“EFECTO DEL ESTRÉS AGUDO POR INMOVILIZACION EN LA ... · II. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal....
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD ÁREA: INMUNOLOGÍA PRESENTA: M. C. y P. KARLA RAMÍREZ JIMÉNEZ DIRECTORES DE TESIS DR. RAFAEL CAMPOS RODRÍGUEZ M. EN C. MARYCARMEN GODÍNEZ VICTORIA MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2009 “EFECTO DEL ESTRÉS AGUDO POR INMOVILIZACION EN LA PRODUCCION BASAL DE IgA EN INTESTINO DELGADO DE RATONES Balb/c”
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS DE LA SALUD
ÁREA: INMUNOLOGÍA PRESENTA:
M. C. y P. KARLA RAMÍREZ JIMÉNEZ
DIRECTORES DE TESIS
DR. RAFAEL CAMPOS RODRÍGUEZ M. EN C. MARYCARMEN GODÍNEZ VICTORIA
MÉXICO, D. F. DICIEMBRE 2009
“EFECTO DEL ESTRÉS AGUDO POR INMOVILIZACION EN LA PRODUCCION BASAL DE IgA EN INTESTINO
DELGADO DE RATONES Balb/c”
I
ÍNDICE
Introducción 1
I. Definición de estrés. 2
a) Clasificación de estrés. 2
b) Etapas de estrés. 3
II. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal. 4
a) Hormonas del estrés (glucocorticoides y
catecolaminas).
5
III. Interacción Eje H-H-A y el Sistema inmune. 6
a) Efecto de las catecolaminas sobre sistema
inmune.
9
b) Efecto “in vitro” de las catecolaminas sobre
macrófagos.
9
c) Efecto “in vitro” de las catecolaminas en las
células NK.
9
d) Modelo de actuación de catecolaminas “in
vivo” en respuesta a linfocitos.
10
IV. Sistema inmunológico 11
V. Anatomía y fisiología de Intestino delgado 12
VI. Sistema Inmunitario de Mucosas 13
a) Sitios inductores y efectores del GALT 14
b) Componentes celulares del GALT 16
c) Componentes humorales del GALT 18
Planteamiento del Problema 23
Justificación 25
Objetivo General 26
Objetivo Particular 26
Hipótesis 27
Material y Métodos 28
I. Grupo muéstrales. 28
II. Obtención de material biológico(suero,
bazo,intestino delgado, líquidos intestinales, placas
de Peyer proximal y distal, lámina propia segmento
29
II
proximal y distal).
III. Determinación de corticosterona. 31
IV. Determinación de niveles de IgA. 31
V. Determinación de poblaciones linfoides. 32
VI. Análisis estadístico. 33
VII. Resultados. 34
VIII. Niveles de corticosterona en suero. 34
IX. Efecto del estrés sobre los niveles de IgA en suero 35
X. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre los
niveles de IgA en lavados intestinales.
36
XI. Efecto les estrés agudo sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en bazo.
37
XII. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento
proximal del intestino delgado.
39
XIII. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento
distal del intestino delgado.
39
XIV. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en lámina propia del segmento
proximal del intestino delgado.
41
XV. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en lámina propia del segmento distal
del intestino delgado.
43
XVI. Comparación de las poblaciones linfoides de las
placas de Peyer entre el segmento proximal y distal
del intestino delgado.
43
XVII. Comparación de las poblaciones linfoides de
lámina propia entre el segmento proximal y distal del
intestino delgado.
44
Discusión 46
Conclusiones 52
Perspectivas 53
III
Bibliografía 54
Abreviaturas IV
IV
ABREVIATURAS
Ac Anticuerpo
ACTH Hormona Adrenocorticotrofa
APC Células presentadoras de Antígenos
BALT Tejido Linfoide Asociado a Bronquios
Cell NK Células Natural Killer
CRH Hormona Liberadora de Corticotropina
Eje H-H-A Eeje Hipótalamo-Hipófisis-Adrenal
ENS Sistema Nervioso Entérico
GALT Tejido Linfiode Asociado a Intestino
IgA Inmunoglobulina A
IgG Inmunoglobulina G
IL Interleucina
LgM Inmunoglobulina M
LIE Linfocitos Intra-Epiteliales
MALT Tejido Linfoide Asociado a Mucosas
NALT Tejido linfoide Asociado a Nariz
RLT Receptor de Linfocito T
SNC Sistema Nervioso Central
TGF-β Factor de Crecimiento Transformante Beta
.
V
INDICE DE CUADROS Y FIGURAS
Pagina
Figura 1 Eje HHA y el sistema nervioso autónomo dispone de dos vías clave para la desregulación del sistema inmunitario.
8
Figura 2 Características histológicas del intestino delgado 12
Figura 3 Modelo de los sitios inductores y efectores en el GALT 15
Figura 4 Sistema inmune de la mucosas 16
Figura 5 Transporte de la IgA en mucosa intestinal 20
Figura 6 Concentración sérica de corticosterona en respuesta al estrés agudo inducido por inmovilización
33
Figura 7 Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA suero 34
Figura 8 Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en
lavados intestinales de los segmentos proximal y distal,
del intestino delgado
35
Figura 9 Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos
T y B en bazo
37
Figura 10 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el
porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del
segmento proximal del intestino delgado
38
Figura 11 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el
porcentaje de linfocitos T y B en placas de Peyer del
segmento distal del intestino delgado
40
Figura 12 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el
porcentaje de linfocitos T y B en la lámina propia del
segmento proximal del intestino delgado
41
Figura 13 Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el 42
VI
porcentaje de linfocitos T y B en la lámina propia del
segmento distal del intestino delgado
Cuadro 1 Interacción de las hormonas con las células inmunes 7
Cuadro 2 Componentes principales de la inmunidad innata y
adaptativa
11
Cuadro 3 Características principales de la inmunidad innata y
adaptativa
12
VII
RESUMEN
Actualmente se han asociado un gran número de enfermedades con la
exposición repetida y crónica al estrés. Ejemplo de ellas son las enfermedades
neurodegenerativas, cardiovasculares, alérgicas, infecciosas e inflamatorias.
Sin embargo aun se desconocen totalmente los mecanismos a través de los
cuales el estrés puede modular al sistema inmunológico y causar estas
patologias.
El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto del estrés agudo
inducido por inmovilización sobre el sistema inmune asociado a la mucosa del
intestino delgado de ratones Balb/c, machos. Para esto se determinó la
concentración de inmunoglobulina A total en suero y líquido intestinal de
ratones sanos y ratones sometidos a estrés, por la técnica de ELISA; el
porcentaje de linfocitos T cooperadores, linfocitos T citotóxicos y linfocitos B,
por citometria de flujo y; la concentradión de corticosterona en suero, por la
técnica de EIA.
También se determinó si existe alguna diferencia en los niveles de IgA y el
porcentaje de linfocitos entre el segmento proximal y distal del intestino
delgado, en ambos grupos de estudio (control y estrés).
VIII
ABSTRACT
Currently, several illness have been associated with repeated and chronic
exposure to stress. Examples are neurodegenerative, cardiovascular, allergic,
infectious and inflammatory diseases. However, the mechanisms through which
stress can modulate the immune system and cause these pathologies are still
completey unknown.
The aim of this study was to determine the effect of the acute stress induced by
restraint on the immune system associated with the mucosa of the small
intestinal of BALB/c mice. Accordingly, a determination was made of the levels
of IgA in serum and intestinal fluid of healthy mice and mice subjected to stress
by ELISA, the percentage of T helper cells, cytotoxic T and B lymphocytes by
flow cytometry, and the concentratión of serum corticosterone by the EIA
technique.
Finally, it was examined whether there is any difference in IgA levels and the
percentage of lymphocytes between the proximal and distal small intestine in
both study groups (control and stress).
