INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E

INVESTIGACIÓN

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR

PRESENTA:

Q.B.P. TANIA DOMÍNGUEZ FERNÁNDEZ

MÉXICO, D.F; 2012

“ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LA

APOPTOSIS EN

Entamoeba histolytica”

DIRECTOR DE TESIS:

D. en C. DAVID GUILLERMO PÉREZ ISHIWARA

ASESORES:

D. en C. CONSUELO GÓMEZ GARCÍA

D. en C. ELIZABETH PÉREZ HERNÁNDEZ

D. en C. DORIS ATENEA CERECEDO MERCADO

D. en C. VIRGINIA SÁNCHEZ MONROY

Este trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biomedicina Molecular I de la

Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del Instituto Politécnico Nacional,

bajo la dirección del Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara.

Los recursos empleados para desarrollar esta investigación fueron proporcionados

por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) con el proyecto

número 83197 y por la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) con el

proyecto 29113499 y 20120527. Adicionalmente la autora del trabajo fue apoyada

con la Beca del CONACYT y la beca del Programa Institucional de Formación de

Investigadores (PIFI).

La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de todo

progreso.

Louis Pasteur

(1822-1895)

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo de tesis de maestría se debe al esfuerzo y a la orientación,

de la autor y del director de tesis, respectivamente.

Quiero agradecer al Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara por su gran apoyo y

sugerencias para este trabajo y finalmente por conducirme en el área de la

investigación.

A mis asesores de tesis: Dra. Consuelo Gómez García, por su compañerismo en

el laboratorio y otras circunstancias, por sus comentarios y sugerencias para

este proyecto.

Dra. Elizabeth Pérez Hernández, por sus valiosas sugerencias en el proyecto,

sin duda sus conocimientos aportaron gran información al trabajo.

Dra. Virginia Sánchez Monroy, al ser parte y autora de los antecedentes del

proyecto, agradezco sus comentarios para el mismo.

Y finalmente a la Dra. Doris Atenea Cerecedo Mercado, una gran mujer a

quién agradezco haya aceptado estar en mi comité evaluador.

Mi reconocimiento a todos ustedes quienes juzgaron este proyecto con sus

valiosas sugerencias y comentarios durante el desarrollo del trabajo.

También quiero agradecer a todos mis amigas (os) y compañeras (os) que me

acompañaron durante el tiempo que estuve en el posgrado, sin duda fueron

parte de esto.

Finalmente agradezco al Profr. Gregorio Domínguez Herrera y a la Profra.

María Guadalupe Fernández Villalobos, mis padres, quienes son un pilar

fundamental para mi, gracias por su apoyo desinteresado.

CONTENIDO

Lista de abreviaturas ............................................................................................. I

Lista de tablas ...................................................................................................... III

Lista de figuras ..................................................................................................... IV

Resumen .............................................................................................................. VI

Abstract ................................................................................................................ VII

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1

1.1. Historia ............................................................................................................................... 1

1.2. Ciclo Biológico ................................................................................................................... 3

1.3. Morfología .......................................................................................................................... 4

1.3.1. Trofozoíto ................................................................................................................... 4

1.3.2. Prequíste ......................................................................................................................... 6

1.3.3. Quíste .............................................................................................................................. 6

1.3.4. Metaquíste ...................................................................................................................... 6

1.4. Epidemiología ........................................................................................................................ 7

1.5. Mecanismos de patogenicidad y virulencia ...................................................................... 8

1.6. Procesos involucrados en la patogénesis ........................................................................ 9

1.6.1. Adhesión ....................................................................................................................... 10

1.6.2. Fagocitosis.................................................................................................................... 10

1.6.3. Lisis ................................................................................................................................ 11

1.6.4. Invasión ......................................................................................................................... 12

1.7. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune .......................................................... 13

1.8. Muerte celular programada ............................................................................................... 15

1.8.1. Moléculas implicadas en el proceso de apoptosis:efectores intracelulares.......... 18

1.8.1.1. La familia de las caspasas ...................................................................................... 18

1.8.1.2. Proteína p53.............................................................................................................. 20

1.8.1.3. Familia de proteínas Bcl-2 ...................................................................................... 20

1. 9. Antecedentes ...................................................................................................................... 27

1.9.1. MCP en Leishmania .................................................................................................... 27

1.9.2 MCP en Trypanosomas ............................................................................................... 29

1.10 MCP en E. histolytica .................................................................................................... 30

1. 10. Proteómica ........................................................................................................................ 36

1. 11. Herramientas de la proteómica ...................................................................................... 36

1. 12. Análisis proteómico de E. histolytica ............................................................................. 38

2. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 40

3. HIPÓTESIS ................................................................................................................................. 41

4. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 42

5. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ............................................................................................ 43

6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 44

6.1. Cultivo de E. histolytica ...................................................................................................... 44

6. 2. Inducción de la apoptosis con G418 .............................................................................. 44

6.3. Obtención de proteínas ..................................................................................................... 44

6.4. Lisis de los trofozoítos ....................................................................................................... 45

6. 5. Precipitación proteíca ....................................................................................................... 45

6.6. Cuantificación proteíca ...................................................................................................... 45

6.7. Primera dimensión - isoelectroenfoque ........................................................................... 46

6.8. Segunda dimensión SDS-PAGE ...................................................................................... 49

6. 9. Visualización proteíca y análisis de imágenes .............................................................. 49

6.10. Digestión con tripsina de proteínas en el gel .............................................................. 51

6. 11. MALDI-TOF (MS); MALDI TOF/TOF (MS/MS) ............................................................ 52

6. 13. Papel de las proteínas identificadas ............................................................................. 54

7. RESULTADOS .......................................................................................................................... 55

8. DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 86

10. PERSPECTIVAS ................................................................................................................... 103

11. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 104

12. ANEXOS ................................................................................................................................. 116

I

Lista de abreviaturas

WHO Organización Mundial de la Salud

ATP Adenosin trifosfato

Ca2+ Calcio

AIF Factor Inductor de Apoptosis

CHAPS [3-[(3-Colaamidopropil)dimetilamonio]-1

propanosulfonato]

DNA Ácido desoxirribunucleíco

DTT Ditiotreitol

Gal Galactosa

H Hora

K+ Ión potasio

M Molar

kDa Kilodaltones

MALDI Desorción/ionización mediante láser inducida por matriz

MCP Muerte Celular Programada

µg Microgramo

µl Microlitro

Ml Mililitro

II

NO Óxido nítrico

PBS Amortiguador de Fosfatos

PI Punto Isoeléctrico

PM Peso Molecular

PS Fosfatidil serina

TOF Tiempo de vuelo

NADP Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato

IPG Gradientes de pH inmovilizados

CPA Cisteín proteasa

GDP Guanosin difostato

G418 Geniticina 418

AFLPs Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados

MS Espectrometría de masas

TCA Acido triclo- roacético

IEF Isoelectroenfoque

E-64 Epóxido-64

PS Fosfatidilserina

Pb Pares de bases

III

Lista de tablas

Tabla 1. MCP en diferentes parásitos protozoarios…………………………………….. 25

Tabla 2. Protocolo de isoelectroenfoque Ettan IPGphor III…………………………….

56

Tabla 3. Protocolo de isoelectroenfoque…………………………………………………

57

Tabla 4. Volumen densitométrico de cada spots………………………………………..

75

Tabla 5. Peso molecular, punto isoeléctrico y expresión cualitativa de cada spot

monitoreado en los diferentes tiempos de inducción……………………………….......

76

Tabla 6. Resultados de huella peptídica (MALDI TOF) y MALDI TOF-TOF……........

78

Tabla 7. Proteínas diferenciales obtenidas de los perfiles proteómicos de

trofozoítos de E. histolytica inducidos a MCP con G418, identificadas por MALDI

TOF/ MADI TOFTOF………………………………………………………………………..

85

Tabla 8. Lista de proteínas de E. histolytica identificadas en geles bidimensionales

teñidos con azul de Coomassie, por Leitsch y colaboradores en el 2005…………….

90

Tabla 9. Lista de algunas proteína de E. histolytica reportadas por J. Tolstrup y

colaboradores en el 2006…………………………………………………………………..

91

IV

Lista de figuras

Figura 1. Proceso patogénico en E. histolytica. ……………………………………........ 9

Figura 2. Esquema comparativo de las características morfológicas de la muerte

celular por apoptosis y por necrosis……………………………………...........................

17

Figura 3. Vías apoptóticas………………………………………………………...............

24

Figura 4. Primera dimensión isoelectroenfoque………………………………...............

48

Figura 5. Perfil proteómico de trofozoítos de E. histolytica sin inducir a MCP con

G418…………………………………………………………………….................................

59

Figura 6. Imagen del perfil proteómico de trofozoíto sin inducir a MCP………………..

61

Figura 7. Perfil proteómico de 1 ½ h (90 min) de inducción a MCP…………………….

62

Figura 8. Perfil proteómico de 3 h de inducción a MCP………………………………….

63

Figura 9. Perfil proteómico de 6 h de inducción a MCP………………………………….

64

Figura 10. Perfil proteómico de 9 h de inducción a MCP………………………………..

65

Figura 11. Comparación del perfiles proteómicos. (A) trofozoítos sin inducir a MCP

(B) trofozoítos expuestos 1 ½ h a G418……………………………………………………

67

Figura 12. Comparación del perfiles proteómicos. (A) trofozoítos expuestos 1 ½ h a

G418 (B) trofozoítos expuestos 3 h a G418……………………………………………….

68

V

Figura 13. Comparación del perfiles proteómicos. (A) trofozoítos expuestos 3 h a

G418 (B) trofozoítos expuestos 6 h a G418……………………………………………….

69

Figura 14. Comparación del perfiles proteómicos. (A) trofozoítos expuestos 6 h a

G418 (B) trofozoítos expuestos 9 h a G418……………………………………………….

70

Figura 15. Etiquetas de los spots diferenciales, utilizando Ludesi REDFIN3………….

71

Figura 16. Ampliación de los spots expresados diferencialmente de los perfiles

proteómicos de trofozoítos: sin inducir a MCP (control); y a distintos tiempos de

inducción de MCP (1 ½, 3, 6 y 9 h)…………………………………………………………

73

VI

RESUMEN

Durante el proceso de infección, Entamoeba histolytica utiliza diversos

mecanismos para evadir la respuesta inmune; uno de los mecanismos descritos

es la inducción de la apoptosis a leucocitos, macrófagos y células hepáticas,

empleando moléculas como lectinas, lipasas y toxinas. Se ha demostrado que la

muerte celular programada (MCP) en este parásito también se induce in vitro: i)

mediante el aminoglicósido G418; ii) por especies reactivas de oxído nítrico y iii)

por especies reactivas de oxígeno. In vivo, nuestro grupo de investigación

demostró en un modelo de hámster chino, que el producto de la interacción entre

el hospedero y el parásito induce la apoptosis tanto en los neutrófilos como en los

trofozoítos, lo que sugiere que durante el proceso fisiopatogénico de la

enfermedad se desarrolla una respuesta del huésped contra el parásito, con la

consecuente activación de mecanismos de defensa del parásito. Recientemente,

demostramos mediante cDNA-AFLPs que la MCP inducida por fármacos

representa un mecanismo activo que involucra la expresión de genes específicos,

como la Glutaminil-tRNAsintetasa, las Subunidades ribosomales 40S y 18S, el Sir-

2, las Graininas 1-2 y la Saponina-like que están implicados en la regulación de

rutas pro- y anti-apoptóticas. En este trabajo presentamos el análisis proteómico

comparativo de la MCP inducida con G418. Los resultados mostraron la expresión

de proteínas diferenciales en los diversos estadios de inducción de la MCP,

identificando hasta el momento por huella péptidica y Maldi TOF TOF, proteínas

del citoesqueleto como actina, proteínas del metabolismo energético como la

alcohol deshidrogenasa y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa e

interesantemente una proteína de unión a Ca2+ como la grainina 2. Estas

proteínas en otros sistemas se ha demostrado que actúan como proteínas pro- y

anti-apoptóticas.

VII

ABSTRACT

During the infection process, Entamoeba histolytica uses different mechanisms to

evade the immune response; one of them is the induction of apoptosis in

leukocytes, macrophages and liver cells, using molecules such as lectins, lipases,

and toxins. It has been shown that programmed cell death (PCD) in this parasite is

also induced in vitro: i) using the aminoglycoside G418, ii) by reactive species of

nitric oxide and iii) by reactive oxygen species. In vivo, our research group

demonstrated in a Chinese hamster model, that after interaction between host and

parasite, apoptosis in both neutrophils and in trophozoites, were induced

suggesting that during the pathophysiological interaction a host response against

the parasite is developed, with the subsequent activation of parasite defense

mechanisms. Recently, we demonstrated by cDNA-AFLPs that PCD induced by

drug represents an active mechanism that involves the expression of specific

genes, such as glutaminyl-tRNAsintetasa, the 40S and 18S ribosomal subunits, the

Sir-2, and Graininas 1-2 and saponin-like that are involved in the regulation pro-

and anti-apoptotic routes. In this assay we present a comparative proteomic

analysis of PCD induced by G418. The results showed differential protein

expression in various stages of induction of PCD, by Peptide fingerprinting and

Maldi TOF TOF, we identified actin, alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase and a grainina 2. Some of them acting as pro- and anti-

apoptotic proteins.

1

1. INTRODUCCIÓN Las enfermedades parasitarias son una de las causas de morbilidad más

importantes a nivel mundial, las cuales reflejan deficiencias sanitarias,

características de áreas pobres donde priva el hacinamiento y el mal manejo de

las aguas y de las excretas. La amebiasis representa la tercera enfermedad

parasitaria a nivel mundial y en México, al ser endémica, constituye un problema

de salud pública muy importante (Conde-Bonfil 1992; WHO 1997).

Entamoeba histolytica, es el agente causal de la amebiasis, reside y se multiplica

en el intestino grueso causando en la mayoría de los casos una infección

asintomática en el lumen del intestino; otras manifestaciones clínicas incluyen la

diarrea y la disentería, sin embargo, ocasionalmente E. histolytica penetra la

mucosa intestinal, y genera una colitis ulcerativa o bien se disemina hacia otros

órganos como el pulmón y el cerebro. Sin embargo, el órgano principal es el

hígado, donde induce la formación de abscesos (Tillack 2007; Baxt 2008) .

1.1. Historia

E. histolytica fue descrito por Rösel van Rosenhof desde el siglo XVII y XVIII,

siendo Lösch quien describió la disentería amebiana en San Petersburgo, Rusia

(Bernal-Redondo 2001). En 1875 descubrió en un campesino de 24 años que

sufría de disentería, unos microorganismos móviles que poseían ecto y

endoplasma y contenían glóbulos rojos. El investigador inoculó 4 perros por vía

rectal y oral con las heces del paciente y logró reproducir en uno de ellos, la

disentería, con ulceraciones en la mucosa intestinal y amibas en el exudado. El

paciente enfermo murió a los 7 meses y la necropsia demostró numerosas y

extensas ulceraciones de la mucosa del colon, donde de nuevo observó los

microorganismos. No obstante estos hallazgos, el autor no consideró a la amiba

2

como el agente etiológico, sino como un coadyuvante mecánico que impedía la

curación de las lesiones originadas por otro agente causal (Jackson, Gathiram, et

al.,1985).

Koch en 1883, revisando necropsias en una epidemia de cólera, demostró las

amibas en la submucosa de la pared intestinal, en los capilares cercanos a la

pared de abscesos hepáticos y en el exudado de lesiones del hígado. Los

hallazgos de Koch fueron confirmados por Kartulis (1885 – 1887), al demostrar la

presencia de amibas en 150 necropsias de casos de disentería. A este autor se le

considera el primero en afirmar que la amiba era el agente etiológico de la

disentería tropical y que el absceso del hígado era una secuela de la disentería

experimental. Councilman y Lafleur (1891), consideraron la disentería como una

entidad clínica caracterizada por lesiones asociadas a la amiba. Usaron por

primera vez las expresiones disentería amibiana, absceso amibiano del hígado y

propusieron para el agente causal el nombre de Amoeba dysenteriae. Heuber en

1903, hizo la descripción de los quistes de esta amiba y Schaudinn de los

trofozoítos, este asignó el nombre de E. histolytica por su capacidad de lisar tejido

y producir úlceras intestinales (Bernal-Redondo 2001); este autor diferenció dos

especies: Entamoeba histolytica o amiba patógena y Entamoeba coli o no

patógena. Para mostrar esta diferencia de patogenicidad ingirió quistes y sufrió

como consecuencia dos crisis disentéricas, lo que para mucho fue la causa de su

temprana muerte. Posteriormente, se adoptó el nombre genérico Entamoeba, que

había sido propuesto desde el siglo pasado.

Los trabajos definitivos sobre la patogenicidad de E. histolytica, fueron realizados

en 1913 por Musgrave y Clegg y por Walker y Sellards, quienes suministraron

quistes de E. histolytica y quistes de E. coli a voluntarios sanos y obtuvieron la

disentería solo aquellos que ingirieron E. histolytica.

En 1914 se realizaron los trabajos inmunológicos por Izar quien preparó antígenos

acuosos de E. histolytica a partir de materias fecales y obtuvo reacciones positivas

3

de fijación del complemento. En 1924 Boeck y Drbohlav lograron cultivar con éxito

E. histolytica en un medio artificial con base de huevo, que contenía la flora

microbiana de las materias fecales. Con este tipo de cultivo Craig, en 1927,

preparó un antígeno con fines diagnósticos para fijación del complemento.

En 1925 Brumpt, mediante experimentos en gatos y en humanos, diferenció una

amiba patógena, E. dysenteriae, equivalente a E. histolytica (Pimenta, Diamond, et

al., 2002) y una no patógena, E. dispar. Diamond en 1961 obtuvo por primera vez

un cultivo axénico, es decir, libre de bacterias, el cual ha sido utilizado para

preparar antígenos con alto grado de pureza para diversas reacciones serológicas.

En 1993, Diamond y Clark, re-describieron la existencia de dos especies

diferentes: E. histolytica, patógena y E. dispar, no patógena, morfológicamente

iguales, pero con diferencias inmunológicas, bioquímicas y genéticas (Botero,

1994).

1.2. Ciclo Biológico

El ciclo de vida de E. histolytica se desarrolla a través de una alternancia de

crecimiento trofozoítico y de la formación periódica de quistes (Calzado, Verde et

al. 2007). Esto comienza después de la ingestión de un quiste no móvil, por el

huésped humano. La forma móvil del parásito o trofozoíto surge después de la

digestión de la pared del quiste durante el paso a través del intestino delgado y

coloniza el intestino grueso, donde prolifera, mientras se alimentan de

la flora bacteriana residente. Para completar el ciclo de vida, los trofozoítos se

desarrollan en quistes cuadri-nucleados y pasan hacia el ambiente exterior

con las heces del huésped. E. histolytica puede existir como un

comensal en el intestino del ser humano, o causar disentería o abscesos

extraintestinales. La proliferación de los trofozoítos en la luz del intestino se

produce en un ambiente polixénico donde coexiste con diferentes especies de

bacterias anaerobias y microaerófilas. En contraste, durante la invasión del

4

epitelio intestinal o en las lesiones extraintestinales como abscesos hepáticos, las

amibas proliferan en un ambiente libre de otros microorganismos (Mukherjee,

Clark, et al., 2008).

1.3. Morfología

La división metaquística en el ciclo de vida de E. histolytica forma un quíste

maduro siendo una amiba metaquística, con cuatro núcleos quísticos. Cada amiba

metaquística produce finalmente ocho amibas por una serie de divisiones

nucleares y citoplasmáticas. Cada núcleo quístico se divide, resultando que ocho

núcleos son producidos, que se separan y forman ocho amibas (Dutta 1960).

1.3.1. Trofozoíto

El trofozoíto o forma móvil, es extraordinariamente pleomórfico. Se multiplica por

fisión binaria y es muy sensible al jugo gástrico y a los agentes externos. Su

hábitat comprende la luz y la pared del colon y específicamente el ciego y el recto

(Pumarola 1991). Su tamaño es muy variable y oscila entre 10 y 60 µm. Las

formas más pequeñas corresponden a las no invasivas y se encuentran

habitualmente en los casos asintomáticos. Los de mayor tamaño son las formas

invasivas, que a diferencia de los anteriores no aparecen en la luz intestinal y

poseen en el endoplasma restos celulares o hematíes.

