Aplicaciones de la técnica SAXS Small Angle X-ray Scattering Universidade de Santiago de...
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Aplicaciones de la técnica SAXS Small Angle X-ray Scattering http :// imaisd.usc.es / riaidt / raiosx / Universidade de Santiago de Compostela Servizo de difracción de RaiosX ED. CACTUS Campus sur Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
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Aplicaciones de la técnica SAXS
Small Angle X-ray Scattering
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
DIFERENCIAS ENTRE SAXS Y DIFRACCIÓN RX
NO necesitamos sistemas sólidos
Posibilidad de determinar la estructura de macromoléculas biológicas
pero en su medio natural
No necesitamos Cristalizar
Cristales líquidos
Partículas, Nanopartículas
Polimeros, Micelasformación de nanopartículas
Medidas Dinámicas
DIAGNOSIS DE CANCER DE MAMA
Diagnóstico de Cancer
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
Solvente
Muestra
Solvente
Solvente
Muestra
Procedimiento Experimental
Promediado de las diferentes recogidasSustracción del blanco
Técnica de contraste
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
I/c
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EFECTO DE LA CONCENTRACIÓNSISTEMAS MONODISPERSOS
Un aumento de la concentración inplica una disminución de la I a bajos ángulos
debido a las interacciones entre partículas
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Sistemas no interaccionantes
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
ESPACIO RECIPROCO – ESPACIO REAL
Función de distribución de pares
La Pr muestra la información del espacio Real
La Curva de Scattering muestra la información
del espacio recíproco
Función de Scattering
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
PARTÍCULAS ESFÉRICAS
Presentan un máximo a Dmax/2
PARTÍCULAS CILÍNDRICAS
Presentan un máximo a menores distancias
correspondientes al radio de la sección transversal
PARTÍCULAS DE MÚLTIPLES UNIDADES
Persentan múltiples máximos en función de las
distancias intra_subunidades y entre unidades
FACTOR DE FORMA
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¿PORQUÉ SAXS PARA MACROMOLÉCULAS?
•Posibilidad de obtener parámetros moleculares de forma sencilla:
1- Radio de Giro2- Peso Molecular
3- Volumen
4- Grado de Hidratación
5- Forma
Datos a Baja Resolución
•Posibilidad de construir modelos atómicos de la estructura
Datos a Alta Resolución + ayuda otras técnicas
Grigoryev en 1971 encontró tanto en polipéptidos sintéticos como en naturales que se puede determinar de forma sencilla si se trata de una estructura β o de una hélice α puesto que ambas presentan un máximo característico en las curvas de SAXS.
Helice αEstructura β
ESTRUCTURA SECUNDARIA
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
INFORMACIÓN ESTRUCTURAL EN MOLÉCULAS BIOLÓGICAS
•Metodología como anterior pero con “Residuos” conocidos
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
METODOS ab initio
Métodos de Ensayo-Error
•Se limitaba a definir el contorno de la molécula con formas geométricas
sencillas
• Número pequeño de parámetros
• Datos baja resolución
• Históricamente fue el primer modelo
Stuhrmann, H. B. (1970) Z.Physik. Chem. N.F. 72,177Svergun, D.I. et al. (1996)Acta Crystallogr. A52, 419
Chacón, P. et al. (1998)Biophys. J. 74, 2760Svergun, D.I. (1999)Biophys. J. 76, 2879
•Se genera una esfera de diámetro Dmax
•Genera un código binario:
1 si pertenece a la partícula
0 si pertenece al solvente
•Se rellena de “bolas” de radio r0
•Mediante un método Monte-Carlo (aleatorio) se modifica en código para generar las curvas
•Se puede acotar las soluciones
•Simulando un proceso de annealing donde se incluye un factor de penalización que
asegure una forma compacta y conectada
•Se trata de conocer las coordenadas de estos residuos que ajusten la curva experimental
Svergun, D.I., Petoukhov,M.V. & Koch, M.H.J. (2001)Biophys. J. 80, 2946-2953.
