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ANTECEDENTES

Mycobacterium tuberculosis

La tuberculosis es una infección bacteriana crónica causada por Mycobacterium

tuberculosis, el género Mycobacterium comprende un grupo de microorganismos muy

diverso, de amplia distribución en la naturaleza. Se han descrito más de 100 especies, 25

de las cuales han sido identificadas como agentes infecciosos frecuentes para el hombre.

Además de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis: M. Bovis, M.

Africanum y M. Tuberculosis productoras de tuberculosis en humanos, existen especies

saprofitas, pudiendo actuar como patógenos oportunistas y causar enfermedad pulmonar

o infecciones en otras localizaciones (Davis, 1978).

Mycobacterium tuberculosis es un bacilo el cual fue descubierto por Roberto

Koch en 1882. Pertenece al orden Actinomicetales, familia Mycobacteriaceae; y son

consideradas formas de transición entre las eubacterias y los hongos. Se caracteriza por

ser de crecimiento lento en comparación con otras bacterias con un tiempo de 12 a 21

hrs. Es una mycobacteria que no forma esporas, aerobia, inmóvil y se tiñe con

dificultad, pero una vez teñidas resisten la decoloración con soluciones ácidas o por el

alcohol y son por lo tanto, llamadas “ácido-alcohol resistentes”. Los bacilos tuberculosos

son resistentes a la desecación y miden de 2 a 4µm de longitud y de 0.2 a 0.5 µm de

ancho, tiene un aspecto típico de bacilo delgado de anchura uniforme, ligeramente

curvo; es resistente a muchos antibióticos debido principalmente a la envoltura celular

altamente hidrofóbica que actúa como barrera permeable lo que hace difícil su

tratamiento (Ramírez R. NA., 2002).

Como todas la mycobacterias, su pared es compleja se caracteriza por tener una

cubierta lipídica constituida por ácidos micólicos- arabinogalactano- peptidoglucano

(mAGP), ello le ocasiona que, una vez teñidos con ciertos colorantes derivados de

anilinas (p. ej.- fucsina fenicada), retengan esta coloración a pesar de ser tratados,

aunado a esta peculiaridad la pared mycobacteriana posee proteínas, polisacáridos y una

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elevada cantidad de lípidos (50 a 60%) que le confieren un carácter hidrofóbico y la hace

refractaria al ataque por hidrólisis enzimática (Gorocica, 2005).

Dentro de su estructura, la pared celular separada de la membrana celular por el

espacio periplásmico, consta de cuatro capas. La capa más interna es la peptidoglucano

con moléculas de N-acetilglucosamina, esta es el esqueleto de la bacteria siendo

relativamente uniforme en todas las especies de mycobacterias que le da la forma y

rigidez. Mientras que externamente hay 3 capas compuestas: una por polímeros de

arabinosa y galactosa, otra formada por ácidos micólicos y otra superficial formada por

lípidos como sulfolípidos que son aproximadamente el 25% del peso seco de la bacteria.

Estos lípidos contienen ceras, micósidos específicos de especie (glucolípidos complejos)

y el factor cordón el cual se asocia al alineamiento en paralelo de las filas de bacilos

siendo esta una de las características de las cepas virulentas de M. tuberculosis. Las

cadenas peptídicas de la capa externa comprenden un 15% del peso de la pared celular y

tienen antígenos biológicos de importancia, que estimulan al sistema inmune celular del

paciente ante esta infección (Pan Fei y Col., 2001).

Las mycobacterias tienen elevada resistencia a los desinfectantes, pero son

destruidos por la pasteurización y la esterilización al calor; no segregan exotoxinas y

sólo libera endotoxinas al lisarse, pueden sobrevivir durante largos periodos en esputos

secos u otros líquidos corporales. Además, los componentes estructurales del complejo

de la pared celular de M. tuberculosis producen la virulencia del microorganismo y le

permiten sobrevivir en condiciones ambientales difíciles (Said F.S.,2005).

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Tuberculosis

Transmisión tuberculosis pulmonar

Es uno de los padecimientos que sigue siendo considerado como una de las

enfermedades infecto-contagiosa de mayor impacto de salud pública en el mundo. El

nombre tuberculosis proviene de la palabra tubérculo. Es trasmitida en tres formas una

de ellas es de persona a persona por la inhalación del agente infeccioso el cual se

encuentra en el aire en forma de aerosoles los núcleos de gota que contienen M.

tuberculosis, por la ingestión de material contaminado usualmente leche (M. Bovis) y

finalmente por inoculación directa que ocurre en personas trabajadores del sector salud

principalmente (Villalba, 2003).

Estos núcleos de 1 a 5 micras que contienen de dos a tres organismos al entrar al

tracto respiratorio, pasan a ser pequeños tumores duros que se forman cuando el sistema

inmune constituye una pared alrededor de la bacteria de la mycobacteria, los cuales se

caracterizan histológicamente por la formación de granulomas. Habitualmente, la

enfermedad se localiza en los pulmones, pero puede afectar prácticamente a cualquier

órgano del cuerpo humano, pudiendo penetrar a través del tubo digestivo, el sistema

genitourinario y el sistema respiratorio. Esta última es la vía de infección más frecuente

ya que las partículas o aerosoles conteniendo bacterias pueden ser liberados por un

paciente con infección activa, se inspiran del aire contaminado que se encuentre en el

interior cerrado por largos periodos de tiempo por un individuo sano, se depositan en las

mucosas de las vías respiratorias superiores y viajan a los pulmones donde se instalan;

en ocasiones pueden moverse por medio del sistema linfático hacia otras partes del

cuerpo, tales como el riñón, espina dorsal y cerebro, donde generan una tuberculosis

extrapulmonar (Mariscal, 2005).