1
Introducción
Actualmente se han asociado un gran número de enfermedades con la
exposición repetida y crónica al estrés. Ejemplo de ellas son las enfermedades
neurodegenerativas, migraña, depresión, hipertensión, infarto, aneurisma,
alergias, asma, infections respiratoires de vías aéreas altas y bajas,
enfermedad inflamatoria intestinal como colitis ulcerativa, enfermedad de
Chron, entre otras1
El estrés es un conjunto de eventos que se inician con un estímulo (estresor)
que inicia una reacción en el cerebro (percepción del estrés) que
posteriormente activa a los sistemas fisiológicos del cuerpo (respuesta de
estrés)2.. También se define como un “estado de amenaza para la
homeostasis, durante el cual se activa una respuesta adaptativa
compensatoria”3, y en una forma mas simple, como la respuesta general del
organismo ante cualquier estimulo estresor o situación estresante. Sin
embargo, no existe en la actualidad una definición del estrés aceptada en
forma generalizada4,5
2
I. Definición de estrés
En 1930, Hans Selye definió al estrés como "la respuesta no específica del
organismo a cualquier demanda de cambio".6. En 1966, Richard Lazaros, lo
describe como "el resultado de la relación entre el individuo y el entorno
poniendo en peligro su bienestar".7. En medicina el estrés es un proceso
fisicoquímico y emocional. La Organización Mundial de la Salud (O.M.S.)
postula que el estrés es "el conjunto de reacciones fisiológicas que prepara al
organismo para la acción".8
.
De acuerdo a lo antes mencionado, se permite définir al estrés como la
respuesta del organismo a condiciones externas que perturban la homeostasis
de una persona, dando como resultado la activación y la inhibición fisiológica y
patológica de diferentes procesos biológicos.
Clasificación de Estrés
En la actualidad existen diferentes formas de clasificar al estrés. De acuerdo a
su etiología se puede clasificar en físico (trauma, cirugía, quemaduras e
infecciones), psicológico o emocional (problemas interpersonales, disgustos,
depresión), metabólico (deshidratación, hemorragias, cetoácidosis,
hipoglicemia) y farmacológico (cocaína, anfetaminas, hipoglicemia).
3
Otra forma de clasificarlo dependiendo de su duración es en estrés agudo y
estrés crónico.
Se denomina estrés agudo cuando el estimulo estresor dura de minutos a
horas y su duración no es prolongada en el tiempo y se presenta en una sola
ocasión.
Estrés crónico es cuando la acción de respuesta y el estimulo estresor que el
sujeto debe enfrentar se prolonga en el tiempo y la sensación de amenaza es
constante. Si la situación de estrés crónico se mantiene constante durante un
tiempo muy prolongado ocasiona agotamiento de la respuesta tanto del
sistema nervioso y este agotamiento puede debilitar al sistema inmunológico
siendo más vulnerable a las enfermedades (inmunológicas y crónico
degenerativas), así como también provoca trastornos metabólicos y
psicológicos.9
Etapas de estrés
La respuesta de adaptación orgánica o estrés tiene tres etapas: alarma o
reacción, adaptación y descompensación. Las dos primeras se consideran
frecuentes, cotidianas y benéficas para la vida, aumentan levemente las
hormonas de estrés y mejoran las funciones orgánicas para lograr adaptación o
triunfar sobre retos estresantes; esos niveles de estrés se advierten en
4
situaciones aún placenteras tales como comer, reír, hacer ejercicio moderado y
cuando los problemas estresantes encuentran solución o escape. La tercera
fase o descompensación del estrés es negativa para el organismo,
predisponiendo el desarrollo de enfermedades serias agudas, crónicas y
mortales 10
La reacción al estrés, se desencadena como una respuesta inespecífica
encaminada a compensar cualquier situación en la que el organismo se
encuentre en peligro y altere su homeostasis. Durante las fases de alarma y
agotamiento del síndrome general de adaptación o síndrome de estrés, ocurre
inhibición del sistema inmune como parte de la respuesta normal del organismo
ante la estimulación y ocurre un hipofuncionamiento del sistema inmune, con
lo que el organismo queda expuesto a la acción de los agentes infecciosos del
ambiente, siendo más susceptible a padecer enfermedades4.
II.Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal
La habilidad de adaptarse a una situación de estrés está determinado por el
modo en que se percibe la situación, fisiológicamente la respuesta al estrés
está controlada por el sistema nervioso central (SNC) y la coordinación que
éste ejerce sobre los tres sistemas encargados de mantener la homeostasis:
autónomo, endocrino e inmune. El principal efector de la respuesta al estrés es
el eje hipotálamo-hipófisis-glándulas adrenales (HHA)11,12
5
En el hipotálamo, las neuronas de la región parvocelular del núcleo
paraventricular poseen axones que se proyectan a la capa externa de la
eminencia media donde secretan la hormona liberadora de corticotropina
(CRH). La hormona liberadora de corticotropina desde la circulación porta-
hipofisiaria estimula a las células corticotropas de la adenohipófisis a que
secreten la hormona adrenocorticotrofa (ACTH) que tiene como órgano blanco
la corteza de las glándulas suprarrenales, específicamente las porciones
fasciculada y reticular, que en respuesta a la estimulación de la ACTH secretan
glucocorticoides; en especial el cortisol que es el glucocorticoide predominante.
Esta hormona estimula la glucogenólisis, la proteólisis y la lipólisis, teniendo
efectos cardiacos inotrópicos (taqicardia, hipertensión arterial, vasoconstricción
periférica sobre todo a nivel intestinal) e induce la expresión genética de varias
proteínas reguladoras y secretoras2.
El sistema nervioso autónomo simpático es otro efector de la respuesta el cual
genera activación de las neuronas preganglionares simpáticas y la liberación
concomitante de noradrenalina por las neuronas posganglionares simpáticas, la
activación simpática estimula a las células cromafines de la médula de la
glándula suprarrenal a que secrete adrenalina al torrente sanguíneo. La
adrenalina aumenta la frecuencia cardiaca y respiratoria y el flujo sanguíneo a
los músculos, con lo que prepara al organismo para emitir una de dos
respuestas, pelear o huir.9
6
III. Interacción del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal y sistema
inmune
Las hormonas glucocorticoides y catecolaminas, liberadas durante la
exposición del organismo al estrés, ejercen funciones inmunoestimulantes o
inmunosupresoras dependiendo del tipo de estrés al que esté expuesto el
individuo. Estos efectos se llevan a cabo a través de su unión directa a sus
receptores específicos, localizados en el citoplasma y en la membrana celular,
de las células inmunes. Los órganos linfoides primarios y secundarios, así
como los linfocitos T y B, los neurotrófilos, los monocitos y los macrófagos,
poseen receptores para hormonas glucocorticoides tipo II, predominantemente.
13
Las catecolaminas adrenalina y noradrenalina modulan el funcionamiento del
sistema inmune a través de sus receptores beta-adrenérgicos localizados en
todos los órganos inmunes y en los linfocitos T y B, las células asesinas
naturales (NK), los monocitos y macrófagos (Cuadro 1)12. El sistema nervioso
autónomo, en su división simpática, inerva la red vascular y parénquima de los
órganos linfoides primarios, como la médula ósea y el timo, y también inerva a
los órganos linfoides secundarios, el bazo, los ganglios linfáticos y el tejido
linfoide asociado a la mucosa pulmonar y al intestino. Las fibras del sistema
nervioso simpático arborizan dentro de compartimentos específicos en los
órganos linfáticos, en la vaina periarteriolar linfática y seno marginal de la pulpa
blanca del bazo y en los cordones medulares, corteza y paracorteza de los
ganglios linfáticos; y establecen contactos, similares a sinapsis neurona-
7
neurona, con células inmunes como linfocitos T, granulocitos, macrófagos y
células asesinas naturales (NK). La inervación simpática de los órganos del
sistema inmune promueve la maduración y movilización de los linfocitos,
timocitos, células NK y granulocitos en condiciones normales y durante
infección del organismo; mientras que la denervación, por el uso de
antagonistas noradrenérgicos o por simpatectomía, produce supresión de la
respuesta inmune14
. En la figura 1 se muestra la relación entre el HHA y el
sistema inmune.
