H. Pylori IgG, IgM, IgACódigo: 9001601

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Ensayo de quimioluminiscencia inmuno absorbente para la detección cuantitativa deH. Pylori IgG, IgM, IgA en suero o plasma

96 PruebasINTENCION DE USO

La determinación cuantitativa de Anticuerpos específicos de Anti- H.Pylori de tipo IgG, IgM o IgA en suero humano o plasma en un análisis con microplato de Quimioluminiscencia (CLIA).

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA

El Helicobacter pylori ha sido mostrado como un bacilo curvo indefinido que fue observado por Warren

1 y Marshall

2 en contacto cercano con el

epitelio gástrico en estudios de biopsias en pacientes que sufren de gastritis crónica. A pesar de que la fuente del H. pylori es desconocida, la evidencia es muy convincente que el bacilo causa una gastritis aguda y puede caer en gastritis crónica. Sethi et al

5 ha reportado que

el H. pylori se presentó en noventa y un 91% de pacientes con gastritis crónica superficial. Marshall

5 determino que el H. pylori se presentó en

90% de ulcera duodenal y setenta por ciento de pacientes con úlcera gástrica.

El uso de pruebas serológicas para comprobar el anticuerpo producido inmunológicamente por la infección de H. pylori se ha sugerido como el método de elección para el monitoreo en grandes poblaciones. Las mediciones de los anticuerpos de H. pylori se ha hecho por hema- glutinación la fijación del suero de complemento y aglutinación bacterial. Estas pruebas no tienen la sensitividad de la enzima por inmunoensayo y son limitadas por interpretación subjetiva. Este procedimiento, con la sensitividad mejorada de la ELISA, permite una fácil detección de anticuerpos para el H. pylori. En adición, los resultados son cuantificados por un espectrofotómetro, el cual elimina la interpretación subjetiva.

La metodología de inmunoensayo de enzima por microplato, provee al técnico con una sensitividad óptima así como también requiere de muy pocas manipulaciones técnicas. En este método, el suero de referencia, el espécimen diluido del paciente, o control es primero agregado a un pozo de microplato. Se añade el H,pylori Biotinilado, y entonces se mezclan los reactivos. Una reacción resulta entre los auto anticuerpos del H.pylori y el H pylori Biotinilado para formar un complejo inmune, el cual es depositado sobre la superficie de los pozos cubiertos con streptavidin a través de la alta afinidad de la reacción de biotin y streptavidin.

Después de completado el período de incubación requerido, los reactivos son separados por la aspiración o decantación los cuales no quedaron adheridos a los pozos. Una enzima anti-humana IgG, M o A conjugada es entonces añadida para permitir la cuantificación de la reacción a través de la interacción con complejos inmunes humanos IgG, IgM e IgA. Después de lavar, la actividad de la enzima determinada por la reacción con el sustrato para producir luz.

El empleo de varias referencias de suero con la actividad de anticuerpos conocidos permite la construcción de un gráfico de la actividad de la enzima y anticuerpo. De la comparación de la curva de la reacción a cierta dosis, la actividad de un espécimen desconocido se puede correlacionar con el nivel de anticuerpo auto inmune.

PRINCIPIO

Método Secuencial de CLIA (Tipo 1):Los reactivos esenciales requeridos por un análisis secuencial de CLIA incluido el antígeno inmovilizado, el anticuerpo circulante y el anticuerpo de enzima-ligada especies-específicos. En este procedimiento, la inmovilización toma lugar durante el ensayo de la superficie del pozo en el microplato a través de la interacción del streptavidin cubierto sobre el pozo y el antígeno de H. pylori biotinilado exogenous agregado.

Una vez mezclado el antígeno biotinilado y un suero que contiene el anticuerpo, resulta una reacción entre el antígeno y el anticuerpo para formar un complejo inmune. La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación:

Simultáneamente, el complejo es depositado en el pozo a través de la reacción de lata afinidad de streptavidin y antígeno biotinilado. Esta interacción se ilustra abajo:

Después del período de incubación, el pozo se lava para separar los componentes desatados por la aspiración o la decantación. La enzima ligada al anticuerpo especies-específico (anti-h-IgG, M o A) se agrega entonces al pozo. Este conjugado ata al complejo inmune que formó.