Existen cuatro factores que determinan la transmisión de Mycobacterium

tuberculosis: 1) el número de organismos que son expelidos en el aire, 2) la

concentración de organismos en el aire determinada por el volumen del espacio y su

ventilación, 3) la magnitud de tiempo a la que se encuentra expuesta la persona al aire

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contaminado y 4) presumiblemente el estado inmune del individuo expuesto. Las

personas infectadas por VIH y otras con alteraciones en la inmunidad celular son más

propensas a desarrollar enfermedad si son infectados. Sin embargo, no son más

susceptibles a transmitir Mycobacterium tuberculosis (Chávez T. NC., 2002).

El estado patológico de la infección y de la enfermedad ocurre en tres etapas:

inicial (infección primaria), latencia y enfermedad posprimaria. En la infección inicial,

los bacilos invaden el tejido en la puerta de entrada, generalmente las zonas medias y

bajas de los pulmones, multiplicándose allí al cabo de 3 a 6 semanas y originando una

pequeña lesión inflamatoria. Los bacilos entran inmediatamente en el sistema linfático y

son transportados al grupo de nódulos linfáticos más próximo, donde también provocan

lesiones inflamatorias. Además, la enfermedad reactiva, es decir cuando el bacilo

ingresa por primera vez al organismo que en general ocurre en edades tempranas como

en el caso de un niño (primoinfección), éste se reproduce y elimina con poca intensidad

por lo que resulta poco infeccioso; cuando se reactiva, el bacilo se reproduce con mayor

intensidad y se elimina en gran cantidad, y esta es responsable de las mayorías de las

tuberculosis activas diagnosticadas hoy en día. Se presenta con mayor frecuencia en los

ancianos y en los individuos con enfermedades crónicas o debilitantes. Aunque la

reactivación puede ocurrir en cualquiera de las lesiones focales, es más frecuente en la

de los lóbulos superiores o del vértice de los lóbulos inferiores de los pulmones, donde

se forman abscesos y cavidades tuberculosas (Chávez T. NC., 2002).

Patogenia

Posterior a la inhalación los núcleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos

son lo suficientemente pequeños para llegar a los bronquíolos respiratorios o alvéolos y

ahí ser fagocitados por los macrófagos alveolares. Siendo el foco inicial en la zona

media de los pulmones donde el mayor flujo aéreo favorece el establecimiento de los

bacilos inhalados, dividiéndose aproximadamente de 25 a 32 hrs. dentro del macrófago.

Sin embargo la multiplicación bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente,

destruye a los macrófagos. Donde son atraídos desde el torrente sanguíneo linfocitos y

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monocitos, diferenciándose los últimos en macrófagos que ingieren las bacterias

liberadas de las células degeneradas, los macrófagos infectados son llevados por vía

linfática a ganglios linfáticos hiliares, pero en el huésped no inmune no son detenidos

ahí y se pueden diseminar por vía hemática a diferentes tejidos. Antes del desarrollo de

hipersensibilidad el crecimiento bacteriano no está inhibido tanto en el foco inicial

dando lugar a la progresión de la enfermedad en los ápices pulmonares o en focos

extrapulmonares prontamente o después de largos periodos de latencia. Los bacilos

continúan multiplicándose, lesionando los órganos donde se localizan, provocando

licuefacción del tejido, donde crecen extracelularmente llegando a ser millones

(Sepkowitz, 1995).

Los bacilos con mayor capacidad agresiva tienen la facultad de resistir a los

mecanismos defensivos celulares y provocar una primo-infección tuberculosa. Se

constituye el llamado complejo primario, formado por el chancro de inoculación o

nódulo de Ghon. La repercusión sobre el pulmón se traduce en dos situaciones

patológicas distintas: una de ellas es la primoinfección tuberculosa o latente, se

caracteriza por la ausencia de síntomas y signos clínicos, radiológicos y bacteriológicos;

dando la prueba de tuberculina positiva. La segunda patología es la enfermedad

tuberculosa como tal, en la cual hay manifestaciones clínicas, radiológicas,

bacteriológicas e inmunológicas. La enfermedad se manifiesta antes de los 5 años que

siguen al contagio y se cataloga como tuberculosis primaria, mientras aquella que se

desarrolla más tarde se denomina tuberculosis postprimaria, secundaria o de tipo adulto.

Esta es poco frecuente en la infancia, ocurre fundamentalmente en la adolescencia

después de haber estado infectado durante varios años, puede producirse como

consecuencia de una reactivación endógena, por los bacilos que han estado acantonados

desde que ocurrió la infección primaria, o bien proceder del exterior y producir una

reactivación exógena; los síntomas son los propios de la tuberculosis: fiebre, tos, astenia,

dolor torácico, esputo hemoptoico, etc (Hurtado MP., 2001).

