SISTEMA INMUNE INMUNOGLOBULINAS RECEPTORES, RESPUESTA INMUNE Y LINFOCITO B.
APORTACIONES AL ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE EN ...
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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Facultad de Veterinaria
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
APORTACIONES AL ESTUDIO DE LA RESPUESTA
INMUNE EN HEMOCITOS DE MYTILUS
GALLOPROVINCIALIS LMK.
Memoria presentada por
Mª Asunción Cao Hermida
para optar al grado de Doctor en Biología
Lugo, abril de 2002
D. Juan Ignacio Ramos Martínez, Catedrático de Universidad y D.
Ramiro Barcia Vieitez, Profesor Titular de Universidad del Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela,
INFORMAN:
Que la presente memoria con título: " APORTACIONES AL ESTUDIO DE
LA RESPUESTA INMUNE EN HEMOCITOS DE MYTILUS
GALLOPROVINCIALIS LMK." elaborada por la licenciada en Biología Dña. Mª
Asunción Cao Hermida, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el laboratorio
de Bioquímica de la Facultad de Veterinaria de Lugo, y hallándose concluída,
autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal
correspondiente para optar al grado de Doctor en Biología.
Lugo, abril de 2002.
Fdo: J. Ignacio Ramos Martínez Fdo: Ramiro Barcia Vieitez
Fdo: Mª Asunción Cao Hermida
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
FACULTAD DE VETERINARIA Universidad de Santiago de Compostela
A mis padres
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi gratitud a todas aquellas personas que con su ayuda y apoyo
han contribuído a la realización de este trabajo.
Al profesor Dr. Ramiro Barcia Vieitez porque me ha proporcionado más ayuda y
apoyo del que nadie puede esperar. Además de su ilimitada paciencia, de su buena
voluntad para dejarlo todo y leer cuando necesitaba su opinión, por su constante
dedicación y entrega.
Al profesor Dr. Juan I. Ramos Martínez, por ofrecerme la posibilidad de trabajar
con su grupo de investigación. Por ser una persona llena de ideas, entregada y siempre
dispuesta a ayudar.
Al resto de profesores del departamento por su ayuda y apoyo: Izaskun, José
Antonio, José Luis y Conchita.
A Lucía Medina por su inestimable ayuda.
Al Doctor Jaime Arbeteta, a Ángeles y a Pilar del Departamento de Hematología
del Hospital Xeral-Calde de Lugo, por su colaboración en los estudios de citometría de
flujo.
A los Drs. Antonio Villalba,. José Martínez y a las Dras Mª Jesús Carballal y Mª
Ángeles Freire por su tiempo, amabilidad y por sus sabios consejos.
Al Dr. Félix Camiña por su profesionalidad, apoyo y ánimo.
A todos los que trabajaron durante este tiempo en el Departamento de Bioquímica
de Lugo, por compartir experiencias e ilusiones.
A mis padres, por su constante dedicación, por su apoyo incondicional y por estar
siempre a mi lado.
A mi abuelo, por las largas charlas mantenidas durante este trabajo.
A mi familia, por su ayuda y comprensión.
A mis amigos, por su ayuda, apoyo y paciencia especialmente a Majo y a Bruno.
A Miguel, por compartir alegrías, inquietudes, ilusiones y una vida llena de
sorpresas. Algún día......se acerca.
