el analisis de la di-gestion con Topo IV de plasmidos provenientes de la estirpe DH5αF’ en geles de agarosaen presencia del agente intercalante. No se detectaron RIs debido presumiblemente aque la alta concentracion del agente intercalante genero roturas de cadena sencilla en lashorquillas de replicacion de los RIs previamente relajados con la Topo IV, reduciendo asıla cantidad de estas moleculas al punto no poder detectarlas tras la electroforesis. Los


Figura 6.1: Cuando dos distintos encadenados con cruces RH (+) se yuxtaponenentre ellos pueden aparecer cruces LH (+).

plasmidos obtenidos de la estirpe termosensible parE10, deficiente en Topo IV, tambiense digirieron con Topo IV y se analizaron mediante electroforesis bidimensional en gelesde agarosa en presencia de 40 µg/mL de cloroquina. En este caso sı se observaron laspoblaciones de RIs agrupadas en la region de las AccRIs y que corresponden a formasparcialmente replicadas con horquillas en retroceso.

6.2 Rol de la DNA Girasa en la regulacion del superenr-rollamiento y el pre-encadenamiento de los intermedi-arios de replicacion

La DNA Girasa es la unica topoisomerasa capaz de introducir Wr(-), los resultadosobtenidos mediante el analisis por electroforesis bidimensional en geles de agarosa delplasmido pBR322@AatII digerido con DNA Girasa confirman esta caracterıstica es-pecıfica de la enzima. Tambien confirmamos la incapacidad de esta topoisomerasa paraintroducir Wr(-) en los OCs, esto se debe a que las OCs presentan roturas de cadenasencilla que imposibilitan la acumulacion de estres torsional. Siendo que la DNA Girasaes la enzima especializada en introducir Wr(-) en los plasmidos procariotas, es de esperarque aumente el superenrrollamiento negativo en las moleculas no replicadas. Cabrıa es-perar que la DNA Girasa tambien introduzca Wr(-) en la region no replicada de los RIs,tal como lo hace durante la replicacion [? ]. La introduccion de Wr(-) en esta region de-berıa provocar un aumento en la tension elastica produciendo un desequilibrio energeticoentre ambas regiones del RI lo que favorecerıa la difusion de tension hacia la region yareplicada, provocando ası un aumento del numero de pre-encadenamientos. Por lo tanto,


se esperaba que el efecto final de la digestion con DNA Girasa fuera un incremento en elnumero total de cruces de todos los topoisomeros de los RIs, causando ası un aumentoen su movilidad electroforetica. Contrariamente a lo esperado, nuestros resultados conla estirpe DH5αF’ sugieren que la digestion con DNA Girasa relaja parcialmente los RIs.Existen antecedentes que sugieren que la DNA Girasa podrıa desencadenar cromatidashermanas [69](Hiasa et. al. 1994; Espeli et. al., 1996; Zecheidrick et. al., 1995). Porotro lado se ha demostrado que la DNA Girasa es capaz de sustituir parcialmente a laTopo IV en las estirpes termosensibles parC o parE (Kato et. al., 1992). En ausencia deTopo IV se producirıa una alta acumulacion de cruces RH(-) en la region no replicaday cruces RH(+) en la region ya replicada (figura 2.13 ) y como consecuencia la tensiontorsional no puede distribuirse in vitro como en el caso de los RIs de la estirpe DH5αF’con LH(-) en la region ya replicada. Nuestros resultados en la estirpe parE10 demos-traron que a la temperatura restrictiva (ausencia de Topo IV) la DNA Girasa no relajalas formas parcialmente replicadas con cruces RH(-) en la region no replicada y crucesRH(+) en la region ya replicada, en contraste con lo observado en los RIs de la estirpeDH5αF’. De igual manera, no se observo ningun efecto sobre las moleculas encadenadas(CatAs, CatBs y CatCs) con cruces de tipo RH(+).