El trofozoíto presenta una membrana citoplásmica dividida en dos porciones: una

externa llamada ectoplasma y una porción interna denominada endoplasma (Petri,

1993)

La pared celular periférica del trofozoíto, recibe el nombre de ectoplasma, es

hialina, transparente, retráctil y casi sin granulaciones (Pumarola 1991). Los

5

pseudópodos son prolongaciones del ectoplasma y proporcionan una movilidad al

parásito de aproximadamente 50 µN/s (Romero, 1993).

El endoplasma tiene una estructura granular fina y, en las formas mayores,

abundantes vesículas y vacuolas, que contienen restos celulares y hematíes

intactos o en vías de degradación, pero no bacterias (Pumarola, 1991).

El núcleo es esférico con un acumulo de cromatina pequeña y puntiforme en el

centro, encerrados en una cápsula llamados cariosoma o endosoma (Petri 1993).

También presenta cromatina adherida a la cara interna de la membrana nuclear,

distribuida en forma más o menos homogénea (Romero, 1993).

El trofozoíto se nutre por fagocitosis a expensas de los tejidos disueltos y

hematíes, y se ayuda de los pseudópodos. Al microscopio electrónico no se

detecta aparato de Golgi, microtúbulos, mitocondrias, ni retículo endoplásmico

rugoso (Pumarola, 1991).

Si las condiciones del medio ambiente no son propicias, el trofozoíto empieza a

cambiar de forma, deja de emitir pseudópodos, el ectoplasma y el endoplasma ya

no se diferencian, de manera que casi desaparece el primero, se pierde la forma

irregular y se hace esférico, al tiempo que aparece una pared gruesa llamada

pared quísitica (Petri, 1993).

También se expulsa al exterior todo el contenido de las vacuolas y empieza a

formar material de reserva como vacuolas de glucógeno y barras cromatoidales. El

cambio de trofozoíto concluye con la formación de un quíste (Romero, 1993).

6

1.3.2. Prequíste En el estado prequístico, el trofozoíto tiene aproximadamente el mismo tamaño

que el quíste. El citoplasma contiene inclusiones de restos celulares pero

usualmente contiene depósitos difusos de glucógeno y ocasionalmente cuerpos

cromatoides. Los cuerpos cromatoides están compuestos de ribosomas; sin

embargo, su papel funcional es incierto. La forma prequística es uninucleada y el

núcleo es agrandado, el cual contiene un cariosoma.

1.3.3. Quíste El quiste o elemento infectante es redondo u oval y de 10-25 µm de tamaño.

Posee una pared lisa de 0.6 µm y es resistente al jugo gástrico, factores

ambientales externos y cifras habituales de cloro del agua (entre 0,5 y 0,2 mg/L)

(Pumarola, 1991). Posee de 1 a 4 núcleos, según la fase de maduración. Los

quistes jóvenes tienen 1 o 2 núcleos, algunos cuerpos cromáticos y vacuolas de

glucógeno. Cuando el quiste madura, posee 4 núcleos y desaparecen los cuerpos

cromáticos. Solo los quistes maduros son infecciosos. Los cuerpos cromáticos

contienen principalmente ácidos nucleicos y fosfatos (Pumarola, 1991).

1.3.4. Metaquíste Durante el proceso de enquistamiento, la amiba contiene 4 núcleos que son muy

activos. La amiba cuadri-nucleada escapa de la pared del quiste a través de un

poro pequeño. Afuera del quíste, los núcleos de la amiba cuadrinucleada

comienzan a separarse de alrededor del citoplasma y someterse a la división para

formar ocho trofozoítos metaquísticos uninucleados. Los trofozoitos resultantes

son siempre más pequeños que los trofozoitos presentes en el intestino de una

7

persona infectada. Los trofozoítos metaquísticos siguen alimentándose y

creciendo para colonizar el intestino (Bruckner, 1992).

1.4. Epidemiología La Organización Mundial de la Salud reportó que E. histolytica causa

aproximadamente 50 millones de casos y 100, 000 muertes (Gaucher, 2002) al

año, principalmente en el centro y sur de América, África y la India, así como una

considerable morbilidad manifestada como características clínicas intestinales o

extraintestinales invasoras (Walsh, 1986).

La gran mayoría de las infecciones son adquiridas en países en desarrollo; por

ejemplo, en un estudio realizado por Rashidul Haque et al, se observó que el 39%

de los niños de un barrio pobre de la zona urbana de Dhaka, Bangladesh, había

una nueva infección por E. histolytica durante un estudio de un año (Haque,

2006).

A nivel mundial, la amebiasis es la tercera causa más común de muerte debido a

una infección parasitaria, después de la malaria y la esquistosomiasis. (Tanyuksel,

2003). Las infecciones por amebiasis son endémicas en la mayoría de las zonas

con climas templados y tropicales en países en desarrollo. La prevalencia de la

amebiasis varía en los distintos países dependiendo de las condiciones

socioeconómicas. (Tanyuksel, 2003). En los países industrializados, la amebiasis

se produce en relaciones sexuales en hombres homosexuales, inmigrantes,

turistas que viajan a zonas endémicas de infección y en individuos

inmunodeficientes, VIH positivos.

La prevalencia global de la infección por E. histolytica en los países

industrializados, como los Estados Unidos, se ha estimado entre un 4% por año a

pesar de la presencia de algunos grupos de alto riesgo. Los estudios

8

epidemiológicos han demostrado que el bajo nivel socioeconómico y las

condiciones insalubres son factores significativos de riesgo. Además, las personas

de edad temprana que viven en países en desarrollo tienen un mayor riesgo que

aquellas que están en regiones desarrolladas. Por ejemplo, en México, 11% de la

población estudiada de 5 a 9 años fueron positivos para la infección, siendo el

porcentaje superior en las niñas (9,34%). Investigaciones seroepidemiológicas de

la amebiasis en algunas zonas tropicales de México indican que, mientras que la

prevalencia de anticuerpos anti-amebianos es relativamente baja en zonas donde

la transmisión de la epidemia no se ha informado, durante las epidemias una tasa

de incidencia de 50% es común, llegando a 80% en caso de epidemia. En los

países desarrollados como Italia, Japón, y Estados Unidos, la prevalencia de la

infección por Entamoeba es entre el 4 y 21% en los hombres que practican sexo

oral-anal con otros hombres, pero la mayoría de las infecciones se deben a la

especie no invasiva, E. dispar, que no requiere tratamiento (Tanyuksel, 2003).

1.5. Mecanismos de patogenicidad y virulencia Mucho se ha avanzado en el conocimiento de la biología de E. histolytica, a partir

de la aparición de los primeros medios sintéticos para su cultivo y su posterior

perfeccionamiento, sin embargo, el papel de la respuesta inmune en el control de

la enfermedad no está bien establecido, menos aún el singular comportamiento

del parásito observado por décadas, que con frecuencia actúa, como comensal y

más raramente como invasor. En general, la capacidad patogénica depende entre

otras cosas, de las sustancias tóxicas que libera, ya sea enzimas o citotoxinas, de

su asociación con otras bacterias, y del estado inmunológico y nutricional del

huésped.

Aunque el término "patogénesis", definido como los mecanismos implicados en el

inicio, evolución y resultado final de un proceso patológico, se refiere tanto a

9

factores del huésped y del parásito, nos centraremos principalmente en los

mecanismos parasitarios que pueden estar relacionados con la amebiasis

invasiva.

1.6. Procesos involucrados en la patogénesis En la actualidad se han identificado diferentes moléculas asociadas a la virulencia

del parásito como son las lectinas, las proteasas, las toxinas y las lipasas.

Figura 1.- Proceso patogénico en E. histolytica. Tomado de TRENDS in Parasitology.

10

1.6.1. Adhesión Para que ocurra la invasión intestinal por los trofozoítos de E. histolytica es

necesario el contacto célula-célula y la adherencia a las células del huésped,

mediante moléculas de superficie del parásito llamadas adhesinas (Canales-

Trevino, 1986). Estas se adhieren a las células epiteliales de la mucosa intestinal y

a las células inflamatorias (Leroy, 2000). Durante este proceso se da una

interacción entre las lectinas del parásito Gal / GalNAc con glicoproteínas (mucina)

que se encuentran en el moco en la luz intestinal del hospedero, que son ligandos

de alta afinidad por la lectina amebiana (Tanyuksel, 2003). Las lectinas son

glicoproteínas, que reaccionan con los azúcares de las paredes celulares. La

lectina Gal/GalNAc facilita la adherencia a la célula diana (como se observa en la

figura 1), la resistencia al complemento y la citotoxicidad (Haque, 2001).

Las cepas virulentas de E. histolytica contienen varias lectinas, de las cuales dos

lectinas de superficie están fuertemente relacionadas con la virulencia del parásito.

La lectina de 140 kDa está unida a la membrana y tiene una especificidad para los

oligosacáridos de N-acetil glucosamina (GlcNAc), mientras que la lectina de 220

kDa tiene afinidad por la galactosa y por la N-acetilgalactosamina (GalNAc).

(Meza, Cazares, et al., 1987).

1.6.2. Fagocitosis La fagocitosis se caracteriza por la ingestión de restos celulares, células vivas,

fragmentos inertes y eritrofagocitosis. Existen mecanismos moleculares muy

específicos donde intervienen proteínas de superficie (Arroyo, 1987), cisteín

proteasas (CPs) (Ankri, 1998) y componentes del citoesqueleto. La fagocitosis es

acompañada por la formación del fagolisosoma (Stuart, 2005) dirigido por

GTPasas y proteínas Rab, que actúan como moduladores en la regulación de la

fusión vesicular con las membranas de la célula blanco.

11

El citoesqueleto de E. histolytica le permite realizar dos funciones importantes

relacionadas con la patogénesis: la locomoción y la fagocitosis. Esto se logra

mediante la polimerización de la actina, la cadena pesada de la miosina II y un

conjunto de proteínas ligadoras de calcio, además de otros mecanismos de

señalización intracelular (Meza, 2006). La lectina Gal-GalNac, a través de una

serie de cinasas transmembranales relacionadas, induce cambios estructurales en

el trofozoíto y en la célula blanco a través de mecanismos no identificados, para

formar una placa de anclaje. Después, la miosina pesada tipo II y la actina

interactúan “contrayendo” el trofozoíto, que de esta manera avanza. Durante el

proceso de fagocitosis, el reconocimiento de la célula blanco depende

nuevamente de la lectina. Así, el trofozoíto penetra rápidamente por la mucosa y la

submucosa, extendiendo la invasión a capas más profundas. Las cisteín proteasas

juegan un papel importante en esta etapa, dado que permiten degradar casi todos

los componentes de la matriz extracelular y su actividad depende de la virulencia

del trofozoíto. Los principales componentes destruidos por las proteasas son

laminina, colágeno tipo I y IV, y fibronectina. A medida que avanza la invasión, la

úlcera se extiende profundamente en un área mayor de la submucosa, dado que

el tejido subyacente al epitelio interglandular ofrece menor resistencia, lo que da

lugar a las típicas úlceras en botón. Para obtener el hierro necesario para su

supervivencia, el trofozoíto procesa los eritrocitos fagocitados por medio de

hemoglobinasas. En este momento se aprecia una notable infiltración

caracterizada por neutrófilos, macrófagos y algunos linfocitos (Romero-Diaz,

2007).

1.6.3. Lisis La lisis de las células epiteliales ocurre a través de la acción del amoebaporo, y de

la degradación de la matriz por acción de cisteín proteasas y otras enzimas líticas

(Carrero, 2007). Varias proteínas que forman el poro amebiano (30, 14 y 5 kDa) se

han descrito. Una proteína amibiana de 30 kD se purificó y se demostró que

12

participa en la lisis de los eritrocitos insertándose en la bicapa lipídica y creando

poros. Otra proteína de 14 kDa que forma poros fue descrita como la proteína que

forma el canal iónico. De éstos, la proteína de 5 kDa, es la más importante y

principal formadora del amoebaporo (Leippe, et al., 1991). Esta proteína está

compuesta por 77 aminoácidos, incluyendo 6 residuos de cisteína. Al igual que

otros polipéptidos que penetran la membrana, también tiene una conformación

helicoidal, todos α- hélices (Leippe, et al., 1992).

Las cisteína proteasas se sabe que son importantes para la patogénesis de E.

histolytica al degradar proteínas extracelulares. Aproximadamente 20 genes, que

codifican para las cisteín proteasas se han identificado. Recientemente, se ha

demostrado que la expresión diferencial de estos 20 genes varía entre E.

histolytica y E. dispar, explicando al menos un mecanismo que permite a E.

histolytica invadir al huésped (Stauffer, et al., 2003).

1.6.4. Invasión Después de la adherencia a la célula huésped a través de Gal-lectina prosigue un

proceso de invasión (figura 1). Se entiende que la invasividad es la capacidad de

destruir localmente los tejidos colonizados, en este caso depende de la liberación

de CPs, del amoebaporo, de las colagenasas, de las fosfatasas acidas y de otras

enzimas hidrolíticas, así como de las hidrolasas (Espinosa-Cantellano, 2000);

(Ackers, 2006).

La invasión es seguida por un proceso de inflamación agudo que recluta

neutrófilos, células plasmáticas, eosinófilos, macrófagos y linfocitos, los cuales

contribuyen al daño tisular por liberación descontrolada de sus productos tóxicos

(Olivos-Garcia, 2004).

13

La mucosa es destruida y el parásito se propaga en el tejido, formando una típica

úlcera, asociada con diarrea conteniendo moco y sangre (Hughes 2000).

Posteriormente, puede producirse la diseminación de los trofozoítos a diferentes

órganos y tejidos (Espinosa-Cantellano, 2000).

1.7. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune Durante el curso de la invasión en el colon o la dispersión hacia el hígado, los

trofozoítos de E. histolytica están en continua exposición con el sistema del

complemento. Los trofozoítos activan la vía clásica y alterna del complemento en

la ausencia de anticuerpos antiamebianos a través de una CP de 56 kDa (Reed,

1990). Esta CP degrada a las fracciones C3, C4, C5 y C9, evitando así efectos

fisiológicos de anafilatoxinas C3a, C5a, así como el incremento de la

permeabilidad vascular y la contracción del musculo liso; de igual manera generan

la supresión de la proliferación de las células T, además de limitar la quimiotaxis

de los neutrófilos (Reed, 1989).

Por otra parte, se ha descrito que la lectina Gal/GalNac inhibe también el

ensamblaje de C8 y C9 del complemento de ataque a la membrana C5b-9, lo que

impide la lisis del parásito mediada por el complemento (Braga, 1992).

Otro mecanismo de evasión de la respuesta inmune usado por Entamoeba, es la

digestión proteolítica de anticuerpos IgA e IgG por proteasas (Kelsall, 1993). Los

anticuerpos IgA se desarrollan durante el episodio de infección intestinal, previo

y/o concomitante con el episodio hepático, es decir invasivo, donde se sintetizan

anticuerpos IgG, sin embargo el problema básico que el paciente tiene es que

aunque la cantidad de anticuerpos específicos IgA e IgG contra la amiba

aumentan, estos son por un lado degradados por las proteasas amibianas, y por

otro removidos de su superficie, a través del recambio membranal del trofozoíto,

14

mediante la formación del casquete y muda de los anticuerpos unidos a su

membrana, ya que se deshace de ellos, evitando así su acción (Calderon, 1980).

In vitro e in vivo, algunos parásitos internalizan los complejos inmunes de la

membrana y recuperan su forma y movilidad al cabo de dos horas y ya no se

inmovilizan al ser re-expuestos al suero inmune (Biagi, 1966) (Cole, 1953); (Neal,

1971).

Por otro lado, varios estudios han documentado que la amiba interfiere en la

actividad anti-amebiana de los neutrófilos, interrumpiendo las actividades de la

NADPH oxidasa, y resistiendo a través de la peroxirredoxina de 29 kDa (Guerrant,

1981) (Arbo, 1990). También se ha demostrado in vitro que E. histolytica puede

inducir la apoptosis de los neutrófilos, siendo este mecanismo un importante

evento en la resolución de la inflamación y por lo tanto de la sobrevivencia del

parásito. Sim y colaboradores en el 2005, investigaron los aspectos

ultraestructurales de la muerte de neutrófilos provocada por E. histolytica, al

incubar neutrófilos humanos de sangre periférica, en ausencia o presencia de

trofozoítos de E. histolytica. Las evidencias de microscopía electrónica de

transmisión (TEM) muestran que los neutrófilos incubados con E. histolytica se

observaron con características de apoptosis, tales como la compactación de la

cromatina y condensación de la envoltura nuclear. Por el contrario, los neutrófilos

incubados en ausencia de la amiba tenían protuberancias en la superficie celular y

heterocromatina nuclear irregular. Estos datos sugieren que la apoptosis de

neutrófilos inducida por Entamoeba contribuye a prevenir la inflamación de los

tejidos, limitando los daños en las lesiones donde la amiba invade (Sim, 2005).

15

1.8. Muerte celular programada La apoptosis o muerte celular programada (MCP), está referida a una forma

específica de muerte celular, proceso que ocurre en los tejidos en condiciones

fisiológicas normales. El nombre de apoptosis fue propuesto por Kerr y Searle

(1972), utilizando un concepto griego de Apo (απο), desde, y Ptosis (πτοσισ),

caída o prolapso de un órgano o parte de él. Glücksmann (1951), fue el primero en

observar la muerte de células durante el desarrollo.

Desde 1972, se han publicado diferentes observaciones referidas a la muerte

celular programada, Kerr y Searle (1972) propuso que la muerte celular

programada era un evento morfogénico normal en el desarrollo de los organismos

multicelulares, describiendo las características morfológicas de células

desintegradas en variados tipos de tejidos (Van Furth, 1998).

La apoptosis constituye por lo tanto un fenómeno fundamental en el desarrollo

embrionario (Bellairs 1961), en la metamorfosis (Goldsmith, 1966), en la atrofia

tisular y la regresión tumoral (Wyllie, 1973; Ucker, 1991) tanto en animales

vertebrados como invertebrados.

Trabajos de Jacobson y colaboradores en 1997 y Lam en el 2004 han descrito que

la MCP ha sido reconocida como un proceso fundamental en los organismos

multicelulares, tanto en animales como plantas. Recientemente, procesos de

muerte celular programada han sido reportados en eucariotes unicelulares, lo que

implica que algunos componentes de la maquinaria de MCP existían a principios

de la evolución de organismos eucariotes.

La apoptosis se caracteriza por una serie de alteraciones morfológicas y

bioquímicas. Ocurre en dos fases: primero un marcaje de la muerte celular,

seguido por una fase de ejecución, caracterizado por dramáticos cambios

16

morfológicos muy característicos en la estructura celular, sugiriendo la presencia

de una maquinaria común en los diferentes organismos (Hsu, 1997).

Los cambios morfológicos que ocurren en las células son: agregación de la

cromatina formando núcleos picnóticos, observables al microscopio óptico;

condensación nuclear y citoplasmática y partición del citoplasma en pequeñas

vesículas llamadas cuerpos apoptóticos que contienen ribosomas, mitocondrias

morfológicamente intactas y material nuclear. Las alteraciones en la disminución

en el volumen celular y la exposición de proteínas específicas en la membrana

plasmática resultan en el reconocimiento y la fagocitosis de células apoptóticas,

evitando así una respuesta inflamatoria (Hsu, 1997) (figura 2).

Ultraestructuralmente, se pierden las uniones estrechas así como de otras

proteínas de la membrana celular. In vivo, estos cuerpos apoptóticos son

rápidamente reconocidos y fagocítados por macrófagos o células epiteliales

adyacentes (Savill, 1993). In vitro, los cuerpos apoptóticos quedan como restos de

células fragmentadas que luego se hinchan y finalmente se rompen, esta fase

terminal en las células in vitro es llamada necrosis secundaria (Wyllie, 1981) .

La muerte celular se puede producir por necrosis, cuando el daño es letal o se

produce una muerte accidental. La necrosis (del griego nekrós “muerte”) es la

muerte patológica de las células o tejidos del organismo. Se origina por una lesión

aguda, irreversible, derivada de una situación no fisiológica o condición patológica

y que no puede ser reparada por mecanismos de adaptación y de resistencia. Ésta

se produce debido a agentes nocivos, condiciones o circunstancias determinadas,

como un aporte insuficiente de sangre al tejido (isquemia), defiencia de oxígeno

(hipoxia), un traumatismo, la exposición a la radiación ionizante, la acción de

sustancias químicas o tóxicos o, por ejemplo, por una infección o por el desarrollo

de una enfermedad autoinmune. Esta forma de muerte celular se califica como un

proceso violento ya que las células se hinchan, las estructuras celulares se

deterioran, y las funciones críticas para la vida se paralizan. La pérdida de

17

viabilidad se asocia a la ruptura de la membrana plasmática con la consecuente

lisis celular y liberación al exterior del contenido citoplasmático y orgánulos,

dañando al tejido en el que se encuentra. La liberación del contenido celular puede

provocar a su vez reacciones inflamatorias importantes (Degterev A, 2008). Los

cambios morfológicos que se observan en una célula necrótica se observan en la

Figura 2.