ÍNDICE
ÍNDICE pág
1.-INTRODUCCIÓN 1
1.1.-Inmunidad natural y adquirida. 2
1.1.1.- La respuesta inmune. 4
1.1.2.- Relaciones entre la inmunidad innata y la adquirida: receptores
Toll. 6
1.1.2.1.- Características y funcionalidad del receptor Toll en Drosophila. 7
1.1.2.2.- Identificación de receptores Toll en mamíferos. 8
1.1.2.3.- Lipopolisacáridos (LPS) y receptores Toll. 9
1.2.- Células y tejidos del sistema inmune de invertebrados. 11
1.2.1.- Estructura y clasificación de las células sanguíneas/
coelomocitos. 11
1.2.2.- Células fijas. 14
1.2.3.- Defensas humorales. 15
1.3.- Sistema de reconocimiento no-clonal. Inmunidad innata. 20
1.3.1.- Mecanismos de reconocimiento inmune innato. 21
1.3.2.- Receptores del sistema inmune innato. 22
1.4.- Citoquinas en la respuesta inmune. 24
1.4.1.- Estructura del receptor de citoquinas y transducción de
señales 28
1.5.- Sistema IL-2/IL-2R. 32
1.5.1.- Mecanismos moleculares de transmisión de señales
mediadas por IL-2. 35
1.6.- Transmisión de señales mediadas por diferentes efectores. 38
1.6.1.- PKC. 38
1.6.2.- PKA. 40
1.6.3.- Lipopolisacáridos bacterianos (LPS). 42
1.6.4.- Corticotropinas. 47
1.6.5.- Factores de crecimiento. 50
1.7.- Células inmunitarias en el mejillón. 55
1.7.1.- La proteína quinasa C en mejillón. 57
1.7.2.- La proteína quinasa A en mejillón. 58
1.7.3.- La cadena ? del receptor de IL-2 en mejillón 59
1.8.- Presencia de moléculas similares a las citoquinas en hemocitos
de moluscos. 59
2.- OBJETIVOS 63
3.- MATERIAL Y MÉTODOS 65
3.1.- Material biológico. 65
3.2.- Reactivos 65
3.3.- Aparatos 66
3.4.- Procedimientos generales. 67
3.5.- Extracción de hemolinfa y obtención de hemocitos. 68
3.6.- Tinción de hemocitos de mejillón. 69
3.7.- Mantenimiento de hemocitos en cultivo. 69
3.8.- Citometría de flujo. 70
3.8.1.- Preparación de muestras de hemocitos. 70
3.8.2.- Análisis de las muestras por citometría de flujo (FACS). 71
3.9.- Western-blotting. 73
3.9.1.- Preparación del tampón de lisis celular. 73
3.9.2.- Tampón de extracción de proteínas de membranas. 74
3.9.3.- Preparaciones de lisados de hemocitos. 74
3.9.3.1.- Cromatografía de afinidad. 74
3.9.4.- Electroforesis para proteínas en geles de poliacrilamida-dodecil
sulfato sódico (SDS-PAGE). 75
3.9.5.- Inmunodetección. 78
3.10.- Detección de catecolaminas. 79
3.11.- Análisis estadístico. 82
4.- RESULTADOS 83
4.1.- Estudio de poblaciones celulares en hemolinfa de mejillón. 83
4.2.- Cultivo de hemocitos de M. galloprovincialis. 84
4.3.-Estudio del efecto de diversos efectores en hemocitos en
diferentes épocas del año. 87
4.3.1.- LPS. 87
4.3.2.- CRF. 93
4.3.3.- ACTH. 97
4.3.4.- ACTH 1-24. 101
4.3.5.-PDGF. 106
4.3.6.- TGF-? 1. 112
4.3.7.- EGF. 117
4.3.8.- IL-2. 120
5.- DISCUSIÓN 126
6.- CONCLUSIONES 143
7.- BIBLIOGRAFÍA 144
8.- ABREVIATURAS 170
INTRODUCCIÓN
1.-INTRODUCCIÓN
Las células y moléculas responsables de la inmunidad constituyen el sistema
inmunitario, y su respuesta colectiva y coordinada frente a la introducción de sustancias
extrañas es la respuesta inmunitaria. Ahora sabemos que muchos de los mecanismos de
resistencia a las infecciones están también implicados en la respuesta individual a
sustancias extrañas no infecciosas. Además, los mecanismos que normalmente protegen a
los individuos de las infecciones y eliminan a las sustancias más extrañas, son por sí
mismos capaces de lesionar los tejidos y producir enfermedad en algunas situaciones. Por
lo tanto, una definición más completa y moderna de inmunidad es la de una reacción frente
a sustancias extrañas, incluídos los microorganismos, y macromoléculas como las
proteínas y los polisacáridos, sin implicar a la consecuencia fisiológica o patológica de tal
reacción. La inmunología es el estudio de la inmunidad en este sentido amplio y de los
acontecimientos celulares y moleculares que se producen después de que un organismo se
encuentra con microorganismos u otras moléculas extrañas (Abbas, A.K. et al, 1995).
El sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y
humorales que interaccionan para proteger al organismo de potenciales patógenos,
parásitos o células neoplásicas. El componente celular de la inmunidad en los
invertebrados está mediado por células sanguíneas (hemocitos) que participan en varios
mecanismos internos de defensa (Ratcliffe, N.A. et al., 1985; Smith,V.J.,1991).
Los invertebrados no poseen un mecanismo de defensa inducible, con el alto grado
de especificidad y memoria como el que presenta la respuesta inmune de los vertebrados
(Klein, J., 1989; Marchalonis, J.J. y Schluter, S.F., 1990), sin embargo son capaces de
reconocer y desarrollar reacciones citotóxicas contra células extrañas (Sminia, T. y Van der
Knaap, W.P.W., 1986; Cooper, E.L. et al., 1992; Renwrantz, L., 1990).
1.1.- INMUNIDAD NATURAL Y ADQUIRIDA.
Los individuos sanos se protegen a sí mismos contra los microorganismos por
medio de mecanismos muy diversos. Estos incluyen las barreras físicas, las células
fagocíticas y los eosinófilos de la sangre y de los tejidos, un tipo de linfocitos llamados
células agresoras naturales (NK), y varias moléculas transportadoras en sangre, los cuales
participan en la defensa del individuo frente a un ambiente potencialmente hostil. Todos
estos mecanismos de defensa están presentes antes de la exposición a microorganismos
infecciosos u otras moléculas extrañas, no aumentan por tales exposiciones y no
discriminan entre la mayor parte de las sustancias extrañas. Estos son los componentes de
la inmunidad natural (también llamada nativa o innata). Otros mecanismos de defensa
son inducidos o estimulados por la exposición a sustancias extrañas, son exquisitamente
específicos para distintas macromoléculas y aumentan en magnitud y capacidad defensiva
con cada exposición sucesiva a una macromolécula en particular. Estos mecanismos
constituyen la inmunidad adquirida o específica (Tabla 1). Las sustancias extrañas que
inducen una inmunidad específica se llaman antígenos (Abbas, A.K. et al ,1995).
NATURAL
ESPECÍFICA
BARRERAS FISICOQUÍMICAS MOLÉCULAS CIRCULANTES CÉLULAS
Piel, mucosas Complemento Fagocitos (macrófagos, neutrófilos) células agresoras naturales
Sistemas inmunitarios cutáneo y mucoso; anticuerpos en las secreciones mucosas Anticuerpos Linfocitos
MEDIADORES SOLUBLES ACTIVOS EN OTRAS CÉLULAS
Citoquinas derivadas de macrófagos, es decir, interferones ? y ? , factor de necrosis tumoral
Citoquinas derivadas de linfocitos, esto es, interferón ?
Actualmente, hay un resurgimiento del interés por la inmunidad natural, la cual se
considera que es innata y no adaptativa, en contraste con la respuesta inducida, adquirida, y
adaptativa, que caracteriza al sistema inmune específico (Hubbert, F. et al., 1997). La
inmunidad innata ha sido considerada como una entidad independiente, pero coincide en
parte, con una inmunidad adaptativa continua. Sin embargo se cree que la inmunidad
innata podría tener un papel suplementario en determinar qué antígenos responden al
sistema inmunitario adquirido y la naturaleza de la respuesta. La inmunidad de vertebrados
es un tipo especializado de inflamación generada contra agentes infecciosos, que se
desarrolla para combatir patógenos intracelulares que no pueden ser eliminados con
respuestas inmunes no específicas.
Tabla 1.- Características de la inmunidad natural y específica (adquirida) (tomado de Abbas, A.K. et al., 1995).
