“TRABAJO DE TITULACIÓN EXAMEN...
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I FACULTAD DE CIENCIAS MÈDICAS ESCUELA DE GRADUADOS “TRABAJO DE TITULACIÓN EXAMEN COMPLEXIVO” PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO DE MAGISTER EN MICROBIOLOGÍA MENCIÓN BIOMÉDICA TEMA DE ESTUDIO DE CASO “PRODUCCIÓN DE LA VACUNA PERTUSSIS. PROPUESTA DE IMPLEMENTACIÓN DE UNA NUEVA TECNOLOGÍA” AUTOR: Q.F. GLADYS MARÍA ÁLVAREZ SALAZAR TUTOR: Dr. DANILO ESPINOSA CUCALÓN AÑO 2016 GUAYAQUIL – ECUADOR
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I
FACULTAD DE CIENCIAS MÈDICAS
ESCUELA DE GRADUADOS
“TRABAJO DE TITULACIÓN EXAMEN COMPLEXIVO”
PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO DE MAGISTER EN
MICROBIOLOGÍA MENCIÓN BIOMÉDICA
TEMA DE ESTUDIO DE CASO
“PRODUCCIÓN DE LA VACUNA PERTUSSIS. PROPUESTA DE
IMPLEMENTACIÓN DE UNA NUEVA TECNOLOGÍA”
AUTOR:
Q.F. GLADYS MARÍA ÁLVAREZ SALAZAR
TUTOR:
Dr. DANILO ESPINOSA CUCALÓN
AÑO 2016
GUAYAQUIL – ECUADOR
II
R E P O S I T O R I O N A C I O N A L E N C I E N C I A Y T E C N O L O G I A
FICHA DE REGISTRO DE TESIS
TÍTULO Y SUBTÍTULO: PRODUCCIÓN DE VACUNA PERTUSSIS. PROPUESTA DE IMPLEMENTACIÓN DE UNA NUEVA TECNOLOGÍA
AUTOR: Q.F. GLADYS MARÍA ÁLVAREZ SALAZAR TUTOR: DR. DANILO ESPINOSA CUCALÓN
REVISOR: DR. RICARDO CAÑIZARES FUENTES
INSTITUCIÓN: ESCUELA DE GRADUADOS FACULTAD: CIENCIAS MÈDICAS
CARRERA: QUÍMICA Y FARMACIA
FECHA DE PUBLICACIÓN: 2016 No. DE PÁGS: 78
ÁREAS TEMÁTICAS: SALUD PÚBLICA. VACUNACIÓN
PALABRAS CLAVE: Suspensión pertussis de células inactivadas- tecnología de fermentación- puntos críticos de control- atributos
críticos de calidad- áreas productivas.
RESUMEN: La producción nacional de vacunas Triple DPT y pentavalente no cubre el requerimiento del país por la baja productividad del componente Pertussis. El objetivo general del presente caso estudio es determinar una nueva tecnología de mayor rendimiento del antígeno para implementarla en el INSPI con apego a las normas BPM, ICH. La metodología utilizada es de tipo analítico, descriptivo y de opinión de autoridades y funcionarios institucionales relacionados con el desarrollo y la producción de biológicos. De los resultados se desprende que, la suspensión Pertussis de células enteras inactivadas es un componente de las vacunas combinadas Triple DPT y Pentavalente (DPT+HB+Hib), administradas en la vacunación primaria y refuerzo de los menores de 24 meses. Las fimbrias 2 y 3 y la TP inactivada tienen un rol importante en la inmunidad por tanto deben estar presentes en la suspensión pertussis . El medio Stainer&Scholte enriquecido con aminoácidos es el más adecuado para el cultivo por fermentación, contiene agentes moduladores que inactivan el efecto no deseado de la AC. La microfiltración tangencial es el método más utilizado para la purificación y separación de la masa celular inactivada por su simplicidad y bajo costo. El diseño funcional de las instalaciones, clasificación de áreas productivas, características de los equipos y sistemas críticos son importantes para la consistencia y robustez de la producción que debe cumplir los requisitos de calidad establecidos por la OMS. Las conclusiones se refieren a que la tosferina está resurgiendo en el mundo y continúa siendo de interés en salud pública y que la tecnología propuesta está enfocada al desarrollo con calidad, viable para implementarla en el INSPI “LIP”. No. DE REGISTRO (en base de datos): No. DE CLASIFICACIÓN:
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ADJUNTO PDF: X SI NO
CONTACTO CON AUTOR/ES: Teléfono: 0999860850 celular E-mail:[email protected]
CONTACTO EN LA
INSTITUCIÓN:
Nombre: SECRETARIA DE LA ESCUELA DE GRADUADOS
Teléfono: 2288086
E-mail: [email protected]
: Av. Whymper E7-37 y Alpallana, edificio Delfos, teléfonos (593-2) 2505660/1; y en la Av. 9 de octubre 624 y Carrión,
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IV
AGRADECIMIENTO
Al Dr. Danilo Espinosa Cucalón, por con haberme guiado
en la consecución de la tesis con paciencia y sabiduría.
A las autoridades y personal administrativo de la
Escuela de Postgrado de la Facultad de Medicina por
la oportunidad brindada para culminar la maestría.
Al extinguido Instituto Nacional de Higiene por haberme
permitido desarrollar mi vida profesional en el servicio a la
comunidad a través de la producción nacional de biológicos
V
DEDICATORIA
A mis padres, esposo, hijos e hija por haber sido
partícipes de mi formación académica a través
de su comprensión y apoyo desinteresado.
Al Padre Dios por haberme dotado de inteligencia y
Sabiduría para lograr la misión de mi vida.
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VII
ABREVIATURAS
BPMFv: Buenas Prácticas de Manufactura Farmacéuticas vigentes
HACCP: Análisis de Peligros y Control de Puntos Críticos
CQAs: Atributos de Calidad
CPPs: Puntos críticos de control
ICH Q8: Comité Internacional de Armonización en Calidad. Sección 8
ISO: Organización Internacional de Estandarización
pH: Potencial de hidrógeno
DO2: Densidad de oxígeno disuelto
ENFARMA: Empresa Nacional de Fármacos
INSPI: Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública
INHMT”LIP”: Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta
Pérez”
OMS: Organización Mundial de la Salud
DPT: Difteria, Pertussis, Tétano
DPT+HB+Hib: Difteria, Pertussis, Tétano, antigen superficial del virus de la hepatitis B,
poliribosil-ribitol fosfato conjugado de Haemophilusinfluenzae.
PT: Toxina Pertussis
FHA: Hemaglutinina filamentosa
TCT: citotoxina traqueal
DNT: toxina dermonecrótica
LPS: lipopolisacáridos
Fim2: Fimbria2
Fim3: Fimbria 3
VIII
FFT: Flujo de filtración tangencial
MF: Microfiltración
U.O.: Unidades de opacidad
UI: Unidades internacionales
HVAC: Calor, ventilación y aire acondicionado
HEPA: Filtros de aire de alta eficiencia
WFI: agua para inyectable
PW: agua purificada
UFC: Unidades formadoras de colonias
TOC: Carbón orgánico total
ppb: partes por billón
OR: Osmosis inversa
CIP: limpieza in situ
NIOSH: Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional
CFU: Unidades formadoras de colonias
IX
CONTENIDO
CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN
1.1. Delimitación del Problema…………………………….. pág. 1
1.2. Pregunta de la investigación…………………………… pág. 1
1.3. Justificación……………………………………………. pág. 1
1.4. Objeto del estudio……………………………………… pág. 1
1.5. Campo de aplicación…………………………………… pág. 2
1.6. Objetivo general………………………………………... pág. 2
1.7. Objetivos específicos…………………………………… pág. 2
CAPÍTULO 2. DESARROLLO
2.1. Marco Teórico
2.1.1. Teorías generales……………………………………. pág. 3
2.1.2. Teorías sustantivas……………………………………pág. 8
2.1.3. Referentes empíricos………………………………… pág. 11
2.2. Marco Metodológico
2.2.1. Categorías……………………………………………... pág. 14
2.2.2. Dimensiones………………………………………….. pág. 15
2.2.3. Instrumentos………………………………………….. pág. 15
2.2.4. Unidad de Análisis…………………………………… pág. 15
2.2.5. Resultados…………………………………………… pág. 17
2.2.6. Discusión…………………………………………….. pág. 29
CAPÍTULO 3 PROPUESTA, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
3.1. Propuesta…………………………………………………. pág. 32
3.2. Conclusiones……………………………………………. pág. 38
X
3.3. Recomendaciones………………………………………. Pág. 40
RESUMEN
La producción nacional de vacunas Triple DPT y pentavalente no cubre el
requerimiento del país por la baja productividad del componente Pertussis. El objetivo
general del presente caso estudio es determinar una nueva tecnología de mayor rendimiento
del antígeno para implementarla en el INSPI con apego a las normas BPM, ICH. La
metodología utilizada es de tipo analítico, descriptivo y de opinión de autoridades y
funcionarios institucionales relacionados con el desarrollo y la producción de biológicos.
De los resultados se desprende que, la suspensión Pertussis de células enteras inactivadas
es un componente de las vacunas combinadas Triple DPT y Pentavalente (DPT+HB+Hib),
administradas en la vacunación primaria y refuerzo de los menores de 24 meses. Las
fimbrias 2 y 3 y la TP inactivada tienen un rol importante en la inmunidad por tanto deben
estar presentes en la suspensión pertussis . El medio Stainer&Scholte enriquecido con
aminoácidos es el más adecuado para el cultivo por fermentación, contiene agentes
moduladores que inactivan el efecto no deseado de la AC. La microfiltración tangencial es
el método más utilizado para la purificación y separación de la masa celular inactivada por
su simplicidad y bajo costo. El diseño funcional de las instalaciones, clasificación de áreas
productivas, características de los equipos y sistemas críticos son importantes para la
consistencia y robustez de la producción que debe cumplir los requisitos de calidad
establecidos por la OMS. Las conclusiones se refieren a que la tosferina está resurgiendo
en el mundo y continúa siendo de interés en salud pública y que la tecnología propuesta
está enfocada al desarrollo con calidad, viable para implementarla en el INSPI “LIP”.
PALABRAS CLAVE: Suspensión Pertussis de células inactivadas - tecnología de
fermentación - puntos críticos de control - atributos críticos de calidad - áreas productivas.
XI
ABSTRACT
The national production of DPT and pentavalent (DPT+HB+Hib) vaccines doesn’t
supply our country demand because Pertussis component is insuficient. The general
objective of this study is to determinate a new technology more productive for implement
on the National Investigation and Public Health Institute (INSPI) according international
normative GMPc and ICH. Analytical, descriptive and official criterion methodology was
used. Whole cell inactivated Pertussis is using now as component of polyvalent antigens
bacterial vaccines, used for basic administration and booster in infants minor to 24 months.
Fimbriaes 2 and 3 andpertussis toxin are important elements for efficacy of vaccines for
this, must be present in pertussis suspension. Stainer&Scholte medium with aminoacids is
prefer for to fermentation B. pertussis culture, it contains modulators agents for to
inactivated adenynateciclase component and its effect undesired. Tangential microfiltration
method is the most uses for purification and cellular mass separation because is the most
simplest and cheap. Facilitydesign, environment specifications, equipment specifications,
operative critical systems and support areas, are important for consistent and robust
production according with OMS quality requirements. Pertussis is a disease of public
health interesting yet and is resurfacing in the world; the technology proposedin this study
is focused to design by quality for to implement on INSPI.
Key words: Whole cells pertussis inactivated suspension - fermentation technology -
critical process parameters - critical quality attributes - manufacturing facility.
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1. INTRODUCCIÓN
La vacuna pertussis es una suspensión salina de células enteras muertas y
destoxificadas de Bordetella Pertussis que cumple todos los requerimientos de calidad
formulados por la Organización Mundial de la Salud; tiene actividad antigénica contra la
tosferina, enfermedad también denominada coqueluche.
La delimitación del problema está basada en la baja productividad del método de
producción actual. Sus causas están relacionadas con factores: educativos ,
económicos y organizacionales que dan como consecuencia las causas siguientes: falta de
capacitación específica, falta de recursos económicos, falta de directrices para elaborar
nuevos biológicos.
Los efectos son: desconocimiento de nuevas tecnologías, falta de infraestructura física y
recursos materiales, falta de proyectos de investigación y desarrollo de nuevas vacunas, que
los hemos observado en la Planta de Producción de Biológicos re-insertada en el Instituto
Nacional de Investigación en Salud Pública.
La pregunta que se deriva de la investigación plantea cómo mejorar la producción de
Vacuna Pertussis.
La justificación plantea que el mejoramiento de la producción de vacuna Pertussis va a
ayudar a reducir el tiempo, incrementar el rendimiento y abaratar el costo de producción
de este principio activo biológico componente de las vacunas bacterianas combinadas
Triple DPT y Pentavalente DPT + HB + Hib; de esta manera se logrará autosuficiencia
nacional y se ofrecerán vacunas bacterianas combinadas que conllevan múltiples ventajas
conforme a la propuesta de la Organización Mundial de la Salud. Por otro lado, se aplicará
una metodología confiable que dará lugar a cultivos homogéneos y productos consistentes,
es decir, la obtención repetida de una vacuna Pertussis de buena calidad minimizando el
riesgo de obtener lotes inferiores ocasionales.
El objeto de estudio es la Vacuna Pertussis usada en asociación con los toxoides
diftérico y tetánico para conformar la vacuna triple DPT que, cuando se le adiciona el
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antígeno superficial del virus de la Hepatitis B y el antígeno poliribosil ribisol fosfato de la
bacteria Haemophilus influenzae tipo b, se transforma en la vacuna pentavalente; las dos
vacunas mencionadas constan en el calendario nacional de vacunación emitido por el
Ministerio de Salud Pública de Ecuador.
A pesar de los esfuerzos realizados para obtener altas coberturas de vacunación, la
infección por B. Pertussis continúa siendo un problema en salud pública, que ha resurgido
a nivel universal, por lo que se necesita realizar estudios destinados a aportar guías que
ayuden a enfrentar la re-emergencia de la enfermedad.
El campo de aplicación es la producción de vacuna Pertussis utilizando una tecnología
con mayor rendimiento y menor costo, teniendo siempre presente la obtención de un
producto con características de calidad consistentes.
El objetivo general de la presente investigación es determinar la producción de Vacuna
Pertussis en ENFARMA EP en el año 2016.
Los objetivos específicos son: revisar los referentes teóricos generales y sustantivos de
la producción de vacuna Pertussis; analizar la producción de vacuna Pertussis en el INSPI;
diseñar una nueva tecnología de producción de vacuna Pertussis.
La premisa está basada en contribuir a mejorar la producción de vacuna Pertussis
mediante la implementación de una nueva tecnología.