Figura 2. Esquema comparativo de las características morfológicas de la muerte celular por

apoptosis y por necrosis. Los diagramas muestran los cambios morfológicos que se observan en

las células apoptóticas y en las necróticas. En las micrografías obtenidas mediante microscopía de

transmisión electrónica se compara el núcleo de una célula normal (panel superior) con el de una

célula en la que se ha iniciado el proceso de apoptosis (panel inferior). Tomado de Lizarbe, 2007.

18

Es evidente que la muerte por apoptosis es más limpia que la necrosis; se

detectan cambios morfológicos particulares y la membrana celular, que no se

destruye, engloba a los cuerpos apoptóticos o material celular (Figura 2). Cabe

enfatizar nuevamente que no se produce inflamación ya que las células

fagocitarias reconocen, captan y eliminan los cuerpos apoptóticos. La apoptosis se

puede definir entonces como “el conjunto de reacciones bioquímicas que tienen

lugar en la célula y que determinan su muerte de una forma regulada en respuesta

a una serie de acontecimientos fisiológicos o patológicos”. En este caso, una serie

de estímulos o señales hacen que la célula programe su propia muerte (Vaux D.L,

et al., 1992; Hengartner M.O, et al., 1994)

1.8.1. Moléculas implicadas en el proceso de apoptosis: efectores intracelulares

La apoptosis es un mecanismo evolutivamente conservado. Se ha demostrado

que los mecanismos moleculares de la apoptosis dependen primordialmente de

una familia de proteasas. Estas proteasas tienen la característica en su secuencia

de tener una cisteína en el sitio activo. Esta cisteína va a interactuar, rompiendo

los enlaces peptídicos de los residuos de ácido aspártico en las moléculas diana.

Por eso, las proteínas que inician la apoptosis se denominan caspasas, que van a

mediar los principales cambios morfológicos.

1.8.1.1. La familia de las caspasas Las caspasas son una familia muy regulada y bien conservada de cisteín

proteasas intracelulares. Una vez que se activa la caspasa iniciadora, los procesos

de caspasas efectoras, río abajo son responsables de la apoptosis. Dado que la

señalización de apoptosis mediada por caspasas es irreversible, la activación de

19

procaspasas y caspasas deben ser reguladas en forma precisa para prevenir la

muerte no deseada de la célula huésped (Lu, 2008).

Las caspasas implicadas en la apoptosis se dividen generalmente en dos

categorías: las caspasas iniciadoras, que incluyen a la caspasa 2, 8, 9 y 10, y las

caspasas efectoras, que incluyen a la caspasa 3, 6 y 7. La tercera subfamilia de

caspasas es la de las caspasas procesadoras de citocinas; caspasa 1, 4, 5, 12,

13, 14 (Earnshaw W.C, et al., 1999).

Se ha descrito que las caspasa 1 se activa por la ausencia de factores de

crecimiento, que hidroliza a la caspasa 3 in vitro y que promueve el procesamiento

y activación de la interleucina-1b (IL-1b), sustancia implicada en la muerte

neuronal. En cuanto a la caspasa 2, se sabe que se activa tras su unión a una

molécula adaptadora que a su vez se une a una parte del complejo de

señalización del receptor de factor de necrosis tumoral (TNF). La caspasa activa

puede procesar su propio precursor.

La caspasa 9, que en situación fisiológica se encuentra en su forma inactiva en el

citosol, se activa tras la salida de citocromo c desde la mitocondria. Ante un

determinado daño se produce una alteración en la membrana mitocondrial que

desencadena la salida de citocromo C al citosol. El citocromo C forma entonces un

complejo con el factor activador de proteasa (Apaf-1), dATP y procaspasa 9, lo

que conduce a la activación de la caspasa. Una vez activa, la caspasa 9 puede

activar otras caspasas.

Las caspasas 3, 6 y 7 son las principales responsables de los cambios

morfológicos y bioquímicos que ocurren en las células apoptóticas (Earnshaw

W.C, et al., 1999). Entre sus sustratos se encuentran un factor responsable de la

fragmentación del ADN. Además las caspasas eliminan la poli ADP-ribosa

polimerasa (PARP), molécula implicada en la maquinaria celular que repara el

daño en el ADN. Por otro lado, activan la vía que conduce a la condensación de la

20

cromatina y participan en la destrucción de la lámina nuclear y de las proteínas del

citoesqueleto (Ravichandran K.S, 2007).

1.8.1.2. Proteína p53 La proteína p53 es la que ordena la ejecución de la apoptosis en respuesta a los

agentes que dañan el DNA. Se ha demostrado que la p53 requiere del concurso

de las proteínas p63 y p73 para realizar su acción. Estas proteínas actuarían en

conjunto o en forma paralela a la p53 para inducir la apoptosis. Estudios genéticos

en animales deficientes en estas proteínas así lo han confirmado.

Se ha sugerido que drogas que en realidad son pequeñas moléculas pueden ser

diseñadas para activar a p53 impidiendo la unión a un regulador negativo llamada

Mdm 2. La proteía Mdm 2 se liga a un amino terminal de p53 en una relación

proteína-proteína que bloquea la actividad de p53. Normalmente la proteína p53

actúa como un factor de transcripción, determinando la expresión de una batería

de genes que detienen el ciclo celular o inician el proceso apoptótico (Flores E.R,

et al., 2002).

1.8.1.3. Familia de proteínas Bcl-2 La familia de proteínas Bcl-2 incluye tanto miembros inductores como inhibidores

de apoptosis (Antonsson B, 2001). Los miembros de esta familia se caracterizan

por poseer dominios homólogos a Bcl-2 conocidos como dominios BH, los cuales

se enumeran del 1 al 4. Según la presencia de estos dominios, estas proteínas se

dividen en tres subfamilias: una con miembros de función antiapoptótica

denominada subfamilia Bcl-2 que incluye a los miembros Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Mcl-1

y A1, todos con los cuatros dominios BH, y dos subfamilias de miembros

proapoptóticos: la subfamilia Bax que incluyen a Bax, Bok y Bak con tres dominios

21

BH y la subfamilia BH3 que incluye a Bim, Bid, Bmf, Bad, Hrk, PUMA y NOXA que

como su nombre lo indica sólo poseen un dominio BH3 (Becerra, 2009).

En general, hay dos vías por las cuales las proteasas de la familia caspasa

pueden ser activadas: una es la muerte inducida por la señal, mediada por

receptor de muerte, y la otra es la inducida por el estrés, mediada por mitocondria

(es decir, vía dependiente de la caspasa 9) como se muestra en la figura 3 (Ting-

Jun FAN, 2005).

La vía mitocondrial es activada por estrés intracelular, como por ejemplo el

iniciado por daño al ADN o el desemsamblado de microtúbulos. Por diversas vías,

estos inductores llevan a la activación de un grupo de proteínas denominadas

“solo BH3”, miembros de la familia del oncogén Bcl-2, que se traslocan a la

mitocondria e inhiben a miembros antiapoptóticos de la familia y/o activan

específicamente a dos miembros proapoptóticos: Bak y Bax. Esta activación lleva,

por mecanismos aún no esclarecidos totalmente, a la liberación de diversas

proteínas apoptóticas al citosol, entre las que destacan citocromo c y Diablo. El

primero forma un complejo con la proteína APAF1 y dATP que recluta a la

caspasa 9. Este complejo, denominado apoptosoma, induce la activación de esta

caspasa iniciadora que a su vez corta a las caspasas efectoras 3, 6 y 7, cuya

función final es el corte especifico de una multitud de sustratos celulares que

culminan con la muerte celular apoptótica. Ejemplos de estos sustratos son la

lamina B y el inhibidor de la nucleasa CAD, la cual lleva al corte especifico del

ADN en regiones internucleosomales y al desensamblado del núcleo (Shi, Y,

2002).

Con el fin de prevenir la activación no regulada de las caspasas, las células

eucariotas poseen una familia de inhibidores, conocidos como IAPs (por Inhibitor

of Apoptosis Proteins) que bloquea la actividad de estas enzimas. Existen diversos

miembros de esta familia, entre los que destacan la XIAP, que posee una alta

afinidad por diversas caspasas y la survivina, proteína muy pequeña e interesante,

22

dado a que también tiene una participación en el ciclo celular para que la

apoptosis se lleve a cabo, es necesario que estas proteínas se inhiban y es aquí

en donde participa Diablo (o SMAC). Al ser liberado de la mitocondria, Diablo se

une a las IAPs, permitiendo la activación de las caspasas y, por ende, la apoptosis

(Shi, Y, 2002). A pesar de que la función de Diablo dependiente de las IAPs ha

sido la más estudiada, la descripción de una isoforma de esta proteína, generada

por splicing alternativo, carente del dominio de unión a IAPs, de localización

citosólica y con capacidad de potenciar la apoptosis sugiere claramente que

existen otros mecanismos para la función de Diablo que hasta la fecha no han sido

elucidados (Roberts, 2001) (Figura 3).

Por otro lado, una ruta de señalización del proceso de apoptosis tiene su origen en

la membrana celular a través de lo que se conoce como vía extrínseca o de

receptores de muerte. Estos receptores pertenecen a la superfamilia del receptor

de TNF (TNFR) cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en

cisteína, un dominio transmembrana y una secuencia en su dominio citoplasmático

para acoplar el receptor con el resto de la maquinaría apoptótica. Estos receptores

también participan en el control de otros procesos como la respuesta inmune e

inflamatoria, la homeostasis ósea y el desarrollo y diferenciación de estructuras

epiteliales.

La señal se inicia tras la unión de los correspondientes ligandos (citoquinas pro-

apoptóticas y proinflamatorias como FasL, TNF, etc.) a sus respectivos receptores

de muerte (Fas, TNFR1, TRAILR1, etc.) (Ashkenazi, A, 1998; Danial. N.N, 2004).

La unión del ligando provoca la homotrimerización del receptor y de este modo, el

receptor de muerte es capaz de reclutar proteínas adaptadoras hacia la membrana

celular. Este proceso implica la interacción homofílica entre los dominios de

muerte DD (Death Domain) de los receptores con los de las moléculas

adaptadoras (proteínas puente entre el receptor y la caspasa) como la proteína

FADD (Fas Associated Death Domain). Las moléculas adaptadoras poseen los

dominios efectores de muerte DEDs capaces de interaccionar homofílicamente

23

con algunos miembros de la familia de las caspasas provocando su activación.

Así, se forma un complejo de señalización de muerte (DISC; Death-Inducing

Signaling Complex) que contiene a la proteína FADD y las caspasas 8 o 10. La

activación de la procaspasa-8 requiere su asociación con la molécula adaptadora

FADD a través de los dominios DED, situándose la caspasa-8 en la vía apoptótica

mediada por receptores de muerte (Muzio, M, et al., 1996; Medema, J. P, et al.,

1997). La caspasa-8 se activa, dirigiendo de esta forma la ejecución de la

apoptosis ya que, a su vez, activa a las caspasas ejecutoras. Además, la caspasa

3 puede eliminar un dominio de la proteína Bid amplificando la señal de muerte

celular ya que causa un daño a la mitocondria.

Además, a través de la vía de señalización de los receptores de muerte, la

activación de las caspasas puede ser regulada por la proteína FLIP (Flice-like

Inhibitory Protein). Ésta contiene el dominio DED, lo que le permite unirse al

predominio de la procaspasa-8 bloqueando la interacción de dicha caspasa con

los complejos receptor-proteína adaptadora e interfiriendo en el proceso

apoptótico (Lizarbe, 2007).

24

Figura 3. Vías apoptóticas. La apoptosis puede llevarse a cabo a través de la vía extrínseca,

mediada por receptores de muerte o, por la vía intrínseca, en donde participa activamente la

mitocondria al liberar diversas proteínas pro-apoptóticas. Estas vías no son excluyentes y

convergen en la activación de las caspasas, que son las principales ejecutoras de la apoptosis.

Tomado de Lizarbe, 2007.

25

1.9. ANTECEDENTES 1.9.1. MCP en protozoarios La muerte celular programada (MCP) ha sido considerada un mecanismo de

desarrollo, diferenciación y control de proliferación de metazoarios. Sin embargo,

evidencias encontradas indican que MCP está también presente en organismos

unicelulares en determinadas condiciones, como los que se resumen en la Tabla 1

(Christensen S. T, 1998; Bruchhaus, et al., 2007). Las formas de MCP así como

procesos de apoptosis y necrosis han sido identificados en varias bacterias,

levaduras, dinoflagelados, ciliados y parásitos protozoarios como Trypanosoma

(Nguewa et al., 2004), Leishmania (Nguewa et al., 2004), Plasmodium (Al-Olayan

et al., 2002) y Entamoeba histolytica (Ramos, et al., 2007).

Tabla 1. MCP en diferentes parásitos protozoarios.

Parásitos protozoarios Señal de la MCP

Plasmodium spp.

Fragmentación de DNA

Exposición de fosfatidilserina

Desintegración parasitaria

Leishmania spp.

Condensación de la cromatina

Fragmentación del DNA

Liberación de citocromo C

Exposición de fosfatidilserina

Activación de proteasas

Trypanosoma cruzi

Fragmentación del DNA

Condensación de la cromatina

Pérdida del potencial transmembranal

mitocondrial

Activación de proteasas

Trichomonas vaginalis

Condensación de la cromatina

Fragmentación del DNA

26

Cuerpos apoptóticos

Giardia lambia

Condensación de la cromatina

Fragmentación del DNA

Cuerpos apoptóticos

Vacuolización citoplasmática

Blastocystis hominis

Vacuolización citoplásmica

Fragmentación del DNA

Contracción celular

Dyctyostelium discoideum

Vacuolización

Condensación de la cromatina

Condensación citoplásmica

Degradación del DNA

Exposición de fosfatidilserina

E. histolytica

Condensación de la cromatina

Fragmentación del DNA

Incremento de Ca 2 + citosólico

Disminución de K + intracelular

En protozoarios, el patrón de eventos de la MCP es similar al observado en las

células de metazoarios; se comparten eventos como la destrucción de la

organización estructural normal del núcleo debido al colapso de la cromatina en

masas electrodensas y, en muchos casos, la ruptura del DNA nuclear en

fragmentos oligonucleosomales. Se considera que la falta de regulación en la

homeostasis del calcio conlleva a importantes eventos de muerte celular en los

parásitos, ya que la mayoría muere en presencia de concentraciones altas de

calcio más que en ausencia de este ión (Fernández-Presas, 2000).

Es evidente que la MCP no está limitada a los eucariontes superiores, si no que

es un evento generalizado, presente en la mayoría de los seres vivos. A

continuación se describen evidencias de MCP en algunos parásitos más

estudiados.

27

1.9.1. MCP en Leishmania Leishmania es un parásito protozoario miembro del orden Kinetoplastida. Es el

agente causante de una de las parasitosis humanas más importantes que puede

conducir, de acuerdo a las especies, desde lesiones mucocutáneas y/o hasta

infección visceral generalizada. La forma promastigote del parásito, flagelado y

extracelular, reside en el intestino medio del vector insecto, la hembra de

flebótomo (Phlebotomus). Se diferencia de una proliferación procíclica no

infecciosa a promastigotes metacíclicos infecciosos que no se dividen. Después

de la picadura por el mosquito, el parásito infecta a los macrófagos del huésped

mamífero y se diferencia en amastigotes que pueden sobrevivir y dividirse en los

fagolisosomas de los macrófagos (Zangger, et al., 2002).

La carencia de nutrientes es uno de los factores que activan la MCP; se analizaron

los cambios de MCP en cultivos de promastigotes (en el intestino del insecto) y

amastigotes (en los vertebrados) de diferentes especies de Leishmania en la fase

estacionaria, donde mostraron un patrón de fragmentación del DNA en múltiples

tamaños oligonucleosomales, siendo esta consistentemente más fuerte en los

promastigotes de L. donovani que los amastigotes axénicos, sugiriendo que los

promastigotes son mas susceptibles a la fragmentación del DNA que los

amastigotes, resultado de la falta de nutrientes (Lee, et al., 2002).

Además, también hay estudios que evidencian la MCP en respuesta a las drogas.

Lee y colaboradores (2002), demostraron que durante la MCP en L. donovani, en

parasitos que fueron tratados con pentostam o anfotericina B, se presentaron

algunas características como la fragmentación del DNA en el núcleo, la

externalización de fosfatidilserina, la disminución del potencial de membrana, así

como la probable activación de caspasas (Lee, et al., 2002).

La fosfatidilserina (PS) es una proteína que se localiza en la superficie de las

células apoptóticas, éstas, son reconocidas por fagocitos vecinos participando en

28

eliminación de la inflamación. Una característica ventajosa del proceso y que

resulta un concepto interesante es que la apoptosis puede funcionar sin la muerte.

Leishmania spp. son capaces de evadir la actividad de los fagocitos y ellos

mismos establecerse como parásitos intracelulares obligados mediante la

exposición de PS y la inhibición de la actividad de los macrófagos, es decir, la

exposición de PS participa en la internalización de amastigotes. El reconocimiento

del resto por lo macrófagos induce la transformación de la secreción del Factor de

crecimiento (TGF-β) y la síntesis de interleucina 10 (IL-10), inhibe la producción de

NO, y aumenta la susceptibilidad del crecimiento intracelular de Leishmania

(Freitas, et al., 2001).

Estudios realizados por Moreira (1995) han demostrado que la muerte de

promastigotes de Leishmania amazonesis se encuentra modulada por iones de

calcio, ya que en los promastigotes sometidos a choque térmico se induce un

incremento de tres a cuatro veces los niveles de calcio. Se ha encontrado, en

cerca de 20% de estos parásitos, un patrón de rompimiento de DNA

internucleosomal típico y características morfológicas sugerentes de MCP. Las

lesiones tipo apoptóticas observadas en leishmanias son claramente de origen

nuclear, y escasamente se observan en los organelos citoplásmicos, incluyendo el

mitocondrión (Moreira, et al., 1995). Se ha observado también una separación

extensa entre el cuerpo y la membrana flagelar, patrón distinto al observado en

promastigotes que mueren por necrosis; también encontrado durante el choque

térmico. Finalmente, se ha señalado que las endonucleasas dependientes de Ca 2+ responsables de la apoptosis actúan exclusivamente en el núcleo, lo cual

concuerda con el hallazgo de que el mitocondrión se encuentra intacto cuando las

alteraciones nucleares ya son detectadas (Moreira, et al., 1995).

Una de las ventajas evolutivas conferidas por la MCP podría incluir la selección

constante de los parásitos más aptos, y la estricta regulación del ciclo celular y la

diferenciación celular en respuesta a los cambios ambientales (Chandrima Shaha,

2006).

29

1.9.2 MCP en Trypanosomas Se ha observado que Trypanosoma cruzi tiene la capacidad de autorregular su

crecimiento. Los epimastigotes proliferantes de T. Cruzi en cultivo, sufren MCP

masiva durante la diferenciación de G0/G1, deteniendo a los parásitos en la fase

de tripomastigotes (fase estacionaria de crecimiento). La muerte puede ser

prevenida o acelerada mediante la modificación de las condiciones de cultivo,

sugiriendo que los tripanosomas reciben señales extracelulares para la regulación

de su sobrevida y/o diferenciación (Ameisen J. C., 1995). La falta de renovación

del medio de cultivo en parásitos crecidos en medio monofásico puede propiciar

que una porción de epimastigotes se diferencie en tripomastigotes metacíclicos

infectivos, mientras que un número significativo de epimastigotes muere. Los

parásitos muertos aparecen como células esféricas con un largo flagelo y

muestran patrones citoplásmicos y nucleares que sugieren apoptosis, como la

fragmentación del DNA en escalera (Billaut-Mulot, 1994).

La inducción de MCP por drogas ha sido estudiado últimamente, Poliana Deolindo

y colaboradores (2005) determinaron el tipo de muerte inducida a epimastigotes

de T. cruzi por el veneno de Bothrops jararacá, que es una serpiente de la familia

Viperidae (Bochner & Struchiner 2003). El crecimiento del parásito fue inhibido

después del tratamiento con el veneno, observándose que el 50% del crecimiento

fue inhibido con 10 mg / ml. Ultraestructuralmente se observó la desorganización

del cinetoplasto y del mitocondrión, además de la condensación citoplásmica y la

pérdida del potencial de membrana mitocondrial. Al aumentar el tiempo de

incubación, la fosfatidilserina se expuso en la parte externa de la membrana

plasmática, seguido de la activación de caspasas, y la fragmentación del DNA.