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Prevalencia

La tuberculosis supone un auténtico problema de salud pública, tanto a nivel

nacional como mundial, por lo que su situación epidemiológica actual es preocupante.

Según cifras que la Organización Mundial de la Salud (OMS) publica en relación a la

situación de la tuberculosis en el mundo, aproximadamente un tercio de la población

mundial está infectado por M. tuberculosis (García G.M., 1995).

En 1990, la unidad de Tuberculosis de la OMS, realizó una evaluación para

determinar la situación arrojando como resultados, en el mundo hubo 1,722 millones de

infectados por M. tuberculosis, 8 millones de casos nuevos y de 2.6 a 2.9 millones de

defunciones por esta misma causa. Sin embargo se estima que la prevalencia global es

superior a 70 por 100 mil habitantes aunque es mucho mayor en algunas zonas

geográficas y grupos de riesgo, como en algunos países africanos, donde llega a ser de

400 por 100 mil habitantes. En cuanto a incidencia, África, y Asia ocupan el primer y

segundo lugar, y América Latina con 250 a 300 mil nuevos casos se ubica en el tercer

lugar. (figura 1) Y Brasil, Perú son los países que tienen las mayores incidencias;

mientras que México ocupa el tercer lugar en América en número de casos, pero en

problemática e incidencia se ubica en la posición número 20 (Farga C.V., 2006).

En México el comportamiento de la tuberculosis en los últimos diez años ha

obedecido a una disminución de su morbilidad como de su mortalidad. De acuerdo al

Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, se tienen un gran número de casos

reportados, siendo los estados de Baja California, Chiapas, Nuevo León y Veracruz,

como aquellos con las mayores aportaciones (ver tabla 1). En el Estado de Sonora,

según Institución y grupos de edad, se presentaron en el año 2001, aproximadamente

514 casos nuevos de tuberculosis del aparato respiratorio, y para el 2004 se encontró una

610 casos nuevo de tuberculosis respiratoria (García, 2003 ).

La OMS ha estimado que entre el año 2000 y el 2020, 200 millones de personas

enfermarán y 35 millones morirán de tuberculosis sino se hace un riguroso control,

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según resultados obtenidos por esta organización permiten afirmar que cada segundo

una persona es infectada por primera vez por el bacilo, cerca del 1% de la población

mundial es infectada por primera vez cada año. La pandemia del VIH ha tenido gran

impacto en la epidemiología y en el año 2000 aproximadamente 12 millones de las 36

millones de personas infectadas con el VIH en todo el mundo, tenían coinfección con M.

tuberculosis y los 8.4 millones (70%) de estos coinfectados, vivían en la región del

África Subsahariana (Farga C.V., 2006).

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Figura 1. Incidencia a nivel mundial de la tuberculosis.

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Tabla Ⅰ. Casos de tuberculosis reportados en la república mexicana del año 2000 al

2004 por el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica

Años Numero de Casos en la República

Mexicana

2000 16 281

2001 15 269

2002 14 310

2003 14 852

2004 13 392

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Diagnóstico

La TB puede ser cien por ciento curable, siempre y cuando se

diagnostique a tiempo y se mantenga al paciente dentro de un régimen de tratamiento

estricto, como en los programas promovidos por la Organización Mundial de la Salud,

la Organización Panamericana de Salud y la Secretaría de Salud en México, los cuales

han demostrado ser altamente efectivos. Recientemente dentro de las estrategias para

combatir a la tuberculosis, el diagnóstico subyace como uno de los pilares más

importantes ya que permite una atención oportuna y eficaz así como el inicio del

tratamiento y en consecuencia una reducción de los riesgos de contagio y dispersión de

dicho padecimiento ( García G. ML., 2000).

Técnicas Tradicionales de Diagnóstico

Baciloscopía

En los últimos 100 años, la única prueba rápida para el diagnóstico de la

tuberculosis ha sido el examen microscópico, la “baciloscopía” con la tinción

microbiológica de Ziehl-Neelsen es la técnica de predilección para el diagnóstico de TB

activa en la mayoría de los laboratorios, por varias características básicas que aún no han

sido superadas por el resto de las técnicas por avanzadas que éstas han sido, como lo son

sencillez, reproducibilidad en cualquier medio, rapidez, bajo costo (Morán M.MC. y

Col, 2000).

La tinción consiste en la fijación de la fucsina sometiendo a calor la muestra

cubierta con el colorante, se continua el calentamiento observando la emisión de vapores

por unos 7 minutos, se elimina el colorante con agua, cayendo esta suavemente, después

se agrega alcohol-ácido por 2 minutos se enjuaga nuevamente y se aplica el colorante de

contraste azul de metileno por un espacio de 5 minutos, se enjuaga y se deja escurrir en

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forma vertical hasta secar. Esta técnica diagnostica a los enfermos con TB que son

bacilíferos, esto es, que son fuente de diseminación de la enfermedad. Sin embargo, es

en este sentido donde se han venido observando grandes limitaciones, ya que este

sistema, necesita un número mayor de 104 bacterias por mililitro para arrojar un

diagnóstico positivo (Valdés, 1999).