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2. DESARRROLLO
En el marco teórico, argumentaremos lo siguiente: teorías generales, teorías sustantivas
y referentes empíricos.
En las teorías generales podemos citar que la vacuna Pertussis es una suspensión salina
de células enteras de B. Pertussis (wP) inactivadas por métodos físicos o químicos, su
potencia se comprueba en animales de experimentación, específicamente en el ratón. Ha
sido introducida en muchos países a partir del año 1995, como una medida sanitaria para
controlar las epidemias de tosferina, enfermedad altamente contagiosa causada por la
bacteria Bordetella Pertussis y difícil de prevenir mediante el mejoramiento de las
condiciones ambientales. La eficacia de la vacuna wP fue probada en el campo de
investigación del British Medical Research Council (Llop, 2011).
Es difícil controlar la expansión de la tosferina mediante el aislamiento de los pacientes,
debido a que el diagnóstico temprano se dificulta cuando la enfermedad se asemeja a un
resfriado y es muy transmisible. Cuando los síntomas de Pertussis son indiscutibles, los
antibióticos no tienen efecto sobre el curso de la enfermedad; razón por la que, el mejor
método de prevención es el uso de una vacuna efectiva, la evidencia actual indica que esta
enfermedad continúa siendo un problema en salud pública debido a que sigue causando
muertes en lactantes con esquema de vacunación incompleto.
Los niños vacunados con Pertussis celular muestran incrementos de anticuerpos contra
toxina pertussis, hemaglutinina filamentosa, aglutinógenos, polisacáridos y contra las
proteínas de la membrana externa de la bacteria. A pesar de que los anticuerpos
provenientes de madres vacunadas atraviesan la placenta, los niños no están protegidos
contra la enfermedad clínica durante los primeros meses de vida y la susceptibilidad de los
más pequeños a enfermar gravemente está bien documentada.
Por lo citado en párrafo anterior es que la vacunación contra Pertussis se debe iniciar
antes de que ocurra la exposición y a una edad en que el sistema inmunitario del niño sea
capaz de responder ya que es un factor que influye en la respuesta serológica a la
vacunación con Pertussis celular. Los títulos de anticuerpos se incrementan a medida que
se eleva la edad en que ocurre la administración de la vacuna. Aunque los estudios han
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demostrado que elevados títulos de anticuerpos contra los aglutinógenos (fimbrias) y la
Pertactina son suficientes para producir protección contra la tosferina, la correlación de
defensa aún enfrenta problemas (Fernando A. Moraga-Llop, 2011).
Las cepas, códigos 143 y 137, usadas actualmente para la producción de vacuna
Pertussis de células completas contienen todos los factores de virulencia de B. Pertussis,
cuyas actividades son las siguientes:
La toxina Pertussis (PT), también llamada factor promocional de la linfocitosis (LPF) es
el más importante antígeno protector, a la vez que el mayor factor de virulencia que
ocasiona leucocitosis en los organismos infectados o inoculados con B. Pertussis. Es una
proteína tóxica que tiene un peso molecular de 105 696 y al ser secretada del patógeno en el
momento de la multiplicación alcanza el órgano diana y varias células e induce varias
acciones tales como: leucocitosis, hipersensibilidad a la histamina, activación de células de
Langerhans, hipoglicemia y promueve o suprime el sistema inmune por medio de las
células linfoides.
Las cepas que no producen PT no causan tosferina. El anticuerpo puede neutralizar
varias actividades farmacológicas de la toxina Pertussis in-vivo o in-vitro. Cuando a los
ratones se les administra inmunoglobulina anti-PT pueden sobrevivir un desafío por
infección respiratoria con una dosis letal de B. Pertussis sin que adquieran la enfermedad.
Es así que, el antígeno PT en la vacuna tiene el mayor papel protector contra la tosferina
en humanos (Loredo, 2013).
La hemaglutinina filamentosa (FHA), es un filamento proteico con peso molecular de
220 000 secretada sobre la superficie y fuera del cultivo bacteriano, puede ser absorbida por
varias células y aglutinarlas. FHA juega un rol importante en la adhesión del patógeno a las
células epiteliales del tracto respiratorio. La virulencia de las cepas de B. Pertussis que
pierden la producción de FHA, es muy baja. Los ratones inmunizados con
inmunoglobulinas anti-FHA pueden sobrevivir un desafío con organismos virulentos en
forma de aerosol, es por eso que se piensa que el anticuerpo anti-FHA impide la infección
previniendo la unión y adherencia de las bacterias a las células presentadoras del antígeno.
Las fimbrias (aglutinógenos 2 y 3), llamados aglutinógenos termolábiles son antígenos
que están en la superficie de las células existiendo una correlación entre los anticuerpos
aglutinantes antifimbria relacionados al serotipo de la bacteria y la protección contra B.
Pertussis. Aunque las fimbrias purificadas, por sí solas no tienen citotoxicidad o actividad
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aglutinante / adherente a las células, se ve que tienen un rol en la unión de la bacteria a las
células huésped similar al FHA; es evidente que los anticuerpos anti-fimbrias otorgan una
inmunidad pasiva a los ratones contra la infección respiratoria (Proenza, 2010).
Pertactin, es una proteína exterior de la membrana peso molecular 69 K, es también un
antígeno que muestra inmunización activa y pasiva, el anti-pertactin puede aglutinar cepas
virulentas de Pertussis. Además, juega algún rol en la unión de la bacteria similar al FHA y
a las fimbrias 2 y 3. La toxina adenilato-cyclasa (ACT), es una enzima única para el género
Bordetella que en la B. Pertussis es una proteína con peso moléculas de 177 KDa, juega un
rol indirecto en la infección por Pertussis (Serrano-Rivero, 2013).
La cytotoxina traqueal (TCT), es un peptidoglucano de bajo peso molecular (921),
compuesta de alanina, ácido glutámico, ácido diaminopimélico, ácido murámico y
glucosamina, tiene acción sobre las células ciliadas en el epitelio respiratorio. La toxina
dermonecrótica (DNT) es de naturaleza proteica con peso molecular de aproximadamente
150000. Causa necrosis hemorrágica, encogimiento del páncreas y muerte,
respectivamente. No es conocido su rol en la inmunización de Pertussis. Las endotoxinas
(LPS), extraídas de la pared celular de B. Pertussis tienen igual actividad biológica que
otras bacterias gram negativas y casusan fiebre.
De los ocho factores de virulencia de B.pertussis, los antígenos que luego de estudios
extensos fueron reconocidos por su actividad protectora son: PT, FHA, fimbrias y
pertactin; el resto aún falta por investigar.
La preocupación por los posibles efectos adversos asociados a la vacuna celular
completa motivó al desarrollo de una nueva vacuna Pertussis (1981) utilizando solamente
las fracciones identificadas como antigénicas que fueron purificadas, es decir, aquellas que
son capaces de estimular una respuesta inmune específica, este hecho llevó a denominarla
vacuna “acelular” (aP). Existen diferentes formulaciones de la vacuna, de acuerdo a los
países que la producen, por ejemplo, la vacuna japonesa contiene los antígenos PT y FHA;
otras vacunas contienen TP (pertusinógeno), HF (hemaglutinina filamentosa), pertactina
(PRN) y fimbrias. Sin embargo, la vacuna acelular, introducida en programas de
vacunación infantil de algunos países desarrollados, ha tenido diferentes porcentajes de
eficacia, alta como 90% y baja como 30%, lo cual confirma la gran variabilidad del
biológico de acuerdo a la procedencia y formulación del producto.
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En el Ecuador, se ha usado la suspensión Pertussis de células enteras, como
componente activo de la vacuna triple DPT que es administrada como refuerzo a los 18
meses de edad. La vacuna Pentavalente, también tiene como ingrediente la vacuna
Pertussis de células completas y es administrada a los 2, 4 y 6 meses de edad. El
desarrollo de la vacuna Pentavalente (DPT+HB+Hib) ecuatoriana, iniciado en el ex
Instituto Nacional de Higiene y contiene Pertussis de células enteras muertas y
detoxificadas por un medio químico, ha culminado exitosamente algunas etapas: de
preformulación, estabilidad en tiempo real y estudios preclínicos, realizadas en conjunto
con el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Cuba. Hemos demostrado que es
una vacuna segura y eficaz que da aval para la ejecución de la última etapa del desarrollo
que es el estudio clínico, aún faltante, con el fin de obtener el Registro Sanitario y estar en
capacidad de producirla en reemplazo de la vacuna pentavalente, actualmente importada.
La manera cómo protege la vacuna en una enfermedad que se produce en la mucosa
respiratoria genera interrogantes, pero el caso es que ensayando la vacuna celular en
modelos experimentales animal y en iguales condiciones se ha demostrado que las vacunas
celulares inducen una respuesta inmune celular que se asemeja a la respuesta celular
observada cuando se da la infección natural y consecuentemente la enfermedad;
interviniendo las células colaboradoras de tipo Th1 y Th17 que coordinan las respuestas
frente a microorganismos, lo que contribuye a una mayor celeridad y eficacia para anular
la colonización del epitelio respiratorio por B. Pertussis, comparando con las vacunas
acelulares que inducen principalmente una respuesta inmunitaria en que intervienen el
subgrupo de células colaboradoras Th2 (helmintos), confiriéndole una menor eficacia en
eliminar la colonización del epitelio respiratorio. Además, estudios de cohortes han
comprobado que la protección conferida por un esquema de vacunación acelular es menor y
que se pierde de forma precoz al llegar el infante a los cuatro años después de la
vacunación primaria (Cofré, 2015).
Las vacunas celulares no se recomienda usarlas en niños sobre los 7 años de edad,
debido a posibles efectos secundarios, la protección conferida se estima entre 6 y 10 años;
las vacunas acelulares protegen por un período menor de 2 a 4 años, según se desprende de
estudios observacionales realizados. Además, la diferente estimulación de la respuesta
inmune celular en comparación con la enfermedad natural y la vacunación celular, tiene
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como efecto una menor capacidad de eliminar B. Pertussis del tracto respiratorio
(tosferina, 2011).
La posición de la Organización Mundial de la Salud con respecto al uso de las vacunas
es que la protección contra la tosferina grave en la lactancia y en la primera infancia se
puede obtener mediante una serie primaria de una vacuna de células enteras o acelular,
ambos tipos tienen un excelente historial de inocuidad con respecto a los eventos adversos
graves; las vacunas acelulares son mucho más caras y para muchos países el beneficio
marginal es insuficiente para considerar el cambio de vacunas de células enteras a vacunas
acelulares (Salud, 2010). Con proyección futura se ve surgir una nueva vacuna con B.
Pertussis viva y atenuada en su virulencia para administración por vía inhalatoria que es la
misma de la infección natural.
La fracción Pertussis es el ingrediente activo contra la tosferina presente en las vacunas
combinadas DPT y Pentavalente y contiene los componentes antigénicos de la bacteria
Bordetella pertussis muertas y detoxificadas pero que son capaces de dar lugar a la
formación de anticuerpos y desencadenar una respuesta inmune en el organismo receptor
para proteger contra la enfermedad producida por este agente patógeno Gram negativo que
se transmite por vía respiratoria a través de aerosoles producidos al toser por el individuo
enfermo al sano.
El desarrollo de la vacuna Pertussis se inició en el laboratorio con el cultivo exitoso de
la bacteria de células completas en fase 1 de B. pertussis inactivadas por agentes físicos o
químicos; inicialmente fue una vacuna monovalente, posteriormente, por el año 1947 se
diseñó la vacuna triple combinándola con las anatoxinas diftérica y tetánica que se aplicó
exitosamente para prevención en la población infantil, a partir de los 2 meses de edad con
intervalos de 2 meses hasta completar 3 dosis como inmunización primaria, la dosis de
refuerzo fue a los 12 meses de la última dosis recibida. En el año 1968, en el Instituto
Nacional de Higiene se elaboró el primer lote de vacuna DPT en Ecuador y con el
esquema indicado se ha logrado controlar la enfermedad.
A partir del año 2002 se introdujo en el calendario nacional de inmunizaciones, la
vacuna Pentavalente que reemplazó a la vacuna triple en la inmunización primaria, sin
embargo, la DPT ha continuado usándose en los refuerzos. En el ex Instituto Nacional de
Higiene y Medicina Tropical “Leopoldo Izquieta Pérez”, se inició el desarrollo de la vacuna
pentavalente ecuatoriana (DPT+HB+Hib) con los antígenos que incluye las anatoxinas
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diftérica y tetánica y la suspensión de células enteras inactivadas de Bordetella Pertussis,
producidas por en Ecuador; el antígeno de superficie del virus de hepatitis B recombinante
y el polisacárido sintético polirribosil ribitol fosfato de Haemophilus influenzae conjugado
a la anatoxina tetánica (PTP-T) producidos por el Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología de Cuba.
La estabilidad en tiempo real de la referida vacuna fue estudiada en cinco lotes
consecutivos de vacuna final almacenada entre 2 – 8 °C, los cuales fueron evaluados a los
0, 6, 12, 18, 24, 30 y 36 meses, para evaluar el pH, toxicología, esterilidad, identidad y
potencia inmunizante. Los resultados obtenidos permitieron asignarle el tiempo de vida útil
de 30 meses, primando los valores de potencia e Inmunogenicidad de los 5 ingredientes
activos biológicos y la inocuidad de la vacuna final; todos cumplieron las especificaciones
establecidas por la OMS para los parámetros de control realizados en este tipo de biológico.
Con este resultado se asegura el uso de los lotes a elaborar para finalizar las etapas
regulatorias del estudio, esto es valorar la seguridad y eficacia en seres humanos.
Las teorías sustantivas, están relacionadas con el campo de la investigación que es la
producción de la vacuna Pertussis. Existen dos métodos de producción: el estático en
medio sólido y el agitado en fermentador.
En la planta de producción de biológicos del INSPI (ex – INH), tradicionalmente se ha
utilizado la tecnología de cultivo estático, mediante el cultivo y multilicación de la
Bordetella Pertussis sobre la superficie de un medio sólido a base de carbón, denominado
de Cohen y Wheeler’s, que luego son muertas y detoxificadas por un agente químico en un
espacio de tiempo determinado. Este método tiene varias desventajas como son: tiempos
de procesos largos, heterogeneidad en la cantidad de recipientes de cultivo empleados y un
control menos estricto de las condiciones en que se multiplica la bacteria.
Se utilizan dos cepas liofilizadas de B. Pertussis 137 y 143, que se reconstituyen con
solución de casaminoácidos estéril, la suspensión es sembrada en cajas de Petri que
contienen Agar Bordet Gengou sangre e incubadas a 35°C durante 72 horas. El
crecimiento es usado para preparar la presemilla en tubos de agar Bordet Gengou sangre,
inclinados, que son incubados 35 °C por 72 horas.