Cuadro 1. Interacción de las hormonas con las células inmunes
Hormona Células que expresan
receptores Función celular
Glucocorticoides Células T y B,
neutrófilos y macrófagos
Inhibe la inflamación, inhibe la producción
de ILl-12 por CPA, inducir a un cambio
de la producción de citocinas TH2 a TH1
Hormona liberadora corticotropina
Células T, monocitos y
macrófagos
Aumenta la producción de IL-1, pruebas
de la modulación de la inflamación
autocrina y / o paracrina
Catecolaminas:
adrenalina y
noradrenalina
Células T y B, células
NK, monocitos y
macrófagos
Inducir cambio hacia la respuesta th2,
participa CPA y células th1
8
Hipotalamo
Hipófisis
Hormona liberadora de corticotropina
Nodo linfático
Citocinas tal como: IL-1Adrenalina y
Noradrenalina
Glucocorticoides
Nodo linfático Corteza
Médula
Hormona Adrenocorticotropa
Hormona lib. prolactina
Sangre periférica
Cerebro
Inervación simpática
Célula BCélula T
Célula Presentadora de antígeno
Célula NK
Monocito
Estrés
Figura 1 El eje HHA y el sistema nervioso autónomo dispone de dos vías clave
para la desregulación del sistema inmunitario. Los factores de estrés pueden
activar el eje simpático-adrenal-medular (SAM), así como el eje HPA, y por lo
tanto provocar la liberación de hormonas hipofisarias y suprarrenales como las
catecolaminas (adrenalina y noradrenalina), hormona corticotropina (ACTH),
cortisol, hormona del crecimiento y la prolactina, que a su vez pueden actuar
directa o indirectamente sobre el sistema inmunológico.11
El efecto inmunosupresor de los glucocorticoides se debe principalmente a la
disminución en la producción de citocinas como el interferón-γ (IFN-γ), el factor
de necrosis tumoral (TNF) y las IL-1, IL-2 e IL-6, necesarias para la
maduración y movilización de los linfocitos y otras células inmunitarias.
9
Efecto de las catecolaminas sobre el sistema inmune
Cuando los niveles de catecolaminas se elevan por el estrés, a
concentraciones de 10-4 M, inhiben la producción de linfocitos T, pero a
concentraciones de 10-8 M y en presencia de hidrocortisona estimulan la
proliferación de estas células. .
Efecto "in vitro" de las catecolaminas sobre los macrófagos
Solo concentraciones de 10-12 M aumentan significativamente la quimiotaxis de
macrófagos. Pero los receptores α son más importantes en este proceso.
Concentraciones farmacológicas (altas) o fisiológicas de norepinefrina
estimulan la capacidad fagocítica de los macrófagos, a no ser que uno de los
receptores esté bloqueado.
Se supone que la quimiotaxis necesita menos concentración de norepinefrina
que la fagocitosis porque en los vasos no hay mucha cantidad, pero cuando los
macrófagos son atraídos al foco infeccioso, la epinefrina y norepinefrina actúan
autocrinamente sobre las células aumentando la concentración en un lugar
localizado. Concentraciones de 10-5 a 10-12 M son además quimioatrayentes
para los fagocitos.
Efectos "in vitro" de las catecolaminas en las células NK
Concentraciones mayores o iguales a 10-7 M de norepinefrina inhiben la
proliferación de células NK. Concentraciones menores de 10-7 M la estimulan
10
bajo determinadas circunstancias. Este efecto se ha visto que influye
directamente sobre las células NK y no sobre las células tumorales.
Modelo de actuación de catecolaminas "in vivo" en respuesta a
linfocitos
La actuación se divide en tres fases temporales: fase inductiva, proliferativa y
efectora.
Fase inductiva: La noradrenalina liberada por las terminaciones nerviosas
estimula la fagocitosis y presentación antigénica así como la colaboración
celular en general a través de receptores α y β adrenérgicos. Se favorece el
inicio de la respuesta inmunitaria. Las citoquinas producidas por los
macrófagos (fundamentalmente la IL-1) inhiben la acción de la noradrenalina
disminuyendo su concentración.
Fase proliferativa: Concentraciones bajas de noradrenalina a través de
receptores α estimulan la proliferación de los linfocitos T. Segregan IL -2 que
también estimula la producción de noradrenalina. Concentraciones de
noradrenalina altas por receptores β inhiben la proliferación de los linfocitos,
con lo que se para y regula la respuesta proliferativa.
Fase efectora: La noradrenalina, a través de receptores β, disminuye la
producción de anticuerpos o la actividad de linfocitos citotóxicos (CTL).
11
IV. Sistema Inmunológico
El sistema inmune es la defensa natural del cuerpo contra infecciones, como
las bacterias y los virus. Los individuos se encuentran protegidos contra
microorganismos por medio de diferentes mecanismos: la inmunidad Innata,
que representa la primera línea de defensa contra microorganismos y la
inmunidad adaptativa que es estimulada tras la exposición a agentes
infecciosos y cuya intensidad y capacidad defensiva aumentan después de la
exposición aún determinado microorganismo pero con características de
especificidad, especialización y la capacidad de recordar y responder con más
fuerza tras exposiciones repetidas al mismo organismo.15,16
En el Cuadro 2 se describen los componentes celulares y humorales de los dos
tipos de respuesta inmune y en el Cuadro 3, se describen algunas
características de estas respuestas.
Cuadro 2. Componentes principales de la inmunidad innata y
adaptativa
Innata Adaptativo
Barreras celulares y
químicas
Piel, epitelios mucosos,
productos químicos
antimicrobianos
Linfocitos presentes en los
epitelios; anticuerpos
segregados en las
superficies epiteliales
Proteínas sanguíneas Complemento, otras Anticuerpos
Células
Fagocitos(macrófagos,
neutrófilos),linfocitos
citolíticos naturales
Linfocitos
12
Cuadro 3. Características principales de la inmunidad innata y
adaptativa
Innata Adaptativo
Respuesta
Contra patrones
moleculares conservado
(PRRs)
Contra antígenos
microbianos o particulados
Especificidad Limitada, codificada por la
línea celular
Muy amplia; los receptores
se producen por
recombinación genética
Diversidad Nula Sí
Memoria Sí Sí
V. Anatomía y fisiología de intestino delgado
El intestino es un órgano tubular formado por tres regiones (duodeno, yeyuno e
íleon)13. Histológicamente está compuesto por cuatro capas concéntricas que
constituyen la pared: mucosa, submucosa, muscular y serosa (Figura 2)17. La
función principal del aparato digestivo es permitir que los alimentos ingeridos
puedan ser digeridos y absorbidos para proveer al organismo los nutrientes
necesarios para el mantenimiento general de las funciones corporales, a la vez
que protege frente agentes patógenos (flora bacteriana), esto se consigue
debido a la respuesta integrada por tres sistemas que se encuentran
distribuidos por todo el organismo: él sistema nervioso, sistema inmunitario y
sistema endocrino2.
13
Figura 2. Características histológicas del intestino delgado.
VI. Sistema inmune de mucosas
El MALT contiene más del 80% de las células inmunes y la respuesta
inmunitaria frente a antígenos orales difiere en algunos aspectos
fundamentales en comparación con la respuesta a antígenos que se
encuentran en otras localizaciones15,16
Las mucosas juegan un papel muy importante en la defensa inmunológica, ya
que un gran número de agentes patógenos entran por estas vías. Las mucosas
cuentan con una cantidad considerable de tejido linfoide asociado a mucosas
denominado (MALT, por sus siglas en ingles, Mucosal Associated Lymphoid
Tissue), en base a su sitio anatómico se divide en: tejido linfoide asociado a
nariz (NALT, por sus siglas en ingles, nasal associated lymphoid tissue), tejido
linfoide asociado a bronquios (BALT, por sus siglas en ingles, bronchiol
14
associated lymphoid tissue) y tejido linfoide asociado a intestino (GALT, por sus
siglas en ingles, gut associated lymphoid tissue).