Un dato adicional que complica la aplicación de este método como el único

sistema para diagnosticar a pacientes tuberculosos, es la estimación de que más de la

mitad de los 10 millones de casos reportados anualmente, son infecciones pulmonares y

extrapulmonares con baciloscopía negativa, y en general, se considera que deben existir

entre cinco mil y diez mil bacilos ácido-alcohol resistentes por militiro de expectoración

para que exista un 50% de probabilidad de ser detectado, con esto se puede considerar

que a estos pacientes se les establezca un diagnóstico con otros criterios como clínico,

histopatológico, epidemiológico, radiológico e inmunológico (Cedeño R., 2004).

La no observación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en una muestra

clínica no descarta el diagnóstico de tuberculosis, ya que es una técnica de sensibilidad

limitada. La reducción del número de bacilos emitidos por el enfermo orienta sobre la

eficacia del tratamiento siempre que se acompañe de una mejoría de sus síntomas

clínicos. Cuando los pacientes bacilíferos son tratados con regímenes de primera

elección suelen negativizar sus esputos a partir de las 2 o 3 semanas de tratamiento. No

obstante, en algunos pacientes se negativizan antes los cultivos que las baciloscopías,

esto es debido a que los bacilos que se siguen eliminando están lo suficientemente

lesionados por el tratamiento para que no sean capaces de desarrollarse en los cultivos y

en muchos de los casos esto da lugar a la presencia de falsos positivos de la

baciloscopía. (Kulski, 1996).

A pesar de la positividad de la baciloscopía, estos pacientes no suelen tener

capacidad contagiante. En los casos de TB pulmonar se deben remitir tres muestras de

esputo de buena calidad, de la primera hora de la mañana, en días distintos. La

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baciloscopía es positiva en un 65 por ciento de los casos cuando se procesan tres esputos

(en las formas cavitadas en hasta un 95 por ciento) frente a un 30 por ciento con una

muestra aislada (Bennensed, 1996).

La baciloscopía es la técnica de elección en el diagnóstico de la TB, más sin

embargo el rendimiento en la identificación directa depende mucho del tipo de muestra

clínica como en muestras de bajo contenido de bacilos, LCR, líquidos pleurales,

continua siendo muy bajo; y por otro lado no es posible identificar la especie de

mycobacteria ni estudiar su resistencia a los fármacos, pasos imprescindibles en algunas

situaciones. Además la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes en el examen

directo de muestras clínicas, no siempre garantiza que se trate de un bacilo tuberculoso,

ya que puede tratarse de una mycobacteria atípica o de otro microorganismo que

comparta la característica de ácido alcohol resistencia ( M. leprae, Actinomyces,

Nocardia ). Esto puede ocasionar graves problemas en el diagnóstico y la terapéutica. El

rango de sensibilidad de la baciloscopía, oscila entre 50 – 80% y la especificidad oscila

entre 80 al 90% (Nava P., 2005).

Debido a las limitaciones dentro de las técnicas microbiológicas una de las

técnicas que ha venido a ser un apoyo más en el diagnóstico de la tuberculosis son las

fluorescentes utilizando la tinción de auramina – rodamina las cuales se basan en el

mismo principio de la ácido-resistencia característica del bacilo, con la ventaja de que

estas proporcionan una visualización más cómoda, y alcanza a detectar bacilos a una

cantidad más baja de 1,000 bacilos por mililitro de expectoración y son más rápidas en

comparación con las baciloscopías, las cuales no han tenido gran uso debido a la

dificultad que tienen en su gran mayoría los laboratorios para tener el equipo adecuado

para realizar el diagnóstico (Zenteno, 2003).

Cultivos

El cultivo de mycobacterias es el único método que permite asegurar y dar un

diagnóstico con certeza mediante la observación correspondiente del bacilo, así como es

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el único completamente válido para evaluar el seguimiento y curación del paciente

tuberculoso, motivo por el cual es considerado el estándar de oro en el diagnóstico de

TB. Los resultados del cultivo dependen en gran medida de los pasos previos a este, que

son la digestión y descontaminación de residuos orgánicos que le permitirán al bacilo de

Koch poder desarrollarse en el medio de cultivo sólido, sin embargo si estos procesos no

se llevan de manera adecuada, puede afectar la viabilidad de las mycobacterias presentes

en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos debido a un exceso de

descontaminación ( Fagundo SR., 2004).

Los cultivos son mucho más sensibles que la baciloscopía, pudiendo detectar una

cantidad tan pequeña de bacterias, basta con que existan más de 10 bacilos por mililitro

en muestras digeridas o concentradas, para que sea positivo. El aislamiento en cultivo

puro es necesario para poder identificar correctamente las cepas aisladas; y los medios

de cultivo tradicionales que hasta la actualidad se han empleado para diagnóstico son

Löwenstein-Jensen, o el agar 7H10 y 7H11 de Middlebrook.