•Cambian criterios de compacidad por criterios de distribución espacial
•Se fija lo conocido y se lanza el proceso de annealing para minimizar las diferencias
•Es de gran utilizar para localizar fragmentos de la molécula que no se han podido determinar por otras técnicas
•Determina formas con huecos en su interior
MODELOS ATÓMICOS
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
Si tenemos información adicional sobre la estructura y buenos datos experimentales podemos evaluar de
forma precisa nuestro modelo estructural
Pero aún así la situación no es fácil puesto que debemos de tener en cuenta:
La estructura própia de la proteina (PDB)
Volumen del solvente excluido de la partícula
Capa de Hidratación
Si no la conocemos entera podemos mediante los fragnemtos de las misma refinar mediante sólido rígido rotaciones y traslaciones de los mismos
para generar la estructura completa
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
Refinement of Multidomain Protein Structures by Combinationof Solution Small-Angle X-ray Scattering and NMR Data
Alexander Grishaev,*,† Justin Wu,‡ Jill Trewhella,§ and Ad Bax*,†Contribution from the Laboratory of Chemical Physics, NIDDK, National Institutes of Health,
Bethesda, Maryland 20892-0520, Department of Biochemistry, The Ohio State UniVersity,Columbus, Ohio 43210, and Department of Chemistry, UniVersity of Utah,
Salt Lake City, Utah 84112-0850Received June 30, 2005; E-mail: [email protected]; [email protected]
Abstract:Determination of the 3D structures of multidomain proteins by solution NMR methods presentsa number of unique challenges related to their larger molecular size and the usual scarcity of constraintsat the interdomain interface, often resulting in a decrease in structural accuracy. In this respect, experimentalinformation from small-angle scattering of X-ray radiation in solution (SAXS) presents a suitable complementto the
NMR data, as it provides an independent constraint on the overall molecular shape. A computationalprocedure is described that allows incorporation of such SAXS data into the mainstream high-resolutionmacromolecular structure refinement. The method is illustrated for a two-domain 177-amino-acid protein,çS crystallin, using an experimental SAXS data set fitted at resolutions from 200 Å to 30 Å. Inclusionof these
data during structure refinement decreases the backbone coordinate root-mean-square differencebetween the derived model and the high-resolution crystal structure of a 54% homologous çB crystallinfrom 1.96 ( 0.07 Å to 1.31 ( 0.04 Å. Combining SAXS data with NMR restraints
can be accomplished ata moderate computational expense and is expected to become useful for multidomain proteins, multimericassemblies, and tight macromolecular complexes.
DRX
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Aplicaciones de la técnica SAXS (Small Angle X-ray Scattering)
Addition of Missing Loops and Domains to Protein Models by X-Ray Solution Scattering
Maxim V. Petoukhov,*† Nigel A. J. Eady,‡ Katherine A. Brown,‡ and Dmitri I. Svergun*§*European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation, D-22603 Hamburg, Germany;
†Physics Department, Moscow StateUniversity, 117234 Moscow, Russia; ‡Department of Biological Sciences, Centre for Molecular
Microbiology and Infection, ImperialCollege of Science, Technology and Medicine, London SW7 2AY, United Kingdom; and §Institute
of Crystallography, Russian Academyof Sciences, 117333 Moscow, Russia
ABSTRACT Inherent flexibility and conformational heterogeneity in proteins can often result in the absence of loops andeven entire domains in structures determined by x-ray crystallographic or NMR methods. X-ray solution scattering offers thepossibility of obtaining complementary information regarding the structures of these disordered protein regions. Methods arepresented for adding missing loops or domains by fixing a known structure and building the unknown regions to fit theexperimental scattering data obtained from the entire particle. Simulated annealing was used to minimize a scoring functioncontaining the discrepancy between the experimental and calculated patterns and the relevant penalty terms. In lowresolutionmodels where interface location between known and unknown parts is not available, a gas of dummy residuesrepresents the missing domain. In high-resolution models where the interface is known, loops or domains are represented asinterconnected chains (or ensembles of residues with spring forces between the C atoms), attached to known position(s) inthe available structure. Native-like folds of missing fragments can be obtained by imposing residue-specific constraints. Aftervalidation in simulated examples, the methods have been applied to add missing loops or domains to several proteins wherepartial structures were available.
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SINCROTÓN LNLS (Campinas, Brasil)