El GALT, es el tejido más extenso del organismo. Este se encuentra en
constante renovación, por lo que hay una alta probabilidad de producirse
células tumorales, también es un lugar de entrada de agentes infecciosos y
alérgenos.17
Sitios inductores y efectores del GALT
En la mucosa gastrointestinal existen sitios para estimular la respuesta inmune,
denominados sitios inductores, y donde se desarrolla la función inmune,
denominados sitios efectores.
Las placas de Peyer (PP) son los sitios inductores reconocidos del GALT. En
el epitelio de las placas existen células especializadas llamadas células M, por
debajo del epitelio se encuentran abundantes células dendríticas (DC), con
capacidad fagocítica, que expresan en su superficie moléculas clase II del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-II), que las capacita como células
presentadoras de antígeno (APC). Después de captar los antígenos, los
procesan intracelularmente y migran hacia el interior de las PP para presentar
al antígeno al los linfocitos T (células inductoras de la respuesta inmune) ya
procesados en la molécula MHC-II, para iniciar la respuesta inmune. Una vez
15
realizada la activación, los linfocitos T y los B (productores de los anticuerpos),
específicos contra el antígeno (Ag), proliferan y abandonan el sitio inductor a
través de la linfa llegando a los ganglios linfáticos regionales (mesentéricos).
De ahí viajan a través del torrente sanguineo y llegan a las otras mucosas del
organismo. Finalmente, la mayoría de esas células llegan a la lamina propia
(LP) intestinal (sitio efector) a través de este mecanismo de recirculación
(Figura 3),18
Figura 3. Modelo de los sitios inductores y sitios efectores en el GALT.
16
Componentes celulares del GALT
En la mucosa del intestino hay una gran cantidad de linfocitos repartidos en
tres regiones (Figura 4):
1. Dentro de la capa epitelial (linfocitos intraepiteliales, LIE)
2. Lamina propia
3. Grupo de placas de Peyer (a lo largo del intestino delgado)
Figura 4 El sistema inmune de la mucosa. A. Esquema de los componentes
celulares del sistema inmune de la mucosa del intestino. B. Microfotografía de
tejido linfático de la mucosa del intestino humano. Similares agregados de
tejido linfoide se encuentran en todo el tracto gastrointestinal y tracto
respiratorio15.
17
Los LIE corresponden a linfocitos. T, en el hombre gran parte son CD8+, en
ratón el 50% expresan RLTγδ, l las células Tγδ constituyen una porción
minoritaria del total de células T (globalmente menos del 5%), aunque los
porcentajes varían según el tejido y la especie.
En los humanos, las células Tγ δ sólo son aproximadamente entre un 0.5-15%
de las células T de sangre periférica, pero muestran una gran dominancia en el
epitelio intestinal (10% de las células T intestinales) y piel. En el ratón, los
linfocitos intraepiteliales son predominantemente células Tγδ (el 50%).
La lámina propia, contiene una población mixta entre las que cuentan los
linfocitos T CD4+, dotados de fenotipo de células activadas y es probable que
los linfocitos T reconozcan el antígeno en primera instancia a nivel de ganglios
linfáticos mesentéricos de drenaje hacia intestino para poblar la lámina propia.
Posee linfocitos B activados y células plasmáticas así como macrófagos,
células dendríticas, eosinofilos y mastocitos .Además los linfocitos b presentes
en la lamina propia producen IgA15 .
El MALT además de linfocitos contiene tejidos linfáticos organizados: placas de
Peyer de intestino delgado, folículos linfáticos pertenecientes a bazo y ganglios,
los folículos en mucosas forman zonas pobladas de linfocitos que suelen
mostrar centros germinales Las placas de Peyer poseen un número de
linfocitos T CD4+, en la región interfolicular. Existen las células M
caracterizadas por que carecen de microvellosidades permitiendo el paso
antigénico.15,16.
18
Componentes humorales del GALT
La IgA es la inmunoglobulina que se produce en gran cantidad en estos
tejidos, a nivel de las mucosas existe un contacto íntimo entre organismo y
medio ambiente. La mayoría de los agentes infecciosos llegan al cuerpo a
través de las mucosas, y el moco adherido a la superficie constituye una parte
esencial del sistema inmune mucosa.
En el organismo la IgA constituye más del 80% de todos los anticuerpos
producidos por el MALT. Además, los anticuerpos de IgA no solo están
presentes en las secreciones externas, sino también ejercen propiedades
antimicrobianas a las células epiteliales durante su transporte a través del
epitelio. Representan la clase de inmunoglobulina predominante en las
secreciones externas, cantidad bien definida, que brinda una protección
inmunológica específica para todas las superficies mucosas, al producir un
bloqueo a este nivel ante la penetración al organismo de agentes patógenos.
La IgA es la inmunoglobulina predominante en la saliva y secreciones
intestinales en forma de IgA secretoria, la mayoría se produce como resultado
de una síntesis y no del torrente circulatorio. Entre sus funciones están la de
inhibir la adherencia bacteriana y la neutralización de enzimas, virus y toxinas.
19. Puede unirse de forma específica a moléculas presentes en la superficie
bacteriana mediadora de la unión de esta célula epitelial, y su unión a la
bacteria aumenta la afinidad de este complejo a la mucina, lo cual facilita la
19
inmovilización del microorganismo a la capa mucosa con la consiguiente
eliminación. Cuando se une a la partícula viral, no solo previene la unión de
esta a la célula huésped mediante el bloqueo de receptores específicos, sino
que este encuentro puede ocurrir dentro de la célula epitelial en el momento del
transporte de IgA (Figura 5) La neutralización de enzimas y toxinas puede
ocurrir por bloqueo del sitio de unión de la toxina con un receptor, o por
modificación conformaciones de este sitio.4.
La cantidad de IgA secretora que produce y transporta hacia las superficies
mucosas cada día, excede los niveles de IgG del suero. La superficie mucosa
en el intestino está cubierta por una capa única de células, entre las que se
encuentran las células absortivas (enterocitos), que son muy numerosas y
cubiertas por mocos y glicocolyx, las Globet cells que sintetizan el moco, las
células de paneth localizadas en el intestino delgado, y que presentan en su
citoplasma gránulos secretorios que contienen lisozimas, IgA, IgE, así como
también células enteroendocrinas, situadas a lo largo del tracto gastrointestinal,
cuya función principal es liberar hormonas al tejido conectivo en respuesta a
cambios en el ambiente exterior.20
Las células M que se encuentran esparcidas por todo el epitelio mucoso y su
función principal de esta célula M es la absorción de partículas desde la luz
gastrointestinal transportándola hacia la región vasolateral rica en linfocitos y
otras células inmunes; además, debido a su bajo contenido en lisozima,
pueden transportar antígenos con una casi nula degradación enzimática. Su
20
superficie contiene receptores específicos para la región Fc. de la IgA, por lo
que puede fijar y transportar complejos antígenos anticuerpos.