Los métodos de identificación convencionales después del cultivo incluyen

determinación de la velocidad de crecimiento, crecimiento a diferentes temperaturas,

morfología de la colonia, producción de pigmentos y susceptibilidad a los agentes. De

tal manera que en los casos en los que se requiera una toma de decisión rápida para

instaurar una terapéutica efectiva su valor es muy limitado. El mayor inconveniente del

cultivo convencional se deriva de la lenta capacidad de división de M. tuberculosis. Este

hecho motiva que el tiempo transcurrido entre la recepción de la muestra y la emisión

del resultado sea superior a 4-6 semanas en los medios sólidos convencionales, tiempo

excesivamente elevado para esperar un diagnóstico de certeza. Algunas mycobacterias,

muchas de ellas relacionadas con SIDA como M. hamophilum, M. malmoense, M.

genavens, exigen suplementar los medios de cultivo con factores de crecimiento

especiales como hemina, sangre, mycobactina o citrato amónico férrico. La incubación

de los medios sembrados en una atmósfera enriquecida con un 5-10% de CO2 favorece

el crecimiento de M. Tuberculosis (Folgueira, 1996).

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Estos métodos sólidos ofrecen las ventajas de su mayor sencillez de realización,

la posibilidad de realizar conteo de colonias, con la importancia que ello conlleva en el

seguimiento del tratamiento de pacientes. Sin embargo, tiene el inconveniente ya

expuesto de su lento crecimiento y de su lectura manual que puede ser la causa de

algunos errores. Estos inconvenientes han llevado a la búsqueda de técnicas más rápidas

y sensibles, y han permitido introducir nuevos métodos de cultivo, entre los que destacan

los métodos radiométricos (sistema Bactec), los cuales utilizan ácido palmítico con

carbono marcado, que al ser utilizado por las mycobacterias en crecimiento van a

producir CO2 marcado permitiendo su cuantificación por radiometría de la radiactividad

emitida por el CO2 marcado. Así también se han desarrollado los medios de cultivo

bifásicos (MB-Septi-Check) y las técnicas usadas para aislar mycobacterias de la sangre

(hemocultivo), son sistemas no radioactivos, totalmente automatizados, que han

permitido reducir el tiempo de detección de 11 a 15 días promedio en cada sistema,

permiten diferenciar de 3 a 5 días si el cultivo es positivo para TB y tienen mayor

sensibilidad (Robledo J. y Col., 2001)

Desafortunadamente tales pruebas tienen la desventaja de que son costosas en su

inicio, requieren de personal altamente calificado debido a la manipulación de material

radioactivo en el caso de los métodos radiométricos, y su sensibilidad y especificidad de

ambas técnicas radiométricas o no, son muy variables de uno a otro laboratorio. Por lo

tanto no están disponibles en todos los países en vías de desarrollo, y en el caso de un

diagnóstico precoz y específico no son lo suficientemente útiles (Eing, 1998).

Prueba de Tuberculina

Esta técnica es de poco valor diagnóstico, la prueba es una reacción cutánea de

hipersensibilidad que indica la existencia de infección por TB previa más no la

enfermedad. Se lleva a cabo con un derivado proteico etanólico purificado (PPD) de M.

tuberculosis (Portillo, 1996).

Este debe administrarse de forma intradérmica, aplicando en la cara anterior del

brazo 0.1ml de tuberculina que equivale a 5 Unidades de PPD. Las reacciones deben

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leerse midiendo el diámetro transverso de la zona de induración entre las 48 y 72 horas.

En la cual se ha recomendado que la prueba se considere positiva a partir de 5 mm; cabe

mencionar que pude dar positiva si el paciente ha tenido contacto con otras

mycobacterias no tuberculosas, en pacientes que han sido vacunados contra la TB con

BCG, el examen puede ser positivo durante un periodo aproximado de 10 años, en estos

casos se considera positiva cuando la reacción sea mayor de 14 mm (Portillo, 1996).

Debido a la reacción cruzada que se presenta en esta técnica con la vacuna BCG,

lo que arroja falsos positivos o falsos negativos, ha dado pie al desarrollo de un sistema

de diagnóstico para una infección latente de TB, donde se mide la cantidad de interferón

gamma producido por las células sanguíneas totales o de las células mononucleares de

sangre periférica previamente estimuladas con derivados proteicos purificados de

tuberculosis o antígenos más específicos. Sin embargo, el empleo de antígenos más

específicos aún sigue en estudio para su aprobación final (Guevara, 2003).

Métodos Serológicos

Uno de los métodos de diagnóstico para la tuberculosis que mayor potencialidad

de empleo ha demostrado ser el ensayo inmune ligado a enzima (ELISA). Mediante este

sistema es posible identificar anticuerpos circulantes específicos contra antígenos de

Mycobacterium y, de esta manera, indicar una infección. Este sistema genera resultados

en cuestión de horas y con sensibilidades que oscilan del 95 al 98% y especificidades del

85 al 92%, dependiendo del antígeno empleado. Posee las ventajas adicionales de que

permiten evaluar el nivel de respuesta inmune ante la infección bacteriana, es decir,

discernir cuándo se presentan bacterias vivas y muertas en el huésped, es más fácil de

estandarizar y necesita menos reactivos y equipamiento. Esta técnica ofrecería el mayor

potencial para la realización de pruebas serológicas rápidas y podría ser de gran valor

cuando sea difícil obtener muestras de esputo, como sucede en el caso de los niños y en

pacientes con tuberculosis extrapulmonar (Hermans M. PW., 1990).