En conjunto nuestros resultados demuestran que la DNA Girasa introduce Wr(-) enlas formas no replicadas y elimina, aunque con muy poca eficiencia, los pre-encadenadosLH(-). En ausencia de Topo IV la DNA Girasa es incapaz de resolver los pre-encadenadosy los encadenados con una alta acumulacion de cruces RH(+). Esto se debe a que laacumulacion de pre-encadenamientos con cruces RH(+) en la region ya replicada impidela redistribucion de la tension a diferencia de lo que ocurre con la estirpe DH5αF’ invitro [? ]. Utilizando un sistema de pinzas magneticas, Nollman y col, demostraronque en condiciones de elevada tension la DNA Girasa relaja los cruces LH pero no loscruces RH (Nollman et. al., 2007). De manera consistente con esta observacion, nuestrosresultados en la estirpe DH5αF’ confirman que la DNA Girasa relaja parcialmente losRIs con cruces LH, actuando principalmente sobre aquellos que estan muy torsionados,pero es incapaz de eliminar los cruces RH que se acumulan en ausencia de Topo IV.

En conjunto nuestros resultados sugieren que la DNA Girasa podrıa eliminar el pre-encadenamiento LH(-) in vitro en RIs aislados de la estirpe DH5αF’. En RIs de estaestirpe, cabe la posibilidad de que la DNA Girasa pudiera introducir cruces RH en laregion ya replicada, compitiendo con los cruces LH que ya se encuentran ahı y en conse-cuencia disminuyendo el numero de pre-encadenamientos de esta region, provocando alfinal una disminucion en la movilidad electroforetica de los topoisomeros. Esto no ocur-rirıa para los plasmidos de la estirpe parE10, ya que la regıon ya replicada tiene crucesRH (+) y la Girasa ya no serıa capaz de introducir muchos mas, y como se menciono


anteriormente, los cruces RH (-) de la regıon no replicada ya no pueden migrar hacia laregion ya replicada.

El resultado del analisis de la digestion con DNA Girasa del plasmido de la estirpe es-tirpe DH5αF’ en presencia de cloroquina no nos permitio distinguir ningun efecto delagente intercalante sobre la procesividad de esta enzima. En presencia de 40 µg/mL

de cloroquina se producen formas parcialmente replicadas con horquillas en retrocesolas cuales son incapaces de acumular estres torsional en forma de superenrrollamientoen la region no replicada y pre-encadenamiento en la region ya replicada. Por lo tantoesperabamos que, en presencia del agente intercalante, el tratamiento in vitro con DNAGirasa no tuviera efecto sobre los RIs. Nuestros resultados confirman que cuando seelimina la cloroquina, las formas no replicadas y los RIs tienden a recuperar su formaoriginal. Tras correr la muestra en una electroforesis bidimensional en geles de agarosaen ausencia de cloroquina tanto las formas no replicadas como las parcialmente repli-cadas tienden a recuperar su forma original, es decir, adquieren superenrrollamientonegativo. En el caso de la digestion con DNA Girasa de los plasmidos provenientes de laestirpe parE10 tambien se observo el mismo efecto del agente intercalante. La diferenciase observo cuando las muestras se analizaron mediante electroforesis bidimensional enpresencia de cloroquina. En este caso la DNA Girasa podıa actuar directamente sobrelos plasmidos pero la presencia de cloroquina durante la electroforesis induce la aparicionde RIs con horquillas en retroceso y la consecuente acumulacion de estos en la regionde las AccRIs. Tambien en el caso de los plasmidos provenientes de la estirpe parE10se observaron RIs agrupados en la region de las AccRIs. En cuanto a las formas noreplicadas, se comprobo que en ausencia del agente intercalante, las muestras digeridascon DNA Girasa no ganaban movilidad electroforetica. Esto podrıa deberse a que laDNA Girasa introduce Wr(-) en los monomeros.

Los resultados de los experimentos con cloroquina no nos permitieron comprobar el efectode la introduccion de Wr(+) sobre la actividad de las topoisomerasas. En el futuro nosplateamos utilizar la DNA Girasa reversa para introducir Wr(+) de forma estable enlos RIs y ası poder analizar su influencia sobre la actividad de las topoisomerasas detipo IIA.

Los resultados obtenidos mediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa de-muestran que la DNA Girasa y la Topo IV reconocen la geometrıa (quiralidad y signotopologico) de los cruces entre las moleculas de DNA. Esta geometrıa difiere entre lasregiones no replicada y ya replicada de los RIs in vitro e in vivo ası como en estirpesdeficientes para la Topo IV.