La presemilla sirve para preparar la semilla en botellas de Roux que contienen medio de
Cohen & Wheeler’s sólido e incubadas por 72 horas a 35 °C. El crecimiento es usado
como inóculo para la siembra de producción en el mismo medio contenido en botellas de
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Roux que son incubadas por 72 horas a 35°C. En cada etapa de la multiplicación celular el
cultivo es chequeado para pureza y características morfológicas del cocobacilo que debe
estar en fase 1 de crecimiento. El día de la cosecha, dentro de cada botella de Roux que
demuestre ser pura, se adiciona aproximadamente 50 ml. de solución salina fisiológica, las
botellas son agitadas suavemente por rotación para desprender el crecimiento de toda la
superficie cuidando que no se rompa el medio de cultivo.
La suspensión bacteriana es colectada en botellas graduadas de vidrio borosilicato
usando un sistema de presión negativa en circuito cerrado y filtrada a través de una malla
de seda con poros finos antes de que ingresen a la botella graduada colectora, se toma una
muestra para medir la opacidad (relativo a la cantidad de microorganismos por mililitro) de
la suspensión cosechada. La suspensión Pertussis es inactivada mediante la adición de un
agente químico y almacenada en refrigeración de 2 – 8 grados C. mientras transcurre la
inactivación / detoxificación. La masa bacteriana que nos interesa es separada por
centrifugación, luego suspendida en solución fisiológica y preservada con thimerosal en
concentración 0.01% w/v.
En la metodología de cultivo agitado, el proceso se realiza mediante la aplicación de
técnicas apropiadas utilizando un equipo apropiado denominado fermentador. Este
concepto no solo aplica al recipiente en el cual va a multiplicarse el microorganismo para
obtener el producto deseado, sino también a los instrumentos auxiliares que miden, indican,
registran y controlan las variables físico-químicas del proceso para obtener información
continua de los parámetros que son la base para seleccionar las condiciones óptimas y
lograr que los valores requeridos para el cultivo se repitan en los subsiguientes, lo cual se
traduce en consistencia del producto que es la fabricación repetida de un biológico de
buena calidad sin que existan lotes inferiores ocasionales.
La fermentación es el modo más confiable de cultivar por las razones siguientes:
Indispensabilidad de controlar las variables físico químicas ya que ningún proceso de
cultivo es llevado a cabio sin temperatura, pH y oxígeno disuelto; se asume que existe una
condición óptima de reproducción de cada microorganismo y, desde luego, todos los
miembros deben cumplir esta condición.
Hay que tener en cuenta que las operaciones de fermentación pueden fracasar debido a:
(1) formulación y esterilización del medio de cultivo (2) esterilización del fermentador y
demás equipos relacionados (3) multiplicación del cultivo puro y activo para semilla del
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fermentador (4) cultivo bajo condiciones óptimas para la obtención del producto (5)
descarga del producto desde el fermentador (Mukesh, 2004).
La B. pertussis necesita para desarrollarse: agua, carbón, energía, fuente de nitrógeno,
minerales, vitaminas y factores de crecimiento, lo cual debe proporcionárselo el medio de
cultivo; es así que el medio líquido de Stainer & Scholte modificado ha sido probado en
otros institutos productores de América Latina con excelentes resultados para la producción
de Suspensión Pertussis por fermentación (N., 1998).
(N, Producción de suspensiones de Bordetella pertussis por fermentación, 1998)
Algunos de los puntos a considerar, cuando se corren los procesos de fermentación de
bacterias, incluye lo siguiente: uso de procedimientos de manufactura para procesos en
pequeña escala, uso de materiales liberados de acuerdo a Buenas Prácticas de Manufactura
incluidos los lotes de cepas de trabajo, tiempo de esterilización de los medios de cultivo y
nutrientes (debe realizarse a escala de manufactura), mantenimiento constante de la relación
del inoculo de semilla y fermentación de producción entre las escalas, los parámetros
operacionales (pH, temperatura, presión, oxígeno disuelto, etc.) deben ser iguales a aquellos
especificados en los procesos de manufactura, seleccionar una velocidad de agitación
máxima a pequeña escala que sea estrechamente similar a la prevista a escala mayor; el
orden de adición de todos los elementos de producción al fermentador debe ser igual en
ambas escalas; la cantidad total de antiespumante, en caso de ser necesario debido a la
mayor velocidad superficial del oxígeno, debe aparejarse con la escala de manufactura; las
escalas productivas deben tener las mismas proporciones de nutrientes e intervalos de
tiempo; debe existir una buena calibración de todas las sondas: oxígeno disuelto,
peachímetro, espectrofotómetro, etc., y existir compatibilidad entre las escalas.
Los parámetros claves del desempeño a monitorear en el proceso de fermentación son
los siguientes: Curvas de crecimiento y densidad óptica final, rangos de crecimiento,
Títulos (unidades de opacidad), uso de nutrientes y de sustancias ácido-base, características
de los nutrientes, tiempos (fermentación total de la semilla, fermentación específico de
producción), viabilidad de las células, calidad del producto. Todas estas mediciones son
generales para todo trabajo de escalamiento de procesos biológicos, pero los que se estima
como críticos se lo hace en base a cada caso en particular.
En la tecnología de fermentación, la Toxina Pertussis (PT) y otros componentes
antigénicos de la B. Pertussis son inactivados con formaldehido con calidad
11
biofarmacéutica; siendo necesario establecer un equilibrio para que la modificación
química no sea excesiva ni insuficiente ya que podría traer como consecuencia la perdida
de Inmunogenicidad y la existencia de toxicidad residual o reversión de la misma,
respectivamente.
En los referentes empíricos encontramos el trabajo realizado por Miguel Tregnaghi en
el artículo “Nueva vacuna combinada DTPw-HB / Hib para la vacunación primaria y de
refuerzo de menores de un año en América Latina” y menciono la relevancia que dice: “la
vacuna combinada DTPw-HB - Hib no dio resultados inferiores a los obtenidos con las
vacunas autorizadas en términos de porcentajes de seroprotección, seropositividad y
respuesta frente a todos los componentes antigénicos de la vacuna”.
En el trabajo realizado por Eduardo Suárez, en el artículo “A fully liquid DTPw-HepB-
Hib combination vaccines for booster vaccination of toddlers en El Salvador” menciono
como relevancia lo siguiente: “según las tasas de seroprotección/seroconversión de todos
los antígenos evaluados, la vacuna DTPw-HepB-Hib no fue inferior que las vacunas DTPw
y Hib administradas por separado. La vacuna combinada produjo una fuerte respuesta de
refuerzo, reflejada en el gran aumento de anticuerpos contra todos los antígenos presentes”.
En el trabajo realizado por Celso Pérez-Bolaños, en el artículo “La vacunación contra
pertussis: Estado actual y perspectivas futuras” destaco la relevancia siguiente: “Con
excepción de la vacuna de cinco componentes fabricada en Canadá, las vacunas acelulares
no son tan eficaces como las europeas compuestas de células enteras”.
En el trabajo realizado por Lourdes Proenza, en el artículo “Expresión de las fimbrias
Fim2 y Fim3 desde el plasmidio pMMB67 en cepas de Bordetella Pertussis” destaco lo
siguiente: “Las fimbrias desempeñan un papel imunomodulador y además, existe una
correlación entre la presencia de anticuerpos aglutinantes antifimbrias y la protección
contra B. Pertussis en pacientes humanos, todo esto ha conducido a la inclusión de Fim2 y
Fim3 como antígenos en algunas de las vacunas acelulares anti-pertusicas”.
En el trabajo realizado por Yunier Serrano Rivero, en el artículo “La toxina adenilato
ciclasa-hemolisina de Bordetella Pertussis, destaco que: “La toxina adenilato ciclasa –
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hemolisina de Bordetella Pertussis, constituye uno de sus principales factores de
virulencia. La estructura flexible de la toxina la convierten en una importante herramienta
para la industria biofarmacéutica y la investigación”.
En el trabajo realizado por Yaima Martínez Loredo, en el artículo “Método para la
detección de la actividad dermonecrótica de cepas Bordetella Pertussis en el modelo del
ratón lactante”, se destaca como referente: “…..en el caso de vacunas celulares y acelulares
es mandatorio determinar la toxicidad residual debida a DNT en el ingrediente activo y la
preparación antigénica final”.
En el trabajo realizado por Bogdan. J A, en el artículo “Bordetella Pertussis
autoregulates Pertussis toxin production through the metabolism of cysteine” cito el
referente siguiente: “….We have observed a reduction in the concentration of Ptx per
optical density unit midway in fermentation………A complete flux analysis of the
intermediate metabolim of B. pertussis revealed that the sulfur-containing amino acids
methionine and cysteine and the organic acid pyruvate accumulated in the media…..Under
conditions that limited cysteine, a fivefold increase in Ptx production was observed”.
En el trabajo realizado por José G Santiago D, en el artículo “Dimensionamiento de
microfiltración para la producción de Vacuna Pertussis elaborada en el Instituto Nacional
de Higiene Rafael Rangel”, destaco como referente lo siguiente: “Se evaluó el uso de la
tecnología de Flujo de Filtración Tangencial (FFT), para obtener la Vacuna Pertussis
Celular a partir de cultivos de la bacteria Bordetella Pertussis, usando el proceso de
Microfiltración (MF) a objeto de recuperar el paquete celular”.
En el trabajo realizado por Algecira N., en el artículo “Producción de Suspensiones de
Bordetella Pertussis por fermentación, destaco como referente lo siguiente: “Se probaron
diferentes medios de cultivo para el proceso seleccionando el medio Stainer-Scholte
adicionado con 3g/L de casaminoácidos…… Se compara la tecnología de cultivo
estacionario con el cultivo en fermentador presentándose esta última como la mejor
alternativa de producción”
En el capítulo de fermentación que aparece en el libro “Biotransformations and
Bioprocesses” destaco como referente el diseño del fermentador que dice: “La relación
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entre la altura y el diámetro del fermentador está generalmente en el rango de 1.2 a 3. Si el
número es muy alto, la agitación es inapropiada, permitiendo una baja concentración de
oxígeno en la parte superior del fermentador y también acumulación de dióxido de
carbono” (Doble, 2004). En el mismo libro tomo como referente lo siguiente: “Cuando
una pequeña cantidad de células vivas es adicionada a una solución conteniendo nutrientes
esenciales a las condiciones de operación correcta, las células van a crecer”.
En el capítulo trece del libro “Process Validation in Manufacturing of
Biopharmaceuticals” destaco como referente lo siguiente: “…un proceso específico es
totalmente caracterizado a escala de laboratorio y escala piloto, a través de un
entendimiento detallado de las operaciones unitarias individuales así como las interacciones
entre las operaciones unitarias en su secuencia final”
En el Informe 32 de la OMS, elaborado por el Comité de Expertos en Especificaciones
para las Preparaciones Farmacéuticas, destaco como referencia empírica lo siguiente: “Las
instalaciones deben ser ubicadas, designadas, construidas , adaptadas y mantenidas de tal
forma que sean apropiadas paras las operaciones que se realizarán en ellas. Es necesario
que en su planificación y diseño se trate de reducir al mínimo el riesgo de error y de
permitir una adecuada limpieza y mantenimiento del orden a fin de evitar la contaminación
cruzada, el polvo y la suciedad, y en general toda condición que pueda influir
negativamente en la calidad de los productos”.
En el trabajo de Néstor Expósito “Pre-formulation study of a pentavalent DTP-HB-Hib
vaccine obtained in Ecuador” destaco como referencia lo siguiente: “…..Sin embargo, su
desarrollo es complejo por los retos tecnológicos que implica y que en ocasiones se
evidencia en las interacciones negativas entre los antígenos”.
En el trabajo de Nestor Expósito “Real – time stability of the Ecuadorian pentavalente
DTP-HB-Hib vaccine”, destaco como referente lo siguiente: “Very few companies have
been able to obtain a liquid pentavalent vaccines with its five antigens mixed in a single
formulation. Only one of these vaccines has achieved this status in Latin American, i.e.
Heberpenta®-L, produced by CIGB in Cuba”.
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La tecnología de fermentación perfeccionada y la información analítica de procesos
licenciados, en laboratorios de países como Cuba, Brasil y México, sirven de referencia
para definir las operaciones unitarias comunes y las condiciones operativas de las tres cepas
de B. Pertussis usadas como materia prima inicial en los lotes de producción.
Los casos de tosferina por semanas epidemiológicas de los años 2014 -2016 tienen una
tendencia descendente, lo cual significa que la enfermedad está controlada en Ecuador,
gracias a las altas coberturas de vacunación. En el año 2014 hubo 11 casos, en el año 2015
se notificaron 10 casos y en el año 2016 se presentaron 8 casos, como se ilustra en anexo 12
tomado de la gaceta Sive-Alerta del Ministerio de Salud Pública. Los grupos de edad
afectados son los niños de 0 a 11 meses, todos sobrevivieron.
La metodología tiene enfoque cualitativo, para lo cual usaremos métodos: analítico,
descriptivo y de opinión. El cuadro CDIU que refleja el campo, el objeto y el árbol de
problemas consta en anexo 2. A continuación describimos dimensiones de las categorías
indicadas.
En la categoría educativa, vamos a investigar la capacidad existente para producir la
vacuna Pertussis en la planta de producción de biológicos del INSPI, notando que el
personal está plenamente capacitado para producirla por el método estático; sin embargo,
no hay personal suficientemente capacitado para implementar una nueva tecnología
utilizando la tecnología de cultivo agitado o fermentación. También se observó que no hay
técnicos entrenados para manejar las variables físico químicas de los fermentadores como
tampoco del sistema de filtración de flujo tangencial; por lo que es imperativo la
capacitación del personal en este campo de la biotecnología industrial para producir
vacunas seguras, eficaces y con calidad total. Los laboratorios públicos productores de
vacunas de América Latina, entre los cuales figura Ecuador, no están capacitados para
competir en este nuevo contexto con los laboratorios privados de los países desarrollados y
se corre el riesgo de ser desplazados del mercado. De ahí la necesidad de fortalecer la
producción nacional de biológicos, mediante la capacitación para implementar tecnologías
de nueva generación que coadyuvarán a incrementar la capacidad operativa y a establecer
programas de control de calidad efectivos.
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En la categoría económica se ha analizado la situación del actual laboratorio de
producción de Vacuna Pertusssis que no cumple con las normas de BPM. Además, se
analizó el recurso económico del INSPI para invertir en la nueva tecnología, observando
que por ser una entidad pública, la construcción del nuevo laboratorio y la adquisición de
equipos y recursos materiales, así como la contratación de investigadores sólo es posible
realizarla a través de proponer un proyecto de inversión a fin de lograr el financiamiento
por parte del gobierno central.
Para el efecto se ha identificado las características del área productiva y de los equipos
que requieren la asignación de recursos económicos; considerando como ventaja de que el
proceso de producción por fermentación es común para las 3 cepas bacterianas incluidas en
la Suspensión Pertussis, consecuentemente el diseño de la construcción de las áreas
productivas y la elección de los equipos e instrumentos adecuados, de conformidad a las
normas de BPM, sirven para producir suspensiones de todas las cepas; particular que
disminuye el costo de inversión.