Figura 5. Transporte de la IgA en la mucosa intestinal. La IgA es producida por
el linfocito B en lamina propia y se secreta en forma de dimero y se mantiene
unido mediante una cadena J. La IgA es transportada al lumen por el receptor
de poli-Ig (sintetizado en células epiteliales). El complejo se endocita y es
secretado hacia el lumen por transporte activo mediante vesículas15
La superficie mucosa intestinal está colonizada por una microflora que alcanza
un gran número de células bacterianas en el intestino distal, y más
específicamente en el colon, al mismo tiempo, estas áreas extensas son la
interfase con el ambiente externo, a través del cual la mayoría de los agentes
patógenos inician los procesos infecciosos. Los mecanismos intestinales de
defensa necesitan discernir correctamente entre la micro flora simbiótica y los
patógenos exógenos. Aún no se entiende bien este mecanismo pero
21
probablemente, tanto la respuesta inmunológica innata como las adaptativa
participen en este proceso.21
Se sugiere un posible papel de las células epiteliales en la presentación de
antígenos. Las células dendríticas situadas en el epitelio de las mucosas que
pueden presentar directamente antígenos hacia las células B, y dirigir sus
cambios de isotipo hacia la IgA e IgA2 con la ayuda de las citoquinas
producidas por las células epiteliales. Las células epiteliales pueden, jugar un
rol mayor en la producción de anticuerpos IgA de las mucosas, los cuales son
esenciales para la defensa contra microorganismos22
Los linfocitos indican que las células inmunológicamente activas son
transportadas hacia secreciones de superficie, y que hay una mayoría
sustancial desde la amígdala nasofaríngea de células inmunológicamente
activas, hacia las secreciones de superficie.
En el epitelio de las vías respiratorias como en aparato gastrointestinal se
produce IL-2, IL-6, IL-10 y TGFβ, factores esenciales para la proliferación clonal
de las células B. La estrecha proximidad de las células B al epitelio de las vías
respiratorias, probablemente garantiza un aporte constante de factores de
crecimiento y diferenciación necesarios para la producción de IgA mucosa.
Además, las células epiteliales producen una glicoproteína, llamada
componente secretor, que no solo confiere creciente estabilidad a la IgA, sino
que es cuantitativamente el receptor más importante del sistema inmunológico
22
de las mucosas, al ser responsable del transporte externo de polímeros de IgA
e IgM producidos localmente.
23
Planteamiento del Problema
El problema que se pretende estudiar es el siguiente: ¿Si el estrés agudo por
inmovilización modifica la producción basal de IgA en el intestino delgado de
ratón Balb/C? Esta pregunta, es relevante por las razones que a continuación
se exponen.
Primero, la mucosa intestinal es sitio de entrada de alérgenos y
microorganismos, potencialmente patógenos por lo tanto es importante
establecer cuáles son los efectos del estrés sobre las respuestas inmunitarias
humorales y celulares en este lugar.
Segundo, La inmunoglobulina A secretora (IgAs) desempeña una función
crucial en la defensa del organismo a nivel de mucosa. La secreción de esta
inmunoglobulina esta bajo control de nervios entéricos con fibras colinérgicas y
adrenérgicas. Esta inervación se encuentra afectada durante estés agudo
dando como respuesta la estimulación la secreción de IgAs 22
. Satoshi
Tsujita,1998 demostró que los niveles de IgAs se ven afectados por el estrés.
Sin embargo, a nivel de mucosa intestinal no hay nada escrito. Por otra parte
Jarillo luna, 2007, demostró que durante el estrés crónico afecta el porcentaje
de linfocitos intra epiteliales.
24
Tercero, Las placas de Peyer juegan un papel importante en el abastecimiento
de células responsables de la inmunidad humoral local lo que sugieren un
camino diferencial para los precursores de IgA y su destino cuando el antígeno
puede causar la expansión de una población de células específicas,23
De aquí la importancia de saber si el estrés agudo es capaz de modificar las
poblaciones linfoides tanto de los sitios inductores (placas de Peyer) como en
los efectores (lámina propia), del tejido linfoide asociado a mucosa intestinal
(GALT)
.
Así también el resaltar la importancia y la diferencia humoral y celular entre los
segmentos proximales y distal del intestino delgado.
25
Justificación
Numerosos estudios han demostrado la asociación entre el estrés y el sistema
inmune en el desarrollo de enfermedades alérgicas, inflamatorias, infecciosas y
autoinmunes, sin embargo poco se sabe sobre el efecto del estrés agudo sobre
el sistema inmune humoral y celular a nivel de mucosa intestinal, lo cual marca
una gran necesidad de estudiar estas respuestas biológicas para lograr
entender los mecanismos fisiopatológicos a través de los cuales se desarrollan
estas enfermedades y proponer nuevas estrategias preventivas y terapéuticas
Aún no se ha logrado demostrar la importancia del estrés agudo sobre la
producción de IgA y la modificación de las poblaciones linfoides en este sitio
anatómico así mismo se desconoce si existe alguna diferencia estructural sobre
el sistema inmune entre el segmento proximal y distal del intestino delgado.
26
Objetivo General
Determinar si el estrés agudo inducido por inmovilización es capaz de modificar
el porcentaje de linfocitos T y células B, así como la secreción de IgA en tejido
linfoide asociado al intestino de ratones Balb/c.
Objetivos Particulares
1. Determinar si el estrés agudo por inmovilización modifica los niveles de IgA
en el líquido intestinal del segmento proximal y del distal del intestino
delgado.
2. Determinar si el estrés agudo por inmovilización modifica las poblaciones de
linfocitos B, linfocitos T cooperadores (CD4) y linfocitos T citotoxicos (CD8)
en las placas de Peyer del segmento proximal y distal del intestino delgado.
3. Determinar si existen diferencias entre los segmentos proximal y distal del
intestino delgado, sobre la producción de IgA y en los porcentajes de
linfocitos T y B.
27
Hipótesis
El estrés agudo inducido por inmovilización es capaz de modificar la
producción basal de IgA en líquido intestinal y de las poblaciones linfoides en
GALT del segmento proximal y distal de intestino delgado en ratones Balb/c,
debido a la secreción elevada de glucocorticoides los cuales tienen efectos
sobre la liberación de citocinas responsables de la proliferación de los linfocitos
y el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas.
28
Material y Métodos
I. Grupos muéstrales
Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c de 8 -10 semanas de edad, de
20-25 g de peso, proporcionados por el bioterio de la Escuela Superior de
Medicina (ESM), del Instituto Politécnico Nacional.
Los Animales fueron mantenidos a una temperatura entre 20 y 25 °C, con una
humedad entre el 40 y 70%, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, bajo
condiciones libres de patógenos y alimentados con Lab Diet 503 de PMI
International. Los ratones fueron divididos en 2 grupos de 5 ratones cada uno,
de la siguiente manera:
Grupo l (control): Este grupo corresponde a los ratones control, los cuales se
mantuvieron bajo restricción de agua y alimento durante un periodo de 4 horas
correspondiente al periodo de estrés al cual fue sometido el grupo problema.
Grupo ll (estresados): Estos ratones fueron sometidos a un periodo de estrés
agudo por inmovilización, durante 4 horas continuas. El modelo de estrés
consistió en sujetar las cuatro extremidades de los animales, a una placa de
acrílico de 15 x 25 cm, lo cual impidió su movilización tanto horizontal como
longitudinalmente.
29
II. Obtención de material biológico
Al concluir el periodo de estrés, ambos grupos de ratones fueron sacrificados
en una cámara de éter. Los líquidos biológicos y los tejidos fueron obtenidos
en condiciones frías (en hielo), de la siguiente manera:
Suero: Para obtener el suero se realizó una punción intracardiaca, obteniendo
1 ml de sangre aproximadamente, por cada ratón. La sangre se centrifugó
inmediatamente a 4000 rpm, por 10 min a 8 °C. Se separó el suero y se
almacenó a -70 °C hasta el momento de su análisis.
Bazo: Este órgano se obtuvo realizando una incisión a nivel de la línea media
en el abdomen de cada animal. Posteriormente fue disgregado y lavado con
medio de cultivo RPMI-1640 y ajustado a 1x106 células/muestra para su tinción
fenotípica y análisis citofluorométrico.