6.3 Simulacion computacional de las regiones no replicaday ya replicada de un intermediario de replicacion

En esta obra implementamos el modelo wormlike chain que consiste en representar unamolecula de DNA mediante una sucesion de segmentos rıgidos unidos entre sı. Se hademostrado que esta simplificacion es aceptable mientras existan suficientes segmentospor longitud de persistencia (a) (Vologodskii and Kamenetskii, 1974; Le Bret, 1980;Kamenetskii 1985; Vologodskii 1992). La implementacion del modelo wormlike chainmediante el metodo Metropolis Monte Carlo consiste en efectuar movimientos de pruebaque conserven la longitud de los segmentos. En esta obra se utilizaron movimentos derotacion rıgida para efectuar perturbaciones en las conformaciones, estos movimientosconservan de manera perfecta la longitud de los segmentos. Las conformaciones iniciales,creadas utilizando el modelo wormlike chain, fueron corridas con el metodo MetropolisMC. Los intermediarios de replicacion se representan como dos dominios topologicosseparados, la region no replicada y la region ya replicada.

Una vez desarrollado el modelo computacional de las regiones no replicada y ya replicadade un RI se procedio a la comparacion de nuestros resultados de la simulacion con losencontrados en la literatura. Entre los parametros analizados en la region no replicadase encuentran el ındice de superenrrollamiento (Wr) promedio para un conjunto detopoisomeros, los angulos de yuxtaposicion entre dos segmentos y la probabilidad deformacion de nudos. Los trabajos de simulacion de Vologodskii [90] [101] han sidoconsiderados como patron para la validacion de nuestros resultados en la simulacioncomputacional del superenrrollamiento en la region no replicada y encadenamiento en laregion ya replicada. Nuestros resultados confirman que bajo las condiciones de equibriotermodinamico, en las moleculas superenrrolladas con un determinado valor de ∆Lkel ındice de superenrrollamiento alcanza el valor Wr = (0.75 ± 0.03)∆Lk, lo cual escongruente con los resultados obtenidos por Vologodskii et. al., donde se comprobo queel ındice de superenrrollamiento Wr mantiene una relacion constante con la variaciondel ındice de ligamiento (∆Lk), alcanzando el Wr el 75% del valor del ∆Lk, por loque la variacion del ındice de torsion ∆Tw alcanza solo el 25% del valor del ∆Lk [90].Los resultados de Vologodskii de medicion de el aporte del Wr en el ∆Lk utilizando elmodelo wormlike chain para un determinado topoisomero para distintos numeros desegmentos [90]. Nuestras mediciones se tuvo en cuenta el aporte del Wr en el ∆Lk paraun numero fijo de segmentos y distintos topoisomeros.

En nuestras simulaciones se encontro que los angulos de yuxtaposicion tienen una mediaen torno a los 140o, lo que discrepa con los resultados de estudios previos, en los cualesse determino que los angulos que forman los segmentos de DNA en las yuxtaposiciones


tienen una media cercana a 120o [95][97]. Pensamos que esta discrepancia podrıa de-berse a la verificacion del diametro efectivo de las conformaciones durante la simulacion(ecuacion 3.9). Para verificar si esta era la causa se realizaron simulaciones utilizandouna funcion de diametro efectivo constante, defectivo(D) = A. Sin importar el valor dela diferencia D que hay entre los ındices de cada segmento entre los que se calculo ladistancia. Las conformaciones obtenidas de esta forma no presentan diferencias signi-ficativas con respecto a las obtenidas usando el diametro efectivo con la ecuacion 3.9.Sin embargo, eventualmente, se observo la aparicion de conformaciones con extremosangulosos.

Los movimientos de prueba utilizados en las simulaciones fueron los de rotacion rıgida(ecuacion 4.2). Estos movimientos permiten que dos segmentos del modelo wormlike

chain se atraviesen entre sı provocando la aparicion eventual de nudos. Utilizamos elpolinomio de Alexander para verificar la presencia de nudos en las conformaciones si-muladas, pues en este estudio solo interesan las conformaciones que carecen de nudos.Nuestros resultados demuestran que la probabilidad de que se produzca una confor-macion anudada aumenta a medida que se incrementa el ∆Lk. Esto podrıa deberse aque un mayor retorcimiento de los segmentos facilitarıa la formacion de nudos y esteresultado esta de acuerdo a resultados de investigaciones previas [88]. Este hecho soloocurrirıa en las simulaciones, ya que estudios realizados por Olavarrieta et. al. indicanque la aparicion de nudos in vivo disminuye conforme va aumentando el numero depre-encadenamientos en los intermediarios de replicacion [63]. Se ha sugerido que unmenor numero de pre-encadenamientos facilitarıa el acercamiento entre dos segmentosdistantes de DNA de manera que estos puedan yuxtaponerse con la intervencion de laTopo IV, este serıa el mecanismo mediante el cual se forman nudos in vivo [? ].