La enzima conjugada de anti-h-IgG, IgM o IgA que se ata al complejo inmune en una segunda incubación es separada del material sin reacción por un paso de lavado. La actividad de la enzima en esta fracción es directamente proporcional a la concentración de anticuerpo en el espécimen. Al utilizar diferentes referencias de suero de actividad de anticuerpo conocida, una curva de referencia puede ser generada de la cual la actividad del anticuerpo para un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS Y MATERIAL PROVEEIDO

A. Calibradores Anti-H.Pylori -- 1ml/vial - Iconos A-ECinco frascos de referencia para anti-H.Pylori en los niveles de 0(A),10(B), 25(C), 50(D) y 100(E) U/ml* del tipo IgG, IgM e IgA. Almacene entre 2-8°C. Se ha agregado un preservativo. *Valor de referencia del fabricante.B. REACTIVO BIOTIN de H.Pylori - 13ml/vial - Icono ▼Un frasco de H.Pylori biotinilado inactivo (IgG, IgM o IgA) en una matriz de suero. Un preservativo se ha agregado. Almacénese entre 2-8°C.

C. REACTIVO TRAZADOR de H.Pylori - 13ml/- frasco del icono Un frasco de conjugado de Peroxidasa Horseradish anti-humano IgG, IgMo IgA en una matriz de suero. Se ha agregado un preservativo. Almacene entre 2-8°C.D. POZOS DE REACCIÓN A LA LUZ - 96 pozos - icono ↓Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en una bolsa de aluminio con un agente deshidratado. Almacénese a 2-8°C. E. Diluyente de Suero - - 20 mlUn frasco con diluyente de suero que contiene solución salina y un tinte. Almacénese entre 2-8°C.

F. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA--20ml - iconoUn frasco que contiene un surfactante en solución salina. Un preservativo ha sido agregado. Almacénese entre 2-30°C.G. REACTIVO SUSTRATO A -- 7ml/frasco icono S

A

Un frasco que contiene luminol en solución. Almacén entre 2-8ºC. (Vea la Sección de Preparación de reactivos.)H. REACTIVO SUSTRATO B --7ml/frasco icono S

B

Un frasco que contiene el peróxido de hidrógeno (H²O²) en solución. Almacénese entre 2-8ºC.I. SOLUCION STOP- 8ml/vial – IconUna botella que contiene un ácido fuerte (1 N HCl). Almacenar a 2-30 ºCJ.Instrucciones del producto.N o t a 1 : No utilice los reactivos más allá de la fecha de vencimiento del kit.N o t a 2 : Los reactivos abiertos son estables por sesenta días cuandoestán almacenados entre 2-8ºC.Nota 3: reactivos anteriores son para una sola microplaca de 96

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO

1. Pipeta capaz de entregar los volúmenes 10, 25 y 50µl con una precisión mejor de 1.5%.2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes0.100ml y 0.350ml con una precisión de mejor de 1.5%.3. Lavador de Micro placas o una botella de apretón (opcional).4. Luminómetro de micro placas.5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.6. Plástico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubación.7. Aspirador de vacío (opcional) para los pasos de lavado.8. Contador de tiempo.9. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONES

Para el Uso De Diagnóstico In Vitro No Para el Uso Interno o Externo en Seres Humanos o AnimalesTodos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antígeno superficial de lahepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos conlicencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer termine el aseguramiento que los agentes infecciosos están ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da Edición, 1988, publicación No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION

Los especímenes deben ser sangre, suero o plasma en tipo y tener las precauciones generales en la colección de muestras del veni-puntura. Para la comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la mañana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo liso de venipuntura de tapón rojo sin añadidos o anticoagulantes. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las células.Las muestras se pueden refrigerar entre 2-8°C. por un período máximo de cinco días. Si el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20°C.por hasta 30 días. Evite congelar y deshelar. Cuando analice enduplicado, se requiere 0.100 ml IgM % IgA) o 0.050ml (IgG) se requiere del espécimen diluido.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

1. DILUYENTE DE SUERODiluya el suero, diluyendo a 200ml en un contenedor adecuado con agua destilada o desionizada. Almacénese entre 2-8°C.2. SOLUCION LAVADORA.

Diluir el contenido del concentrado lavador a 1000ml con agua destilada o desionizada en un contenedor adecuado. Almacénese a temperatura ambiente entre los 20-27°C.

3. SOLUCIÓN DE TRABAJO SUSTRATO.Determine la cantidad de reactivo necesario y prepare mezclando porciones iguales del reactivo sustrato A y sustrato B en un contener limpio. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos tiras de 8 pozos (Se crea un exceso pequeño de solución). Deseche la porción sin usar si no se usa dentro de las 36 horas siguientes después de ser mezclado. Si la utilización de los reactivos se completa anticipadamente, dentro del tiempo, vierta los contenidos del Reactivo de Señal B dentro del Reactivo de Señal A y etiquete adecuadamente.4. Dilución de la Muestra del Paciente (1/100)Dispense 0.010ml (10µl) de cada espécimen del paciente en 1 ml del suero diluido. Cubra y mezcle por inversión. Guarde entre 2-8°C. hasta por cuarenta y ocho horas.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA

Antes de proceder con el análisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero y controles a la temperatura ambiente (20 - 27°C.).1. Ajuste el formato de los pozos de las micro placas para que cada referencia del suero, control y espécimen del paciente sean analizados enduplicado. Guarde los micropozos nuevamente dentro del bolso dealuminio, séllela y almacénela a 2-8°C.2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25µl) de la referencia, del control o del espécimen apropiado del suero en el pozo asignado para la determinación de IgG. Para IgM o IgA pipetear 0.50ml (50µl) del suero de referencia apropiado, control o espécimen diluido de paciente en el pozo asignado.3. Agregue 0.100 ml (100µl) del reactivo Biotin de H.Pylori. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo.4. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir.5. Incube 60 minutos en la temperatura ambiente.6. Deseche el contenido del micro placa por decantación o la aspiración. Si decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel absorbente.7. Agregue 350 µl de la solución lavadora (véase la sección de lapreparación del reactivo), decántelo (golpee y borre) o aspírelo. Repita cuatro veces adicionales para un total de cinco lavadas. Una lavadora automática o manual de la placa puede ser utilizada. Siga las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si se emplea una botella de apretón, llene cada uno bien presionando el envase (evite burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada y repita cuatro veces adicionales.8. Agregue 0.100ml (100µl) de Anti-Ig (x-IgG, IgM o IgA) ReactivoTrazador de a cada pozo.9. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir e incube por 30 minutos a temperatura ambiente.10. Repita los pasos (6 & 7) como se explico arriba.11. Agregue 0.100 ml (100µl) del reactivo de la solución de trabajo a todos los pozos (véase la sección de la preparación el reactivo). Agreguesiempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias de tiempo de reacción entre los pozos.12. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por cinco minutos.13. Agregue 0.050 ml (50 l) de la solución de parada a cada pocillo y agitar la microplaca suavemente por 15-20 segundos para mezclar. Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias de tiempo de reacción entre los pozos.14. Leer la absorbancia en cada pocillo a 450 nm (utilizando una longitud de onda de referencia de 620-630nm para minimizar imperfecciones del pozo) en un lector de microplacas. Los resultados deben ser leídos dentro de los treinta (30) minutos de agregar la solución de parada.

Nota: Para el re análisis las muestras con concentraciones superiores a 100 U / ml, diluir la muestra 1:05 un adicional o 1:10 usando el material diluido original en el diluyente de suero. Multiplicar por el factor de dilución para obtener la concentración de la muestraCONTROL DE CALIDADCada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y altorango de la curva de la reacción para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada método de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos proveídos. Los métodos estadísticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradación del kit de reactivos. Se deben usar reactivos frescos para determinar la razón de las variaciones.

CALCULO DE RESULTADOS

Una curva de referencia se utiliza para determinar la concentración de anticuerpos anti - H . Pylori en las muestras desconocidas.1 . Registre la absorbencia obtenida del listado del lector de microplacas tal como se describe en el Ejemplo 1.2 . Trace la absorbencia para cada referencia duplicada del suerofrente a la actividad anti- H.Pylori correspondiente en U / ml en el papel milimetrado (no promedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar ) .3 . Dibuje la mejor curva a través de los puntos trazados.4 . Para determinar el nivel de actividad anti - H.Pylori para un desconocido , localizar la absorbancia promedio de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical de la gráfica , encontrar el punto de intersección en la curva , y lea la concentración ( en U / ml ) desde el eje horizontal del gráfico ( los duplicados del desconocido se pueden promediar como se indica ) . En el siguiendo el ejemplo de la absorbancia promedio de 1,603 corta a la curva de respuesta de dosis a 64,0 U / ml de concentración de anti- H.Pylori ( Ver Figura 1 ) . *

Nota: Los datos presentados en el Ejemplo 1 y la Figura 1 es sólo para ilustración y no se deben utilizar en lugar de una curva estándar preparada con cada ensayo

Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada ensayo. En adición, los RLU’s de los calibradores deben ser normalizados a 100,000 RLU’s para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversión minimiza las diferencias causadas por la eficiencia de la variedad de instrumentos que pueden ser usados para medir la salida de luz.