Intestino delgado: Con el animal en decúbito dorsal sobre una cama de
disección de 15x25cm, se hace una incisión media de apéndice xifoides hasta
región pélvica exponiendo las vísceras, se localiza el estomago tomándolo
como base para la disección del intestino delgado 3 mm por debajo del píloro
hasta 3 mm por arriba del ciego y se divide en porción proximal y distal
respectivamente.
30
Liquido Intestinal: Obtenida la porción proximal y distal de cada muestra y
colocadas en cajas de petri estériles y en medio de cultivo RPMI-1640, se
realizo un lavado con 3 ml de RPMI-1640, utilizando una cánula estéril. Se
adicionó 200 μl de un inhibidor de proteasas, a cada muestra y se centrifugaron
a 1500 rpm, por 10 min, a 4 °C. Se separó el sobrenadante y se almacenaron a
-70 °C hasta el día de su análisis.
Placas de Peyer: Las placas de Peyer fueron removidas de cada segmento
del intestino y colocadas en RPMI-1640, posteriormente fueron disgregadas en
una malla metálica y por ultimo fueron lavadas con PBS 1x y ajustadas a 1x10 6
células/muestra para su tinción y análisis citofluorométrico.
Lamina propia de intestino delgado (proximal y distal): Se evirtieron los
intestinos de cada grupo y se incubaron en colagenasa a 37°C, por 30 min, en
agitación continua (200 rpm). Posteriormente se disgregaron y se filtraron con
una malla de organza. El filtrado se centrifugó a 1500 rpm, por 10 min a 4 °C.
El botón celular fue lavado dos veces con RPMI-1640. Para separar las células
mononucleares, se utilizó un gradiente de percoll.. El gradiente se realizó de la
siguiente manera: el botón celular se resuspendió en una solución de percoll al
40% y fue depositada sobre las paredes de un tubo falcón el cual contenía una
solución de percoll al 70%. Una vez hecho el gradiente, y sin mezclar las fases,
las muestras fueron centrifugadas a 2500 rpm, durante 30 min, a 8 °C,
utilizando una aceleración y desaceleración de cero. El anillo correspondiente a
las células mononucleares fue separado utilizando una pipeta Pasteur y lavado
31
dos veces con RPMI-1640. Las células fueron ajustadas a 1x106
células/muestra para su tinción fenotípica y análisis citofluorométrico.
III. Determinación de corticosterona
Los niveles de corticosterona fueron determinados en suero por inmunoensayo
enzimático (EIA, por sus siglas en ingles enzyme immunoassay) utilizando un
kit de la marca Stressgen (catalogo 901-097 480), con base a las instrucciones
del fabricante. La lectura de placa se llevó a cabo en un lector de ELISA (BIO-
RAD), a una longitud de onda de 405 nm. Se realizó una curva estándar para
conocer la concentración de corticosterona en ng/ml.
IV. Determinación de los niveles de IgA
La concentración de IgA fue determinada en suero y lavados intestinales por
medio de la técnica de ELISA.
Se utilizó una placa de ELISA de 96 pozos, la cual se recubrió con un primer
anticuerpo de conejo anti-IgA de mieloma de ratón. Posteriormente se bloqueo
la placa con leche Svelty al 6%, disuelta en PBS 1x y se incubó con los sueros
y los lavados intestinales. Para el suero se utilizó una dilución de 1:1000 y para
los líquidos intestinales, una dilución de 1:2. Después se agregó un segundo
anticuerpo de chivo anti-IgA de ratón peroxidado, a una dilución de 1:1000. Por
último se reveló con un regulador de citrato-fosfatos. La reacción fue detenida
32
con una solución de H2SO4, a una concentración de 2.5 M. La placa se leyó en
un lector de ELISA de la marca BIO-RAD, a una longitud de onda de 492 nm.
V. Determinación de población linfoides
Los porcentajes de linfocitos T y B fueron determinados en bazo, placas de
Peyer y lámina propia de los segmentos proximal y distal del intestino delgado,
por citometría de flujo.
Los linfocitos T cooperadores fueron marcados con un anticuerpo (Ac) anti-
CD4/FITC (BD Biobienses), los linfocitos T citotóxicos, con un Ac anti-CD8/PE
(Caltag) y los linfocitos B, con la combinación de los Ac´s anti-CD19/-APC (BD
Biobienses) y anti-B220/PerCP (BD Biobienses). Las células CD19+/B220+
involucran a las células pro B, Pre B, B inmaduras y B naive.
Una vez teñidas las células, fueron fijadas en una solución de para-
formaldehido/PBS al 2% y adquiridas en un citómetro FASC Calibur, Becton
Dickinson, utilizando el software Cell Queso-Pro, versión 4.0. Se adquirieron
10,000 eventos de la región de linfocitos delimitada en el histograma de puntos
de tamaño (FSC) contra granularidad (SSC). Los archivos fueron analizados
utilizando el software Summit V 4.0. Los datos representan el porcentaje de
células positivas tomadas de la región de linfocitos totales.
33
VI. Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete estadístico Sigma-Stat,
versión 11.0
En todos los casos se compararon las medias de los resultados obtenidos entre
el grupo control y el grupo de estrés (t de student). También se compararon las
medias de los resultados obtenidos de los porcentajes de cada población
linfoide y los niveles de IgA en lavados intestinales entre el segmento proximal
y el segmento distal de cada grupo (andova). La significancia estadística se
consideró cuando el valor de p fue ≤ 0.05.
Para la tinción fenotípica, se hizo un concentrado de los órganos de estudio de
los 5 ratones que conformaban cada grupo y se realizaron tres experimentos
independientes entre sí.
34
VII. Resultados
VIII. Niveles de corticosterona en suero
Los niveles de corticosterona sérica fueron determinados tanto en el grupo
control con el grupo de estrés, por la técnica de EIA, con la finalidad de
corroborar que el tipo de estrés al cual fueron sometidos los animales, es capaz
de estimular el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA).
En la Figura 6 muestra la media ± D.S. de las concentraciones de
corticosterona en suero de ambos grupos de ratones. En esta figura se pueda
observar un aumento significativo (p<0.001) en la concentración de
corticosterona en el grupo de estrés (179±2.0 ng/ml), en comparación con el
grupo control (18.58±1.01. ng/ml).
Figura 6. Concentración sérica de corticosterona en respuesta al estrés agudo
inducido por inmovilización. *p<0.0001
Dens
idad
Opt
ica (n
g/m
l)
0
50
100
150
200
250
Control Inmovilización
*
35
IX. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en suero
Los niveles de IgA fueron determinados en suero por la técnica de ELISA, con
la finalidad de observar si el estrés agudo inducido por inmovilización, tiene
algún efecto sobre los niveles de IgA a nivel sistémico (sangre).
En la Figura 7 se puede observar que este tipo de estrés aumentó los niveles
de IgA en suero en comparación con el grupo control (*p=0.001).
Suero
Den
sida
d O
ptic
a (4
92nm
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Figura 7. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA suero. En esta figura
se muestra la media ± D.S. de la densidad óptica del triplicado de tres
experimentos independientes entre sí. *p=0.001; t de student.
* *
36
X. Efecto del estrés agudo inducido por inmovilización sobre los
niveles de de IgA en lavados intestinales
Los niveles de IgA en lavados intestinales del segmento proximal y distal de
cada grupo de ratones (estrés y control), fueron determinados por la técnica de
ELISA.
En ambos segmentos intestinales se observó un incremento significativo en los
niveles de IgA en comparación con los ratones del grupo control (p<0,001).
También se observo que los niveles de IgA en el segmento proximal fueron
significativamente mas altos en comparación con el segmento distal tanto en el
grupo control como en los ratones sometidos a estrés (p<0.001) (Figura 8).
37
Proximal
Dens
idad o
ptica
(492
nm)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Distal
Figura 8. Efecto del estrés agudo sobre los niveles de IgA en lavados
intestinales de los segmentos proximal y distal, del intestino delgado. En esta
figura se muestra la media ± D.S. de la densidad óptica del triplicado de tres
experimentos independientes entre sí. *p<0.001; t de student.