Nuestra implementacion del algoritmo para calcular la integral de Gauss para el Wr

efectivamente corre en tiempo O(n2). El tiempo que la funcion que calcula el superenr-rollamiento se demora en crear una conformacion se debe principalmente al tiempo queesta se demora en calcular el Wr y por esto es importante como trabajo futuro mejorarel tiempo computacional del algoritmo que calcula el ındice de superenrrollamiento Wr.La verificacion del estado topologico de conformaciones encadenadas se puede realizarfacilmente mediante el calculo del Lk de las curvas. Sin embargo, ese algoritmo contiempo computacional O(n2) requiere mas tiempo de ejecucion que el que calcula el Wr,que debe recorrer dos curvas distintas para resolver la integral doble de Gauss, y porello en futuros trabajos se buscara mejorar el tiempo computacional del algoritmo paraencontrar numericamente el Lk y tambien se implementarıan metodos diferentes paraverificar el estado topologico de curvas encadenadas.


Figura 6.2: Simulacion computacional de un RI mediante el metodo Metropolis MonteCarlo. La regıon no replicada se halla unida fısicamente a la region ya replicada.

La implementacion del algoritmo que crea conformaciones con superenrrollamiento uti-liza el algoritmo para calcular el Wr solo una vez para cada movimiento de pruebamientras que la implementacion del algoritmo que crea conformaciones encadenadas re-lajadas debe realizar, por cada movimiento de prueba, dos veces el calculo del Wr, unavez por cada cada curva encadenada, y tambien debe utilizar el algoritmo que calculael Lk para verificar el estado topologico de las curvas. Por esto, el algoritmo que creaencadenados relajados se demora mas del doble de tiempo computacional que el que creaconformaciones superenrolladas.

El analisis de la simulacion de la region ya replicada mostro una correlacion cuadraticaentre el Wr inducido por el encadenamiento y el numero de encadenamientos Ca. Esteresultado discrepa notoriamente con el resultado obtenido por Vologodskii et. al [101].En dicho estudio se encontro que entre moleculas con numeros de encadenamiento de 3,4y 7 existe una correlacion lineal entre el Wr y el Ca. La diferencia fundamental entrelas simulaciones en ambos trabajos radica en la longitud de los plasmidos simuladospara el encadenamiento. Los plasmidos simulados por Vologodskii et. al. tienen unalongitud ≈ 1.3 veces mayor que los plasmidos simulados para esta tesis, por lo queserıa importante como trabajo futuro realizar simulaciones con plasmidos de la mismalongitud que los simulados por Vologodskii et. al.

Como los RIs simulados en esta obra se representaron en dos partes separadas e inde-pendientes, la region no replicada y la ya replicada, en un trabajo futuro se modelarıaa un RI como una sola molecula la cual contarıa con dos regiones con propiedades to-pologicas diferentes, pero con una horquilla de replicacion que permitirıa el intercambiodirecto de energıa entre ambas regiones de la molecula. En la figura 6.2 se muestrala estructura por simulacion computacional de un RI, ajustado a las caracteristicas delplasmido pBR322@AatII, cuya implementacion aun no ha sido terminada satisfactoria-mente durante la realizacion de esta obra.