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Con todo, las técnicas de inmunodiagnóstico tienen la desventaja de presentar

variaciones dependiendo del antígeno empleado, arroja falsos positivos por mal manejo

de los reactivos o contaminación de la muestra, y se necesita personal altamente

capacitado y equipo especializado para la lectura de las muestras, por lo regular caro, lo

cual limita su empleo en los países pobres. Por otro lado, la habilidad de la micobacteria

de infectar un paciente y permanecer latente por muchos años antes de su reactivación es

un obstáculo clave para el control y eliminación de la tuberculosis y las fallas en la

identificación y tratamiento de individuos latentemente infectados permite continuar con

la cadena de transmisión. El diagnóstico de tuberculosis latente se ha realizado a través

de la prueba de la tuberculina, sin embargo, el proceso de vacunación con BCG en

muchas ocasiones da lugar a una reacción cruzada con esta prueba, y en otras genera un

proceso de anergia, lo que arroja falsos positivos o falsos negativos. Debido a esto se a

derivado una técnica de ELISA llamada ELISPOT, que ha permitido desarrollar un

sistema de diagnóstico más para una infección latente. El sistema mide la cantidad de

interferón gama producido por las células mononucleares de sangre periférica

previamente estimuladas por antígenos específicos o por derivados proteicos purificados

(PPD). Con la finalidad de evitar falsos positivos actualmente se están desarrollando

nuevos sistemas inmuno-enzimáticos que empleen otros antígenos no presentes en la

vacuna, los cuales aún no se han aprobado (Guevara, 2003).

Nuevas Estrategias en el Diagnóstico para TB

Técnicas de Biología Molecular

Durante la última década se han desarrollado una serie de técnicas de biología

molecular que permiten la amplificación de secuencias de ADN y ARN específicas de

M. tuberculosis. Esta tecnología ha logrado solucionar, al menos en parte, los principales

problemas inherentes a las técnicas microbiológicas convencionales, permitiendo

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establecer diagnósticos rápidos entre 2 y 8 horas, y mejorar la sensibilidad de las

técnicas clásicas. Esto es particularmente importante en las muestras clínicas de origen

extrapulmonar en las que el inóculo mycobacteriano es habitualmente bajo (Rodríguez,

2000).

Debido a la óptima sensibilidad y especificidad de estas técnicas de

amplificación cercana al 100 por ciento, cuando son aplicadas a muestras con

baciloscopía positiva tanto respiratorias como extrarrespiratorias, un valor positivo de

amplificación establecería el diagnóstico de TB. En este tipo de muestras, un valor

negativo de amplificación aseguraría la presencia en la muestra de una mycobacteria no

perteneciente al complejo M. tuberculosis. En muestras con baciloscopía negativa, y

debido a la excelente especificidad de estas técnicas, un valor positivo de la

amplificación establecería con relativa seguridad un diagnóstico de TB. Por último, un

valor negativo de amplificación obtenido en muestras con baciloscopía negativa

descarta el diagnóstico de TB (Méndez Álvarez S., 2004).

A pesar del aporte de éstas técnicas de amplificación al diagnóstico de TB, han

presentado grandes inconvenientes y la principal radica en que se diagnostican falsos

positivos con gran facilidad debido a la contaminación de los reactivos causados por un

personal mal capacitado, a la posibilidad de formación de aerosoles en el ambiente con

amplicones, por lo que se ha visto en la necesidad de trabajar en ambientes separados

dentro del mismo laboratorio, se recomienda el uso de distinto vestuario de una sección

a otra en la preparación de reactivos (Soylemez, 2005).

Solventando los problemas que existieron en un inicio, en la actualidad se

dispone en el mercado de una gran variedad de sistemas de amplificación, que proveen

todos los reactivos necesarios y que permiten trabajar en condiciones estandarizadas. El

desarrollo y perfeccionamiento de la PCR ha ido seguida del diseño de nuevos sistemas

de amplificación genética de segunda generación: amplificación de hebra por

desplazamiento “strand displacement amplification” (SDA), reacción en cadena de la

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ligasa (LCR), Q-beta replicasa, amplificación mediada por transcripción (TMA), etc

(Soini, 2001).

En general, todos estos sistemas necesitan de tres pasos fundamentales: 1)

preparación de la muestra, dirigida a eliminar las posibles substancias inhibidoras de la

reacción de amplificación, 2) amplificación del ácido nucleico específico del complejo

M. tuberculosis, disponiéndose de diferentes formatos que permiten amplificar tanto

ADN como ARN mycobacteriano; y 3) detección del producto amplificado, mediante

diferentes métodos (Loera, 2003).

Las técnicas de amplificación disponibles en la actualidad para el diagnóstico de

la TB se pueden clasificar según la naturaleza del ácido nucleico a amplificar, ADN o

ARN (Yang, 2001).

Técnicas que amplifican el ARN mycobacteriano

Amplificación mediada por transcripción (TMA) o RT - PCR

El sistema AMTDT-2 la prueba directa de amplificación de M. tuberculosis por

sus siglas en inglés (Amplified M. tuberculosis Direct Test) se basa en la amplificación

de ARN ribosomal mediante la síntesis de ADN complementario y ARN, utilizando una

mezcla enzimática compuesta por la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa.