En la categoría organizacional se observó el “Estatuto Orgánico de Gestión
Organizacional por Procesos del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública –
INSPI” que aparece en el Registro Oficial – Edición Especial N° 355 del 17 de agosto de
2015 donde consta la Resolución No. MSP-INSPI-2015-0004-RES, emitida por el
Director Ejecutivo del Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública. En el Art. 8
del Título V se establece la estructura del INSPI alineada a la Misión y en el numeral 2 del
mismo artículo constan los Procesos Sustantivos que realizan las actividades esenciales
para promover los servicios y los productos que ofrece a sus clientes la institución.
En el numeral 2.1.1 consta la Gestión Técnica de Investigación, Desarrollo e
Innovación. En el Capítulo II Art. 13, se indica que su misión es “Dirigir alternativas de
solución a los problemas de salud pública desde el ámbito de investigación, a través de la
planificación, seguimiento y ejecución de actividades de I+D+i en el área de salud pública
en su nivel de competencia”. En el mismo artículo se indican las Atribuciones y
Responsabilidades, cuyo literal b) dice Dirigir la priorización de las líneas de investigación
del INSPI de acuerdo a los lineamientos del Ministerio de Salud y SENESCYT”. El
numeral d) establece “Presidir el comité de revisión y selección de proyectos I+D+i. El
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numeral m) dice “Proponer tecnología a implementarse en el INSPI por parte de los
proyectos y laboratorios especializados”.
Toda esta coyuntura nos permitirá desarrollar en el INSPI la nueva tecnología de
producción de Vacuna Pertussis por fermentación, bajo el contexto de Desarrollo
Tecnológico e Innovación con la finalidad de generar un nuevo método de producción que
permita incrementar valor al ya existente y de esta manera lograr ventaja competitiva en la
elaboración de vacunas combinadas DPT y Pentavalente.
En la gestión de datos, los instrumentos que se utilizaron para obtener información
fueron, observación de la experiencia local de la tecnología utilizada para la producción y
control de la Suspensión Pertussis así como el diseño de las áreas productivas, flujos,
sistemas críticos, áreas de apoyo y equipos existentes; la revisión bibliográfica de fuentes
confiables local y externa; la observación de la estructura orgánica funcional del Instituto
Nacional de Investigación en Salud Pública - INSPI y el criterio de funcionarios de
investigación y desarrollo del instituto.
Criterios éticos:
La información obtenida en la planta de producción de biológicos de la institución
donde trabajo, acerca de la elaboración y control de calidad de la Suspensión Pertussis, así
como de la infraestructura que se dispone, ha sido manejada bajo criterios morales y éticos,
con autorización expresa de la autoridad competente y utilizada únicamente para fines de
elaboración del presente estudio. La obligación es mantener la confidencialidad y
abstención de acceder a la información que no haya sido autorizada o permitida.
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RESULTADOS
Al revisar el método de producción de Suspensión Pertussis de células enteras
inactivadas, actualmente utilizado en el INSPI, encontramos que es de tipo estático
perteneciente al pasado, utiliza mucho material, mano de obra y tiempo para ejecutar las
actividades y tareas del proceso técnico, no obstante, el rendimiento es insuficiente para
cubrir la necesidad país. En razón de utilizar gran cantidad de recipientes para multiplicar la
bacteria, existe heterogeneidad en los lotes productivos.
En la tecnología por fermentación propuesta en el presente trabajo, el proceso
productivo es común para las tres cepas de células enteras liofilizadas de Bordetella
Pertussis utilizadas, y son: B. Pertussis cepa 165 originaria del departamento de Salud de
Michigan-USA., B. Pertussis cepa 509, originaria del Instituto de Salud de Holanda, B.
Pertussis cepa 134 originaria del laboratorio Sate de Nueva York; cuyas características se
detallan en Anexo – 3
El flujo del proceso de manufactura propuesto para la elaboración de la suspensión
Pertussis de células enteras inactivadas por fermentación, es el siguiente: (1) preparación
del lote de siembra de trabajo de Bordetella Pertussis, (2) obtención del medio de cultivo
de producción, (3) elaboración de la pre-semilla, (4) obtención de la semilla, (5)
fermentación, (6) concentración-diafiltración celular, (7) mezcla de concentrados celulares
inactivos de las tres cepas, (8) obtención del concentrado estéril de suspensión Pertussis de
células enteras inactivadas.
La preparación del lote siembra de trabajo se inicia con la apertura de una ampolla
liofilizada del lote semilla de referencia de cada una de las cepas de B. pertussis, a la cual
se le ha comprobado que mantiene vacío en su interior; el contenido de la ampolla es
reconstituido con una solución de ácido casamino estéril al 1% (p/v), la suspensión
resultante se siembra por estría en medio de Agar Bordet Gengou adicionado de sangre
(conejo raza neozelandes), las cajas son incubadas a 34 – 36 °C por 48 horas. Al final de
este tiempo se realiza el ensayo de pureza que consiste en observar las características
microscópicas del cocobacilo que debe estar en fase 1, indicativo que posee virulencia y
pili; también es importante verificar la morfología de las colonias.
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El crecimiento bacteriano puro se utiliza para la preparación del lote siembra de trabajo
mediante la multiplicación de la bacteria y posterior distribución de la suspensión en
crioviales que se almacenan de -65 a -75 grados C. El lote de siembra trabajo debe ser
aprobado por control de calidad antes de usarlo en el proceso de producción.
El medio de cultivo usado en la recuperación de las bacterias liofilizadas es el de Bordet
Gengou Agar Base deshidratado (BD Laboratories) al cual se adiciona glicerina y proteosa
peptona, se esteriliza en autoclave y cuando la mezcla alcance una temperatura aproximada
de 40°C se le adiciona sangre de conejo desfibrinada estéril para obtener una
concentración final de 20%, luego el medio es incubado entre 35 - 37°C durante 24 horas
para probar la esterilidad.
El medio líquido para producción es el de Stainer & Scholte modificado que contiene
nutrientes como fuentes de carbono, vitaminas, nitrógeno y factores de crecimiento, la
composición consta en anexo 4. Se prepara en dos partes: el medio basal que es esterilizado
en autoclave y el suplemento que se esteriliza por filtración con membrana 022 µm y está
constituido por: l-cystina, sulfato ferroso heptahidrato, ácido ascórbico, niacina y glutatión
reducido, el cual se adiciona asépticamente al medio basal en una proporción de 10% (v/v),
justamente antes del uso.
La elaboración de la pre-semilla se realiza sembrando un criovial del lote semilla trabajo
en el medio agar Bordet Gengou sangre, seguido de dos pases sucesivos e incubación a una
temperatura de 34 -36 °C para multiplicar la bacteria; chequear la pureza microbiológica
previo a sembrar en un recipiente que contenga el medio líquido Stainer & Scholte, incubar
con agitación de 200 rpm y temperatura de 34-36°C durante 20 - 24 horas.
El inóculo de producción o semilla se lo prepara en un fermentador de menor capacidad
que el de producción, que previamente contiene el medio de cultivo Stainer & Scholte
esterilizado in-situ, cuando el medio ha adquirido la temperatura ambiente se le adiciona
el cultivo puro de la pre-semilla en la proporción de 5% (v/v) y se pone a funcionar el
fermentador durante 24 horas bajo los siguientes parámetros físicos operativos: 35 °C de
temperatura, agitación 300 rpm, flujo de aire estéril 5 litros/minuto y 0.2 bar de presión.
La fermentación de producción se realiza en un fermentador con la capacidad necesaria
para producir suspensión Pertussis en cantidad suficiente para formular las vacunas Triple
DPT y Pentavalente (DPT+HB+Hib) de acuerdo a la necesidad nacional anual. Para llevar
a cabo esta etapa, el medio de cultivo Stainer & Scholte es dispensado en el fermentador
19
industrial y esterilizado in-situ; cuando el medio alcance la temperatura ambiente se
adiciona asépticamente el inóculo semilla puro en la proporción de 4% (v/v). El
fermentador es mantenido en agitación constante durante 48 horas bajo los parámetros
iniciales siguientes: 300 rpm, temperatura 35°C, flujo de aire 120 L/min., densidad de
oxígeno (DO2) 100%, presión 0.4 bar, pH 7.4.
Durante las primeras 12 horas de fermentación el pH tiende a bajar, posteriormente a
partir de las 16 horas, aproximadamente, se incrementa a la escala de alcalinidad, llegando
a pH 8.0 al cabo de las 48 horas de cultivo. Es importante controlar el % de oxígeno (O2)
disuelto en el medio ya que tiende a descender debido a la multiplicación bacteriana, por lo
que es importante incrementar el flujo de aire cuando así lo indique el dispositivo de
control del equipo o, en su defecto, incrementar las r.p.m. en caso que no sea posible
abastecer de oxígeno. Las etapas secuenciales del proceso se ilustran en la tabla 3.
El proceso de fabricación, marcha paralelo con la ejecución de pruebas para valorar los
atributos críticos de calidad (CQAs) del producto que están indicados en los manuales
técnicos normativos de la OMS/OPS, las que se ejecutan en los puntos críticos de control
(CPPs) que constituyen los parámetros operacionales básicos para un proceso específico,
por ejemplo, la filtración tangencial seguida de una diafiltración nos conduce a la
concentración de células de B. pertussis.
Los CQAs son características físicas, químicas, biológicas o microbiológicas que deben
mantenerse dentro de un límite, rango o distribución apropiado, para asegurar la calidad del
producto de acuerdo a las normas técnicas; permiten monitorear el rendimiento de cada
etapa del proceso de producción de Pertussis por fermentación ya que incluyen ensayos
para: principios activos, excipientes, productos intermedios y producto final. Las
similitudes en el proceso de producción para las 3 cepas de Bordetella Pertussis permiten
definir un conjunto de CPPs y CQAs, cuyos rangos son comunes, tienen la misma base y
están ilustrados en la Anexo 5
Las pruebas de control de calidad definidas para cada uno de los puntos críticos están
indicadas en el diagrama de flujo que consta en anexo 8, deben realizarse sistemáticamente
y sus resultados ser anotados y firmados en el Registro de Calidad respectivo.
Es así que, en la etapa de multiplicación celular controlamos: Pureza microbiológica del
cultivo, morfología de las colonias, identidad / composición serológica. En la etapa de
20
fermentación controlamos: Esterilidad del medio de cultivo, pureza microbiológica del
cultivo, determinación de pH, Ensayo de opacidad (rendimiento celular). En la
Inactivación química controlamos: Ausencia de B. Pertussis viva, dermonecrosis en ratón
lactante En la etapa de Concentración y diafiltración celular realizamos: Ensayo de
opacidad (rendimiento celular), Ensayo de Esterilidad.
En la mezcla de concentrados celulares de las 3 cepas individuales para obtener el
producto final, realizamos las pruebas siguientes: Opacidad (concentración celular),
Identidad (composición serológica), Toxicidad Específica, Potencia, Esterilidad,
Determinación de pH, Contenido de tiomersal, Contenido de formaldehido residual.
Para ilustrar el proceso, en el anexo 7 está el diagrama de flujo detallado para la
producción de Suspensión Pertussis de células enteras inactivadas por la tecnología de
fermentación, indicando de manera gráfica la secuencia de actividades, operaciones o
tareas del procedimiento. En la simbología utilizada están representadas: las operaciones,
los productos de ingresan al proceso, las esperas temporales para la toma de decisiones, el
movimiento del producto entre diferentes sitios de producción y el almacenamiento
temporal o permanente. También están indicados los atributos de calidad para cada etapa.
El producto terminado al granel, esto es, la Suspensión Pertussis inactivada debe
cumplir los requerimientos de calidad indicados por el Comité Técnico de la Organización
Mundial de la Salud adoptados por Ecuador, cuyos parámetros y especificaciones de
calidad se ilustran en el anexo 8. Si el biológico cumple satisfactoriamente todos los
ensayos, el producto es liberado para uso como ingrediente activo en la formulación de las
vacunas combinadas DPT y Pentavalente.
Debido a que la producción lleva implícito el control de calidad durante todo el
proceso productivo, se describirán someramente los métodos analíticos de control de
calidad de la Suspensión Pertussis. Iniciamos con el ensayo de opacidad, que se realiza
con la muestra diluida hasta que la opacidad sea idéntica al comparar con la 5ta.
Preparación Internacional de Referencia de Opacidad de la OMS. El patrón tiene 10
unidades de opacidad, de manera que tomando en cuenta el factor de dilución, se calcula
las unidades de la muestra.
El ensayo de identidad, se realiza para evidenciar la composición serológica de la
bacteria, haciendo reaccionar la suspensión Pertussis con una gota de cada antisuero mono-
21
específico en una placa portaobjeto. Se mezcla y se balancea la placa por unos pocos
minutos. Debe observase una aglutinación rápida con los antisueros específicos dentro de
los tres minutos subsiguientes.
El ensayo de toxicidad específica lo realizamos en no menos de 10 ratones saludables,
del mismo sexo, en el rango de peso 14 – 16 g. El peso total del grupo de ratones es
determinado inmediatamente antes de la inyección, luego cada ratón es inyectado por vía
intra-peritoneal con 0.5 ml. de la Suspensión Pertussis inactivada que contiene una
concentración de masa bacteriana equivalente a la mitad de la dosis humana simple
recomendada como vacuna final. Un grupo similar de control es inoculado con 0.5 ml. de
solución salina fisiológica conteniendo la misma concentración de preservante que la
vacuna final. El peso total de cada grupo es determinado al final de las 72 horas y al final
de siete días después de la inyección. El producto es considerado satisfactorio si: (a) al final
de las 72 horas el peso total del grupo no es menor que el peso antes de la inyección, (b) al
final de siete días el promedio de peso ganado por ratón no es menor que el 60% de aquel
del grupo control y (c) no más del 5% de ratones muere.
La actividad dermo-necrótica se mide en el modelo de ratón lactante de 4 días de
nacido, inyectándole por vía intradérmica 0.1 mL de la Suspensión pertussis en la zona
dorsal entre el cuello y el lomo. A las 24 o 48 horas se observa la sobrevivencia y la
presencia de lesión hemorrágica necrótica con medición del diámetro longitudinal si la
hubiera.
El ensayo de potencia es comparativo en relación a la potencia de un material biológico
calibrado contra el Estándar Internacional para Vacuna Pertussis o un estándar equivalente
aprobado por la autoridad nacional de regulación y control. El ensayo es de protección
intracerebral de ratón, para lo cual tres grupos de animales sanos de 10-14 gramos son
inmunizados por vía intraperitoneal con tres diluciones seriadas de suspensión Pertussis.