6.4 Coordinacion del superenrrollamiento y el pre-encadenamientoen condiciones de equilibrio termodinamico

Basandonos en que un RI in vitro esta compuesto por dos dominios topologicos in-terrelacionados, correspondientes a sus regiones no replicada y ya replicada, estas sesimularon por separado y se analizo la naturaleza topologica de ambas en condicionesde equilibrio termodinamico. La variacion de entalpıa (∆H) es la diferencia de energıapotencial elastica entre el plasmido relajado y el que tiene un determinado ındice desuperenrrollamiento [90]. Del estudio del equilibrio termodinamico en la region no repli-cada (considerada como una molecula que solo tiene superenrrollamiento) se encontroque la energıa potencial elastica de un plasmido aumenta conforme aumenta su estrestorsional, es decir, que un mayor ındice de superenrrollamiento produce un mayor al-macenamiento de energıa potencial dentro de la molecula. En la figura 5.18 se puedeobservar que la energıa libre (∆G) que deberıa introducir una topoisomerasa para cam-biar el ∆Lk se hace mayor que la variacion de entalpıa conforme aumenta el ındicede ligamiento del topoisomero. Esto se puede interpretar como que las moleculas masrelajadas se encuentran en un estado termodinamico mas aleatorio, con un espacio deconformaciones posibles mucho mas amplio, y por ende presentan un mayor grado dedesorden. Las moleculas con mayor ındice de ligamiento cuentan con menos estadosaccesibles por lo cual presentan un menor grado de desorden. Estos resultados coincidencon los observados previamente por el grupo de Vologodskii [90].Nuestros resultados de simulacion indican que si la variacion de entalpıa (∆H) en laregion no replicada es la misma que la de la region ya replicada entonces, el Wr enla region no replicada tiene un valor muy similar al numero de pre-encadenamientosde la region ya replicada. De este resultado podemos deducir que en equilibrio termo-dinamico la eliminacion de un cruce en la regıon no replicada tendrıa como consecuenciala reduccion de un de pre-encadenamiento en la ya replicada, y viceversa.

A la variacion de entalpıa ∆H en la region ya replicada le corresponde una tendenciacuadratica respecto al numero de pre-encadenamientos de la region ya replicada. Estees un resultado esperable teniendo en cuenta a la naturaleza cuadratica de la funcionde energıa potencial elastica utilizada para esta region del RI (ecuacion 4.3), y ademasya tenıamos el antecedente de que un aumento en el Ca induce un aumento equivalenteen el Wr. Por lo tanto, el resultado obtenido es congruente con nuestras observacionesprevias y con las de Vologodskii et. al. [101].

La comparacion entre la entalpıa introducida en ambas regiones, respecto al ındice desuperenrrollamiento Wr de la region no replicada y al numero de encadenamientos Ca(pre-encadenamientos en este contexto) de la region ya replicada puso de manifiesto una


alta similitud entre ambas regiones. Por otro lado en la comparacion entre las dos vari-aciones de entalpıa (∆H) el ajuste lineal de la correlacion entre ambas energıas presentauna pendiente con valor 1.1053, lo cual corresponde a una buena correspondencia 1 a 1de las energıas. Estos resultados dan la pauta de que existe equilibrio termodinamicobajo la condicion de que el numero de vueltas o cruces en la region no replicada debeser similar al numero de pre-encadenamientos en la region ya replicada. Cada cambiode una unidad en el Wr requiere un cambio en un cruce en la region no replicada y cadacambio en el Ca de la region ya replicada implica un cambio en dos cruces.

Los resultados de los experimentos con RIs purificados junto con las simulaciones com-putacionales confirman y aportan nuevas evidencias que apoyan la existencia de unacoordinacion entre superenrrollamiento y pre-encadenamiento. Sabemos que, hacia elfinal de la replicacion no existe espacio suficiente delante de la horquilla para que actuenlas topoisomerasas. El avance de la horquilla incrementarıa la densidad de Wr(+) amedıda que diminuye la longitud de la region no replicada. Por lo tanto, es de esperarque las topoisomerasas actuen por detras de la horquilla (en la region ya replicada)eliminando pre-encadenados para facilitar la terminacion del proceso replicativo. Porotro lado, se ha demostrado tanto en la presente obra como en otros estudios que lainhibicion de las topoisomerasas de tipo II provoca la acumulacion de moleculas enca-denadas inhibiendo ası la segregacion coromosomica. Tambien se ha comprobado que laprocesividad de las helicasas generando Wr(+) por delante de la horquilla replicativaera significativamente mayor que la de cualquier topoisomerasa eliminandolo [68]. Porlo tanto, es bastante improbable que estas enzimas permitan mantener una velocidadde elongacion constante eliminando solo Wr(+) en la region no replicada. Nuestrosresultados apoyan la hipotesis de la existencia de un mecanismo que permite difundirel ∆Lk de la region no replicada a la ya replicada. Si bien la presencia del replisomaen la frontera entre las regiones no replicada y ya replicada del RI limitarıa la difusiondel ∆Lk. Se ha sugerido que podrıa funcionar como una barrera selectiva permitiendosolo la difusion del Wr(+), el cual se transforma en pre-encadenados RH(+), que serıaneliminados por la accion de la Topo IV.