Es un proceso isotérmico y autocatalítico diseñado para amplificar ARN

ribosomal 23S mycobacteriano; totalmente manual, que no requiere instrumentos ni

instalaciones sofisticadas, fácilmente aplicable a cualquier laboratorio y que permite

obtener resultados rápidos (menor de 4 horas), con una elevada sensibilidad y

especificidad (Rosino, 2004).

21

Por su parte, el sistema AMTDT-3, similar al previo, ofrece la ventaja de la

completa automatización de los procesos de amplificación y detección del producto

amplificado, así como la incorporación de un control interno de amplificación , a pesar

de esto una barrera que no ha permitido el uso de esta técnica es debido a falta de acceso

en los laboratorios de países subdesarrollados.

Q-Beta-replicasa

Descrito inicialmente en 1988, se basa en la incorporación de un oligonucleótido

diseñado para unirse específicamente al ácido nucleico diana (ARNr 23S). Es un sistema

completamente automatizado, en el que la detección del producto amplificado se realiza

mediante un ensayo fluorométrico, en donde la cantidad de fluorescencia emitida es

proporcional a la cantidad de ARN amplificado (Kaboev, 2000).

Técnicas que amplifican el ADN mycobacteriano

Amplificación por desplazamiento (SDA)

Este sistema emplea cebadores específicos, ADN polimerasa y una endonucleasa

de restricción, con la finalidad de conseguir una amplificación del ADN diana original

después de 2 horas de reacción. Aunque el sistema es complejo, las etapas de reacción

ocurren individualmente y, una vez iniciada la reacción, no exige más cuidados. Tiene

las ventajas de ser isotérmico, salvo la etapa inicial de desnaturalización a 95ºC, de no

requerir un laboratorio especializado y de que puede ser aplicado sobre una hebra

sencilla o doble de ADN (Schirm, 1995).

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Reacción en cadena de la ligasa (LCR)

La reacción en cadena de la ligasa (LCR) consta de las mismas etapas que la

PCR. Sin embargo, utiliza cuatro iniciadores diseñados para flanquear la región a

amplificar, de tal modo que quedan dispuestos en posiciones adyacentes.

Así, las sondas pueden unirse enzimáticamente, mediante la ADN ligasa, después

de la actuación de la ADN polimerasa, para formar el producto amplificado, que a su vez

servirá de molde para posteriores ciclos de amplificación. El LCx MTB es un sistema

semiautomático en el que la detección del producto amplificado se realiza por una

técnica de inmunoensayo enzimático de micropartículas ( Cohen, 1998)

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Dada a conocer por Kary Mullis, la técnica se basa en la replicación del ADN en

los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la

síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5’→ 3’ usando un molde

de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región

doble cadena se usan los denominado iniciadores (primers). Son una pareja de

iniciadores sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los

extremos 3’ del fragmento de ADN que se desea amplificar (William Benjamin, 2001).

Aunque es imposible detectar moléculas individuales de ADN, estas pueden ser

amplificadas usando la técnica de la PCR, pueden detectarse secuencias específicas del

ADN en pocas horas, facilitando su análisis cualitativo y cuantitativo con técnicas

comunes de laboratorio. Es de extrema sensibilidad, confiable en un 99% de los casos y

bajo condiciones experimentales óptimas, permite la amplificación de más de un billón

de copias de la secuencia deseada a partir de una sola copia del ADN original (Beige,

1995).

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Partiendo de este principio, la reacción en cadena de la Polimerasa se basa en la

repetición de un ciclo formado por tres etapas:

1) Desnaturalización de la cadena doble de ADN.

2) Hibridación de los iniciadores a la zona 3’ específica de cada una de

las hebras.

3) Extensión, a partir de los cebadores. Esta reacción se desarrolla por la

actuación de una ADN polimerasa (TaqADN polimerasa).

En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos

hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97°C).

La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

En el segundo paso (hibridación) los iniciadores se unen a las zonas 3’

complementarias que flanquean el segmento que queremos amplificar. Se realiza gracias

a la disminución de la temperatura (50-65°C).

En la tercera etapa (Elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla

(produciéndose un fragmento de doble cadena por complementariedad) en la dirección

5’→ 3’ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los dNTPs presentes en

el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente

en la figura 2. Estas tres etapas representan un único ciclo de amplificación, y la

repetición de cada ciclo implica un incremento exponencial del producto a amplificar

(Corvalán A.R., 2002).

La detección del producto de la reacción en cadena de la polimerasa se realiza

normalmente mediante el corrido electroforético dependiendo del tamaño de la

amplificación y la resolución deseada se utilizará diferentes medios (agarosa,

poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar

con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia,

radioactividad; la electroforesis en general permite la separación de las moléculas como

consecuencia de su diferencia de movilidad en un campo eléctrico. Por lo tanto, el

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parámetro esencial es la diferencia de carga eléctrica de las moléculas, cabe mencionar

que la carga depende del pH del medio (Butt, 2004).