Estos resultados indican que el estrés inducido en los epimastigotes por el

veneno, activa un proceso de muerte celular programada, similar a la apoptosis de

los metazoos, lo que conduce a los parásitos a la muerte (Poliana Deolindo,et al.,

2005).

30

Por otro lado, el tratamiento de los parásitos T. cruzi con el antibiótico geneticina

(G418) indujo la muerte celular de epimastigotes mostrando una selectiva

localización del factor de elongación 1-α en el núcleo de los parásitos muertos

(Billaut-Mulot, et al., 1996), sugiriendo la participación de este factor en la

regulación genética de la MCP.

1.10 MCP en E. histolytica Un fenómeno importante en el proceso de fisiopatogénesis de Entamoeba

histolytica es la inducción de la MCP (Stauffer, 2003) a una variedad de células del

huésped, incluyendo los leucocitos (Berninghausen, 1997), los macrófagos, las

células hepáticas (Seydel, 1998), por mecanismos dependientes de contacto

mediados a través de la interacción de galactosa-N-acetil-D-galactosamina del

parásito y la lectina de superficie del huésped (Bruchhaus, et al., 2007),

permitiendo el establecimiento del patógeno y la infección, así como la evasión a

la respuesta inmune.

Por otro lado se ha demostrado que la MCP también se presenta en E. histolytica,

inducida por especies reactivas de oxido nítrico (Ramos, et al., 2007). Los

parásitos que se incubaron durante 1 h con NOs desarrollaron 6 h más tarde la

MCP, resultando la fragmentación del DNA y niveles bajos de ATP. El inhibidor de

la caspasa Z-VAD-FMK inhibió totalmente la actividad de cisteín proteasas (CPA),

pero no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis. Por otro lado, Ghosh, utilizando

peróxido de hidrógeno (Ghosh, 2010); demostró varias características

morfológicas en el parásito cuando se expone a H2O2 que son idénticas al fenotipo

de MCP de otros metazoos, observando una contracción de la célula, la

fragmentación del DNA, el aumento de las especies reactivas de oxígeno cuando

se expone a 2,0 mM de H2O2. Aunque en el genoma del parásito no se han

encontrado homólogos de caspasas de mamíferos, si codifica para una gran

cantidad de cisteín proteasas que pueden asumir la función de las caspasas. Sin

31

embargo, el estudio indica la existencia de cisteín proteasas independientes de

muerte celular programada en el parásito ya que el E-64 que es un inhibidor

específico de la cisteín proteasa no pudo rescatar a las células de una MCP como

apoptosis inducida por H2O2.

Nuestro grupo de trabajo determinó que el tratamiento con antibióticos como

aminoglicósido G418 (Villalba, 2007) y la emetina (Villalba, 2007a) induce MCP

en este parásito. Las micrografías electrónicas de los trofozoítos tratados con

G418 revelaron características de MCP, los trofozoítos sin tratamiento presentaron

un núcleo de 4-7 µm de diámetro, con un endosoma central y presencia de

cromatina periférica en la membrana nuclear; después de la incubación con G418,

la amiba mostró una forma redondeada mostrando condensación nuclear,

formación de cuerpos de inclusión y vacuolización citoplasmática, con la pérdida

aparente de la membrana nuclear; algo muy importante es que durante el tiempo

de exposición al fármaco, la membrana plasmática se mostró integra, siendo esto

una característica de la apoptosis.

Las primeras evidencias durante la apoptosis, son lesiones ultraestructurales en

la organización de la cromatina conduciendo a la aparición de fragmentos de DNA

(300 y/o 50 kb) (Walker et al., 1991; Tomei et al., 1993), en este estudio se

observó un patrón de DNA en escalera en gel de electroforesis, resultando

fragmentos de 180-200 pb y múltiples de estos. Es obvio que la incubación de

trofozoítos de E. histolytica con G418 da lugar a un fragmentación del DNA pero

no se detectó por análisis de gel electroforético, ya que se observó un DNA

degradado y las bandas en escalera eran débiles, sin embargo, el DNA

condensado y el corte sin desintegración de la membrana fue observado por

microscopía electrónica de transmisión. Mediante la prueba de TUNEL que es

altamente sensible para confirmar un proceso de suicidio intracelular, se observó

una reacción positiva en los trofozoitos induccidos a MCP con G418. E-64 que fue

un inhibidor específico de cisteín protesas, bloqueo la degradación del DNA, esto

se demostró por geles electroforéticos, TUNEL y la ultraestructura de los

32

trofozoítos por microscopia electrónica, lo cual sugiere fuertemente que al menos

una de las cisteín proteasas reportadas participan en la inducción de MCP por

G418. Estos resultados contrastan con los publicados por Ramos et al. (2007),

donde el autor especula que especies de oxído nítrico induce apoptosis

independiente de cisteín proteasa. Esta afirmación se basa en el hecho de que el

tratamiendo con E-64 falló en abolir la muerte de trofozoítos, sin embargo, no se

llevaron a cabo experimentos para determinar los efectos a niveles

ultraestructurales y moleculares de la MCP.

Durante las etapas tempranas de la apoptosis en eucariotes, se produce la

translocación de PS, desde el interior a la capa externa de la membrana

plasmática (Gatti et al., 1998). Para determinar este fenómeno se utilizó citometría

de flujo y anexina V-FITC que se une con afinidad a PS, siendo esto negativo para

trofozoítos tratados y no tratados con G418, ya que una de las razones es que la

PS forma menos del 10% de los lípidos de membrana de E. histolytica, reportado

por Aley et al. (1980), mientras que Martin et al. (1993) no detectó PS como

constituyente de la membrana de E. histolytica, mediante espectroscopia 31P-

NMR, sin embargo reporta que los principales fosfolípidos es fosfatidilcolina y dos

especies de fosfatidiletanolamina. Debido a los resultados se sugiere que la

abundancia de PS es insuficiente para la detección por el método usado, o que la

membrana plásmatica de E. histolytica no contiene PS o que PS interactúa con

otros componentes que bloquean su interacción con anexina V.

Una de las características bioquímicas que se producen por la MCP en trofozoítos

tratados con G418 es la disminución de Ki+ del 90% en comparación con los

trofozoítos no tratados, esto observado mediante citometría de flujo. En este

estudio también se mostró que en E. histolytica inducida a MCP por G418 hubo un

incremento dos veces los niveles de ROS intracelular. A su vez, el estrés oxidativo

causan incremento de los niveles de Ca2+ citosólico (Jiang et al., 1994),

observándose en este estudio un significante incremente de [Ca2+]i en

trofozoítos inducidos a MCP. Como consecuencia de la sobreproducción de ROS

33

y la pérdida de Ki+, la disminución del pHi fue observado en trofozoítos inducidos a

MCP.

Recientemente, Sánchez y colaboradores (2010), investigaron la expresión

diferencial de genes durante de la inducción de MCP. Mediante cDNA-AFLPs se

comprobó que el proceso de muerte en los trofozoítos inducido por G418 está

asociado con un mecanismo activo que involucra la síntesis de proteínas

específicas, incluyendo: Glutaminil-tRNA sintetasa, Subunidades ribosomales 40S

y 18S, Sir-2 y Graininas que pudieran estar implicadas en la regulación de rutas

apoptóticas como reguladores negativos de MCP, por ejemplo, las graininas,

donde el fenómeno se caracteriza por un incremento temprano de calcio citosólico,

el hecho de que la expresión de las graininas disminuya al paso del tiempo de

interacción con las células inflamatorias , sugieren fuertemente que los trofozoítos

activan mecanismos moleculares que disparan la recaptura de calcio citosólico, es

decir , una respuesta compensatoria para disminuir el calcio intracelular libre,

probablemente teniendo una actividad anti-apoptótica. y a tiempos largos de

interacción aumentan genes con probable actividad apoptótica suprimiendo la

expresión de gene anti-apoptóticos, Por otro lado, se observó la expresión del gen

Saponina-like, que pudiera estar actuando como un regulador positivo de

apoptosis, activando algunas rutas de muerte celular programada. Estos

resultados dan evidencia de los primeros genes identificados durante estadios

tempranos de MCP en E. histolytica, que pudieran estar regulando negativa o

positivamente a la apoptosis; concluyendo que este evento molecular es regulado

genéticamente.

De esta manera se sugirió que los trofozoítos de E. histolytica puede inducir la

apoptosis de la célula huésped, lo que correlaciona con la virulencia del parásito.

Y por otro lado, son capaces de evadir la respuesta inflamatoria contribuyendo a

la supervivencia de otros parásitos. Los estudios mencionados anteriormente han

demostrado que trofozoítos de E. histolytica son sometidos a MCP in vitro, sin

embargo, no estaba claro si éste proceso sucede in vivo de la célula huésped. En

34

este caso, Villalba y colaboradores (2011) estudiaron la MCP de trofozoítos de E.

histolytica como parte de un evento in vivo relacionado con la reacción inflamatoria

y la interacción huésped-parásito, con la finalidad de entender mejor el mecanismo

de MCP después de la interacción entre células inflamatorias y amebas. Se diseñó

un nuevo modelo in vivo utilizando una bolsa de diálisis que contenía trofozoítos

de E. histolytica, colocada quirúrgicamente dentro de la cavidad peritoneal de

hámsters y se dejó interactuar con los componentes de exudado peritoneal del

huésped. Las amebas recogida de las bolsas se examinaron entonces por

ensayos de TUNEL y microscopía electrónica de transmisión, siendo muy evidente

la condensación nuclear y la fragmentación del DNA tanto de los trofozoítos como

de las células inflamatorias, esto se observó después de la exposición al exudado

peritoneal, que se compone principalmente de los neutrófilos y los macrófagos.

Los resultados mostraron que el 90 %de las células inflamatorias y el 70 % de los

trofozoítos fueron positivos para los ensayos de TUNEL a las 6 h; sugiriendo que

la producción de óxido nítrico por las células inflamatorias podrían estar

involucrados en la MCP de trofozoítos y que la población restante de los

trofozoítos que sobreviven son resistentes a la MCP (Villalba, 2011). El hecho de

que haya un porcentaje de trofozoítos sobreviviendo después de la interacción

podría representar un mecanismo de virulencia y patogenicidad, ya que los

parásitos más aptos podrían sobrevivir evadiendo el sistema inmune, y así

propagar su genoma, garantizando la supervivencia y el establecimiento de la

infección. Estos resultados son útiles para una mejor comprensión del mecanismo

de MCP mediante un sistema in vivo, ya que la MCP parece jugar un papel

destacado en la interacción huésped-parásito.

Un estudio molecular de los genes encontrados en estados tempranos de MCP en

E. histolytica anteriormente mencionados in vitro e in vivo, permitirá elucidar de

que manera podrían estar implicados en la apoptosis y a su vez en la participación

en la interacción huésped-parásito para identificar blancos terapéuticos y ser de

gran ayuda para desarrollar estrategias terapéuticas efectivas, activando la MCP

en E. histolytica para combatir la amebiasis.

35

Recientemente, se está analizando en el mismo modelo experimental in vivo, la

expresión diferencial global de genes implicados en la MCP de E. histolytica,

mediante microarreglos de expresión, resultando que bajo estas condiciones la

regulación de la expresión de 39 genes de trofozoítos de E. histolityca disminuyó a

partir de los 30 min y aun más a los 90 min de interacción con las células

inflamatorias, algunos de estos genes se relacionan con mecanismos

antiapoptóticos, por ejemplo, las graininas, comprobando algunos resultados del

trabajo de Sánchez en el 2010.

Considerando que la MCP podría ser un importante evento en la patogénesis de la

amibiasis y que se aislaron y caracterizaron genes involucrados en la

regularización de las fases tempranas de este fenómeno. Se ha postulado la

inducción de ciertas proteínas efectoras específicas (Sánchez, et al., 2010)

responsables de los cambios morfológicos y ultraestructurales además de los

cambios bioquímicos que representa la fase de ejecución ocurrida entre el tiempo

de 9 y 12 h después de la incubación con G418 (Villalba 2007, 2011).

En el estudio publicado por Sánchez y colaboradores en el 2010 se evaluó el

grado de la síntesis de proteínas de novo durante la MCP in vitro (Sánchez, et al.,

2010); los resultados sugieren que los trofozoítos inducidos a MCP producen una

fuerte síntesis proteíca desde los primeros minutos, es decir que fue evidente el

incremento del rango de incorporación de metionina [35S] teniendo un pico máximo

de 5348 cpm/ml a los 90 minutos de incubación con G418, para posteriormente

regresar a niveles basales de incorporación después de las 3 horas. Derivado de

estos estudios, es clara la importancia no solo de conocer la expresión genética de

los trofozoítos durante la MCP si no también conocer que proteínas efectoras

están participando en la ejecución de este mecanismo, siendo el uso de la

proteómica una alternativa viable para la obtención de dicho conocimiento.

36

1. 10. Proteómica

El proteoma está formado con todas las proteínas que se expresan a partir del

genoma de un organismo (Wilkins MR, et al., 1996). La proteómica nos permite la

identificación de las proteínas, el conocimiento de su estructura primaria en su

secuencia de aminoácidos, la identificación de sus modificaciones

postraduccionales, su localización y la cuantificación de la expresión proteica

(proteómica cuantitativa) (Aebersold R, et al., 2003, Hanash S, et al., 2003, Steen

H, et al., 2004).

El término para esta nueva disciplina fue acuñado por el Dr. Fred Sanger a

mediados de los 80 como una rama de la genética y biología molecular. Este

término fue utilizado a mediados de los 90 como una rama o disciplina adicional a

la naciente genómica. Estos términos junto con otras “ómicas” se refieren al

estudio de sets completos de genes, proteínas, metabolitos, enzimas, rasgos

fenotípicos, etc… Todas estas disciplinas han evolucionado rápidamente gracias a

los avances tecnológicos en la última década. Este conocimiento nos ha ayudado

a entender mejor cómo el genoma y su expresión tiene impacto en la génesis de la

enfermedad, así como en su comportamiento biológico y por lo tanto en el

pronóstico clínico. La utilización de este conocimiento ha mejorado el diagnóstico y

clasificación de muchas enfermedades humanas, teniendo un impacto real y

práctico en la medicina clínica (Velásquez-Fernández. 2011).

1. 11. Herramientas de la proteómica

Una de las principales herramientas de la proteómica es la electroforesis

bidimensional en geles de poliacrilamida (2D-PAGE) (Anderson NL, et al., 2000).

Esta técnica permite separar miles de proteínas en un solo experimento, y

constituye actualmente el método más eficiente para la separación de mezclas

muy complejas de proteínas. Esta tecnología ha existido por tres décadas y está

37

basada en una separación de las proteínas en función de la carga, seguida de una

separación de las proteínas en función de su masa molecular. La separación de la

primera dimensión se realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las

proteínas se separan en un gradiente de pH hasta alcanzar una posición en la que

su carga neta es cero, es decir, su punto isoeléctrico (pI). En una segunda

dimensión, las proteínas se separan por su peso molecular (PM) mediante

electroforesis. Posteriormente para la visualización de las proteínas se utiliza la

tinción con azul de Coomassie, con plata o tinciones más sensibles como SYPRO

Ruby y Deep Purple (Gil C, et al., 2003).

La otra herramienta clave para la proteómica es la espectrometría de masas

(Mass Spectrometry, MS), que lleva a cabo la identificación de las proteínas

(Wittke S, Mischak H, et al., 2005). Para analizar las proteínas mediante MS deben

ser convertidas a péptidos mediante proteólisis, generalmente con tripsina. Los

péptidos generados se convierten en iones en fase gaseosa mediante técnicas de

ionización suave, como láser asistida por matriz de desorción / ionización (Matrix

Assited Laser Desorption Ionisation, MALDI). Posteriormente los iones son

separados de acuerdo a su relación masa-carga (M/Z) en un analizador de masas

tipo ToF (Time of Flight). Los datos obtenidos son analizados mediante software

disponibles en la red como MASCOT en www.matrixscience.com, este software

hace búsquedas en base de datos para determinar la secuencia de las proteínas

(Aebersold R, et al., 2003).

La proteómica incluye diversos campos de investigación:

• La identificación de las proteínas expresadas por un organismo en una

condición dada (proteómica descriptiva o estructural, todas las proteínas

expresadas en un momento y en un contexto).

• La identificación de los cambios en el nivel de expresión de proteínas

asociadas a cambios en las condiciones del organismo (proteína

38

comparativa, cuáles proteínas cambian cuando un organismo se somete a

condiciones diferentes).

• La identificación de conjuntos funcionales de proteínas, es decir, grupos de

proteínas que se localizan en un mismo sitio celular y que operan en mutua

interacción (interacciones proteína-proteína, proteómica funcional)

• La identificación de las proteínas que forman un organelo (este enfoque

conduce a la elaboración de un mapa molecular de la célula).

1. 12. Análisis proteómico de E. histolytica

El proteoma de E. histolytica en cultivos axénicos se ha analizado por

electroforesis de gel en dos dimensiones (2-DE), empleando un procedimiento

práctico y eficaz para la solubilización de las proteínas de E. histolytica.

Aproximadamente 900 especies de proteínas en el intervalo de pH entre 4 y 7

fueron detectados por tinción con Coomassie Blue. 95 spots fueron degradados

enzimáticamente con tripsina y se sometieron a espectrometría de masas. Los

datos resultantes de las huellas peptídicas, es decir las masas de péptidos fueron

comparados con las bases de datos disponibles en el genoma de E. histolytica y

Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para la identificación y

categorización de las proteínas. 63 de las proteínas identificadas se postula que

se relacionan con el citoesqueleto, la superficie, la glucólisis, el metabolismo del

DNA / RNA, el sistema ubiquitina-proteasoma, el tráfico vesicular y transducción

de señales. Este estudio constituye uno de los primeros que demuestran que los

genes correspondientes son en efecto expresados en E. histolytica y proporciona

una base para posteriores estudios proteómicos de este parásito (Tolstrup 2006).

Por otro lado, para identificar los factores de virulencia de E. histolytica, se definió

por primera vez los fenotipos de dos cepas: HM-1: IMSS (cepa virulenta) y E.

histolytica Rahman (cepa que se informa menos virulento que el HM-1: IMSS). Se

utilizó electroforesis- 2D (DIGE) diferencial para comparar el proteoma de Rahman

39

y HM-1: IMSS, identificando proteínas que fueron diferencialemente expresadas

cerca de un nivel de cinco veces más, entre los dos microorganismos. Esto incluía

dos proteínas con propiedades antioxidantes (Peroxirredoxina y superóxido

dismutasa), y tres proteínas de función desconocida; grainina 1, 2 y unas proteína

que contiene un LIM-dominio (Paul H. Davis, et al., 2006).

Otro resultado de análisis proteómico en ameba, señala que la glucosa tiene un

papel en la modulación de la virulencia de este parásito, se examinó si la

virulencia del parásito podría ser influenciada por la privación de glucosa (GS). El

comportamiento migratorio del parásito y su capacidad para matar las células de

eucariotes y la lisis de los eritrocitos está fuertemente reforzado por la GS. Con el

fin de obtener información sobre el mecanismo que subyace la GS en los efectos

sobre potenciar la virulencia, se analizaron las diferencias en los niveles de

expresión de proteínas en el control de la glucosa y privación en los trofozoitos,

por análisis proteómico cuantitativo, observado que río arriba hay una proteína de

unión al elemento regulador 3 (URE3- BP), un factor de transcripción que modula

la virulencia E.histolytica, y la proteína rica en lisina-1 (KRiP1), que se induce

durante la el desarrollo de absceso hepático, se reguló por la GS. Se analizaron

también las fracciones de membrana de E. histolytica, determinando que la

subunidad ligera LgL1 de lectina Gal / GalNAc es regulada por la GS.

Sorprendentemente, el amoebapore A (AP-A) y la cisteína proteinasa A5 (CP-A5),

dos importantes factores de virulencia de E. histolytica, fueron fuertemente

reguladas por la GS. Mientras que el efecto potenciador de la virulencia por GS en

E. histolytica se conserva en cepas silenciadas para AP-A y PP-A5, y la perdida

en LgL1 y KRiP1 en cepas bajamente reguladas (Ayala Tovy, et al., 2011).

Sin embargo, hasta la fecha de la realización de esta tesis no se han reportado

otros estudios comparativos que muestren la expresión diferencial de proteínas en

algún mecanismo celular relacionado con el proceso de MCP en patogenicidad del

microorganismo.