Al cabo de 14-17 días, los ratones inmunizados son desafiados, por vía intracerebral, con
una dosis que contiene 100 – 500 DL50 de un cultivo de 20 -24 horas de la cepa virulenta
B. Pertussis 18323. Los ratones son observados por 14 días y aquellos que mueren dentro
de los tres días siguientes son excluidos del ensayo. Los valores de la dosis efectiva 50
(DE50) para cada preparación son determinados por el método de análisis estadístico
Probits o Spearman Karber. El ensayo es válido si la DE50 de la suspensión Pertussis y
de la vacuna patrón están entre la mayor y menor dosis inmunizante, las regresiones son
22
lineales, los límites de una desviación estándar de cada DE50 están entre el rango de 64 –
156 % y la respuesta es gradual en relación a la dosis inmunizante. La potencia es estimada
en Unidades Internacionales y la suspensión pasa el requerimiento si el resultado del
ensayo estadísticamente valido muestra que la potencia es igual o mayor que 4 U.I. en el
volumen recomendado como una dosis humana simple.
El ensayo de esterilidad se realiza para verificar si existe contaminación con bacterias
aerobias y/o anaerobias y fúngica; sembrando en medios de cultivo apropiados: Agar
Bordet Gengou sangre, medio fluido de thioglicolate, caldo soya tripticase. Los cultivos se
incuban a temperaturas de: 30 – 32°C para bacterias y 20 – 25°C para hongos, se
observan diariamente hasta el final del ensayo que es de 14 días.
La suspensión Pertussis pasa el ensayo si no existe evidencia de crecimiento bacteriano o
fúngico en los medios de cultivo.
Para el ensayo de pH se usa un equipo con electrodo de referencia previamente
estandarizado con soluciones buffer a pH 4.0, 7.0 y 10.0. El electrodo es enjuagado con
agua destilada, secado y sumergido en la muestra de Suspensión Petussis para registrar el
pH que debe estar entre 6.8 a 7.3 para que cumpla requerimiento técnico.
La determinación de Thimerosal se realiza realizando una digestión química de la
muestra, estándar y blanco, durante el tiempo apropiado para destruir la materia orgánica;
los tubos son transparentados con solución de Clorhidrato de Hidroxilamina para extraer el
thimerosal de los tres especímenes mediante agitación fuerte con solución de ditizona en
cloroformo. Los extractos clorofórmicos son separados e inmediatamente se determina el
máximo de absorción en un espectrofotómetro a 490 nm., previa calibración del equipo
con el blanco. Se aplica la fórmula de Lambert y Beer para calcular la concentración de
thimerosal en la muestra de suspensión Pertussis. El contenido de thimerosal debe
cumplir la especificación.
La determinación de formaldehido residual se realiza haciendo reaccionar la muestra, el
estándar y el blanco con ácido cromotrópico en baño maría a 57°C, se detiene la reacción
sumergiéndolos inmediatamente en un baño de hielo y se determina su absorbancia a 515
nm, ajustando previamente el equipo a cero con el blanco. Registre los resultados y aplique
la fórmula de Lambert.
En la bibliografía revisada encontramos que la Suspensión Pertussis de células enteras
inactivadas continúa usándose como un componente biológico activo de las vacunas
23
bacterianas combinadas: Pentavalente DPT+HB+Hib administrada en la vacunación
primaria de infantes saludables a los 2, 4 y 6 meses de edad, y vacuna triple DPT
administrada como refuerzo al año después de la tercera dosis de pentavalente; las dos
vacunas están incluídas en el calendario nacional de inmunización del Ministerio de Salud
Pública de Ecuador. La presente propuesta aporta al país los lineamientos necesarios para
implementar la nueva tecnología de fermentación para la producción del antígeno Pertussis
y ser autosuficientes.
En estudios clínicos aleatorizados en fase III realizados en América Latina, se demostró
que la fracción Pertussis de células enteras inactivada, manufacturada con esta tecnología,
confiere una alta respuesta inmunogénica medida por la concentración de anticuerpos anti-
Bordetella Pertussis en los vacunados en términos de seroconversión predefinida y,
además, dispone de un perfil de seguridad favorable.
Existe la tendencia universal de reemplazar la vacuna de células enteras por la vacuna
acelular. Sin embargo, en la revisión realizada con motivo del presente trabajo encontramos
que la vacuna Pertussis de células enteras es más eficaz que la acelular y es por ello que la
OMS sugiere que aquellos países que usan la primera no la cambien hasta que existan
estudios más concluyentes sobre la eficacia de la vacuna acelular. Ante el resurgimiento
de la tosferina a nivel universal, con mayor énfasis en personas mayores de 10 años cuando
no está recomendado el uso de la vacuna de células enteras por las posibles reacciones
adversas que pueda causar, necesitamos investigar y desarrollar y estudiar vacunas
acelulares más efectivas y que confieran una inmunidad más duradera.
Los aglutinógenos 2 y 3 de Preston se encuentran en las fimbrias de B. Pertussis, y en la
revisión de estudios realizados hemos encontrado que éstos tienen un rol muy importante
en la inmunidad protectora contra la infección respiratoria y que existe una correlación
directa entre la presencia de anticuerpos aglutinantes y la protección contra la tosferina. La
OMS recomienda que la vacuna final debe incluir los referidos aglutinógenos, para lo cual
es necesario utilizar en producción cepas bacterianas que los contengan, tal es el caso de
las cepas codificadas 134, 509 y 165 recomendadas en este estudio; además, que están
adaptadas para crecer en medio líquido como es el caso del utilizado en fermentación.
La adenilato ciclasa es una enzima que constituye uno de los principales factores de
virulencia de B. pertussis habiéndose verificado que confiere cierto grado de protección
contra la bacteria debido a que los anticuerpos anti-adenilato ciclasa neutralizan a la toxina
24
e incitan a la fagocitosis de la B. pertussis por los neutrófilos. No obstante, la toxina tiene
un efecto adverso de bloquear temporalmente a los receptores CR3 e inhibir la fagocitosis
dependiente del complemento por neutrófilos. Este efecto no deseado se inactiva en
presencia de concentraciones milimolares de agentes moduladores como el ácido
nicotínico que es un componente del medio de cultivo Stainer & Scholte reconocido en
este estudio.
La toxina dermonecrótica constituye un factor de virulencia pero su rol en la
inmunización no es bien conocido, sino que causa lesiones necróticas y muerte a los
animales de experimentación, por tanto debe estar ausente en el ingrediente activo y en el
producto final (vacunas combinadas). En el presente estudio propuesto para producir la
suspensión Pertussis celular por fermentación, se plantea inactivar totalmente la toxina
con formaldehido y determinar la posible presencia de toxicidad residual en la suspensión
sometiendo el producto a la prueba de detección de la actividad dermonecrótica en ratón
lactante.
Según estudios de investigación consultados se ha encontrado que, a través del
metabolismo del aminoácido cisteína, la B. Pertussis es capaz de autoregular la secreción
de la Toxina Pertussis que es uno de sus principales factores de virulencia a la vez que el
más importante antígeno protector que debe estar presente en la suspensión Pertussis de
forma inactivada. El medio de cultivo de Stainer & Scholte modificado reconocido en este
estudio-caso como ideal para cultivar el citado microorganismo no contiene cisteína con la
finalidad de incrementar la secreción de la Ptx a partir de cepas seleccionadas que la
producen. Los anticuerpos formados (antitoxina) neutralizan o inactivan varias actividades
perjudiciales de B. Pertussis a tal punto que los ratones inmunizados con esta antitoxina
sobreviven a una infección respiratoria con dosis letales de la bacteria salvaje.
En la bibliografía consultada y la experiencia de los procesos de producción de
biológicos similares desarrollados en los Institutos Finlay (Cuba) se encontró que la
microfiltración tangencial es el método más utilizado para la recolección de células por su
eficiencia comprobada y bajo costo. El sistema utiliza un filtro escogido de acuerdo al
tamaño de las partículas a separar o aislar, la suspensión Pertussis producida en el
fermentador e inactivada fluye paralelamente al filtro, a una presión de entrada y salida
controlada por manómetros, y se recicla varias veces a través de un depósito para eliminar
el medio líquido y recuperar de manera concentrada las células presentes. En el trabajo
25
consultado se demostró que un formato tipo cassette en formato SS (suspended screen) 0.2
µm permite el procesamiento de cosechas celulares provenientes de fermentadores que no
han tenido un proceso de clarificación previo.
El medio de cultivo Stainer & Scholte modificado para la producción de Suspensión
Pertussis por fermentación, es el más apropiado para el cultivo de B. pertussis debido a que
produce suspensiones con valores altos de opacidad, hasta 43 UO/ml., a la vez que
conserva la morfología del cocobacilo en fase 1 de crecimiento; características apropiadas
para producir vacunas eficaces y consistentes, consecuentemente la tecnología de cultivo
en fermentador es la de elección para innovar la actual de tipo estático en el ISNPI. Existe
experiencia de producción en institutos de América Latina (Cuba, Brasil, México). En
anexo 9 está descrito un análisis comparativo de los tiempos técnicos y la productividad
entre los métodos: estático (actual) y fermentación (propuesto).
Es muy importante el diseño del fermentador, por lo que se debe escoger uno que
permita a la bacteria contar con la concentración de Oxígeno requerida para multiplicarse,
ya que este elemento constituye la fase gaseosa del fermentador aerobio y tiene una baja
solubilidad en el agua (alrededor de 10 mg/L) al mismo tiempo que se va consumiendo
porque lo utiliza el microorganismo que está multiplicándose en el medio; de manera que
debe introducirse aire continuamente en la cámara a una relación aproximada de 0.5 a 1 por
volumen de caldo en el fermentador por minuto; la solubilidad se incrementa cuando se
adiciona oxígeno puro. La escases de oxígeno es el factor limitante en el crecimiento del
cultivo y el uso de un fermentador con características técnicas no adecuadas es uno de los
problemas para la transferencia de este elemento; bajo esta consideración en el presente
trabajo de desarrollo de un proceso de producción de suspensión Pertussis por fermentación
se ha escogido un fermentador de 80L con vasija agitada cuya relación entre altura y
diámetro interno de la misma es de 1.83. De igual manera los dispositivos operativos de
control abarcan los valores de medición de los parámetros establecidos en la metodología
(DO2, pH, temperatura, nivel de espuma) para que las células tengan una curva de
crecimiento óptima, mismos que son manejados por el software del computador.
Una vez que sembramos el medio Stainer & Scholte contenido en el fermentador, sigue
la fase lag que corresponde al tiempo donde el microorganismo se adapta a las nuevas
condiciones y pone en marcha su maquinaria metabólica para multiplicarse, por lo tanto, no
hay cambio apreciable en el número de B. Pertussis. Con la finalidad de acortar este tiempo
26
utilizamos el mismo medio para preparar el inóculo semilla del fermentador y cultivos
que están en la fase exponencial de crecimiento, la concentración del inóculo es ≥ 25
UO/mL. Luego viene la fase logarítmica en que se evidencia un rápido incremento del
número de células, a tal punto que el número de bacterias presentes en un tiempo dado es
función multiplicativa del número de células existentes en un tiempo previo, a un factor
constante, la cosecha se realiza a las 48 horas. El crecimiento de las biocélulas es
favorecido por el pH, temperatura, sustancias nutricionales del medio, oxígeno, agitación
constante y disponibilidad de agua, condiciones que están contempladas en la presente
propuesta.
Considerando que la calidad va paralela a la producción, en el presente estudio se ha
indicado detalladamente la secuencia de las etapas individuales del nuevo proceso
productivo y sus respectivas pruebas de control, así como la forma en que se relacionan
hasta obtener el producto terminado constituido por la suspensión Pertussis inactivada. En
base a este detalle se debe validar el proceso para conocer el grado de seguridad con que
vamos a obtener consistentemente lotes que cumplan las especificaciones predeterminadas
y características de calidad. En vista que la suspensión Pertussis inactivada está conformada
por diferentes cepas es aconsejable validar cada una separadamente, haciendo al menos 3
lotes de cada una y demostrando que cumplen las especificaciones predefinidas.
El diseño funcional de las instalaciones productivas; equipos adecuados; sistema de
calentamiento, ventilación y aire acondicionado (HVAC); sistema y calidad del agua;
clasificación del aire limpio que ingresa a las salas de: multiplicación celular, fermentación
/ cosecha, inactivación, purificación, mezcla de cepas, áreas de apoyo, descritas en el
presente estudio, son elementos básicos para que la operación de la planta de fabricación
pueda ser validada mantenida a un nivel de cumplimiento consistente con los
requerimientos de las BPMv. La meta final es obtener un biológico que cumpla con los
atributos de calidad en cuanto a seguridad, pureza, potencia, identidad y eficacia.
La implementación de las BPM se inicia desde el momento que abrimos el vial
liofilizado de cepa B. Pertussis del “banco semilla trabajo”, por tanto, el área de
multiplicación celular donde se realizan operaciones “abiertas” debe estar asegurada para
prevenir la contaminación cruzada, particularmente estas operaciones se realizan en
ambiente de flujo laminar. Las áreas de fermentación / cosecha son salas cerradas con el
fin de que el medio ambiente no impacte sobre la calidad del producto a esta etapa de
27
producción, se sugiere diseñarla con estándar de clase 100000 (ISO 8). Las superficies de
los cuartos son lisas y no porosas para facilitar la limpieza.
El área empleada para cosecha puede ser parte de la sala donde se ubica el fermentador
o estar en un área adyacente. Con la finalidad de evitar la potencial generación de
aerosoles al cosechar organismos vivos, la inactivación de la suspensión bacteriana se
realiza en el mismo fermentador. El uso de cascadas de presión negativa y el cambio de
ropa de bioseguridad por parte de los operadores es requerido en las dos etapas del
proceso: fermentación y cosecha.
La microfiltración tangencial / separación celular y la mezcla de cepas B. pertussis son
procesos limpios y las áreas deben ser diseñadas de tal forma que minimicen el riesgo de
adicionar carga biológica y endotoxinas, generalmente son clase C (ISO 7) o clase B (ISO
6) con todas las manipulaciones abiertas realizadas en clase de aire A (ISO 5); el área tiene
cascadas de presión positiva con filtración terminal HEPA y bajo nivel de retornos y los
operadores tienen un alto nivel de cambio de ropa. La superficie del cuarto es lisa y no
porosa permitiendo un buen estándar de limpieza. .
Las áreas de soporte son muy importantes, incluyen: lavado y preparación de
materiales, almacenamiento y preparación para esterilización, almacenamiento de
materiales esterilizados, preparación de medios de cultivo, las salas deben estar diseñadas
con cajas de transferencia, lavaderos y autoclaves, los operadores deben hacer cambio de
ropa para pasar los materiales del área de lavado al área limpia. El flujo de materiales debe
ser unidireccional para prevenir la mezcla de materiales sucios, limpios y estériles. Son
áreas limpias de clase D (ISO 8) que deben tener filtración HEPA con cascadas de presión
y bajo nivel de retornos; las superficies de los cuartos son lisas para facilitar la limpieza
mediante un protocolo estandarizado.