XI. Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en
bazo
Los porcentajes de linfocitos T (células CD4+ y CD8+) y linfocitos B (CD19+ y
CD19+/B220+) en bazo, fueron determinados por citometría de flujo.
*
*
*
38
En la Figura 9 se muestran los resultados obtenidos entre el grupo de estrés y
el control, donde se observa que el estrés es capaz de aumentar
significativamente el porcentaje de linfocitos T citotóxicos (CD8+), en este
órgano (p<0.001). Los porcentajes de linfocitos T cooperadores (CD4+) y
linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), no se vieron modificadas por el estrés en
este modelo
. CD4
Cél
ulas
Pos
itiva
s (%
)
0
10
20
30
40
50
CD8 CD19 CD19/B220
Figura 9. Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en
bazo. Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotóxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+). *p<0.001; t de
student.
* *
39
XII. Efecto de estrés sobre el porcentaje de linfocitos T y B en placas
de Peyer del segmento proximal del intestino delgado
El efecto del estrés sobre las poblaciones de linfocitos T y B en las placas de
Peyer del segmento proximal del intestino delgado (Figura 10), solo modificó, al
igual que en bazo, el porcentaje de linfocitos T citotóxicos, observándose un
aumento significativo de esta población (4.59±1.36% de células T CD8+) en
comparación con el grupo control (3.37±0.36 % de células T CD8+; p<0.001).
El resto de las poblaciones no se vieron modificadas.
XIII. Efecto del estrés agudo sobre el porcentaje de los linfocitos T y B en
placas de Peyer del segmento distal del intestino delgado
Al evaluar por citometría de flujo, el efecto del estrés agudo sobre las
poblaciones linfoides en las placas de Peyer, del segmento distal del intestino
delgado, los porcentajes de linfocitos T cooperadores, T citotóxicos y células B,
no se vieron modificadas por el estrés (Figura 11).
40
CD4
Cél
ulas
Pos
itiva
s(%
)
0
20
40
60
80
CD8 CD19 CD19/B220
Figura 10. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento proximal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotóxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de
flujo. *p<0.001; t de student.
*
*
41
CD4
Cél
ulas
Pos
itiva
s (%
)
0
20
40
60
80
CD8 CD19 CD19/B220
Figura 11. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en placas de Peyer del segmento distal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotóxicos (CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de
flujo.
XIV. Efecto de estrés agudo sobre el porcentaje de linfocitos T y B en
lámina propia del segmento proximal del intestino delgado
El estrés agudo inducido por inmovilización no modificó los porcentajes de
linfocitos T cooperadores ni citotóxicos pero aumentó significativamente los
porcentajes de linfocitos B (64.71±8.34% de células CD19+/B220+) en
42
comparación con el grupo control (24.35±1.33%), en la lámina propia del
segmento proximal del intestino delgado (Figura 12).
CD4
Cél
ulas
Pos
itiva
s(%
)
0
20
40
60
80
CD8 CD19 CD19/B220
Figura 12. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en la lámina propia del segmento proximal del intestino delgado.
Se determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T
citotóxicos (CD8+), los linfocitos B totales (CD19+ y CD19+/B220+), por
citometría de flujo. *p<0.001; t de student.
*
43
XV. Efectos de estrés sobre el porcentaje de linfocitos T y B en
lámina propia del segmento distal intestino delgado
El estrés agudo inducido por inmovilización, modificó los porcentajes de
linfocitos T y B, en la lámina propia del segmento distal del intestino delgado
(Figura 13). Las poblaciones que se vieron modificadas fueron los linfocitos T
cooperadores (células CD4+) los cuales disminuyeron del 43.36±2.81% en el
grupo control a 33.72±1.97% en el grupo de estrés. Las células B por el
contrario aumentaron significativamente en el grupo de estrés (52.17±3.71% de
células CD19+ versus 40.07±3.21% en el grupo control; y 49.96±2.0% de
células CD19+/B220+ versus 12.55±10.7% en el grupo control). Los
porcentajes de linfocitos T citotóxicos (CD8+), no se vieron modificados por el
estrés en este sitio.
XVI. Comparación de las poblaciones linfoides de las placas de
Peyer entre el segmento proximal y distal del intestino delgado
Al comparar los porcentajes de linfocitos T y B, entre las placas de Peyer del
segmento proximal y distal (anova de dos-vías), los linfocitos T cooperadores
(CD4+) se encuentran estadísticamente más altos en el segmento proximal
(*p=0.025). Con respecto a la población de linfocitos T citotóxicos (p=0.771) y
linfocitos B (p=0.237), no se observó ninguna diferencia estadística, entre
ambos grupos (control y estrés).
44
CD4
Cél
ulas
Pos
itiva
s(%
)
0
20
40
60
80
CD8 CD19 CD19/B220
Figura 13. Efecto del estrés agudo por inmovilización sobre el porcentaje de
linfocitos T y B en la lámina propia del segmento distal del intestino delgado. Se
determinaron los linfocitos T cooperadores (CD4+), los linfocitos T citotóxicos
(CD8+), los linfocitos B (CD19+ y CD19+/B220+), por citometría de flujo.
*p<0.001; t de student.
XVII. Comparación de las poblaciones linfoides en lámina propia
entre el segmento proximal y distal del intestino delgado.
A nivel de lámina propia en el análisis de anova de dos-vías, no se observó
diferencia estadística entre ambos segmentos (proximal y distal) ni entre
*
*
*
45
grupos (control y estrés). Sin embrago, al hacer una comparación entre
segmentos por grupo (anova de una-vía), se observó que el porcentaje de
linfocitos T CD8+ fue estadísticamente mayor (*p=0.0101) en el segmento
distal del grupo control. Sin embargo esta diferencia se pierde cuando los
ratones son sometidos a un periodo de estrés agudo (p=0.9595). Además en
este último grupo se observa una diferencia estadística entre los porcentajes de
linfocitos B (CD19+/B220+) entre el segmento proximal y distal (p=0.0138*),
siendo más alto el porcentaje en el último segmento.
46
Discusión
Las respuestas fisiológicas inducidas por el estrés involucran al eje hipotálamo-
hipófisis-adrenal y el sistema nervioso autónomo y son mediadas, en parte, por
la liberación de glucocorticoides y catecolaminas, respectivamente24,25. Otras
interacciones involucran el contacto directo de terminaciones nerviosas con
linfocitos en órganos linfoides26
El sistema neuroendrocrino influye en las respuestas inmunitarias, sobre todo
en el sistema inmunitario de las mucosas27,28,en particular el sistema
inmunitario del intestino. El aparato digestivo está controlado por un sistema
nervioso integrador e independiente con una cantidad de neuronas semejante a
de la medula espinal. Este sistema se considera como una tercera división del
sistema nervioso autónomo y se denomina sistema nervioso entérico. Los
nervios extrínsecos conectan al sistema nervioso entérico (ENS) con el SNC al
través de las vías simpática y parasimpática. Por otro lado, el aparato digestivo
contiene un sistema inmunitario formado por un número igual de células a las
existentes en el resto del cuerpo 32,29,30. La comunicación directa bidireccional
entre el sistema inmunitario y sistema neuroendocrino dentro del intestino esta
mediada en gran parte, por neurotransmisores (noradrenalina, acetilcolina),
neuropéptidos (sustancia P, somatostatina, VIP, etc.) y receptores que son
comunes en ambos sistemas 31,32,33
47
El estudio de la regulación neuroendocrina de la inmunidad de mucosas se ha
basado principalmente en la determinación de la secreción de IgA en
saliva34,35, en la síntesis y secreción del componente secretor de las glándulas
lagrimales 36,37 y en la regulación de la síntesis del componente secretor en el
aparato reproductor femenino38,39. Otros hallazgos importantes son el
incremento en la secreción de S-IgA después de la administración de
colecistocinina y pilocarpina40,41; el incremento en la secreción de varios
neuropéptidos, como son sustancia P, neurocinina A y péptido vasoactivo
intestinal después de la estimulación eléctrica de nervios extrínsecos del
intestino42,43; y el incremento en la secreción de IgA en ileon después de la
administración de somatostatina y su inhibición con la noradrenalina44
Los efectos del estrés sobre las respuestas inmunitarias en mucosas se han
estudiado casi exclusivamente sobre las enfermedades inflamatorias del
intestino, y en la secreción de la IgA en saliva. La abundante información
existente confirma que el estrés psicológico desempeña un papel fundamental
en la fisiopatología y presentación clínica de la enfermedad inflamatoria del
intestino45,46. Además, estudios en animales, confirman que el estrés
contribuye a la patogénesis de esa enfermedad51. Por otro lado, diversos
estudios han analizado la relación entre los niveles de IgA secretoria (S-IgA) en
saliva y diferentes circunstancias de estrés, tales como ejercicio, estados de
humor, y exámenes académicos; sin embargo, los resultados han sido
contradictorios. En unos se encuentra que el estrés psicológico y físico reduce
los niveles de IgA presente en la saliva de individuos humanos, por el contrario,
en otros se encontró que los niveles de IgA aumenta como consecuencia del
48
estrés47,48,49,50. En corredores de maratón51 no hay reducción en el número de
células plasmáticas productoras de IgA o IgM en la mucosa duodenal. Lo
anterior impide realizar una conclusión acerca del efecto del estrés sobre la
respuesta inmune humoral de las mucosas, representada por la S-IgA.