40

2. JUSTIFICACIÓN

La MCP es un factor importante en este parásito, ya que no solo es capaz de

inducir apoptosis a las células efectoras del sistema inmunológico si no también es

capaz de inducir y regular su propia muerte celular, siendo esto un mecanismo de

evasión de la respuesta inmune. Por lo tanto, este mecanismo podría ser un

elemento importante dentro de la fisiopatogénesis de la amebiasis. El mecanismo

de MCP podría conferir ventajas adaptativas al parasito de limitar el número de

parásitos en el huésped, habilitando la propagación de tan sólo aquellos parásitos

más aptos, regulando así el tamaño de la población, favoreciendo la

supervivencia, proliferación y replicación del resto de la población de parásitos,

permitiendo por lo tanto, el establecimiento de este patógeno y a su vez la

infección.

El proceso de MCP in vivo reduciría de esta manera el proceso inflamatorio

evitando que células inflamatorias lleguen al sitio de infección, es decir evadiendo

la vigilancia del sistema inmunológico. Recientemente, nuestro grupo demostró

que la MCP es un proceso que involucra la expresión de genes anti-apoptóticos

en fases tempranas de la inducción del fenómeno, seguido por la expresión de

genes pro-apoptóticos en fases intermediarias que dan lugar a la codificación de

moléculas efectoras y/o proteínas específicas de la fase de ejecución que

permiten los cambios bioquímicos, morfológicos y ultraestructurales que marcan y

promueven la MCP.

Por esto, el estudio o el análisis proteómico de la apoptosis en E. histolytica

permitirá identificar las proteínas específicamente expresadas durante el proceso,

lo que a su vez permitirá conocer las moléculas efectoras, así como las proteínas

reguladoras de este fenómeno. Este conocimiento podría ser empleado en el

desarrollo de estrategias que contribuyan a generar drogas o terapias efectivas en

contra de la amebiasis, basadas en la activación MCP y por otro lado permitiría

entender los mecanismos moleculares que el parásito pone en juego durante la

interacción huésped-parásito.

41

3. HIPÓTESIS

En virtud de que se ha demostrado que la MCP es un evento genéticamente

controlado en el que en fases tempranas se inducen eventos anti-apoptóticos y

pro-apoptóticos, mediante un análisis proteómico durante distintos estadios de la

MCP, se podrán identificar diversas proteínas que participan en dichos

mecanismos.

42

4. OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar el perfil proteómico de la MCP en Entamoeba histolytica

inducida por G418.

Objetivos Específicos

Caracterizar el perfil proteómico de trofozoítos inducidos y sin inducir a

MCP.

Identificar proteínas específicas expresadas durante las distintas fases de la

MCP.

Identificar proteínas específicas que pudieran estar involucradas en

mecanismos pro-apoptóticos y anti-apoptóticos.

43

5. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL

CA - (HM1:IMSS) E. histolytica

Trofozoítos sin inducir a MCP Trofozoítos inducidos a MCP con G418 a diferentes tiempos.

1-D: Migración de proteínas por su PI.

2-D: Migración de proteínas por PM.

Extracción y Purificación de proteínas

Separación de proteínas:

1-D 2-D

Visualización proteíca y análisis de la imagen (gel).

Identificación

(MALDI-TOF)

Huella peptídica

Homología proteíca (Base de datos)

44

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Cultivo de E. histolytica

Se utilizó la clona A de la cepa HM1:IMSS, y se cultivó axenicalmente en medio

TYI-S-33 suplementado con penicilina 100 U y estreptomicina 100 µg/ml a 37 °C.

Se cultivaron 8 millones de trofozoítos para cada tiempo de interacción con el

antibiótico.

6. 2. Inducción de la apoptosis con G418

Una vez observados los cultivos confluentes, se indujo la MCP adicionando G418

(10 µg/ml) a diferentes tiempos de exposición al antibiótico (0, 1 ½, 3, 6, 9 h).

6.3. Obtención de proteínas

Terminados los distintos tiempos de incubación, los trofozoítos se cosecharon

colocando las cajas de cultivo durante 10 min en hielo para despegarlos, se

centrifugaron a 1500 rpm/10 min y se lavaron con 10 ml de PBS pH 6.8 tres veces,

y un lavado final de 10 ml deTris 10 mM pH 6.8 para eliminar el exceso de las

sales contenidas en el PBS, ya que estas interfieren en la conductividad de la

muestra y en el enfoque de las proteínas. Una vez lavadas las células, se hicieron

alícuotas de cada condición, a estas se le adicionó 40 µl de inhibidores de

proteasas (complete de Roche) y se almacenaron a -20 °C hasta su uso.

45

6.4. Lisis de los trofozoítos

Se tomaron alícuotas de cada condición para lisar los trofozoítos por

congelamiento/descongelamiento, se colocaron 100 µl de buffer de lisis o de

muestra (urea 7M, tiourea 2M, 4% p/v CHAPS, 40 mM p/v ditiotreitol (DTT) y 2%

v/v IPG buffer de 3-10 NL(GE Healthcare) (anexo 1), se homogenizó y se congeló

en nitrógeno líquido, se trituró con un pistilo tipo simple Grinding, una vez

descongelada la muestra se volvió a congelar y se a triturar dos veces más. Este

procedimiento se realizó de manera independiente para cada muestra.

6. 5. Precipitación proteíca

Una vez lisadas las células de cada condición se procedió a concentrar y/o

precipitar las proteínas con ácido tricloroacético(TCA) -acetona fría.

Cada muestra se aforó a 900 µl con agua milliQ y se adicionaron 100 µl de una

solución de 77% de TCA y 23% de acetona fría, se realizó homogenización por

inversión y se dejó 30 minutos a 20°C. Se centrifugó a 15000 g por 10 minutos, se

decantó el sobrenadante y la pastilla se lavó tres veces con 400 µl de acetona fría

centrifugando a las mismas condiciones 5 minutos, se adicionaron 40 µl de

inhibidores de proteasas (complete de Roche) para evitar que las proteínas se

degradaran y posteriormente 250 µl de buffer de hidratación (urea 7 M, tiourea 2

M, 2 % p/v CHAPS, 10 mM DTT y 0.2% v/v IPG buffer de 3-10 NL(GE Healthcare)

(anexo 2). Las alícuotas se guardaron a -20°C hasta su uso.

6.6. Cuantificación proteíca

Para la cuantificación se usó el kit 2-D Quant (GE Healthcare), de acuerdo a las

especificaciones del proveedor (anexo 3) el cual está diseñado para la

46

determinación precisa de la concentración de proteína en las muestras a ser

analizadas por técnicas de alta resolución de electroforesis, tales como

electroforesis 2-D, SDS-PAGE o IEF. Los reactivos utilizado en la preparación de

muestras, para IEF incluyen detergentes, agentes reductores, agentes

caotrópicos y anfólitos, que son incompatibles con otros ensayos de proteínas. El

procedimiento consta en precipitar las proteínas, dejando las sustancias que

interfieren en la solución. El ensayo se basa en la unión específica de los iones de

cobre a la proteína. El precipitado proteico se resuspendió en una solución que

contiene cobre y el cobre no unido se mide con un agente colorimétrico. La

densidad del color es inversamente proporcional a la concentración de proteínas.

El ensayo tiene una relación lineal a la concentración proteínas en un intervalo de

0-50 mg.

El procedimiento es compatible con muestras en las que se hayan empleado

reactivos para su preparación tales como SDS al 2%, DTT al 1%, urea 8 M, 2 M

tiourea, CHAPS al 4% y 2% y 2% IPG buffer. Para la determinación de la

concentración proteica se utilizaron 10 µl de cada muestra. Una vez determinada

la concentración se tomó el volumen equivalente a 400 µg de proteína y se

completó con 250 µl buffer de hidratación, que es el volumen adecuado para las

tiras de poliacrilamida de 13 cms.

6.7. Primera dimensión - isoelectroenfoque

La primera dimensión consistente en la separación por punto isoeléctrico, se llevó

a cabo en el equipo Ettan IPGphor III (AmershamBiosciences), se usaron tiras de

13 cm en un rango de pH de 3-10 NL (ImmobilineDryStrip, GE Healthcare). Para la

rehidratación pasiva de la tira, se colocó la muestra ya cuantificada (figura 4) en la

tira durante 14 h para absorber todas las proteínas que hubiera en cada muestra.

La rehidratación de la tira IPG se llevó a cabo de la siguiente manera: se pipeteó

el volumen apropiado de solución de rehidratación y muestra, en cada soporte,

47

como se indica en la figura 4 A, y se colocó lentamente en un punto del soporte de

las tiras, se evitó hacer burbujas y/o eliminarlas para garantizar una homogénea

absorción de la muestra; posteriormente se procedió a colocar la tira, para esto se

quitó el plástico protector de la IPG (figura 4 B), al exponerse el lado donde está

el gel, esta debe quedar hacia abajo, haciendo contacto con la muestra. La

muestra debe expandirse a lo largo de toda la tira para asegurar nuevamente una

absorción homogénea. Por último, se levantó suavemente y se bajó la banda

deslizándola hacia atrás y hacia adelante a lo largo de la superficie de la solución,

inclinando ligeramente el soporte de tiras para asegurar la completa hidratación

del gel, como se ilustra en la figura 4 C. En seguida, se aplicó aceite (DryStrip

Cover Fluid GE Healthcare) sobre la tira para evitar que la muestra se evapore y

se cristalice la urea, se pipeteó el aceite y se colocó gota a gota sobre un extremo

de la tira hasta llegar a la mitad de esta, y continuar con el otro extremo, hasta

que la tira IPG quedó cubierta, se cerró la caja IPG, y se llevó a cabo una

hidratación pasiva por 14 h.

Pasado el tiempo de hidratación se colocó el colector o charola de porcelana en el

equipo Ettan IPGphor III. La pequeña protusión en forma de T encaja en la

apertura del Ettan IPGphor III haciendo una fácil colocación del colector (figura 4

D). Posteriormente, se colocó la tira o las tiras IPG en el colector como se ilustra

en la figura 5 E, la tira debe ir con la parte del gel hacia arriba con el extremo

anódico (+) de la tira sobre la marca correspondiente grabada en la pista del Ettan

IPGphor III. Finalmente se humedecieron las almohadillas con agua milliQ y se

colocaron en los extemos de la tira o tiras IPG (ver figura 5 F), y se cubrió con el

uso del aceite (Immobiline DryStrip) posteriormente se colocaron los electrodos.

Se cerró la tapa del equipo: Ettan IPGphor III.

48

Figura 4. Primera dimensión isoelectroenfoque.

La separación por isoelectroenfoque se llevó a cabo de acuerdo a las

especificaciones del manual de Amersham Biosciences, y se procedió al

corrimiento en 1-D, donde las proteínas se localizaron en base a su PI.

Se estableció el programa y/o los parámetros deseados para la migración

electroforética en primera dimensión, que consiste en un inicio la aplicación de 500

V durante 1 h, posteriormente dos gradientes de 1000 V, uno por 1 h, y otro de

2:30 h, finalmente un mantenimiento de 8000 V con duración entre 25 y 55 min.

Este programa de isoelectroenfoque tiene una duración de 4:55-5:25 hs.

Cabe mencionar que al terminar el procedimiento, las tiras pueden ser

congeladas por 2 meses a – 20°C y de 6 meses a un año a – 80°C, mientras que

en el presente proyecto, una vez terminado el corrimiento en 1-D, las tiras se

almacenaron no mas de una semana para continuar con el siguiente paso.

49

6.8. Segunda dimensión SDS-PAGE

Posteriormente, a la separación por isoelectroenfoque, se llevó a cabo la segunda

dimensión, que es la separación por peso molecular (PM) en geles

desnaturalizantes de poliacrilamida al 12% y 10% (anexo 4) de 16 x 18 cm. La

segunda dimensión consistió de los siguientes pasos: preparación del gel de

segunda dimensión llevando la polimerización de la acrilamida toda la noche, se

equilibró la tira con un buffer de equilibrio (anexo 5), el equilibrio se lleva acabo

tratando las tiras IPG con buffers reductores (Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, urea 6 M,

glicerol y trazas de azul de bromofenol) que contengan SDS e iodoacetamida/DTT,

con el fin de permitir la solubilización de las proteínas previamente enfocadas y de

una completa interacción de las proteínas con el dodecil sulfato sódico (sodium

dodecyl sulfate, SDS) de la segunda dimensión; el primer paso es colocar la tira

con 10 ml del buffer de equilibrio adicionando DTT (100 mg) para mantener el

estado reducido de las proteínas desnaturalizadas, este paso se realizó durante

15 minutos en agitación y a temperatura ambiente, posteriormente se quitó la

solución y a continuación se añadió iodoacetamida (250 mg) a 10 ml del buffer de

equilibrio para evitar una posible reoxidación de las proteínas. Se repite la

incubación de 15 min con agitación a temperatura ambiente. La o las tiras quedan

listas para usar en la segunda dimensión.

Se colocaron las tiras de geles y se selló con agarosa al 0.1 %. Las condiciones

de corrida para la electroforesis fueron a 100 Volts. Una vez que las proteínas

entraron al gel separador se disminuyó la corriente a 80 Volts durante 8 horas.

6. 9. Visualización proteíca y análisis de imágenes

Los geles de cada muestra se tiñeron con azul de Coomassie coloidal para el

analisis de la imagen, para esto, cada gel se colocó en solución fijadora (30%

etanol, 5 % ácido acétido glacial) durante 1 h, posteriormente se retiró la solución

50

fijadora y se cubrió el gel con azul coomassie coloidal de Bio-Rad, durante 1 h.

después fue retirado y se hicieron 3 lavados con agua milliQ con la finalidad de

desteñir, para obtener una mejor tinción se repitieron los pasos a partir de la

adición del colorante, una vez teñidos, los geles se mantuvieron en agua milliQ.

Los perfiles proteícos de cada muestra se escanearon con el Scanner LAS4000

(GE Healthcare) para obtener las imágenes digitalizadas y exportadas en formato

TIFF para importarlas a continuación al software Ludesi REDFIN3 con el que se

realizó el procesamiento de las imágenes y el análisis bioinformático para ver la

cantidad y porcentaje de spots, la intensidad de cada spot por densitometria,

además de la normalización: esto es el proceso de hacer que el volúmen de estos

spots sean disponibles y/o comparables entre la imagen del gel en la parte de

diferencias técnicas en la tinción, el escaneo, el volumen de la muestra, y así

sucesivamente.

Las imágenes importadas a este programa se depuraron y optimizaron mediante

un filtrado previo al análisis. A continuación, se creó un archivo “experimento”, en

el que el programa incluye todos los geles que se vayan a comparar para detectar

a continuación las manchas proteicas existentes en cada gel y emparejarlas con

las correspondientes manchas en el resto de los geles. Este proceso requiere una

revisión manual pormenorizada y, en ocasiones, la edición y corrección de alguna

de las manchas o de los emparejamientos detectados automáticamente. A

continuación el programa densitometría las manchas proteicas, lo que permite

obtener medidas del nivel de expresión de cada una de ellas. Para compensar las

posibles variaciones entre geles debidas a diferencias en la eficacia de la tinción

en los diversos niveles de concentración en cada gel, se aplica el método de

normalización como ya se ha mencionado anteriormente. Este método calcula una

curva en el diagrama de dispersión que minimiza la distancia a todos sus puntos y

que sirve para calcular el factor de normalización para cada mancha.

51

El software realiza la prueba de ANOVA, que nos permite comparar las medias de

una misma variable en más de dos grupos, cuando existe normalidad en la

distribución de los datos y homogeneidad en las varianzas muestrales.

Se compararon los perfiles proteícos de cada tiempo de inducción a MCP con el

perfil proteómico de trofozoítos sin MCP, con el fin de identificar las proteínas

diferenciales, para esto se tomó en cuenta sólo a aquellos spots que

desaparezcan y/o aparezcan en cada condición, cabe mencionar que otro

parámetro que se tomó en cuenta fue la concentración; solo nos enfocamos en

aquellas proteínas que estuvieran en alta concentración , es decir, al ser

visualizadas con el azul de Coomassie coloidal y que la detección fuera intensa y

no ténue. Una vez determinadas las proteínas diferenciales de cada perfil proteíco

contemplando los parámetros anteriormente mencionaddos.

6.10. Digestión con tripsina de proteínas en el gel

Una vez que se observó las manchas en el gel de 2-D teñido con azul de

Coomassie coloidal, se procedió al corte de esa o esas manchas de interés, con

una punta de pipeta recortada (aproximadamente 1.5mm) se tomó cada mancha y

deposito en un tubo eppendorf (previamente rotulado con el número de la mancha

seleccionada). adicionando 100 µl de agua MilliQ y se analizaron las proteínas

mediante espectrometría de masas MALDI TOF/MALDI TOF-TOF en colaboración

con la Unidad de Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid, para

identificar las proteínas diferenciales presentes en cada uno de los spots

seleccionados que pudieran estar participando en el proceso de apoptosis de E.

histolytica.

Las proteínas seleccionadas en el gel fueron reducidas, alquiladas y digeridas con

tripsina empleando el protocolo de digestión de Schevchenko (Schevchenko, et

al., 1996), con ligeras variaciones. Brevemente, los spots fueron lavados dos

veces con agua.

52

Se añadió acetonitrilo hasta que cubra la mancha (20 µl) y se incubó 5 minutos

para que el gel se deshidrate y libere el colorante (se repitió 2 veces). Se secó a

vacío en “speed-vac” por 30 min.

Con la finalidad de que las manchas pasen por un proceso de reducción y

alquilación, las bandas se cubrieron con una solución de DTT 10 mM en NH4

HCO3 (25 mM) y se incubó por un tiempo de 30 minutos a 56 °C. Posteriormente,

se dejó a temperatura ambiente, donde se eliminó el DTT y se añadió Acetonitrilo

que se retiró rápidamente para incubar con Iodoacetamida 55 mM en NH4 HCO3

(25 mM) durante 15 minutos en oscuridad.

Finalmente, se realizó la digestión con tripsina añadiendo 20 µl del tampón de

digestión (12.5 ng/µl de tripsina (Roche Molecular Biochemicals) en 25 mM de

NH4 HCO3, pH 8.5) y se incubó el tubo eppendorf a 37 °C toda la noche, para

favorecer la acción de la enzima.

6. 11. MALDI-TOF (MS); MALDI TOF/TOF (MS/MS)

La mayor parte de las manchas proteicas de interés se identificaron mediante

análisis con MALDI-TOF por huella peptídica (PMF), o bien MALDI-TOF/TOF, por

secuenciación peptídica.

Una vez finalizada la digestión, se mezcló una alícuota de cada digestión con una

alícuota de matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (Sigma Aldrich) 3 mg/mL en

acetonitrilo al 50% y el de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1%). La mezcla (1μl) se

deposita en un portamuestras MALDI y se dejó cristalizar a temperatura ambiente.

El análisis MALDI-TOF MS se realizó en el espectrómetro de masas 4800 Plus

MALDI TOF/TOF Analyzer, con fuente de ionización tipo MALDI y dos

analizadores tipo tiempo de vuelo en tandem y cámara de colisión (CID) para

fragmentación (Applied Biosystems, MDS Sciex Toronto, Canadá) en la Unidad de

Proteómica del Parque Científico de Madrid, Universidad Complutense de Madrid.

53

Los espectros de masas se miden en modo reflector positivo (analizándose iones

cargados positivamente), con un voltaje de aceleración iónica de 20.000 V.

Para obtener una mayor exactitud, los espectros MALDI-TOF se calibran

internamente empleando como referencia señales de masa de dos iones

provenientes de la autolisis de la tripsina, lo que garantiza un error menor a 30

ppm en la masas peptídicas detectadas.

El análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF produce la huella de las

masa peptídicas y los péptidos observados con una señal ruido superior a 10,

pueden ser recogidos y representado como una lista de pesos moleculares

monoisotópicos.

De los espectros MS se seleccionan los precursores más apropiados para el

análisis MS/MS con la CID conectada (empleando gas atmosférico) a un voltaje de

1 kV en modo ion reflector y con una ventana de masa para el precursor de ± 5

Da. El modelo de la placa y la calibración por defecto fueron optimizados para el

procesamiento de espectros MS-MS.