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al multiplicar por millones de

veces un fragmento determinado de ADN, es aplicable a la identificación de diferentes

maneras. Se puede proceder de tres formas: 1) Amplificar con los cebadores apropiados

y detectar después un fragmento específico de una determinada especie por

electroforesis y tinción con bromuro de etidio 2) amplificar un fragmento de ADN

común a todas las especies de mycobacterias y posteriormente reconocer el amplificado

con sondas específicas de especie 3) amplificar un fragmento de ADN común a todas

las especies de mycobacterias, someterla a lisis con enzimas de restricción y visualizar

los fragmentos de restricción en gel de agarosa, tras teñir con bromuro de etidio. Esta

metodología, conocida como reacción en cadena de la polimerasa y análisis del

polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (PRC o PCR-RFLP), es de

gran utilidad en la identificación rápida de las especies del género Mycobacterium (Taci,

2003) .

La caracterización de las regiones hipervariables del fragmento 16S ARNr,

específicas de las especies mycobacterianas, ha permitido el desarrollo de un esquema

de identificación de las mycobacterias basado en la secuenciación de sus ácidos

nucleicos. Tras amplificar un fragmento genómico por PCR, se realiza la secuenciación,

y la identificación de especie se logra al comparar el resultado obtenido con las regiones

específicas conocidas de cada especie mycobacteriana. Con esta tecnología se han

podido identificar y describir nuevas especies del género Mycobacterium (Laniado LR.,

2001).

Actualmente se disponen de métodos automatizados para PCR, que incorporan,

además del gran atractivo que supone la automatización, dos novedades importantes: la

introducción de un control interno de amplificación y el uso de partículas magnéticas

unidas a la sonda específica para la captura de amplicones (Miller, 2002).

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Figura 2. Pasos básicos de la PCR

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Marcadores Moleculares en la Tuberculosis

Tradicionalmente, el estudio de la epidemiología de la TB se ha visto dificultado

por la ausencia de marcadores de cepa adecuados. Así, el único marcador utilizado hasta

fechas recientes, el estudio de susceptibilidad a mycobacteriófagos, presenta

limitaciones importantes derivadas de su bajo poder descriminativo. Otros métodos

investigados como el enzimotipo, serotipo y antibiotipo, no han conseguido tener

aplicación práctica en epidemiología (García, 2003).

Segmento de Inserción IS6110

A finales de la década de 1980, Zainuddin y Dale, al buscar plásmidos en

aislamientos clínicos de M. tuberculosis encontraron un elemento dentro del genoma con

características similares a las de un transposón, en número variable y los cuales generaba

patrones de ADN polimórfico. Al poco tiempo, diferentes investigadores en Estados

Unidos y en Europa identificaron estos elementos como secuencias de inserción, y que

por su diversidad dentro del genoma presentaban un poder distintivo de discriminación

suficiente para establecer el parentesco entre los aislados.

A partir de ese momento, se generó una explosión de información referente a la

aplicación de estas metodologías para el reconocimiento de líneas de transmisión,

surgiendo así la epidemiología molecular (Ponce, 1999).

En la actualidad, la aplicación a la epidemiología de las técnicas moleculares

permite establecer con precisión las cepas circulantes en una población. Se ha utilizado

la restricción genómica seguida de electroforesis con alternancia de campos, los patrones

de restricción-hibridación con sondas complementarias de secuencias repetidas en el

genoma de M. tuberculosis, o el polimorfismo de amplificación por PCR. De todos estos

marcadores, el más utilizado por su gran poder descriminativo ha sido el estudio del

polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP), utilizando la secuencia de

inserción IS6110 que desde 1993 se estableció como estándar (Walter, 1996).

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Existe un protocolo estandarizado que permite comparar los resultados entre

distintos laboratorios y establecer bancos de datos a gran escala. Este marcador puede

utilizarse: a) para conocer el patrón epidemiológico general en una población, b) en el

control de epidemias, c) en la diferenciación de las recaídas de las reinfecciones

exógenas, y d) en el estudio de contaminaciones cruzadas en el laboratorio (Cortinas,

2002).

El genoma de M. tuberculosis contiene, en general, un elevado número de copias

del elemento IS6110, entre cinco y 20, localizadas en posiciones variables a lo largo del

cromosoma, debido a su capacidad de transposición. Por ello, las cepas no relacionadas

epidemiológicamente presentan patrones de restricción-hibridación propios y, por lo

tanto, un elevado grado de polimorfismo (Neimark, 1996).

Contrariamente, las relacionadas epidemiológicamente muestran patrones

idénticos, pudiendo establecerse fácilmente una relación de clonalidad. No ocurre lo

mismo en el caso de cepas sin ninguna copia de IS6110 en su cromosoma, o con un

número muy reducido de copias integradas, normalmente, en posiciones constantes. En

estos casos es necesario diferenciar las cepas no relacionadas epidemiológicamente

mediante otros marcadores moleculares que ofrezcan un mayor grado de polimorfismo

(Mulcahy M.G.,1996).

Es necesario resaltar que, aunque estos estudios pueden ser de gran utilidad en

conocer la dinámica de la transmisión en la comunidad, sus resultados deben ser

adecuadamente interpretados, y siempre ser evaluados conjuntamente con lo que aporta

la epidemiología convencional (Mathema y Col., 2002).