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD

Maximum Absorbancia (100 U/ml calibrator) = > 1.3

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

A. Funcionamiento1. Es importante que el tiempo de reacción en cada pocillo se lleva a cabo constante para lograr resultados reproducibles.2. El pipeteo de las muestras no debe extender más allá de diez ( 10 ) minutos para evitar la deriva del análisis .3. Altamente lipémicas , hemolizadas o ampliamente contaminadas espécimen ( s ) no debe ser utilizado .4. Si se utiliza más de una ( 1 ) placa , se recomienda repetir la curva de respuesta a la dosis .5. La adición de solución de sustrato inicia una reacción cinética, que se termina por la adición de la solución de parada.Por lo tanto, hay que añadir el sustrato y solución de paro en la misma secuencia para eliminar cualquier desviación de tiempo durante reacción.6. Lectores de la placa miden verticalmente. No toque la parte inferior del los pozos.7. Si no se retira solución adherirse adecuadamente en el aspiración o decantación etapa de lavado ( s ) podría resultar en un replicación y resultados espurios .8. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reactivos de diferentes lotes.9. Muy alta concentración de anticuerpos anti - H.Pylori en las muestras de pacientes pueden contaminar las muestras inmediatamente después de estos niveles extremos. Bad duplicados son indicativos de cruz contaminación. Repita cualquier muestra, que sigue a cualquier paciente espécimen con más de 3,0 unidades de absorbancia.10. Las muestras, que están contaminadas microbiológicamente, en caso de no se utilizarán.11. Pipeteado exacto y preciso, así como después de la exacta requisitos de tiempo y temperatura prescritos son esenciales.Cualquier desviación de IFU de Monobind puede producir inexacta resultados.12. Todas las normas nacionales aplicables, los reglamentos y las leyes incluyendo, pero no limitado a , los buenos procedimientos de laboratorio , debe ser estrictamente seguido para asegurar el cumplimiento y la correcta el uso del dispositivo .13. Es importante calibrar todo el equipo por ejemplo, Pipetas,Lectores, Lavadoras y / o de los instrumentos automatizados utilizados con este dispositivo, y realizar preventivo de rutina mantenimiento.14. Análisis de Riesgos, como requerido por la marca CE IVD Directiva 98/79/CE- Para este y otros dispositivos, hechos por Monobind , puede ser deseados a través de correo electrónico de Monobind@monobind.com .

B. Interpretación1. Los resultados de laboratorio son sólo un aspecto de la determinación la atención al paciente y no debe ser la única base para la terapia, sobre todo si el conflicto con los resultados de otros determinantes.2. Para obtener resultados válidos, los controles adecuados y otros parámetros debe estar dentro de los rangos indicados y los requisitos de ensayo.3. Si se alteran los kits de prueba, tales como por partes de mezcla de diferentes kits, lo que podría producir resultados falsos de las pruebas , o si los resultados son interpretado incorrectamente , Monobind no tendrá ninguna responsabilidad .4. Si se utiliza la reducción de datos controlada por ordenador para interpretar la resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los calibradores caigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas .5. La importancia clínica del resultado se debe utilizar en la evaluación de la posible presencia de enfermedad gastrointestinal.Sin embargo, las inferencias clínicas no deben basarse exclusivamente en esta prueba , sino más bien como un complemento a la clínica las manifestaciones de las pruebas pertinentes a los pacientes y otros tales como Histología , ureasa y Cultura. Un resultado positivo no indicar una enfermedad gastrointestinal y no distingue entre la colonización y la infección de H.Pylori . Del mismo modo , una resultado negativo no elimina la ausencia de H.Pylori infección, sino más bien un muy bajo título de anticuerpos que pueden ser relacionado con las primeras etapas de la colonización .

RANGOS ESPERADOS DE VALORES

Un estudio de población aparentemente saludable (n=118) y pacientes sufriendo anormalidades gástricas (n=154) fueron tomadas para determinar los valores esperados para el sistema de pruebas de H. pylori Acculite de CLIA. Basados sobre la siguiente información puntos de niveles de corte fueron establecidos.

La presencia de anticuerpos IgG e IgA de H.Pylori está confirmada cuando los niveles de suero excedan los 20U/ml.La presencia de anticuerpos IgM de H.pylori está confirmada cuando los niveles de suero excedan los 40U/ml.

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores que se pueden esperar ser encontrado por un método dado para una población de personas “normal” es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la especificidad del método, de la población probada y de la precisión del método en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una lata interna de la gama determinada por los analistas usando el método con una población indígena al área en la cual el laboratorio está situado.

CARACTERISTICAS DE ACTUACIÓN

A. Precisión Anti-H. pylori - IgGLa precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de Anti- H.Pylori (IgG) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por análisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El número (N),

el valor medio(X), la desviación de estándar (σ ) y el coeficiente de

variación (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 1 y la tabla 2

B. Precisión Anti-H. Pylori – IgMLa precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de Anti-H.Pylori (IgM) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por análisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El

número (N), el valor medio(X), la desviación de estándar (σ ) y el

coeficiente de variación (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 3 y la tabla 4.

C. Precisión Anti-H. Pylori – IgALa precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de Anti-H.Pylori (IgA) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por análisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El número (N),

el valor medio(X), la desviación de estándar (σ ) y el coeficiente de

variación (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 5 y la tabla 6*.

REFERENCIAS