El posterior análisis para la identificación de proteínas, se eliminaron los valores

de masas contaminantes (tripsinas, queratinas, aductos de sodio o señales

resultantes de la oxidación de metioninas), para buscar en una base de datos no

redundante (NR; ~4 x 106 entradas; Nacional Center for Biotechnology

Information) (secuencias 2012/05/08, 17919084; residuos 6150218869) y sin

restricción taxonómica además de la base de Entamoeba histolytica (secuencias

070.612; 1366; residuos 456887) de NCBI donde se realizaron búsquedas

empleando también MASCOT 2.3 (Matrix Science/www.matrixscience.com) a

través del servidor Global Protein v3.5 de Applied Biosystems. Los parámetros de

búsqueda fueron los siguientes:

• Carbamidometil cisteín como modificación fija y metionina oxidada como

variable de modificación.

54

• Tolerancia de la masa péptido fue de 50 para las búsquedas de PMF y 80-

100 ppm de MS/MS y búsquedas combinadas (PMF + MS/MS).

• Un sitio pérdido de corte de tripsina

• La tolerancia de fragmentos MS-MS de 0.3 Da

• En total la identificación de proteínas, la probabilidad de puntuación fue

mayores que la puntuación fijada por la MASCOT como significativa con un

valor de p > 0.05.

6. 13. Papel de las proteínas identificadas

Mediante la literatura se obtuvo información sobre la función de dichas proteínas

identificadas por MALDI-TOF/MALDI TOF-TOF y así determinar si las proteínas

diferenciales pudieran estar relacionadas con eventos pro-apoptóticos o anti-

apoptóticos.

55

7. RESULTADOS

Mucho se ha avanzado en el conocimiento de la biología de E. histolytica, sin

embargo, el papel de la respuesta inmune en el control de la enfermedad no está

bien establecido, menos aún el singular comportamiento del parásito, que con

frecuencia actúa, como comensal y más raramente como invasor.

Durante el proceso de infección, E. histolytica está expuesta a la respuesta

inmunológica del hospedero, no obstante se ha demostrado que utiliza diversos

mecanismos para evadir la respuesta inmune; por ejemplo induce la apoptosis de

leucocitos (Berninghausen, 1997), macrófagos y células hepáticas (Seydel, 1998),

empleando moléculas como lectinas, lipasas y toxinas. Recientemente, se ha

demostrado que la muerte celular programada (MCP) también se induce en este

parásito in vitro: i) mediante el aminoglicósido G418 y la emetina (Villalba, 2007 a,

b); ii) por especies reactivas de oxído nítrico (Ramos, et al., 2007) y iii) por

especies reactivas de oxígeno (Ghosh, 2010). In vivo, nuestro grupo de

investigación demostró en un modelo de hámster chino que el producto de la

interacción entre el hospedero y el parásito se induce la apoptosis tanto en los

neutrófilos como en los trofozoítos, lo que sugiere que durante el proceso

fisiopatogénico se desarrolla una respuesta del huésped contra el parásito, con la

consecuente activación de mecanismos de defensa del mismo (Villalba, 2011).

Recientemente, también demostramos mediante cDNA-AFLPs y RT-PCR en

tiempo real que la MCP inducida por fármacos representa un mecanismo activo

que involucra la expresión de genes específicos, incluyendo: la Glutaminil-tRNA

sintetasa, las Subunidades ribosomales 40S y 18S, el Sir-2, las Graininas 1-2 y la

Saponina-like que en otros sistemas, se ha visto que están implicados en la

regulación de rutas pro- y anti-apoptóticas (Sánchez, et al., 2010). En este trabajo

presentamos el análisis proteómico comparativo de la MCP activada con G418,

con la finalidad de poder identificar proteínas que participen en el proceso de

apoptosis in vitro.

56

El estudio se inició con la estandarización del protocolo del isoelectroenfoque de

las proteínas de trofozoítos sin inducir a MCP, es decir sin exposición a G418. Se

emplearon cultivos confluentes para obtener los extractos, lisar las células y

extraer las proteínas mediante precipitación con ácido tricloroacético-acetona fría.

Se realizó la cuantificación proteica y se tomaron 400 µg de proteína para la

hidratación de la muestra, durante 12-14 h. Se evaluaron dos programas de

isoelectroenfoque para la separación de las proteínas (ver tabla 2 y 3).

Tabla 2. Protocolo de isoelectroenfoque Ettan IPGphor III. (protocolo corto)

Intervalos de Ph Modo de voltaje Voltaje (V) Tiemp (h:min)

3-10 NL 1. voltaje inicial 500 1: 00

2. Gradiente 1000 1:00

3. Gradiente 1000 2:30

4. Voltaje final 8000

0:25-0:55

Total 4:55-5:25

57

Tabla 3. Protocolo de isoelectroenfoque. (protocolo largo)

Intervalos de pH Modo de voltaje Voltaje (V) Tiempo (h:min)

3-10 NL 1. Voltaje inicial 1 120 1:00

2. Voltaje inicial 2 500 1:00

3. Gradiente 1000 2:00

4. Gradiente 4500 6:00

5. Voltaje final 4500 10:00

Total 20:00

Una vez finalizado el isoelectroenfoque, las proteínas ya enfocadas en su PI se

separaron en base a su PM, para lo cual, las tiras se colocaron en geles de

poliacrilamida al 12%, la migración de las proteínas se inició al aplicar un voltaje

de 100 durante 45 min, y se separaron por 8 h a un voltaje de 80 volts. Con la

finalidad de observar el perfil proteómico de trofozoítos sin inducir a MCP, los

geles se tiñeron con Azul de Coomassie coloidal (Bio-Rad), al comparar la

separación de las proteínas, empleando los dos protocolos de isoelectroenfoque,

se observó una separación y enfoque similar en ambos, por lo que se optó por

seleccionar el primer programa (Tabla 2), en virtud de que se requiere menos

tiempo para su ejecución.

Se notó que las proteínas resueltas no se separaban correctamente en el gel, es

decir que se observaban aglomeradas en la parte de arriba del gel, como se

puede ver en la figura 5 A. Por lo tanto, se procedió a utilizar geles al 10 %,

observándose que estas proteínas de alto peso molecular se resolvían de mejor

manera, obteniendo spots mejor definidos, como se puede ver en la figura 5 B.

58

Una vez que el patrón de trofozoítos sin inducir a MCP fueron reproducibles, se

inició la inducción de los trofozoítos a MCP con G418 (10 µg/ml), el antibiótico se

adicionó a cada caja de cultivo confluente con aproximadamente 8 millones de

trofozoítos, a diferentes tiempos de exposición (0. 1 ½, 3, 6 y 9 h). Posteriormente

se obtuvieron los extractos de cada tiempo para lisar las células y obtener así las

proteínas mediante precipitación con ácido tricloroacético-acetona fría. Se

cuantificaron los extractos de proteínas de cada tiempo de exposición con G418,

por el método 2-D Quant (GE Healthcare) y se tomaron 400 µg de proteína para la

hidratación de la muestra y realizar el corrimiento electroforético en 1-D,

posteriormente se realizó el corrimiento electroforético en 2-D. Una vez terminado

los geles bidimensionales, estos fueron teñidos con Azul de Coomassie coloidal

(Bio-Rad) para la visualización proteica y el posterior análisis de las imágenes.

Cabe mencionar un punto importante, Entamoeba histolytica contiene grandes

cantidades de cisteín proteasas, que tienen que ser inhibida rápidamente para

obtener resultados reproducibles y fiables. Por lo tanto, la presencia del inhibidor

específico de cisteín proteasas antes y después directamente en los ciclos de

congelación-descongelación del extracto de E. histolytica fue altamente

beneficioso tanto para la resolución y reproductibilidad en el análisis 2-DE, desde

luego la extracción de proteínas en general como primer paso. Para evaluar la

resolución y la reproducibilidad de los mapas proteómicos, se comparó el total de

spots en cada condición haciendo mínimo tres experimentos independientes.

Las imágenes de los geles bidimensionales de cada tiempo se obtuvieron con el

Scanner LAS4000 y se analizaron con el software Ludesi REDFIN3 (figura 6) para

obtener la cantidad de spots, el porcentaje de spots de cada condición y la

intensidad de los mismos mediante densitometría.

59

Figura 5. Perfil proteómico de trofozoítos de E. histolytica sin inducir a MCP con G418. (A) gel al

12 %. (B) gel al 10 %.

60

La imagen analizada con el software del perfil proteómico de los trofozoítos de E.

histolytica sin inducir a MCP presentó 142 spots predominantes, se identificaron

un grupo de 18 spots de 50-37 kDa con aproximadamente un pH entre 5 a 9; 51

spots en el rango de 37-20 kDa, 41 spots con un pH de 5 a 8 y 10 spots con pH

aproximado de 9; también se identificaron spots con bajo peso molecular entre 20-

10 kDa, 49 spots con un pH de 4 a 8 y 9 spots con pH de 9 a 10 (figura 6). De

acuerdo con algunos parámetros que nos brindó el software Ludesi REDFIN3, el

volumen de cada spot a través de unidades de pixelaje para determinar la

densitometría y cabe señalar que se observaron varios spots de menor intensidad

que no fueron considerados. A partir de esta imagen control (gel maestro) ¿se

analizaron las imágenes de los perfiles de trofozoítos inducidos a MCP con G418,

utilizando el software Ludesi REDFIN3 las imágenes de los mapas proteómicos

con MCP se colocalizaron para ir monitoreando los spots que se localizaron en el

gel maestro (mapa proteómico de trofozoítos sin MCP) con las imágenes de los

mapas proteómicos con las inducciones a MCP. Donde se observó que después

de los 90 min de inducir el proceso de apoptosis con G418, se detectaron 140

spots, manteniéndose esencialmente el mismo perfil proteómico (figura 7). A las 3

h de exposición con el antibiótico hubo un total de 148 spots, en general el patrón

de proteínas se mantuvo pero se logró detectar aproximadamente un grupo de 7

proteínas ácidas (pH de 5): dos spots de 100 kDa, tres spots entre el rango de 75

a 50 kDa, dos spots con un peso molecular entre 50 a 37 kDa, y una proteína

básica (pH de 9) de aproximadamente 37 kDa (figura 8). A las 6 h hay un total de

152 spots, aparentemente se mantuvo el mismo patrón del perfil proteómico de 3 h

de inducción, además de un spot de 250 kDa y pH 5 (figura 9). El perfil de 9 h de

inducción a MCP tuvo un total de spots de 156, el grupo de proteínas ácidas del

perfil proteico de 3 h y 6 h de inducción fue más evidente en esta condición (figura

10).

61

Figura 6. Imagen del perfil proteómico de trofozoíto sin inducir a MCP. Análisis de imagen con el

software Ludesi REDFIN3.

Flechas naranja, spots en el rango de 50-37 kDa; flechas moradas, spots ubicados en el rango de

37-20 kDa; flechas verdes spots en el rango de 20-10 kDa.

62

Figura 7. Perfil proteómico de 1 ½ h (90 min) de inducción a MCP.

Flechas naranja, spots en el rango de 50-37 kDa; flechas moradas, spots ubicados en el rango de

37-20 kDa; flechas verdes, spots en el rango de 20-10 kDa.

63

Figura 8. Perfil proteómico de 3 h de inducción a MCP.

Flechas rojas, spots ubicados en el rango de 250-75 kDa; flechas naranja, spots en el rango de 50-

37 kDa; flechas moradas, spots ubicados en el rango de 37-20 kDa; flechas verdes, spots en el

rango de 20-10 kDa.

64

Figura 9. Perfil proteómico de 6 h de inducción a MCP.

Flechas rojas, spots ubicados en el rango de 250-75 kDa; flechas naranja, spots en el rango de 50-

37 kDa; flechas moradas, spots ubicados en el rango de 37-20 kDa; flechas verdes, spots en el

rango de 20-10 kDa.

65

Figura 10. Perfil proteómico de 9 h de inducción a MCP.

Flechas rojas, spots ubicados en el rango de 250-75 kDa; flechas naranja, spots en el rango de 50-

37 kDa; flechas moradas, spots ubicados en el rango de 37-20 kDa; flechas verdes, spots en el

rango de 20-10 kDa.

66

Posteriormente, para observar la expresión diferencial de los spots, se utilizó el

programa Ludesi REDFIN3. Con herramientas que nos brinda el software los spots

detectados fueron etiquetados (datos no mostrados), como se muestra en la figura

figura 11 (donde solo se ilustra aquellos spots a los cuales se fue monitoreando

individualmente su comportamiento), una vez etiquetados los spots se realizó la

comparación de los perfiles proteómicos para ver aquellos spots diferenciales que

pudieran aparecer o desaparecer en las diferentes condiciones. Comparando el

perfil de trofozoítos sin G418 con el perfil de 1 ½ h de inducción a MCP, se

observó la desaparición del spot 114 de aproximadamente 10 kDa con pH de 7

(figura 11). A las 3 h de exposición con el antibiótico, comenzaron a ocurrir

cambios significativos, aparecieron tres spots con un pI de 5 dentro del rango de

75 y 37 kDa, nos referimos a los spot con los ID siguientes: 65, 77 y 2. Por otro

lado, se detecto también al spot 11 con aproximadamente un pI de 8 y un PM

experimental de 35 kDa (figura 12). A las 6 hde inducción de la apoptosis

aparecen tenuemente el spot 16 con aproximadamente 250 kDa y pH 5; y el spot

94 con un pH de 7 y un PM de 15 kDa aproximadamente. Además en esta

condición desparecieron los spots 2 y 11, por otro lado también desapareció un

spot que se observaba desde el perfil proteómico control, es decir en el perfil de

trofozoítos sin inducir a MCP, y durante el tiempo de 1 ½ h y 3 h de inducción, no

fue hasta las 6 h que el spot 86 con PM experimental de 18 kDa y un pI de 8

aproximadamente, se ausentó (figura 13). En el perfil de 9 h de inducción

comparado con el de 6 h, fue más evidente el spot 16, mientras que los spots 65 y

77 que aparecieron tenuemente a las 3 h de MCP, fueron más evidentes a las 9 h

de inducción a MCP; en esta condición aparecieron notablemente los spots 117

(PM experimental de 72 kDa y pH de 8), 45 (PM de 38 kDa y pH de 6

experimental), 115 (PM de 37 kDa y pH de 6.5 experimental), 78 (PM de 35 kDa y

pH de 6 experimental ) y 83 (PM de 23 kDa y pH de 7 experimental). En contraste,

desaparecieron los spots 15 (PM de 23 kDa y pH de 5 experimental) y 13 (PM de

16 kDa y pH de 9), ambos spots fueron aparentemente notables en todas las

condiciones y se ausentaron hasta las 9 h de incubación con el G418 (figura 14),

67

mientras que el spot 94, el cual estuvo presente a las 6h de inducción a MCP

aparentemente desaparece en esta condición.

Figura 11. Etiquetas de los spots diferenciales, utilizando el software Ludesi REDFIN3.

68

Figura 12. Comparación del perfiles porteómicos. (A) trofozoítos sin inducir a MCP (B) trofozoítos

expuestos 1 ½ h a G418. El círculo rojo indica la desaparición del spot.

69

Figura 13. Comparación del perfiles porteómicos. (A) trofozoítos expuestos 1 ½ h a G418 (B)

trofozoítos expuestos 3 h a G418. Los círculos negros indican la presencia de nuevos spots.

70

Figura 14. Comparación del perfiles porteómicos. (A) trofozoítos expuestos 3 h a G418 (B)

trofozoítos expuestos 6 h a G418. Los círculos rojos indican la desaparición de spots mientras que

los círculos negros la presencia de nuevos spots.

71

Figura 15. Comparación del perfiles proteómicos. (A) trofozoítos expuestos 6 h a G418 (B)

trofozoítos expuestos 9 h a G418. Los círculos rojos indican la desaparición de spots y los círculos

negros la presencia de nuevos spots.

72

Se ampliaron los spots monitoreados para observar los cambios de la inducción

del proceso de apoptosis, donde se puede observar la desaparición o aparición de

cada spot diferencial, el software nos brida herramientas para demostrar la

expresión de los spots mediante densitometría el volumen de cada spot además

de graficar estos valores densitométricos (figura 16).

Los spots seleccionados fueron analizados cuantitativamente mediante

densitometría en unidades de pixelaje. El valor de densitometría de cada spot fue

graficado, la primera barra del lado izquierdo corresponde al control, y la segunda,

tercera, cuarta y quinta barra de izquierda a derecha corresponde al tiempo de

inducción de apoptosis de 1 ½ h, 3 h, 6 h y 9 h, respectivamente (figura 16). El

volumen de cada spots diferencial seleccionado se puede observar en la tabla 4.

Mientras que en la tabla 5 se muestra un resumen del peso molecular, punto

isoeléctrico experimental y del monitoreo de la intensidad de detección observada

en el transcurso de la inducción a MCP de los spots seleccionados.

Cabe mencionar que en nuestro caso realizamos el Análisis de Expresión

Diferencial para poder trabajar con un conjunto de datos reducido que incluyese

sólo aquellas manchas con un valor p <0.05 en la prueba de ANOVA, además

este software cuenta también con la prueba de Mann-Whitney.

,

73

74

Figura 16. Ampliación de los spots expresados diferencialmente de los perfiles proteómicos de

trofozoítos: sin inducir a MCP (control); y a distintos tiempos de inducción de MCP (1 ½, 3, 6 y 9 h).

Del lado derecho se gráfica el volumen de su comportamiento de cada spots, la barra roja indica el

control y las barras verdes de izquierda a derecha indican los tiempos de inducción a MCP 1 ½, 3,

6 y 9 respectivamente. La línea horizontal representa el valor de corte que discrimina un valor

densitométrico positivo para cada spot.

75

Tabla 4. Volumen densitométrico de cada spot

ID CONTROL 0 h

1 ½ h 3 h 6 h 9 h

114 2092.60 1187.36 929.11 693.06 738.06

65 6607.68 3245.01 2924.40 3744.10 26031.11

77 12874.88 5182.33 3421.59 4549.23 53364.00

2 9982.08 30257.02 27343.46 20460.24 17463.80

11 10941.22 7945.30 43740.12 16047.54 2685.13

16 47715.91 150907.03 35933.51 155366.58 154480.73

94 1674.41 1869.31 1600.79 2170.23 2000.43

86 3207.65 5288.49 4746.75 3774.60 954.88

117 1391.64 1400.84 938.58 1581.92 3242.88

115 1020.22 1058.54 1426.20 857.20 1746.00

45 1247.18 1485.57 1411.41 1463.54 4062.40

78 1884.64 2014.03 1848.47 3055.92 2466.39

83 5734.81 3761.82 3651.03 4890.08 5499.21

15 49164.54 79444.74 65215.60 67976.33 22031.41

13 287151.00 159028.66 317176.41 124286.34 21007.25

Se recortaron las secciones del gel correspondientes a cada proteína

seleccionada, se colocaron en tubos eppendorf adicionando 100 µl de agua MilliQ

para analizar las proteínas mediante MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF, en

colaboración con la Unidad de Proteómica de la Universidad Complutense de

Madrid.

76

Tabla 5. Peso molecular, punto isoeléctrico experimental y expresión cualitativa de

cada spot monitoreado en los diferentes tiempos de inducción

ID de spot

PM (kDa)

PI 0 h (S/A)

1 ½ h 3 h 6 h 9h

114 12 7 +++ + + + -

65 51 5 - + ++ ++ +++

77 42 5 - + ++ ++ +++

2 37 5 - + +++ - -

11 35 8 - - +++ - -

16 250 5 - - - ++ +++

94 15 7 - - - +++ +

86 18 8 +++ +++ ++ - -

117 72 8 - - - - +++

115 37 6.5 - - - - +++

45 38 6 - - - - +++

78 35 6 - - - ++ +++

83 23 7 +++ - - ++ +++

15 23 5 + +++ ++ ++ -

13 16 9 +++ ++ +++ ++ -

Los símbolos representan: +, spot presente;++, detección moderada; +++, detección alta; -, spot

ausente).

De los 15 spots seleccionados, 7 que ya fueron identificados y caracterizados por

sus perfiles peptídicos (tabla 6) y comparados con una base de datos no

redundante (NR; ~4 x 106 entradas; Nacional Center for Biotechnology

Information), donde se realizaron búsquedas empleando también MASCOT 2.3

(Matrix Science/www.matrixscience.com) a través del servidor Global Protein v3.5

de Applied Biosystems. Mediante el análisis de la fragmentación peptídica MALDI

77

TOF-TOF, se secuenciaron las proteínas obteniendo: El spot con ID: 83, que se

identificó como una alcohol deshidrogenasa con un PM de 180.76 kDa y PI de

6.34; el spot 11 que correspondió como gliceraldehído-3-fosfatasa deshidrogenasa

con PM de 36.333 kDa y PI de 7.04; los spots 16, 65, 77 y 2 identificados como

actina con pesos moleculares de 42.042 KDa, 42.042 kDa, 42.345 kDa, 42.345

kDa y puntos isoeléctricos de 5.26, 5.26, 5.19 y 5.19, respectivamente y el spot 13

que fue identificado como Grainina 2 con PM de 24. 220 kDa con un PI de 8.35.