La preparación de medios debe cumplir un estándar clase D (ISO 8) con un alto
monitoreo de control del medio ambiente y uso de sistemas de circuito cerrado para evitar
la contaminación con bacterias y/u hongos; debe tener un área de filtración estéril y
dispensación en recipientes con pequeño volumen para las operaciones de multiplicación
celular. El área tiene filtración terminal HEPA con bajo nivel de retornos y cascadas de
presión positiva. La limpieza de la misma es más rigurosa y la vestimenta del operador
incluye guantes y máscara. En anexo 9 se ilustra el grado de calidad de aire europeo y los
límites de contaminación permitidos.
28
La vacuna Pertussis no es de tipo monovalente sino que forma parte de las vacunas
bacterianas combinadas, mismas que no son una simple combinación de antígenos, sino
que constituyen una nueva vacuna que debe cumplir parámetros regulatorios previo a su
aprobación para comercialización. Al combinar antígenos puede haber interferencias e
incompatibilidades de carácter químico o inmunológico que van desde una disminución de
la potencia de alguno de sus antígenos y un decrecimiento en la estabilidad; principalmente
por parte de la fracción pertussis; sin embargo Ecuador ha sido uno de los pocos países de
Latinoamérica que ha logrado combinar satisfactoriamente los cinco antígenos en un solo
vial para obtener la vacuna pentavalente.
De acuerdo a reportes de UNICEF, hay algunas vacunas pentavalentes en el mundo,
que incluyen las Pertussis de células enteras por ser más viable la obtención, pero el
suministro de las mismas no cubre la demanda mundial que se ha incrementado y alcanzado
la cifra de 177,3 millones de dosis en el año 2013 de acuerdo a reportes de UNICEF. Se
espera que en el 2021 la demanda global de vacunas se incremente a 48.03 billones de
dosis, en el estudio se incluye la vacuna DPT para proteger contra Difteria, Pertussis y
Tétano (Unicef, 2016).
Se recogió la opinión del Director de Investigación, Desarrollo e Innovación del INSPI
quien, al preguntarle acerca del interés institucional para implementar la nueva tecnología
por fermentación propuesta para la producción de vacuna Pertussis, manifestó lo siguiente:
“La propuesta de investigación se encuentra dentro de las líneas de investigación del INSPI
y representaría un importante avance en la producción de vacuna Pertussis de acuerdo a los
procedimientos que se emplean en la actualidad a nivel mundial”.
Se incluye en el anexo 11 el cuadro de resultados.
29
DISCUSIÓN
La contrastación empírica la iniciamos enunciando que la suspensión Pertussis de
células enteras inactivada es un componente de las vacunas bacterianas combinadas. De
acuerdo a los resultados obtenidos comprobamos que efectivamente existen en el mundo,
incluido Ecuador, algunas vacunas polivalentes que tienen como base la triple DPT
(difteria, pertussis, tétano), ejemplo, la pentavalente y la hexavalente, que han sido
introducidas exitosamente en los programas de vacunación de muchos países del mundo y,
comparado con el estudio realizado por Tregnaghi y Suárez en donde describen los altos
porcentajes de seropositividad y respuesta frente a todos los antígenos incluidos en las
vacunas indicadas, nos podemos dar cuenta que existe coherencia con el control de la
tosferina, la difteria y el tétanos neonatal, entre otras enfermedades, por las ventajas que
ofrecen ya que permiten inmunizar con algunos antígenos al mismo tiempo y en un
mismo sitio físico y lograr, al mismo tiempo, altas coberturas de vacunación contra las
enfermedades infecciosas correspondientes.
En la contrastación empírica notamos que se han probado muchos medios de cultivo
líquidos para el cultivo de B. Pertussis en fermentadores. De acuerdo a los resultados
obtenidos podemos decir que el medio de cultivo de Stainer & Scholte es el que ofrece los
mejores nutrientes para la multiplicación de la bacteria y, comparado con el estudio
realizado por Algecira N., en donde describe que el medio Stainer & Scholte adicionado
con una pequeña cantidad de ácido casamino incrementaron la producción de biomasa, nos
podemos dar cuenta que existe similitud con lo indicado en el presente estudio
considerando que para este tipo de bioproceso aerobio, operado bajo el sistema de lote, la
proporción de formación del producto está directamente relacionado con la proporción de
consumo del sustrato y también a la proporción de masa celular producida.
La adición de aminoácidos semisintéticos, como el casaminoácido o el extracto de
levadura enriquecen el medio de S & S, consecuentemente, incrementan la producción de
biomasa que nos interesa; en todo caso, es necesario determinar, a la luz de la experiencia,
cuál es la cantidad a adicionar en cada lote de medio de producción para obtener el efecto
deseado. Esto concuerda con nuestra experiencia local, donde, el medio de Cohen y
Wheeler sólido utilizado para producción de suspensión Pertussis por el método
30
estacionario, contiene básicamente ácido casamino y extracto de levadura, habiéndose
obtenido en todos los lotes de cosecha una gran producción de masa celular.
En la contrastación empírica enunciamos que un proceso específico bien caracterizado
es aquel donde existe un entendimiento detallado de las etapas que lo conforman y de
cómo interaccionan las operaciones hasta obtener el producto final. De acuerdo a los
resultados obtenidos en este caso-estudio, podemos decir que hemos enfocado los esfuerzos
hacia la implementación de una nueva tecnología contando con el conocimiento
conceptual y práctico del producto bajo el concepto de calidad basada en el diseño
orientado a construir la calidad del biológico y el proceso de manufactura desde la etapa de
su desarrollo y, comparado con el estudio realizado por Rathore, en donde indica que todo
proceso de producción debe ser validado para asegurar consistencia y robustez de que cada
lote de producto manufacturado tiene las mismas características de calidad como cada otro
lote.
Por lo expuesto en párrafo anterior, nos podemos dar cuenta que existe similitud, de
manera que el proceso aquí descrito está alineado a la práctica habitual de evaluar la
calidad de los parámetros críticos mediante las pruebas de control establecidas: en proceso,
en productos intermedios y en producto final, debiendo, el producto, cumplir los valores
fijados para los atributos críticos de calidad; todo lo cual servirá de base para el análisis y
la toma de decisiones, así como para ser incorporados en las prácticas de mejoramiento
continuo del Instituto y en el rediseño de productos y procesos. El tiempo es de gran
relevancia en la oportunidad de mercado, aunque tiene poca incidencia en la calidad del
producto; sin embargo, con esta tecnología logramos reducir en aproximadamente un
40% los tiempos técnicos de producción.
En la contrastación empírica señalamos que las instalaciones para las preparaciones
farmacéuticas deben contar con la infraestructura apropiada para las operaciones que se
van a realizar. De acuerdo a los resultados obtenidos podemos decir que para la
preparación de biológicos tiene que disponerse de instalaciones dedicadas y confinadas
para esta finalidad; los locales deben ubicarse de forma que la producción pueda realizarse
en zonas conectadas de acuerdo a un orden lógico correspondiente a la secuencia de las
operaciones y a los niveles requeridos de limpieza. Su disposición y diseño debe minimizar
el riesgo de errores y permitir una limpieza y mantenimiento efectivos para evitar la
31
contaminación cruzada, la acumulación de polvo o suciedad y, en general, cualquier efecto
negativo sobre la calidad de los productos.
Lo indicado en párrafo anterior, comparado con el estudio realizado por el comité de
Expertos en Especificaciones para las Preparaciones Farmacéuticas y publicado en el
Informe 32 de la OMS en donde se describe las condiciones que deben cumplir los locales
destinados a la producción de biológicos, nos podemos dar cuenta que existe similitud por
lo que se está en capacidad de mencionar que en las diferentes regiones del mundo donde
existen laboratorios productores de biológicos tenemos igual resultado debido a que la
OMS es el organismo rector en salud a nivel mundial que imparte recomendaciones en
guías que ayudan a promover la armonización internacional de buenas prácticas de
manufactura para facilitar la comercialización internacional de los biológicos.
En el mundo existen institutos que tienen estandarizada la tecnología de producción en
fermentadores por las ventajas en rendimiento con calidad como se ilustra en anexo 10.
Entre los países de América Latina podemos citar principalmente a Brasil, Cuba y México,
que se constituyen en un referente para captar el conocimiento en este campo, no sólo para
el antígeno Pertussis, sino también para los toxoides diftérico y tetánico y otros.
32
3. PROPUESTA
Implementación de la producción de Suspensión Pertussis por la tecnología de
fermentación en el INSPI.
Introducción:
De acuerdo al reglamento nacional de biológicos, la licencia regulatoria del nuevo
proceso a implementar, así como el diseño del laboratorio para fabricar volúmenes
mayores requiere la ejecución de procesos de validación y, el presente estudio constituye
un instrumento para la elaboración del Protocolo de Validación del proceso de
producción de la suspensión Pertussis de células enteras inactivadas por Fermentación, en
el INSPI, como un medio para implementar y optimizar la producción a escala industrial.
Previo a la manufactura de lotes industriales, deben completarse las tres fases del
proceso a implementar, esto es, escala de laboratorio, escala piloto y escala completa. El
trabajo a escala de laboratorio, debe realizarse en lotes que equivalgan al menos a la
centésima parte de la escala de manufactura. La escala piloto corresponde realizarla al
menos en la décima parte de la escala de manufactura. El equipo de las versiones a
pequeña escala debe usarse en la escala piloto con la finalidad de simular la propuesta del
proceso de manufactura, lo más estrechamente posible y minimizar los riesgos a escala
superior.
La implementación de un nuevo laboratorio para producir los lotes de Vacuna Pertussis
por fermentación a escala completa, es necesaria para realizar un ensayo final de la
disposición del equipamiento, elaborar los procedimientos de manufactura y
documentación complementaria, iniciar los estudios de validación y evidenciar algún
suceso inesperado en escala superior. Los datos de los lotes a escala piloto y a escala
completa proveen un fuerte soporte al proceso de validación del proceso a escala de
manufactura.
La justificación está asociada con las ventajas que ofrece el método: (1) incremento de
la productividad para ser autosuficientes, (2) uso de materias primas baratas, (3) obtención
de productos con mayor especificidad y pureza. Ver anexo 10.
33
El objetivo general es desarrollar la producción de vacuna Pertussis por la tecnología
de Fermentación en el INSPI.
Los objetivos específicos son: Crear un laboratorio específico con BPM y capacitar al
personal en el proceso tecnológico de fermentación aerobia.
Desarrollo:
Para la separación de la biomasa de B. pertussis, se propone la micro filtración de
flujo tangencial porque es sencillo, rápido, eficiente y la bacteria no sufre impactos
forzados que dañen su estructura, además se adapta a volúmenes mayores del producto.
El producto fluye paralelamente al filtro y recircula varias veces a través de un depósito, de
manera que las partículas más pequeñas que el tamaño del poro del filtro se empujan a
través como filtrado recogiéndose la masa bacteriana que interesa (Santiago, 2012).
En el diseño de la planta debe contemplarse la elaboración de protocolos para el flujo
del personal, flujo de material limpio y sucio, entre otros. De conformidad al proceso de
manufactura determinado en el presente estudio-caso, se procede a revisar los criterios
regulatorios aplicados a los establecimientos y a los equipos específicos.
El establecimiento para fabricar la suspensión Pertussis por fermentación requiere
información general así como información específica de los edificios y servicios de apoyo
críticos de la planta. Es necesario inicialmente determinar la cantidad de biológico a
producir para que el diseño de los locales sea coherente. El requerimiento nacional anual
propuesto por el Ministerio de Salud Pública es de aproximadamente 1’100.000 de dosis
de vacuna Pentavalente y 400.000 dosis de vacuna DPT, considerando que Pertussis es un
componente de estas vacunas combinadas se requieren aproximadamente 23’200.000
unidades de opacidad totales para formular las vacunas referidas .
Las Normas de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) son las directrices para definir
los estándares de calidad en la fabricación de biológicos y de obligado cumplimiento para
la industria farmacéutica del Ecuador. El diseño estructural debe ser de una planta baja
construida de tal forma que los cubículos internos de las áreas productivas estén dentro de
un casco de concreto exterior, lo cual simplifica el aprovisionamiento y mantenimiento de
34
servicios debido a que el personal de ingeniería puede trabajar dentro de la estructura sin
interrumpir el trabajo en el laboratorio. Las áreas productivas con aire clasificado quedarían
distribuidas de la siguiente forma: Cuartos de cambio de ropa y baños para hombres y
mujeres; multiplicación celular (clase A); liofilización y biocustodia (clase B);
fermentación (clase D); separación celular / purificación (clase A); mezcla de cepas
(clase A).
Las áreas de apoyo especializado con gradientes de presión son: materias primas y
materiales; pesadas; control en proceso; preparación de medios de cultivo/filtración
estéril; descontaminación; lavado de materiales; preparación y esterilización;
almacenamiento de materiales preparados y esterilizados.
. Las áreas limpias productivas señaladas en párrafo anterior deben estar clasificadas en
función del grado de limpieza de aire, dentro de los 4 grados indicados en la tabla del
anexo 8, donde se indica el número máximo permitido de partículas por metro cúbico de
aire para el estado en reposo y en funcionamiento.
Para alcanzar los grados de aire B, C y D, el número de renovaciones del aire debe ser
proporcional al tamaño del área, al equipo y al número de personas que trabajan en la
misma. El sistema de aire que desemboca en las salas con grados A, B y C debe tener filtros
terminales HEPA que retienen al menos un 99.97% de partículas inertes contaminantes
presentes en el aire ˃ 0.3 µm. La temperatura debe oscilar entre 18 – 20 °C y la humedad
relativa < 50%.
Para desarrollar el proceso productivo dentro de las áreas clasificadas, el flujo de
personal debe ser unidireccional, entramos por la puerta principal a la recepción, pasamos
al vestidor donde existen casilleros para cada uno de los técnicos, allí dejamos nuestras
pertenencias, luego en esta misma área hacemos un primer lavado de manos y vamos hacia
un cubículo donde nos colocamos la cofia y dejamos la ropa externa, nos lavamos
nuevamente las manos y pasamos a una zona limpia donde nos colocamos una vestimenta
de tránsito en el laboratorio. Previo al ingreso a las áreas de contención y estériles
hacemos un segundo cambio de ropa (OMS, 32 informe).
Los sistemas de apoyo crítico tienen un papel muy importante en la eficacia del proceso,
los más importantes son los siguientes:
Debe existir un sistema HVAC apropiado para dotar de aire con un alto grado de pureza
que cumpla tres exigencias importantes: protección del producto, protección del
35
operador y protección del medio ambiente. Consta de un equipo que calienta o
refresca el aire insuflado al laboratorio, controla el caudal de aire y sus cualidades,
pasando por un sistema de filtros, el aire es refrigerado y a partir de este punto
conducido a través de ductos sellados herméticamente y con un aislamiento térmico.