Capıtulo 7

Conclusion

En esta obra se utilizo un abordaje multidiciplinario con tecnicas de biologıa molecu-lar y simulaciones computacionales para entender mejor la funcion de las enzimas quecontrolan la topologıa del DNA durante la replicacion de un plasmido bacteriano quetiene sus horquillas replicativas detenidas tras haber replicado el 60% de la molecula. ElDNA aislado se trato in vitro con topoisomerasa IV y DNA girasa y su efecto se analizomediante electroforesis bidimensional en geles de agarosa. Simulaciones computaciona-les basadas en el metodo de Metropolis Monte Carlo fueron realizadas para predecir laestabilidad termodinamica de estas moleculas.De acuerdo con los resultados experimentales y de simulacion computacional obtenidosnuestras conclusiones son las siguientes:

1- La Topo IV relaja completamente los RIs aislados de la estirpe DH5αF’, los cualesposeen cruces RH(-) en la region no replicada y LH(-) en la ya replicada.

2- La DNA Girasa relaja parcialmente a los RIs aislados de la estirpe DH5αF’, los cualesposeen cruces RH(-) en la region no replicada y LH(-) en la ya replicada.

3- La inhibicion in vivo de la Topo IV provoca una acumulacion de RIs con crucesRH(-) en la region no replicada y RH(+) en la ya replicada, los cuales son completamenterelajados por la Topo IV pero no por la DNA Girasa.

4- La simulacion computacional por el metodo de Metropolis Monte Carlo de la region noreplicada demuestra que la misma adquiere la conformacion plectonemica en su estadode equilibrio termodinamico. Se confirmo ademas que el Wr contribuye en un 75% alvalor final del ∆Lk.

5- La simulacion computacional por el metodo de Metropolis Monte Carlo de la regionya replicada demuestra que aun en estado relajado (∆Lk = 0) las cadenas nacientesadquieren un ındice de superenrrollamiento Wr inducido debido al encadenamiento.

87

Capitulo 7. Conclusion 88

6- La simulacion computacional de un RI, representando sus regiones no replicada y yareplicada por separado, confirma que bajo la condicion de equilibrio termodinamico, elındice de superenrrollamiento Wr y el numero de pre-encadenamiento se mantienen convalores numericos similares en todo momento.

ANEXO A

Anexo

A.1 Algoritmos de base

A.1.1 Un circulo cerrado

Un polıgono regular con N segmentos es creado para utilizarlo como conformacion inicialen el modelo wormlike chain que luego sera modificado con perturbaciones mediante elmetodo de Metropolis Monte Carlo.

Algorithm 1 PoligonoInicialRequire: N numero de vertices o segmentos del poligonoEnsure: Vectores de coordenadas x, y, z de cada vertice del poligono regular de radio

R.t Vector de N valores equiespaciados entre 0 y 2πfor i = 1 hasta N dox(i) = Rcos[t(i)]y(i) = Rsen[t(i)]

end forz es un vector de ceros de tamano N.return x,y,z

A.1.2 Un toroide

Se crea una curva toroidal para control de la funcion que calcula el ındice de superenr-rollamiento y tambien para poder crear dos curvas encadenadas mediante dos toroides.

89

Algoritmos utilizados 90

Algorithm 2 Curva toroidalRequire: N numero de segmentos del toroideEnsure: Vectores de coordenadas x, y, z de cada vertice del toroide de radio mayor R,

radio menor r, y numero de vueltas v.t Vector de N valores equiespaciados entre 0 y 2πfor i = 1 hasta N dox(i) = cos[t(i)](R+ rcos(v ∗ t(i)))y(i) = sen[t(i)](R+ rcos(v ∗ t(i)))y(i) = rsen(v ∗ t(i))

end forreturn x,y,z

A.1.3 Dos curvas encadenadas

Se crean dos toroides iguales pero desfasados para formar dos curvas cuyo numero deencadenamiento coincide con el numero de vueltas de los toroides. Estas curvas enca-denadas son utiles tambıen para controlar el desempeno de la funcion que calcula elLk