Cabe mencionar que los PM y pI de las proteínas identificadas son datos teóricos.

En la tabla 7, se resume los datos de PM y pI experimentales y teóricos de cada

spot con su ID y el nombre de los spots ya identificados por espectrometría de

masas MALDI TOF, MALDI TOF-TOF.

78

Tabla 6. Resultados de huella peptídica (MALDI TOF) y MALDI TOF-TOF.

79

80

81

82

83

84

85

Tabla 7. Proteínas diferenciales obtenidas de los perfiles proteómicos de

trofozoítos de E. histolytica inducidos a MCP con G418, identificadas por MALDI

TOF/ MADI TOF-TOF.

ID PROTEÍNA IDENTIFICADA PM (T/E) PI (T/E)

83 Alcohol deshidrogenasa 18.076/23 6.34/7

11 Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 36. 333/35 7.04/8

16 Actina 42. 042/250 5.26/5

65 Actina 42. 042/51 5.26/5

77 Actina 42. 345/42 5.19/5

2 Actina 42. 345/37 5.19/5

13 Grainina 2 24.220/16 8.35/9

86

8. DISCUSIÓN

Anteriormente se consideraba que la muerte celular programada (MCP) existía

exclusivamente en eucariontes superiores, sin embargo, estudios recientes

demuestran que diversos eucariotas unicelulares pueden ejecutar mecanismos de

muerte celular programada, por lo que se cree constituye un fenómeno biológico

generalizado en todos los seres vivos. Es por eso que este mecanismo se ha

convertido en un campo interesante en los parásitos protozoarios, no sólo por sus

implicaciones evolutivas, sino también debido a la participación que este proceso

pudiera tener en la interacción huésped-parásito.

Con base en los estudios realizados en Trypanosoma (Nguewa et al., 2004),

Leishmania (Nguewa et al., 2004) y Plasmodium (Al-Olayan et al., 2002) entre

otros se ha sugerido que la MCP puede contribuir a la regulación de la densidad

celular de los parásitos, tanto en los huéspedes vectores como en los mamíferos;

a la diferenciación de los distintos estadios de algunos parásitos; a la respuesta al

estrés y como un mecanismo que module la respuesta inmune del huésped.

Diferentes eventos celulares característicos de la apoptosis de eucariotes

superiores han sido observados ante ciertos estímulos tales como: la exposición

de fosfatidilserina en la superficie de la membrana celular; la fragmentación del

DNA genómico y diversos cambios morfológicos, así como la despolarización de la

membrana mitocondrial. Sin embargo, debido a que los microorganismos no

presentan todas las características propias de la apoptosis típica, se sigue

discutiendo la existencia de mecanismos suicidas de muerte en estos organismos.

En E. histolytica, durante el proceso patogénico, es decir durante el proceso de

invasión y durante la colonización del tejido, los trofozoítos se ven continuamente

expuestos a la respuesta inmune que monta el huésped en contra del parásito. Sin

embargo, diversos estudios han mostrado que E. histolytica posee varios

mecanismos de evasión para dicha respuesta: Los trofozoítos activan la vía

clásica y alterna del complemento en la ausencia de anticuerpos anti-amebianos a

87

través de una CP de 56 kDa (Reed, 1990), degradando a las fracciones C3, C4,

C5 y C9, evitando así efectos fisiológicos de anafilatoxinas C3a, C5a (Reed,

1989); inducen la digestión proteolítica de anticuerpos IgA e IgG por proteasas

(Kelsall, 1993); presentan un recambio membranal importante, mediante la

formación del casquete y muda de los anticuerpos unidos a su membrana, ya que

se deshace de ellos, evitando así su acción (Calderon, 1980); interfieren la

actividad anti-amebiana de los neutrófilos, interrumpiendo las actividades de la

NADPH oxidasa, y resistiendo a través de la peroxirredoxina de 29 kDa (Guerrant,

1981)(Arbo, 1990); y también se ha demostrado in vitro que E. histolytica puede

inducir la apoptosis de los neutrófilos; Sim y colaboradores en el 2005,

evidenciaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) en que los

neutrófilos incubados con trofozoitos se observaron características de apoptosis,

tales como la compactación de la cromatina, la condensación de la envoltura

nuclear, manteniendo la integridad de la membrana celular, siendo este

mecanismo un importante evento en la resolución de la inflamación y por lo tanto

de la sobrevivencia del parásito (Sim, 2005). Se ha descrito que induce apoptosis

en leucocitos (Stauffer, 2003) (Berninghausen, 1997), en los macrófagos y células

blanco como las hepáticas (Seydel, 1998). En contraparte, también se ha

observado la MCP en este parásito, in vitro: mediante antibióticos como G418 y

emetina (Villalba, 2007 a y b), evidenciado por nuestro grupo de trabajo en el

2007; por especies reactivas de oxído nítrico descrito por Ramos y colaboradores

en el 2007 y por especies reactivas de oxígeno según Ghosh y colaboradores en

el 2010. De estos trabajos se puede resumir que el fenómeno presenta diversos

cambios morfológicos y bioquímicos como: la fragmentación del DNA, la

condensación de la cromatina nuclear, la acidificación del pH intracelular, el

incremento de los niveles de Ca2+citosólico, y el aumento en las especie reactivas

de oxígeno.

En nuestro grupo de investigación también demostramos que la MCP inducida por

G418 representa un mecanismo activo que involucra por un lado la síntesis de

novo de proteínas, y por el otro lado el encendido de genes específicos a tiempos

88

tempranos, tales como la Glutaminil-tRNAsintetasa, las Subunidades ribosomales

40S y 18S, el Sir-2, las Graininas 1-2 y la Saponina-like, los cuales pudieran estar

implicados en la regulación de rutas pro y anti-apoptóticas (Sánchez, 2010). Esta

hipótesis se sustenta por el hecho de que en otras especies, genes similares

participan en el fenómeno de MCP, sugiriendo que es un evento controlado y

modulado genéticamente.

Mucho se ha avanzado en el conocimiento de la biología de E. histolytica, sin

embargo, la singular relación huésped-parásito aún no está bien establecida.

In vivo, nuestro grupo de investigación demostró mediante un modelo

experimental de interacción huésped parásito, que consistió en la colocación de

una bolsita de diálisis con trofozoitos de E. histolytica en la cavidad peritoneal de

hámster chinos, que existen factores difusibles del huésped y del parásito que

inducen la apoptosis tanto en los neutrófilos como en los trofozoítos, lo que

sugiere que durante el proceso fisiopatogénico se desarrolla una respuesta del

huésped contra el parásito, con la consecuente activación de mecanismos de

defensa del parásito que agreden al huésped (Villalba 2011). Así, como

mecanismos de protección contra la apoptosis ante dicho evento.

Con lo anterior, está claro que E. histolytica, además de sufrir eventos de MCP, es

capaz de inducir o prevenir la MCP en las células efectoras del sistema

inmunológico, tanto in vivo como in vitro.

Con la finalidad de profundizar en el conocimiento de los posibles mecanismos

que participan en el mecanismo de MCP en la relación huésped-parásito, nuestro

grupo se encuentra analizando la expresión diferencial global de genes implicados

en la MCP de E. histolytica, mediante microarreglos de expresión (datos no

mostrados), utilizando el mismo modelo experimental in vivo. Los resultados

sugieren que bajo estas condiciones se modifica la expresión de 124 genes, de

estos, 39 genes se observaron con una menor expresión basal, en comparación

con 85 genes que fueron altamente regulados, como por ejemplo las proteínas de

unión a calcio que aumentó a los 30 min y fue disminuyendo a los 90 min y aún

89

mas a los 180 min de interacción con las células inflamatorias, (Pérez Ishiwara,

D.G., comunicación personal).

Los datos obtenidos con el análisis global de expresión que están en proceso de

publicación, sugieren que el evento inducido in vivo e in vitro pudiera seguir

procesos moleculares similares y ser un importante evento en la patogénesis de la

amebiasis, del cual se han aislado y caracterizado algunos genes involucrados en

la regulación de las fases tempranas de MCP inducida por G418, tanto in vitro

(Sánchez, et al., 2010) como in vivo (Pérez Ishiwara, D.G., 2012 comunicación

personal). La caracterización de la expresión de estos genes permite sentar las

bases para caracterizar las moléculas efectoras, es decir aquellas responsables

del inicio y la ejecución de la MCP que darán lugar a los cambios bioquímicos,

ultraestructurales y morfológicos que ocurren después de 6 h de la incubación con

G418, es decir la fase resolutiva de la apoptosis (Villalba en el 2007). Al respecto

en un análisis proteico inicial realizado por Sánchez en el 2010, se observó la

inducción de la síntesis de novo de proteínas durante la MCP (Sánchez, et al.,

2010), resultando que a los 90 min hay un pico máximo de síntesis de proteínas, lo

que sugiere la inducción a esos tiempos de proteínas inductoras y reguladoras del

proceso tanto pro- como anti-apoptoticos.

Es por eso que nos dimos a la tarea de investigar que proteínas específicas están

participando en el fenómeno de apoptosis. En este trabajo presentamos el análisis

proteómico comparativo de los diversos estadíos de la MCP inducida con G418 in

vitro. Inicialmente, se estandarizó la técnica de isoelectroenfoque de las proteínas

de trofozoítos sin exponerlos al G418, es decir, sin inducir MCP. Las proteínas de

los geles bidimensionales fueron visualizadas con azul de Coomassie coloidal

(Bio-Rad) obteniendo un patrón reproducible con aproximadamente 110 spots,

cabe mencionar que el total de spots encontrados es el promedio de tres

experimentos biológicos independientes y reproducibles (datos no mostrados). El

hecho de que se hayan detectado alrededor de 110 spots no indica que este fuera

el número total de spots encontrados, debido a que existen tinciones con mayor

sensibilidad que el azul de Coommasie coloidal, como la tinción de plata o

90

métodos de fluorescencia y radiactividad, que tienen una sensibilidad de 5-10 ng

(Shevchenko, et al., 1996), 1 ng (Rabilloud, et al., 2001) y 1 pg, respectivamente.

Uno de los primeros estudios proteómicos de E. histolytica, como evidencia de lo

anteriormente mencionado, son los trabajos de Leitsch en el 2005, donde

obtuvieron alrededor de 1500 spots que fueron detectados por tinción de plata, de

los cuales 10 spots fueron identificados por espectrometría de masas matriz

asistida por láser de desorción / ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o

secuenciación de proteínas (Tabla 7).

Tabla 8. Lista de proteínas de E. histolytica identificadas en geles bidimensionales

teñidos con azul de Coomassie, por Leitsch y colaboradores en el 2005.

Número Proteína identificada PM PI (T/E)

1 Actina 42.000 5.20/5.6

2 Calreticulim 47.700 4.7/5.1

3 Bip/Grp 78 71.600 5.05/5.5

4 Hsp70 71.526 5.30/5.75

5 Fragmento de actina

˜ 35.000

/5.75

6a-6b Piruvato fosfatasa dicinasa 98.060 6.00/6.4-6.6

7 Fructusa 1,6 bifosfato

aldosa

36. 286 6.10/6.8

8 Deshidrogenasa-1 NADP-

dependiente de alcohol

38.567 6.10/6.85

9 Fosfogliceratocinasa 46.700 8.20/7.1

10 Superoxidodismutasa 22.030 6.30/7

(PM), peso molecular y (PI) punto isoeléctrico. T, teórico; E, experimental.

91

J. Tolstrup y colaboradores en el 2006, caracterizaron 100 de los spots obtenidos

en los geles bidimensionales y fueron identificados como proteínas relacionadas

con el citoesqueleto, la glucólisis, el metabolismo del DNA/RNA, el sistema

proteasomal, el tráfico vesicular y la traducción de señales (tabla 8).

Tabla 9. Lista de algunas proteína de E. histolytica reportadas por J. Tolstrup y

colaboradores en el 2006.

Proteína identificada # de acceso PM (T/E) PI (T/E)

Citoesqueleto:

Actina

Actina

Actina

Actina

Actina

Actina

Actina

Factor despolimerizador de actina

Actoforina

Coactosina

Cinesinalike

Cadenas ligeras de miosina unida a calcio

XP_656738

XP_656738

XP_656738

XP_656738

XP_656610

XP_656610

XP_656610

XP_654122

XP_651689

XP_650926

XP_651294

XP_657577

41.7/47

41.7/47

41.7/37

42.0/39

33.3/40

33.3/33

33.3/50

15.2/13

15.7/13

16.1/17

64.0/15

16.9/14

5.0/5.7

5.0/5.7

5.0/5.6

5.2/5.8

5.3/5.5

5.3/5.8

5.3/6.5

5.4/5.5

5.3/5.5

5.0/5.3

6.5/4.7

4.7/4.8

92

Proteínas asociadas a superficie:

Proteína con repetidos ricos en leucina como

BspA

Cysteín proteasa (EhCP-C3)

XP_652259

XP_655128

19.7/24

65.5/11

5.0/5.9

5.5/5.2

Glicólisis:

Aldehído- alcohol 2-

deshidrogenasa

Enolasa

Enolasa

Enolasa

Enolasa

Fructuosa- 1,6 bifosfato-aldosa

Fosforilasa glicógeno

Alcohol deshidrogenasa dependiente de NADP

Piruvatocinasa

XP_657577

XP_649161

XP_649161

XP_649161

XP_649161

XP_650373

XP_655667

XP_653507

XP_649089

95.6/38

47.4/40

47.4/39

47.4/39

47.4/40

36.2/30

105/120

39.2/37

36.4/22

6.9/6.6

5.9/6.2

5.9/6.3

5.9/6.4

5.9/6.5

6.1/6.7

6.2/6.0

6.1/6.7

6.5/6.5

Metabolismo del

DNA/RNA:

Box helicasa DEAD/DEAH

Sububidad catalítica alfa

de DNA polimerasa

XP_649638

XP_657373

47.7/24

130/120

5.7/5.0

8.7/6.1

93

Vía de ubiquitinación:

Proteína de choque

térmico 70 kDa

Proteína de choque térmico 70

Subunidad alfa de

proteosoma

Subunidad alfa de proteosoma

Ubiquitina

Proteína relacionada con

ubiquitina

XP_653218

XP_650458

XP_65639

XP_653086

XP_650527

XP_651112

74.0/63

72.0/63

26.9/25

28.2/42

8.7/10

8.6/10

5.1/5.8

5.3/5.9

5.9/6.0

5.6/4.1

6.6/6.1

5.0/5.3

Traducción de señales:

Proteíncinasa

Fostatasaserina/threonina

Tráfico vesicular:

Inhibidor de disociación Rab- GDP

Familia Rab

GTPasa-RabK1

Familia Rab GTPasa-RabK1

Familia Rab GTPasa-

RabF4

Familia Rab GTPasa-RabX28

Familia Rab GTPasa-

RabX28

XP_655027

XP_656538

XP_655898

XP_652298

XP_652298

XP_654217

XP_650164

XP_650164

138/130

46.8/23

55.0/38

24.4/22

24.4/15

23.7/24

21.7/21

21.7/22

5.7/5.2

8.3/6.3

5.4/6.0

5.0/6.6

5.0/4.5

6.6/5.6

5.6/5.4

5.6/6.4

94

Familia de Rho GTPasa

Inhibidor de intercambio

Rho-GDP

XP_650536

XP_654522

22.5/22

20.0/17

5.8/5.5

5.5/5.9

En este trabajo también se realizaron tinciones con plata (datos no mostrados) en

geles bidimensionales de trofozoítos sin inducir a MCP, obteniendo un total de 286

spots, cabe mencionar que el numero total de spots obtenidos es menor que el

esperado, ya que algunos antecedentes reportan la detección de un mayor

número de spots detectados tanto con tinciones de azul de Coomassie como con

plata. Consideramos que la diferencia puede deberse a dos hechos

fundamentales: i) los autores citados anteriormente, sugieren que la utilización de

rangos de pH más estrechos, permite una mejor separación de las proteínas y ii) a

diferencia de los otros trabajos, la concentración de proteína utilizada para la

técnica de isoelectroenfoque, en este trabajo fue menor, 400 µg a diferencia de los

autores mencionados que usaron 500 µg. Por lo tanto, debido a que en el presente

trabajo en primera instancia nos interesaba detectar y seleccionar proteínas en los

trofozoítos de E. histolytica cuya expresión se apagara o encendiera al inducir

MCP con G418, decidimos utilizar tiras de poliacrilamida de un rango más amplio

de pH (3-11 NL), lo anterior con la finalidad de ampliar el rango de posibilidades

para la detección de las proteínas. Una vez que se estandarizó la técnica de

isoelectroenfoque y se obtuvieron resultados reproducibles, se procedió a realizar

la inducción de MCP de los trofozoitos a tiempos tempranos (1 ½ h y 3 h), medios

(6 h) y tardíos (9h) con G418 con la finalidad de detectar aquellos spots

diferenciales de cada tiempo.

El perfil proteómico de los trofozoitos sin tratamiento, presento 142 spots

predominantes, a la 1 ½ h de exposición con G418 se detectaron un total de 140

spots, a las 3 h 148 spots, al tiempo de 6 h se detectaron 152 spots y finalmente a

95

las 9 h 156 spots (cabe señalar que se observaron un número importante de spots

de menor intensidad que no fueron considerados), indicando que el fenómeno de

MCP por G418 en trofozoítos de E. histolytica conlleva la síntesis de moléculas

que pudieran participar en la MCP.

Villalba en el 2007, caracterizó los cambios morfológicos y bioquímicos de

trofozoítos de E. histolytica inducidos a MCP con G418 in vitro durante 3, 6, y 9 h,

reportando que a partir de las 6 h es donde se observaron cambios morfológicos

evidentes de MCP, los cuales evolucionaron paulatinamente hacia las 9 h.

Como comentamos con anterioridad, este evento se demostró que es controlado

genéticamente (Sánchez y colaboradores, 2010) ya que hay una expresión de

genes anti-apoptóticos a los 30 min de exposición con G418, incluyendo:

Glutaminil-tRNAsintetasa, Subunidades ribosomales 40S y 18S, Sir-2 y las

Graininas; así como también la detección de gen de la saponina-like que es un

gen apoptótico. De manera paralela, se observó la síntesis de proteínas de novo a

los 90 min posteriores a la inducción de los trofozoítos incubados con G418. Lo

que sugiere que dicha expresión puede ser el reflejo de la inducción de la

expresión de genes específicos.

Por tanto, encontrar aquellas moléculas responsables de los cambios

mencionados anteriormente, fue el objetivo de este trabajo. Se compararon los

geles bidimensionales de los distintos tiempos de inducción a MCP probados (0, 1

½, 3, 6 y 9 h) para detectar los spots diferenciales (ID: 114, 65, 77, 2, 11, 16, 94,

86, 117, 115, 45, 78, 83, 15 y 13), de estos solo los spots: 83, 11, 16, 65, 77, 2 y

13 ya fueron identificados mediante huella peptídica (MALDI TOF) y fragmentación

peptídica (MALDI TOF-TOF):

96

Dos de las proteínas identificadas, Alcohol deshidrogenasa con ID: 83 y

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogena con ID: 11, son enzimas importantes en la

vía metabólica de la amiba; la proteína 83, Alcohol deshidrogenasa, se expresó

basalmente en el control (trofozoítos sin G418) y su expresión incrementó en los

tiempos de 6 y 9 h de inducción a MCP. Las alcohol deshidrogenasas (ADHs) son

enzimas que catalizan la oxidación reversible de alcoholes a los correspondientes

aldehídos o cetonas, con la consiguiente reducción de NAD o NADP.

En un estudio de Espinosa en el 2010 en E. histolytica se demostró el efecto

inhibitorio de NO en la actividad de las CPs y la alcohol deshidrogenasa 2, los

resultados indican que la ADH2, es una enzima fundamental para la sobrevivencia

del parásito.

Por otro lado, comparaciones proteómicas entre E. histolytica y E. dispar

evidenciaron la presencia y actividad de alcohol deshidrogenasa 3 (EhADH3), la

cual fue localizada en la superficie de los trofozoítos. Aunque la sobreexpresión de

dicha proteína no fue capaz de asociarse a un incremento en la virulencia, si se

determinó que EhADH3 es más abundante en E. histolytica HM-1: IMSS que

cualquier cepas de E. dispar (Paul H., Davis, 2009).