Antes de entrar a la sala clasificada existen filtros HEPA de alta eficiencia.
La fermentación de Pertussis se debe realizar en área de contención, donde la presión
del aire es negativa con relación a los cuartos adyacentes, debiendo certificarse que
ninguna cantidad de aire de esta sala se escape sino a través del sistema de
extracción que cuenta con filtros Hepa o un incinerador del aire antes de ser lanzado
al medio ambiente. Todos los accesos a estas salas tienen barreras físicas, las cuales
no permiten que aire “no limpio” entre en la sala donde se está produciendo el
biológico.
El área de purificación y filtración debe ser de calidad controlada, tener presión positiva
para garantizar la limpieza del aire a través de las gradientes de presión entre las salas inter-
ligadas a estas áreas. Por otro lado, deben realizarse ensayos periódicos para certificar el
buen funcionamiento del sistema HVAC: (1) integridad de los filtros, (2) ensayo de ductos,
(3) flujo de aire y gradiente de presión (4) contaje de partículas, (5) velocidad del aire y
número de recambios por hora, (6) monitoreo microbiológico del ambiente (OMS, Practicas
adecuadas de fabricación de productos farmacéuticos, 32 informe).
El agua purificada (PW) y el agua para inyectable (WFI) son de vital importancia en la
producción del biológico y de acuerdo con la farmacopea americana deben cumplir
caracteristicas físico-químicas y microbiológicas particulares. Entre los parámetros más
importantes del agua purificada está la conductividad que debe ser < 1.3 µs/cm-1 a 25°C, en
tanto que el TOC debe ser < 500 ppb. En referencia a las características microbiológicas,
en el caso de WFI, tenemos como límite máximo 100 UFC/ml. Generalmente, en procesos
de fermentación se utiliza PW, obtenida por osmosis inversa con pre-tratamiento para
minimizar la presencia de algún agente que destruya las membranas; también se la emplea
como fuente para autoclaves, fuente para el generador de vapor puro, para el lavado y
procesos de limpieza (CIP), entre otros (34, 2016) .
El agua purificada es almacenada en un tanque sanitario de gran capacidad y mantenida
próxima a los 10°C nunca ˃ 25°C; desde este depósito se la lleva a los distintos puntos de
36
uso o Sistema de Distribución a través de tubos de acero sanitario 316L formando una
trayectoria entrecruzada cerrada que recibe el agua bombeada del Sistema de
Almacenamiento a una velocidad de 1.5 - 2.0 m3/segundo para controlar el riesgo de
crecimiento bacteriano. Los “puntos de uso” están inmersos en la trayectoria cerrada y
poseen válvulas de acero sanitario 316L con punto muerto cero.
El agua para inyectables (WFI) tiene mayores exigencias de calidad. Entre las
características físico químicas podemos citar que la conductividad debe ser < 1.3 µs/cm-1 a
25°C y el TOC < 500 ppb. En cuanto a las características microbiológicas tenemos, la
inexistencia de coliformes, ausencia de pirógenos y el nivel de microorganismos totales
debe ser < 10 UFC/100 ml. Para lograr agua con estas particularidades necesitamos un
destilador con múltiples etapas y agua de alimentación previamente tratada que es el agua
purificada (PW). Para distribuir el agua WFI, se la refrigera al salir del tanque para que la
temperatura se aproxime a los 10°C con velocidad de 1,5 – 2,0 m/s y para retornar al
almacenamiento es calentada próximo a los 90 °C para entrar al tanque.
También es necesario el aire comprimido que debe tener algunas características de
pureza debido a que está en contacto con el producto y, ´por tanto, debe satisfacer en su
composición ciertos niveles de partículas en suspensión, límites de agua y aceite; el patrón
de referencia es la ISO 8573, clase 1, que se refiere a procesos farmacéuticos. El sistema
de generación utiliza un compresor exento de aceite y el sistema de tratamiento se lo realiza
con filtro secador que remueve el agua presente en el aire que ingresa que, al ser
comprimido, condensa el agua presente. El tratamiento también se realiza con pre-filtros
y filtros coalescentes que retiran con precisión el agua, partículas residuales y aceite antes
de pasar al filtro secador.
La distribución y almacenamiento del aire comprimido se realiza mediante un pulmón
que mantiene siempre alimentado el sistema de distribución. En el punto de uso debe tener
un filtro terminal microbiológico de 0.22um para evitar que alguna partícula que pudiera
existir en el aire pueda ingresar a tener contacto con el producto. Todo el sistema debe ser
validado con la norma NIOSH 5026, ISO 7183 y NIOSH 0500, también merece especial
atención el análisis microbiológico del aire comprimido para controlar riesgos de
contaminación en los procesos de filtración, esterilización, fermentación, etc.
37
Otro servicio básico crítico es el sistema de vapor puro está constituido por un
generador que utiliza agua purificada como fuente primaria, es usado para alimentar
autoclaves en procesos de esterilización de materiales, tubuladuras del sistema de
fermentación, entre otros usos; es distribuido a través de tuberías de acero inoxidable
sanitario 316L con aislamiento térmico y con válvula sanitaria en el punto de uso del
laboratorio. Este sistema de generación de vapor puro se valoriza en Kg/h, presión de
trabajo con límite de 3 bars y temperatura de 150°C.
La existencia de un sistema eléctrico de emergencia es muy importante puesto que
mantiene en constante funcionamiento todo el equipamiento del área de producción en el
caso de que se corte la luz eléctrica comercial. Este equipo posee paneles de control
eléctricos que entran en funcionamiento inmediatamente después de la falla en la red
comercial, aprovisionando de energía eléctrica hasta que se normaliza la situación.
Para llevar a cabo el proceso en la nueva planta de producción de Suspensión Pertussis
por fermentación necesitamos los equipos siguientes: Cabina de bioseguridad tipo II,
Microscopio biológico de luz, pH metro, espectrofotómetro, incubadora (35 – 37 °C),
estufa de agitación (35 – 37 °C), liofilizador, congelador - 40°C, fermentador de 14 L
con panel de control, fermentador de 80 L con panel de control, equipo de micro-filtración
tangencial, tanque farmacéutico de 100 L, balanza de precisión, balanza analítica, bomba
peristáltica, autoclave doble puerta (material limpio), autoclave para descontaminación,
horno para esterilizar y despirogenizar con doble puerta, agitadores magnéticos,
deshumidificador, báscula (1 – 10kg), cámara fría (2-8°C), nevera panorámica de
laboratorio, tanque presurizado, porta-filtro de acero sanitario.
Durante el desarrollo del proceso productivo hay generación de impactos ambientales,
por lo que es necesario contar facilidades para el vertimiento de desechos infecciosos
biosanitarios de microorganismos del grupo de riesgo 2 y 3, como es el caso de la
Bordetella Pertussis; en el presente caso deben ser sometidos a esterilización en autoclave
en el sitio donde se los genera para eliminar la carga biológica contaminante de dichos
residuos. Posteriormente pueden ser colocados en el relleno sanitario municipal.
38
CONCLUSIONES
La tosferina continúa siendo una enfermedad infecciosa fácilmente transmisible de
interés en salud pública, más aún cuando se ha visto un resurgimiento de la enfermedad en
adolescentes y adultos en algunas regiones del mundo, que contagian a la población infantil
susceptible. La vacunación contra la Pertussis es la medida sanitaria más eficaz debido a
que logra el mayor beneficio en función del costo incurrido y la suspensión Pertussis de
células enteras inactivadas continúa siendo utilizada en el mundo para la inmunización
primaria debido a su mayor eficacia en comparación con la vacuna de tipo acelular. Para
evitar los efectos indeseables que pudiera ocasionar la administración del antígeno de
células completas, los productores deben poner especial cuidado en el proceso de
inactivación de los componentes tóxicos de la bacteria y su prueba de control, ya que
constituye un punto crítico del proceso, desde luego sin afectar la potencia; así como en la
cantidad de masa bacteriana (UO) usada en la formulación de las vacunas combinadas que
llevan el componente Pertussis, ejemplo DPT y Pentavalente.
El medio de cultivo Stainer & Scholte, constituido principalmente por glutamato de
sodio, es el adecuado para lograr una buena productividad, sin afectar la eficacia de la
suspensión; lo cual se logra por el incremento de la opacidad al final de la etapa de
fermentación, a la vez que permite conservar las características morfológicas de la Pertussis
en fase 1 de crecimiento, esto significa que hay presencia de las proteínas que se adhieren a
los epitelios del tracto respiratorio, similar a lo que ocurre cuando se adquiere la
enfermedad natural, las cuales fueron conocidas inicialmente como aglutinógenos y luego
como fimbrias. Lo dicho es muy importante si consideramos que se ha demostrado que los
anticuerpos anti-fimbria otorgan una inmunidad pasiva que protegen a los ratones contra la
infección respiratoria. La incorporación de los aglutinógenos 1, 2 y 3 en las vacunas le
confiere un mayor grado de eficacia a la vacuna, al menos si se están contenidos en el curso
de las tres dosis de inmunización primaria que se da a los niños.
El desafío al diseñar la tecnología del proceso de producción de Pertussis por
fermentación es hacerlo de tal manera que las etapas sean consistentes con las Buenas
Prácticas de Manufactura vigentes y así asegurar la calidad del producto, principalmente
39
eficacia, seguridad y pureza, considerando que el producto será usado para propósitos
clínicos. Otro punto importante del estudio es asegurar la robustez de cada paso del
proceso durante el desarrollo, previo a su transferencia a escala mayor de manufactura.
El enfoque está dirigido a desarrollar un proceso eficiente y exitoso que dé como
resultado un proceso “óptimo y robusto”; logrado a través de la descripción de la tecnología
de producción y control de la Suspensión Pertussis de células inactivadas por fermentación,
con mención a su optimización, identificación de puntos críticos y caracterización. El punto
de partida para hacerlo es reemplazar la metodología actual estacionaria que pertenece al
pasado y que, además, resulta costosa debido a su baja productividad y requerimiento de
mucha mano de obra.
Otra conclusión es aquella referente al diseño de las instalaciones para llevar a cabo el
proceso de producción. Describimos el establecimiento con información general y
específica de las localidades, utilidades y sistemas críticos, haciendo especial énfasis en el
uso de sistemas cerrados y validados que permitan al manufacturero reducir las salas con
clasificaciones ambientales y disminuir el nivel de ropa especializada de sus operadores.
Se ha puesto especial énfasis en el sistema de agua, su calidad y validación. Similar
consideración con el sistema HVAC, su validación y programa de monitoreo ambiental. El
enfoque para la descripción del establecimiento está de acuerdo con la norma vigente de
BPM incluido la necesidad de contar con procedimientos de limpieza y su validación, así
como características de contención en el diseño de los locales para prevenir la
contaminación y contaminación cruzada.
40
RECOMENDACIONES
Que el Instituto de Investigación en Salud Pública adopte esta propuesta, como un
medio para cumplir su nueva misión que emerge del Decreto Ejecutivo N°1160 expedido
el 22 de agosto de 2016, donde le incorpora como atribución y responsabilidad: la
investigación y desarrollo de principios activos y producción y comercialización de
biológicos, a la vez que lograría importante avance en la producción del antígeno Pertussis.
Que el Gobierno del Ecuador invierta en la modernización de las instalaciones
productivas bajo estándares de calidad, con el propósito de lograr autosuficiencia en el
abastecimiento de las vacunas combinadas que tienen el componente Pertussis en su
formulación, como son, la triple DPT y la Pentavalente (DPT+HB+Hib) y disminuir la alta
dependencia de la producción internacional que debilita la soberanía en salud. En paralelo
avanzará en la escala de países pertenecientes a las regiones de América Latina y el
Caribe que producen biológicos con tecnologías de nueva generación.
Que se utilicen los equipos adquiridos con el objetivo de implementar esta nueva
tecnología y escalar a niveles mayores la producción, principalmente de la vacuna
Pentavalente cuyos estudios de desarrollo están muy avanzados en el Ecuador con
excelentes resultados; así se cubriría la alta demanda de esta vacuna a nivel nacional,
quedando un remanente para exportar y así traer divisas a nuestro país en vez de que salgan
al importarlas, como actualmente se lo hace.
Que se realicen investigaciones sobre la Caracterización Molecular de las cepas de
Bordetella pertussis aisladas en el Ecuador para conocer si se están produciendo cambios
genéticos en la bacteria como respuesta a la inmunidad vacunal; conforme se ha observado
y demostrado en estudios realizados en otros países (ej. EE.UU.) donde los casos
reportados de tosferina han aumentado; hacemos mención a que en este país usan la
vacuna Pertussis acelular.
41
ANEXOS
Anexo 1.- Árbol de problemas
ÁRBOL DE PROBLEMA
DESCONOCIMIENTO DE FALTA DE INFRAESTRUCTURA FALTA DE INVESTIGACIÓN
NUEVAS TECNOLOGÍAS FÍSICA Y EQUIPOS Y DESARROLLO
efectos
BAJA PRODUCTIVIDAD DE VACUNA PERTUSSIS
causas
FACTORES EDUCATIVOS FACTORES ECONÓMICOS FACTORES ORGANIZACIONALES
(capacitación) (no hay dinero) (falta de directrices)
42
Anexo 2. Matriz CDIU
CATEGORÍAS DIMENSIONES INSTRUMENTOS UNIDAD
ANÁLISIS
Educativa
Económica
Organizacional
Capacitación
Recursos
económicos.
Directrices
organizacionales
Observaciones,
Revisión
bibliográfica
Experiencia local
Revisión
documental de
Infraestructura y
equipos para nueva
tecnología
Observación,
Criterios de
autoridades INSPI
Tecnologías de
producción y control
de calidad de
Vacuna Pertussis
Características del
área productiva y
equipos.
Estructura orgánica
funcional, Opiniones
de funcionarios de
I+D del INSPI .
43
Anexo 3. Caracterización de las cepas de B. Pertussis usadas en fermentación.