Algorithm 3 EncadenadosRequire: N numero de segmentos de cada curva toroidalEnsure: Vectores de coordenadas x, y, z de un toroide, y x′, y′, z′ de otro toroide,

ambos de radio mayor R, radio menor r, y numero de vueltas v.t Vector de N valores equiespaciados entre 0 y 2πϕ : Desfasaje entre los dos toroides, necesario para que una curva no este muy unidaa la otra.for i = 1 hasta N dox(i) = cos[t(i)](R+ rcos(v ∗ t(i)))y(i) = sen[t(i)](R+ rcos(v ∗ t(i)))y(i) = rsen(v ∗ t(i))x′(i) = cos[t(i) + ϕ](R+ rcos(v ∗ t(i)))y′(i) = sen[t(i) + ϕ](R+ rcos(v ∗ t(i)))y′(i) = rsen(v ∗ t(i))

end forreturn x,y,z,x′,y′,z′

A.1.4 Linking number

El siguiente algoritmo calcula el ındice de ligamiento Lk entre dos curvas.


Algorithm 4 Calculo del ındice de ligamientoRequire: N numero de segmentos de las curvas

Vectores de coordenadas x,y,z de una curva y los vectores de coordenadas x′,y′,z′ dela otra

Ensure: Linking number Lk entre las dos curvasLk = 0 Inicializa a cero el valor de Lkfor i = 1 hasta N dobi = [x(i+ 1)− x(i), y(i+ 1)− y(i), z(i+ 1)− z(i)]for j = 1 hasta N dobj = [x′(j + 1)− x′(j), y′(j + 1)− y′(j), z′(j + 1)− z′(j)]Rji = [x′(j)− x(i), y′(j)− y(i), y′(j)− y(i)]Mixto = ProductoV ectorialM ixto(bi, bj , Rji)Lk = Lk + Mixto

‖Rji‖32

end forend forLk = −Lk

4π

return Lk

A.1.5 Writhe

Este algoritmo calcula el ındice de superenrrollamiento de una curva.

Algorithm 5 Calculo del WritheRequire: N numero de segmentos de la curva

Vector de coordenadas x,y,z de la curvaEnsure: Writhe Wr de la curvaWe = 0 Inicializa a cero el valor de Wrfor i = 1 hasta N − 1 dobi = [x(i+ 1)− x(i), y(i+ 1)− y(i), z(i+ 1)− z(i)]for j = i+ 1 hasta N dobj = [x(j + 1)− x(j), y(j + 1)− y(j), z(j + 1)− z(j)]Rji = [x(j)− x(i), y(j)− y(i), y(j)− y(i)]Mixto = ProductoV ectorialM ixto(bi, bj , Rji)Wr = Wr + Mixto

‖Rji‖32

end forend forWr = −Wr

2πreturn Wr


A.1.6 Diametro efectivo

Este algoritmo verifıca si dos puntos cualquiera de la curva C estan a una distancia dmayor que el diametro efectivo defectivo.

Algorithm 6 Verificacion del diametro efectivoRequire: N numero de segmentos de la curva C

Vector de coordenadas x,y,z de la curvaEnsure: FALSE si no hay ninguna violacion del defectivo, TRUE caso contrario.count = 0 Inicializa a cero un contadorfor i = 1 hasta N − 1 do

for j = i+ 1 hasta N dodefectivo = A(1 + (i− j − 1)3e(1−i+j))d = ‖(x(i)− x(j)), (y(i)− y(j)), (z(i)− z(j))‖if d <= defectivo thencount = count+ 1

end ifend for

end forreturn count


A.2 Simulacion del superenrrollamiento

Algorithm 7 SuperCoilingRequire: Numero de segmentos N de la curva, su de ∆Lk, cantidad Iter de movimi-

entos de prueba.T : Temperatura absoluta; kb: Constante de Boltzman; C: Constante de rigidez detorsion; a: Constante de rigidez de doblado; L: Longitud de la cadena en pbMin =∞ Inicializa la energıa a un valor muy grande Min

(x, y, z)=PoligonoInicial(N)for l = 1 hasta Iter do

if l = 1 thenx = Xaceptado, y = Y aceptado, z = Zaceptado

end ifI, F : indices aleatorios entre 1 y N para una rotacion rıgida;ϕ: angulo aleatorio.RotacionRigida(x, y, z, I, F, ϕ) : Rotacion de los puntos entre I y FDiametroEfectivo(x, y, z, di− ef)Eb=EnergiaDoblado(x, y, z): El valor de la energıa de doblado de la confor-macionWr = Writhe(x, y, z): Calcula el writhe de la curvaEt = 2π2