Recientemente, hemos reportado que el estrés por inmovilización afecta los
niveles intestinales de IgA, así como de la población de linfocitos intraepiteliales
de la mucosa duodenal de los ratones52,53
.
Los objetivos del presente trabajo fueron determinar si es estrés agudo
inducido por inmovilización modifica los niveles de IgA en suero y en el líquido
intestinal del intestino delgado, determinar si hay alguna modificación en el
porcentaje de linfocitos T y B tanto en las placas de peyer como en la lámina
propia del intestino y evaluar si existe alguna diferencia en los niveles de IgA y
en los porcentajes de las poblaciones linfoides entre el segmento proximal y
distal del intestino delgado.
Uno de los efectos del estrés agudo o crónico sobre el sistema endocrino es el
aumento en las concentraciones séricas de corticosterona (Miroslav Adzic y
cols, 2009, Gomez González, 2006). En este estudio observamos, que los
ratones someidos a estrés aumentaron las concentraciones de corticosterona
hasta un 200% en comparación con el grupo control lo que valida el modelo de
estrés empleado en este protocolo (Figura 6).
49
Otro de los efectos del estrés agudo observado por Ramal et al, ha sido una
disminución en los niveles de IgA en suero inducido por un periodo excesivo de
ansiedad54; Laidlaw et al, no observó cambios en el mismo tipo de estrés55. Sin
embargo Rehenbinder et al, demostraron que los niveles disminuyen en sangre
y aumentan en heces fecales56. En otro modelo también se ha demostrado que
el estrés agudo produce un incremento en las concentraciones de IgA en
saliva57. Por otra parte, Jarillo et al, demostraron que el estrés crónico redujo la
concentración de IgA en líquido intestinal. Estas observaciones nos permiten
confirmar que la respuesta a nivel inmunológico depende tanto del tipo de
estrés como de la duración del mismo (agudo y crónico). En este modelo de
estrés agudo inducido por inmovilización observamos que los niveles de IgA
aumentaron tanto en suero como en líquido intestinal de ambos segmentos y
que la respuesta al estrés en el segmento proximal fue significativamente
mayor en comparación con el segmento distal del intestino tanto en el grupo
control como en el de estrés (Figura 8). El aumento en las concentraciones en
suero correlacionan con lo observado por Karacabey et al, en mujeres
sometidas a un periodo de estrés inducido por ejercicio58
.
Con respecto a las poblaciones de linfocitos T (CD4+ y CD8+) y linfocitos B
(CD19, CD19+/B220+), en un modelo de estrés inducido por inmovilización, no
se observaron modificaciones en bazo ni timo. Sin embargo, el estrés
disminuyó el porcentaje total de linfocitos, en hígado59. Rammal H, observó que
hubo una disminución en el porcentaje de estas poblaciones en sangre, tras un
periodo de ansiedad excesivo auque en otros estudios se ha demostrado que
durante el estrés agudo existe una movilización de linfocitos a la circulación
50
como un mecanismo de defensa del organismo ante esta situación, siendo los
linfocitos T CD8+, Tγδ, y células NK, las más afectadas60. Otra hipótesis sobre
la modificación de los porcentajes de linfocitos en la circulación y en otros
órganos, ha sido la inducción de apoptosis en estas células debido al aumento
en las concentraciones de corticosterona61
. Sin embargo la redistribución de
los linfocitos o la muerte de estos no han sido totalmente demostradas. A nivel
de GALT solo se encuentra el trabajo de Jarillo et al, donde observaron una
disminución en el porcentaje de linfocitos intraepiteliales en intestino delgado,
en ratones sometidos a estrés crónico. En el presente trabajo se realizo un
análisis del porcentaje de linfocitos T y B en diferentes regiones del GALT y
bazo. Los resultados mostraron que a nivel de sitios efectores como la lámina
propia, hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos B. Este incremento
pudiera deberse a una activación policlonal o a una redistribución de las
células, sin embargo nuestros estudios no nos permiten dar una explicación a
este fenómeno.
A nivel de sitios inductores se pudo observar un aumento en el porcentaje de
linfocitos T citotóxicos (placas de peyer del segmento proximal y bazo). Los
linfocitos T cooperadores solo se vieron modificados en las placas de peyer del
segmento distal del intestino delgado.
Una situación sobresaliente sobre la distribución y la respuesta ante el estrés
entre los segmentos intestinales es el hecho de que en las placas de Peyer del
segmento proximal aumentan los linfocitos T CD8+ y que en el segmento distal
51
disminuyen y aumentan los linfocitos T CD4+. Las diferencias sobre el
porcentaje de linfocitos T y B entre los segmentos proximal y distal del intestino
delgado se deben probablemente a que en el segmento distal, la flora intestinal
es más abundante. Esto demanda a que haya una mejor regulación y
tolerancia del sistema inmunológico.
52
Conclusiones
El periodo de estrés inducido por inmovilización, durante cuatro horas, es
capaz de aumentar las concentraciones séricas de corticosterona en ratones
Balb/c. Este tipo de estrés presentó un efecto inmunoestimulador a nivel
humoral demostrado por el aumento en los niveles de IgA en suero y en líquido
intestinal y a nivel celular, demostrado por el aumento en el porcentaje de
linfocitos T y B en bazo y GALT. La respuesta humoral (IgA) y celular (linfocitos
T y B) de las placas de Peyer y la lámina propia del segmento proximal fue
estadísticamente diferente con respecto al segmento distal.
53
Perspectivas
1. Correlacionar los niveles de IgA en líquidos intestinales con el porcentaje
de linfocitos B y células productoras de anticuerpos localizadas en tanto
en los sitios inductores (placas de Peyer) y sitos efectores (lámina
propia) de los segmentos proximal y distal del intestino delgado de
ratones control y estresados.
2. Conocer si el estrés agudo modifica la expresión de citocinas (TGF-β,
IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6) involucradas en el cambio de isotipo para IgA en
células productoras de anticuerpos (lgA+)en el segmento proximal y
distal de intestino delgado en sus sitios inductores (placas de Peyer) y
sitios efectores (lamina propia).
3. Medir el componente secretor del segmento proximal y distal del
intestino delgado para relacionarlo con los niveles de IgA así como de la
cuantificación de IL.
54
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