Microscópic
as
Macroscópica
s
Fimbria
s
2, 3
Pertactin HFA Toxina
pertussis
DNT Adenilato
ciclasa
CTT LPS
3 lotes
por
cepa
134
Cocobacilo
Gram
negativo
pequeño, 0.2
a 0.5 um
diámetro y
0.5 a 2 um
largo
Colonias
pequeñas
brillantes,
lisas, bordes
regulares,
convexas,
color perlado
x
x
x
x
x
x
x
x
3 lotes
por
cepa
165
Cocobacilo
Gram
negativo
pequeño, 0.2
a 0.5 um
diámetro y
0.5 a 2 um
largo
Colonias
pequeñas
brillantes,
lisas, bordes
regulares,
convexas,
color perlado
x
x
x
x
x
x
x
x
3 lotes
por
cepa
509
Cocobacilo
Gram
negativo
pequeño, 0.2
a 0.5 um
diámetro y
0.5 a 2 um
largo
Colonias
pequeñas
brillantes,
lisas, bordes
regulares,
convexas,
color perlado
x
x
x
x
x
x
x
x
44
Anexo 4. Composición de medios de cultivo líquidos para crecimiento de B. Pertussis
INGREDIENTES
(g/L)
STAINER &
SCHOLTE
COHEN &
WHEELER HBP-2
Glutamato de sodio
Ácido Casamino
L-prolina
Cloruro de sodio
Fosfato de potasio
monobásico
Cloruro de potasio
Cloruro de magnesio
hexahidrato
Cloruro de calcio
Tris (hidroximetil
aminometano)
l-Cystina
Sulfato Ferroso
heptahidrato
Sulfato de cobre
pentahidrato
Ácido ascórbico
Niacina
Glutatión, reducido
Almidón soluble
10.72
--
0.24
2.50
0.5
0.2
0.1
0.02
1.525
0.04
0.01
--
0.02
0.004
--
10.0
--
2.50
--
--
0.40
0.01
--
--
0.01
0.001
--
--
--
14
--
5.0
--
0.25
0.025
0.002
--
--
0.014
0.0005
--
--
45
Extracto de levadura
L-cisteina clorhidrato
Fosfato de potasio
dibásico
pH final
0.1
--
--
--
--
7.6
--
1.50
3.00
0.025
--
7.2 – 7.3
0.025
1.0
0.5
--
0.25
6.9
46
Anexo 5. Parámetros críticos del proceso (CPPs) y atributos de calidad críticos (CQAs)
Etapa CPPs Valor CQAs Valor
CPP1 Pureza Igual para todas cepas Puro Cocobacilos G (-)
Microbiológica
Caracterización Igual para todas las cepas Cultivo Colonias y bacteria
De la cepa en fase 1
Serología Aglutinógenos
1, 2, 3
Pureza Igual para todas las cepas Puro Cocobacilos G (-)
pH Igual para todas las cepas pH < 8.2
Rendimiento Igual para todas las cepas Opacidad ˃ 30 U.O/ml.
celular
Relación Igual para todas las cepas Opacidad 8 - 10%
volumen/inoculo
Pureza Igual para todas las cepas No crecimiento Ausencia B. P viva
p
Detoxificación Igual para todas las cepas Toxicidad Ausencia
dermo necrosis
Concentración Rendimiento Igual para todas las cepas Opacidad ˃ 100 U.O/ml. celular
Esterilidad Igual para todas las cepas Cultivo Ausencia bacterias
Y hongos
Concentración Igual para todas las cepas Opacidad ˃ 100 UO/ml.
celular
Toxicidad Igual para todas las cepas Peso ganado ≥ 60% del grupo
específica Ratón control
Concentración Igual para todas las cepas Determinación ≤ 0.02%
formaldehido química
libre
Potencia Igual para todas las cepas Potencia ≥ 4 UI/DHS
pH Igual para todas las cepas pHmetría 6.8 – 7.3
Esterilidad Igual para todas las cepas Cultivo Ausencia bacterias
y hongos
Multiplicación
celular
Fermentación
Inactivación
química
químic
Concentración-
diafiltración
celular
Mezcla
concentrados
celulares de cepas
individuales
47
Anexo 6. Flujo de etapas y objetivos del proceso productivo.
ETAPAS OBJETIVO CONTROL CALIDAD
Preparar inóculo Identidad y pureza
fermentación del cultivo
Expansión celular Identidad, pureza, pH
y opacidad del
cultivo (UO/ml)
Inactivación Ausencia de B. pertussis
Viva. Destoxificación.
Agente inactivante
Concentración Determinación UO/ml.
celular Esterilidad
Obtención de concentrado Concentración de
inactivo de cepa individual preservante
Obtención de producto Identidad, potencia, pH
toxicidad, inocuidad,
Terminado (a granel) Esterilidad, U.O,
Preservante
Multiplicación
celular
Fermentación
Muerte y
destoxificación
Separación y
diafiltración celular
Descarga de
concentrados celulares
Mezcla concentrados
celulares de cepa
individual
48
Anexo 7. Diagrama de flujo del proceso de fermentación y purificación.
Etapa de obtención de pre-inóculo
Variables del proceso
CQAs Crioconservado de B. Pertussis
(lote semilla trabajo)
Medio Agar
Bordet Gengou
Multiplicación
Incubación 34-36°C
Pases
Pureza microbiológica
Medio Stainer
Scholte
Multiplicación
Incubación 34-36°C
Agitación 200 r.p.m.
Pureza microbiológica
Pre-inóculo
49
Etapa de obtención del inóculo
Variables del proceso
CQAs
Preparación medio
Stainer-Scholte
Esterilización por calor Esterilidad
Ajuste de pH
Suplemento Integridad del filtro
Vitamínico
Esterilizado por
filtración Adición al
fermentador
Pre-inóculo
Inoculación al
fermentador
Fermentación
35°C / 24-48 h
Pureza microbiológica
Inóculo de producción
T
50
ETAPA DE FERMENTACIÓN
CQAs
Preparación medio de
Cultivo Stainer-Scholte
Esterilización por calor
Ajuste de pH
Suplemento Esterilidad del suplemento
vitamínico Integridad del filtro
esterilizado por
filtración Adición al
fermentador
Inóculo de
fermentador
Inoculación del
fermentador
Fermentación,
35°C / 32-46 h
Pureza microbiológica
Rendimiento (UO/ml)
pH final
Cultivo final
´ de producción
51
ETAPA DE INACTIVACIÓN
Solución formaldehido Adición solución formaldehido
37% (P/V) al 0.1% (P/V)
Incubar a 37°C / 48 horas
Enfriar
Pureza microbiana
Cultivo inactivado
52
ETAPA DE CONCENTRACIÓN-DIAFILTRACIÓN CELULAR
CQA
Cultivo inactivado
Concentración
celular
Tampón fosfato salina
salina 2mM
Diafiltración
Celular y arrastre
Descarga del
´ células concentradas
inactivas
Concentración (UO/ml.)
Inactivación
Esterilidad
Solución thimerosal
10% p/v Adición c.s.p.
Concentración 0.1 g/L
Almacenamiento 2-8°C
Concentrado celular
Inactivo cepa individual
53
ETAPA DE MEZCLA DE CONCENTRADOS CELULAS INACTIVAS DE CEPAS INDIVIDUALES
CQA
Concentrados celulares inactivos de cepa individual
Mezcla lotes cepas
Agitación suave
Concentración
Toxicidad específica
Esterilidad
Potencia (UI/ml.)
pH
Formaldehido residual
Contenido thimerosal
Cuarentena 2-8°C
Aprobación
Almacenar en cámara 2-8°C
Concentrado estéril de células
Inactivadas de Bordetella Pertussis
(producto al granel)
P
54
Anexo 8. Especificaciones de calidad de la Suspensión Pertussis inactivada.
ETAPAS ENSAYO ESPECIFICACIÓN
Multiplicación celular
Pureza microbiológica Cultivo puro de cocobacilos
Gram negativos en fase 1
Morfología de las colonias Pequeñas, color gris aperlado,
bordes y superficie lisos
Identidad Presencia de aglutinógenos 1,
2 y 3
Fermentación
Pureza microbiológica del
cultivo
Cultivo puro de cocobacilos
Gram negativos
Determinación de pH < 8.2
Opacidad ˃ 30 U.O / ml.
Esterilidad del medio cultivo Estéril
Inactivación química
Ausencia de B. Pertussis viva
No crecimiento
Actividad dermo-necrótica
Lesión no detectable grado 0
Lesión leve d < 0,5 cm
Lesión moderada d ≤ 1 cm
Lesión severa d ≥ 1 cm.
Concentración y
Diafiltración celular
Opacidad
˃ 100 U.O / ml.
Esterilidad
Estéril
55
Mezcla de concentrados
De cepas individuales
Opacidad
˃ 100 UO / ml.
Identidad Presencia de aglutinógenos 1,
2 y 3.
Toxicidad específica
Peso ganado en ratones es
mayor al 60% que grupo
control
Potencia
≥ 8 U.I. / ml.
Esterilidad
Estéril
Determinación de pH
6.8 – 7.3
Contenido de thimerosal
0.005 – 0.02 %
Formaldehido residual
≤ 0.02 % (p/v)
56
Anexo 9. Clases de Partículas no viables transportadas por el aire y Límites de
contaminante viables.
Número máximo de partículas de tamaño igual o superior al
indicado en la tabla, permitido por m3
Partículas no viables
En reposo
Partículas no viables
Durante operaciones
Viable (Unidades
formadoras de
colonias CFUs)
Grado EU ≥ 0.5 µm. 5.0 µm 0.5 µm 5.0 µm
A (flujo
laminar)
3.530 20 3.530 20 < 1
B 3.530 29 353.000 2900 7
C 353.000 2.900 3’530.000 29.000 100
D 3’530.000 29.000 3’530.000 Sin definir 100
57
Anexo 10. Análisis comparativo del tiempo técnico que requieren los parámetros del
proceso de producción del Concentrado Estéril de células de Bordetella Pertussis
inactivadas y el rendimiento, por los métodos: estacionario y fermentación
ETAPAS TIEMPO TÉCNICO/lote (horas) RENDIMIENTO/lote
Estacionario
(medio sólido)
Fermentación
(medio líquido)
Estacionario Fermentación
Obtención lote
siembra trabajo
216 168 N/A N/A
Obtención del
pre-inóculo
72 24 N/A N/A
Obtención de
semilla
72 24 N/A N/A
Cultivo
producción
72 48 N/A N/A
Inactivación/
detoxificación
4.320
(6 meses)
48 N/A N/A
Separación masa
celular
16 3 N/A
Obtención
suspensiones
individuales
6 N/A N/A N/A
Obtención de
concentrado
estéril de células
3 3 120.000 dosis.
1’920.000 UOT
93.750 dosis.
1’500.000 UOT
TOTAL 4.777 h (6.4
meses)
270 horas (12
días)
120.000 dosis.
1’920.000 UOT
93.750 dosis.
1’500.000 UOT
En los 6.4 meses consumidos por el método estacionario para elaborar un lote de
Suspensión Pertussis (120.000 dosis), se producirían app. 14 lotes del biológico por
fermentación (1’312.500 dosis.).
58
Anexo 11. Tabla de resultados
REFERENCIA RESULTADO OBSERVACIONES
Tecnología actual INSPI de
tipo estático
Bajo rendimiento de
suspensión Pertussis wP
Insuficiencia para formular
vacunas combinadas
Tecnología de nueva
generación
Fermentación aerobia Mayor rendimiento del
producto con calidad
homogénea
Pertussis wP es
componente de vacunas
bacterianas combinadas
Componente de vacunas:
Triple DPT, Pentavalente
DPT + HB + Hib
Pentavalente usada en
inmunización primaria en
infantes a los 2, 4 y 6 meses
de edad.
Triple en refuerzo a los 18
meses de edad.
wP confiere alta respuesta
inmunológica y seguridad
Se evidencia altos títulos de
anticuerpos (seroconversión)
Según estudios de campo la
Pertussis de células enteras
es más eficaz que Pertussis
acelular.
Aglutinógenos 2 y 3 tienen
rol importante en la
inmunidad protectora
contra la tosferina
Se encuentran en las
fimbrias de B. Pertussis, le
confiere el tipo serológico.
OMS recomienda que estén
incluidos en la vacuna
terminada.
Adenilato ciclasa es uno de
los principales factores de
virulencia de B. pertussis .
Anticuerpos anti adenilato-
ciclasa neutralizan la
toxina Pertussis e incitan la
fagocitosis de la bacteria.
Ácido nicotínico en el
medio de cultivo neutraliza
posible efecto adverso de
bloquear a los receptores
CR3
Toxina dermonecrótica es
factor de virulencia
Porque causa lesiones
necróticas y muerte de
animales debe estar ausente
en la vacuna final
Debe inactivarse por medio
químico y realizar prueba de
control.
Cisteína es metabolizada Toxina Pertussis es el Medio Stainer & Scholte no
59
por la B. Pertussis y
autoregular la secreción de
toxina pertussis
mayor factor de virulencia
y además el más
importante antígeno
protector
contiene cisteína para
incrementar la secreción de
TP.
Microfiltración tangencial
aplicada para recolección
de biomasa bacteriana
El fundamento de la
separación es por tamaño
de partículas
Recupera las células
concentradas y diafiltradas.
Uso de formato tipo cassette
SS de 0.2 um.
Diseño del fermentador es
importante para lograr
concentración optima de
oxígeno
Relación entre altura y
diámetro interno del
fermentador seleccionado
es de 1.83
Escases de oxígeno limita el
crecimiento del cultivo.
Fase lag inicial en el
cultivo es de adaptación
del microorganismo al
medio de cultivo. Fase log
es de multiplicación rápida
Inóculo para fermentador
de semilla y cultivo debe
estar en fase exponencial
de crecimiento.
Concentración del inóculo
debe ser ≥ 25 UO/mL
Es importante que la
calidad vaya paralela a la
producción
Flujograma elaborado con
secuencia de etapas y sus
respectivas pruebas de
control
Sirve para validar el proceso
de producción de cada cepa
de B. pertussis.
Diseño de instalaciones
productivas debe ser
funcional
Además, se ha considerado
los equipos adecuados,
clasificación de aire en
salas productivas, sistemas
críticos, áreas de apoyo
Cumplir normas BPM para
asegurar calidad del
producto.
Implementar normas BPM
a los largo del proceso para
prevenir errores y
contaminación cruzada
Aire clasificado según
normas pertinentes con
diferenciales de presión en
cada una de las salas de
acuerdo a la actividad
técnica
En el presente estudio se
escogió la norma europea.
60
Vacuna Pertussis no es de
tipo monovalente
Combinada con los
toxoides diftérico y
tetánico conforman la
vacuna DPT y si a ésta se
le agregan los antígenos de
superficie de la hepatitis B
y el poliribosil ribitol
fostato de H. influenzae se
obtiene la vacuna
pentavalente.
Ecuador es uno de los pocos
países latinoamericanos que
ha desarrollado la vacuna
pentavalente.
UNICEF informa que la
vacuna pentavalente es
insuficiente para cubrir la
demanda mundial
En el año 2013 alcanzó la
cifra de 177,3 millones de
dosis
En el 2021 la demanda
crecerá a 48.03 billones de
dosis incluyendo la vacuna
DPT. Ecuador debe
continuar con el desarrollo
de su vacuna pentavalente,
sólo falta el estudio clínico
final.
61
Anexo 12. Situación epidemiológica de la tosferina en el Ecuador.
62
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