L (∆Lk −Wr)2 : La energıa de torsion de la conformacionE=Eb+EtProb = e− (E−Min)

kbT

∆ = PolinomioAlexander(x, y, z) : Verifıca la topologıa de la conformacionif ∆ 6= 1 then

E =∞end ifif E > Min then

if Prob > ProbabilidadMinimaAceptada thenMin = E

end ifend ifif E ≤Min thenMin = EXaceptado = x, Y aceptado = y, Zaceptado = z,

end ifend forreturn Xaceptado, Y aceptado, Zaceptado


A.3 Simulacion del encadenamiento

Algorithm 8 Encadenamiento: parte 1Require: Numero de segmentos N de cada curva, su Ca, y la cantidad Iter de movi-

mientos de prueba.T : Temperatura absoluta; kb: Constante de Boltzman; C: Constante de rigidez detorsion; a: Constante de rigidez de doblado; L: Longitud de cada cadena en pbMin =∞; Min′ =∞ Inicializa las energıas a un valor muy grande Min

(x, y, z, x′, y′, z′)=Encadenado(N)for l = 1 hasta Iter do

if l = 1 thenx = Xaceptado, y = Y aceptado, z = Zaceptado; x′ = X ′aceptado, y′ =Y ′aceptado, z′ = Z ′aceptado

end ifI, F , I ′, F ′ : indices aleatorios entre 1 y N para una rotacion rıgidaϕ; ϕ′ : angulo aleatorio de rotacion para una rotacion rıgidaRotacionRigida(x, y, z, I, F, ϕ) : Hace la rotacion rıgida entre los puntos de lacurva comprendido entre I y FRotacionRigida(x′, y′, z′, I ′, F ′, ϕ′) : Hace la rotacion rıgida entre los puntos dela curva comprendido entre I’ y F’DiametroEfectivo(x, y, z, di − ef): Asigna un valor alto de energıa si encuentrados puntos con distancia menor al diametro efectivo di-efDiametroEfectivo(x′, y′, z′, di− ef)DiametroEfectivo2(x, y, z, x′, y′, z′, di − ef): Asigna un valor alto de energıa siencuentra dos puntos entre ambas curvas con distancia menor al diametro efectivodi-efEb=EnergiaDoblado(x, y, z): Devuelve el valor de la energıa de doblado total dela conformacionEb’=EnergiaDoblado(x′, y′, z′)Wr = Writhe(x, y, z): Calcula el writhe de la curvaWr’ = Writhe(x′, y′, z′)Et = 2π2

L Wr2 : La energıa de torsion de la conformacionEt’ = 2π2

L Wr′2

E=Eb+EtE’=Eb’+Et’

end for


Algorithm 9 Encadenamiento: parte 2for l = 1 hasta Iteraciones doProb = e− (E−Min)

kbT∆ = PolinomioAlexander(x, y, z) : Verifıca el estado topologico de la confor-macionif ∆ 6= 1 then

E =∞end ifProb′ = e− (E’−Min′)

kbT

∆′ = PolinomioAlexander(x′, y′, z′) : Verifıca el estado topologico de la confor-macionif ∆′ 6= 1 then

E’ =∞end ifVerificaEncadenamiento(x, y, z, x′, y′, z′) : Devuelve energıas infinitas si las cur-vas tienen un encadenamiento distinto de Ca, si no, no hace nada.if E > Min then

if Prob > ProbabilidadMinimaAceptada thenMin = E

end ifend ifif E ≤Min thenMin = EXaceptado = x, Y aceptado = y, Zaceptado = z,

end ifif E’ > Min′ then

if Prob′ > ProbabilidadMinimaAceptada thenMin′ = E’

end ifend ifif E’ ≤Min′ thenMin′ = E’X ′aceptado = x′, Y ′aceptado = y′, Z ′aceptado = z′,

end ifend forreturn Xaceptado, Y aceptado, Zaceptado,X ′aceptado, Y ′aceptado, Z ′aceptado


A.4 Abstracts en congresos

A.4.1 Wilheln Bernhard Workshop 23th


A.4.2 XXXVI Congreso SEBBM


A.4.3 Banff International Research Station

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