En otros sistemas de eucariotes superiores, se ha encontrado una asociación de

la ADH con la apoptosis en la disfunción miocárdica (Zhang X, et al ., 2004). Se

observó que durante la miocardiopatía alcohólica, uno de los metabolitos

principales del alcohol es el acetaldehído, este induce la disfunción miocárdica

contráctil, el alargamiento de los cardiomiocitos, liberación de Ca2+, daño

mitocondrial y finalmente la apoptosis. Sugiriendo que la sobreexpresión de la

ADH en la disfunción cardiaca esta íntimamente relacionada con el daño celular

vía apoptosis (Rui Guo, Jun Ren., 2010).

Debido a lo anteriormente mencionado, y a los patrones de detección del alcohol

deshidrogenasa en los geles bidimensionales, podemos sugerir que de alguna

97

manera a tiempos tardíos de la MCP la ADH participa como una proteína

apoptótica, marcando a los trofozoítos a la MCP.

La glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH ) con ID: 11,por su parte, es una

enzima de la glucólisis, GAPDH ejerce entre otras funciones, por ejemplo,

participar en la endocitosis, en la reparación del DNA (debido a que es una uracil

DNA glucosilada y que remueve uracilos) , en la transcripción, en la exportación

de RNA al núcleo y al parecer puede participar también en la apoptosis (Kim JE,

2003).

Diversos estudios han indicado un papel para la GAPDH en la apoptosis o estrés

oxidativo. El papel en la apoptosis fue inicialmente demostrado en células

granulares de cerebelo (CGCs) (Ishitani, et al., 1998, 1996; Sunaga, et al., 1995).

Las CGCs maduras que sufren una muerte por apoptosis inducida por la edad, fue

asociado con la expresión incrementada de GAPDH. Este efecto fue demostrado

por el hecho que la inhibición de la GADPH mediante secuencias en antisentido

suprimen la acumulación de GADPH antes de la apoptosis (Ishitani, et al., 1998;.

Saunders, et al., 1999; Sawa, et al., 1997). Otros resultados indican que la

translocación al núcleo de GAPDH puede jugar un papel en la apoptosis y estrés

oxidativo, probablemente como enzima reparadora del DNA o como acarreadora

de moléculas pro-apoptóticas (Dastoor, et al., 2001).

En nuestro análisis esta GAPDH fue detectada en el perfil proteómico a las 3 h de

inducción de MCP con G418, sugiriendo, que la GAPDH pudiera compensar el

proceso apoptosis ya que podría participar en la reparación del DNA y actuar

como una proteína anti-apoptótica.

Una de las consecuencias de la activación del proceso de muerte celular consiste

en la fragmentación y desacoplamiento de las principales estructuras celulares,

como componentes del citoesqueleto. Las caspasas degradan a la mayoría de los

constituyentes del citoesqueleto de la célula; los sustratos incluyen componentes

de los microfilamentos de actina, tales como la actina misma y sus proteínas

98

asociadas, incluyendo la miosina, espectrinas, α-actinina, gelsolina y filamina.

Asimismo, diferentes proteínas microtubulares son también sustrato de las

caspasas, incluyendo la tubulina y las proteínas asociadas a los microtúbulos,

tales como Tau, la cadena intermediaria de dineina citoplasmática y pl50Glued

(Rojas Masyelly, et al., 2009). Adicionalmente, las proteínas de filamentos

intermediarios tales como vimentina, queratinas y laminina nuclear son también

moléculas diana de las caspasas.

La proteólisis de estos constituyentes del citoesqueleto probablemente contribuye

al redondeamiento y retracción de la célula que es observado en los estados

tempranos de la apoptosis (Taylor, et al., 2008). Morfológicamente los trofozoítos

de E. histolytica inducidos a apoptosis a partir de las 3 h de incubación con G418,

se observan redondeados, siendo este evento muy evidente a las 12 h, según

datos de Villalba en el 2007. Otra consecuencia de la desestabilización del

citoesqueleto es el “blebbing” o burbujeo de la membrana (otra característica

distintiva de la apoptosis) en el cual el citoplasma celular se particulariza en

pequeñas membranas que son expulsadas al medio. Un sustrato de caspasas que

está fuertemente implicado es esta fase de la apoptosis es el efector Rho ROCKI,

un regulador de la dinámica del citoesqueleto de actina. La eliminación de la

región C-terminal de ROCKl a través del corte por caspasa resulta en la activación

constitutiva de esta cinasa, conduciendo a la fosforilación de la cadena ligera de

miosina y la contracción de la actina (Taylor, et al., 2008).

Por otro lado, aunque la fragmentación nuclear es la principal característica de la

apoptosis, no es claro porque el núcleo se fragmenta y se dispersa a través de los

cuerpos apoptóticos durante este modo de muerte celular. La fragmentación

nuclear resulta de la desintegración de la lámina nuclear y del colapso de la

envoltura nuclear. El primero de estos eventos involucra la proteólisis de las

lamininas A, B, y C por las caspasas. El citoesqueleto de actina tiene también un

rol importante en la fragmentación nuclear. La lámina nuclear está rodeada por

una malla de actina, la cual está asociada con la envoltura nuclear. La inhibición

99

tanto de ROCKI, la cinasa de cadena ligera de miosina, o la interrupción de los

filamentos de actina evita la fragmentación nuclear asociada con la apoptosis. La

degradación de la lámina no es suficiente para causar fragmentación nuclear en

ausencia de la fuerza contráctil del citoesqueleto de actina, pero podría debilitar la

lamina nuclear, permitiendo que la envoltura nuclear se desgarre, luego de la

fragmentación del núcleo (Rojas Masyelly, et al., 2009).

La actina fue una las proteínas prominentemente detectadas a tiempos tardíos en

los geles bidimensionales, lo que sugiere que su detección en fases tardías del

proceso pudiera deberse a la sobreexpresión de actina como un intento de la

célula para re-establecer el citoesqueleto.

Las actinas con ID: 77 y 65, fueron detectadas a tiempos tardíos (9h) en los geles

bidimensionales con PM de 42 kDa y 51 kDa, respectivamente. Mientras que la

actina con ID: 16 con PM de 250 kDa fue evidente a las 6 h y 9 h de inducción a

apoptosis..

La actina con ID: 65, que tuvo un PM experimental de 51 kDa y PM teórico de 42.

042 kDa, es interesante; el hecho de haber identificado diferentes spots como

actinas, con diferentes PM pudiera deberse a que la actina es una proteína muy

versátil que tiene la capacidad de asociarse con otras proteínas, las cuales afectan

la velocidad de polimerización y destrucción de filamentos; algunas proteínas,

como la profilina, se unen a las proteínas de actina libres y favorecen su unión a

filamentos prexistentes, también hay proteínas que median en la interacción de los

filamentos de actina con otras proteínas relacionadas, como es el caso de la

tropomiosina, que media la interacción entre actina y miosina. También las

proteínas de anclaje permiten la unión de los filamentos de actina a estructuras

celulares como las membranas o a otros componentes del citoesqueleto (Molist, et

al., 2011). Este hecho concuerda también con la actina con ID: 16, que teniendo

un PM teórico de 42. 042 kDa, en los geles bidimensionales se observó un PM

experimental aproximado de 250 kDa, indicando posiblemente la formación de

complejos de actina con otras proteínas del citoesqueleto.

100

La aparición a tiempos tardíos de la MCP de las actinas con ID: 77 (9 h), 65 (9 h) y

16 (6 h y 9 h) indican que podrían tener un papel importante, como proteína anti-

apoptótica tratando de re-establecer la conformación del citoesqueleto y/o el

rescate del acoplamiento del citoesqueleto,

Por otro lado, la actina con ID: 2 fue apareciendo en las primeras horas de

inducción (1 ½ h y 3 h) a MCP con G418, este spot con PM teórico de 42.345 kDa

pero con PM experimental aproximado de 37 kDa observado en el gel

bidimensional, indican quizás una proteína no polimerizada (G-actina),

comprometiendo a los trofozoítos a la MCP.

De manera muy interesante en este trabajo se identificó el spot ID: 13 que

correspondió a la proteína grainina 2, hecho que correlaciona con el fenotipo

bioquímico de la MCP producto de la liberación del calcio intracelular (Villalba,

2007), y con los resultados obtenidos a nivel genómico, tanto mediante AFLPs-

RTPCR (Sánchez, 2010) como mediante análisis de expresión global donde se

detectó la sobreexpresión de las graininas 1 y 2. Se observó que la grainina 2

aparece notablemente desde las primeras fases hasta las 6 h de inducción a MCP,

y se dejó de detectar a las 9 h de incubación con G418. Los hallazgos obtenidos

sugieren fuertemente que la proteína grainina 2, participa como factor anti-

apoptotico en la MCP tratando de recapturar el calcio liberado. Hasta antes de

estos estudios se tenía evidencia de la sobreexpresión del gen, sin embargo ahora

podemos mencionar que dicha inducción claramente conduce a la síntesis de la

proteína grainina 2 que por su patrón de expresión participa en el fenómeno de

MCP inducida con G418 en trofozoítos de E. histolytica, tratando de compensar la

liberación del Ca2+ intracelular, recapturándolo para limitar la activación de

diversos procesos celulares, entre ellos los relacionados con las fases activadoras

del proceso de MCP y por lo tanto la adopción sin retorno del compromiso hacia

la muerte.

Analisis tipo Blast y alineamientos con otras proteínas demuestran que la grainina

2 tiene homología con calmodulinas (CaM) de otros protozoarios como T. brucei y

101

T. gondii (Moreno y Docampo, 2003) jugando un papel importante en la MCP

activando mecanismos moleculares que disparan la recapturación de calcio

citosólico, es decir, una respuesta compensatoria para disminuir el calcio

intracelular libre (Sánchez, 2010).

De los 15 spots diferenciales y seleccionados, 8 spots con los siguientes ID:.114,

94, 86, 117, 115, 45, 78 y 15 en estos momentos están secuenciandose por Maldi

TOF-TOF.

102

9. CONCLUSIÓN

Nuestros resultados del análisis proteómico de la MCP en E. histolytica in vitro,

nos permitió elucidar y conocer la expresión de algunas proteínas en las distintas

fases de la MCP inducida por G418.

Se observaron 15 spots diferenciales, los cuales fueron analizados por huella

peptídica y MALDI TOF-TOF con la finalidad de identificar que proteínas son las

que están participando en proceso de apoptosis. Hasta el momento solo se han

identificado 7 spots:

El spot 83 como alcohol deshidrogenasa, se expresó aparentemente tanto en el

control (trofozoítos sin G418) como en los tiempos de 6 y 9 h de inducción a MCP;

sugiriendo un papel apoptótico. Mientras que el spot 11 (gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa) solo se expresó a las 3 h del fenómeno, tratando de compensar

la MCP como proteína anti-apoptótica, en la reparación del DNA.

Además, se identificaron por fragmentación peptídica a los spots 77, 2, 65 y 16

como proteínas del citoesqueleto, tales spots fueron determinados como actina

que probablemente en otros sistemas se ha demostrado que tienen un papel

apoptótico, ya que la actina 65, 77 y 16 fueron más evidentes hasta las 9 h de

exposición con el antibiótico, mientras que el spot 2 con PM de 42.345 kDa y PI

de 5.19 se expresó durante las fases iniciales (1 ½ y 3 h) de MCP.

En el perfil proteómico de la ameba se identificó por fragmentación peptídica al

spot 13 como grainina 2, esta proteína una vez inducida la apoptosis desapareció

a las 9 h de exposición con el antibiótico, sugiriendo que la amiba tiene

mecanismos anti-apoptóticos a fases iniciales de la MCP.

103

10. PRESPECTIVAS

• Continuar la investigación sobre proteínas específicas de la MCP de E.

histolytica para conocer el papel fundamental y como están participando en

dicho mecanismo.

• Realizar cepas mutantes con la inhibición de la expresión de proteína (s)

que pudieran tener un papel anti-apoptótico, con la finalidad de detectar

posibles blancos terapéuticos en contra de la amibiasis basada en la MCP

en la ameba.

• Realizar cepas mutantes con la sobreexpresión de proteínas que pudieran

tener un papel apoptótico en E. histolytica, con la finalidad de detectar

posibles blancos terapéuticos en contra de la amibiasis basada en la MCP

en la ameba.

104

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116

12. ANEXOS

Anexo 1 Buffer de lisis o de muestra

Reactivos Concentración final Cantidad

Urea (PM 60.06) 7M 10.5 g

Tiourea 2 M 3.8 g

CHAPS 4 % 1.0 g

IPG Buffer 2 % 500 µl

DTT (PM 154.2) 40 Mm 154 mg

Agua MilliQ -- Para 25 ml (16 requeridos)

Notas:

- Pesar la urea y disolverla en aproximadamente 10 ml de agua y

desionizarla por los menos 2 h, en agitación con la resina AG 501-X8 (Bio-

Rad) en una proporción de 5g de resina por 100 ml de solución.

- No adicionar las IPG buffer.

- Hacer alícuotas de 2 ml y almacenar a -20°C.

- Para utilizar una alícuota adicionarle 40 µl de las IPG buffer.

Anexo 2 Buffer de hidratación

Reactivos Concentración final Cantidad

Urea (PM 60.06) 7M 10.5 g

Tiourea 2 M 3.8 g

CHAPS 2 % 1.0 g

117

IPG Buffer 0.5 % o 2 % 500 µl

1 % azul de bromofenol 0.002 % 154 mg

Agua MilliQ -- Para 25 ml (13.5 requeridos)

Notas:

- Pesar la ures y disolverla en aproximadamente 10 ml de agua y deionizarla

por lo menos 2 h, en agitación con la resina AG 501-X8 (Bio-Rad) en una

proporción de 5g de resina por 100 ml de solución.

- No adicionar las IPG buffer

- No adicionar azul de bromofenol

- Hacer alícuotas de 2 ml y almacenar a -20 °C

- Para utilizar una alícuota adicionarles 15 µl de las IPG buffer y 7 mg de

DTT.

Anexo 3

Protocolo Introducción

El volumen de ensayo es de 1,5 ml, que es compatible con la mayoría de las

cubetas del espectrofotómetro. Sin embargo, el volumen de ensayos mayores o

menores pueden ser acomodados por la ampliación proporcionalmente de los

volúmenes de la muestra, la curva estándar y los reactivos del ensayo.

La precisión de este ensayo se determina principalmente por la técnica del

usuario. Pipeteo cuidadoso de las soluciones de la curva estándar, la muestra y

reactivos es esencial. Si la muestra es viscosa, puede ser difícil la precisión

al pipetear volúmenes por debajo de 10 μl. Resultados más precisos pueden

obtenerse diluyendo una muestra concentrada en agua antes del ensayo.

118

Se recomienda la realización del ensayo por duplicado.

A diferencia de la mayoría de los ensayos de proteínas, la absorbancia de la

solución de ensayo disminuye con la concentración de proteína en aumento. No

reste la lectura del blanco a partir de la lectura de muestra. El rango de volumen

del ensayo es de 1-50 μl y el rango lineal para la cuantificación es 0-50 µg. El

ensayo tiene un umbral de sensibilidad de 0.5 μg.

Sugerencia: Colocar siempre los tubos de microcentrífuga en el rotor de la

centrífuga con la tapa de bisagra hacia afuera. De esta manera el pellet siempre

quedará en el mismo lado del tubo para que pueda ser dejado sin tocar, y

minimizar la pérdida.

El ensayo se debe realizar a temperatura ambiente.

Requerido, pero no proporcionado:

- Tubos de microcentrifuga de 2 ml.

- Mezclador vortex

- Microcentrifuga

- Espectrofotómetro de luz visible (ejem. Novaspec II o Ultrospec 1000pro)

Preparaciones preliminares:

Previo a realizar el ensayo, preparar un volumen apropiado de reactive color de

trabajo, mezclando 100 partes de reactivo de color A con 1 parte del reactivo de

color B. Cada ensayo individual requiere de 1 ml de reactivo de color de trabajo.

El reactivo de color de trabajo puede ser guardado a 4-8 °C durante un máximo de

una semana o siempre que la absorbancia óptica (A480) de la solución

permanezca por debajo de 0. 025 a 480 nm.

119

Procedimiento estándar

1. Preparación de una curva estándar de acuerdo a al tabla de abajo, usando 2

mg/ml de la solución estándar de la albumina de suero bovino proporcionada en el

kit. Coloque seis tubos y añadir una solución de acuerdo a la siguiente tabla.

Tabla 10. Tubo 1 es el blanco de ensayo, que no contiene proteínas.

Preparación de la curva estándar: Numero de tubo 1 2 3 4 5 6

Volumen de 2 mg/ml

de la solución estándar de BSA

0 μl 5 μl 10 μl 15 μl 20 μl 25 μl

Cantidad de proteína 0 μg 10 μg 20 μg 30 μg 40 μg 50 μg

Nota: La precisión del ensayo no se ve afectado por el volumen de la muestra así como el volumen

de muestra es de 50 μl o menos. Por consiguiente, no es necesario una dilución estándar o

soluciones de muestra para un volumen constante.

2. Preparar los tubos que contienen 1-50 µl de la muestra a ser analizada. Se

recomienda hace duplicado. El intervalo rango útil del ensayo es 0.5-50 µg.

3. Añadir 500 µl de precipitante a cada tubo (incluyendo los tubos de la curva

estándar). Se usó vortex brevemente e incubar los tubos 2-3 min a temperatura

ambiente.

4. Añadir 500 µl de co-precipitación a cada tubo y mezclar brevemente por

vortex o inversión.

5. Centrifugar los tubos a 10 000 x g durante 5 min. Esto sedimentos la proteína.

120

6. Sacar los tubos de la centrífuga, tan pronto como la centrifugación se completa.

Un pequeño precipitado debe ser visible. Decantar el sobrenadantes. Proceder

rápidamente con el paso siguiente para evitar la resuspensión o dispersión de los

gránulos.

7. Vuelva a colocar los tubos en la microcentrífuga como antes, con la tapa de

bisagra y el precipitado hacia afuera. Centrifugar los tubos de nuevo para llevar

todo el líquido restante a la parte inferior del tubo. Un breve pulso es suficiente.

Utilizar una micropipeta para eliminar el sobrenadante restante. No debe haber

ningún líquido visible que quede en los tubos.

8. Añadir 100 µl de solución de cobre y 400 µl de agua destilada o desionizada a

cada tubo. Dar voxtex brevemente para disolver la proteína precipitada.

9. Añadir 1 ml de reactivo de color de trabajo a cada tubo (Ver "preliminar

preparados" para la preparación del reactivo de color de trabajo). Asegurar

instantánea mezcla al introducir el reactivo tan rápidamente como posible. Mezclar

por inversión.

10. Incubar a temperatura ambiente durante 15-20 minutos.

11. Leer la absorbancia de cada muestra y estándar a 480 nm utilizando agua

como referencia. La absorbancia debe leerse dentro de 40 minutos de la adición

de reactivo de color de trabajo (paso 9).

Nota: A diferencia de la mayoría de los ensayos de proteínas, la absorbancia de la

solución del ensayo disminuye con la concentración de proteína en aumento. No

restar la lectura del blanco a partir de la lectura de la muestra o utilizar el ensayo

blanco como referencia.

121

12. Generar una curva estándar trazando la absorbancia del estándar contra la

cantidad de proteína. Utilice esta curva estándar para determinar la concentración

de proteína de las muestras.

Anexo 4 Gel separador

Reactivos 10% 12%

Agua milliQ 16.4 ml 13.6 ml

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 10 ml 10 ml

20% (w/v) SDS 200 µl 200 µl

Acrilamida/Bis-acrilamida (30%/0.8% w/v) 13.2 ml 16 ml

10% (w/v) persulfato de amonio 200 µl 200 µl

TEMED 20 µl 20 µl

Cantidad total 40.02 ml 40.02 ml

Gel concentrador

Reactivos 4%

Agua milliQ 6.15 ml

0.5 M Tris-HCl, pH 8.8 2.5 ml

20% (w/v) SDS 50 µl

Acrilamida/Bis-acrilamida (30%/0.8% w/v) 1.34 ml

10% (w/v) persulfato de amonio 50 µl

TEMED 10 µl

Cantidad total 10.01 ml

122

Anexo 5 Buffer de equilibrio (200 ml)

Reactivos Concentración final Cantidad

Urea (PM 60.06) 6 M 72.1 g

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 75 Mm 10 ml

Glicerol (87%) 29.3 % 69 ml

SDS 2 % 4 g

1 % azul de bromofenol 0.002 % 400 µl

Agua milliQ -- 40 ml

Cantidad total Aforar a 200 ml