Hay al menos dos importantes razones para analizar el sistema inmune innato de
invertebrados; primera, podemos aprender más de la expansión y el desarrollo de la
evolución de la inmunidad de los invertebrados; segunda, porque los productos humorales
derivados de estos organismos son generalmente potentes agentes antibacterianos, que nos
permitirán un mejor entendimiento de los mecanismos de protección natural (Hubbert, F. et
al., 1997).
1.1.1.- LA RESPUESTA INMUNE
La inmunidad innata es filogenéticamente más antigua y ya está presente en
organismos multicelulares poco evolucionados, mientras que la adquirida se ha
desarrollado hace 400 millones de años y se encuentra en peces cartilaginosos y óseos,
anfibios, reptiles, pájaros y mamíferos (Thompson, C.B., 1995). La diferencia esencial
entre los dos sistemas es el medio por el cual reconocen microorganismos (Fearon, D.T. y
Locksley. R.M., 1996 ).
Los sistemas inmunes innatos utilizan proteínas codificadas en líneas de gérmenes
para identificar sustancias potencialmente nocivas. Estas proteínas son receptores de
superficie celular que generalmente reconocen estructuras carbohidratadas (Stahl, P.D.,
1995). Los macrófagos también tienen un receptor para lipopolisacáridos (LPS). Este
efector común en membranas externas de bacterias Gram-negativas indica la presencia de
infección y estimula la síntesis de productos químicos y citoquinas tales como
Interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-12 y factor de necrosis tumoral (TNF) que inducen una
respuesta en fase aguda, un aumento de funciones antimicrobiales de macrófagos y otras
células y promueven el desarrollo y crecimiento de células T Cooperadoras (Ulevitch, R.J.
y Tobias, P.S., 1995).
La respuesta inmunitaria específica se inicia con el reconocimiento de los antígenos
extraños por linfocitos específicos, que proliferan y se diferencian a células efectoras
cuya función es eliminar el antígeno. La fase efectora de la inmunidad específica precisa la
participación de varios mecanismos de defensa, incluidos el sistema de complemento, los
fagocitos, las células inflamatorias y las citoquinas, que son operativas en la inmunidad
natural. La respuesta inmunitaria específica amplifica los mecanismos de la inmunidad
natural y potencia su función, sobre todo tras exposiciones repetidas al mismo antígeno
extraño. El sistema inmunitario posee varias características fundamentales, éstas son: la
especificidad, la diversidad, la memoria, la autoeliminación, y la capacidad para
discriminar entre lo propio y lo extraño (Abbas, A.K., et al., 1995).
Los principales constituyentes celulares del sistema inmunitario son los linfocitos,
los fagocitos mononucleares y las células accesorias relacionadas. Los linfocitos son las
únicas células inmunocompetentes capaces de reconocer de forma específica a los
antígenos. Son morfológicamente homogéneos aunque constan de diferentes subgrupos
que realizan diferentes funciones, y se les puede distinguir fenotípicamente. Los fagocitos
mononucleares son críticos para la defensa del huésped en ausencia de inmunidad
específica y se han convertido en participantes claves en las fases de reconocimiento,
activación y efectora de las respuestas inmunitarias específicas. Los linfocitos se originan
en la médula ósea, maduran en diferentes órganos generadores y se localizan en tejidos
linfoides periféricos anatómicamente definidos. La organización estructural de los tejidos
linfoideos optimiza el contacto íntimo y la interacciones entre las poblaciones celulares que
cooperan en la generación de las respuestas inmunitarias (Abbas, A. K. et al., 1995).
El sistema del complemento es el principal efector soluble de la inmunidad innata y
se activa cuando interacciona con partículas ricas en carbohidratos que carecen de ácido
siálico (Fearon, D.T. y Austen, K.F., 1980). De este modo la inmunidad innata ha dividido
las sustancias en inocuas y potencialmente nocivas dependiendo de su contenido en
carbohidratos. El reconocimiento de estos compuestos pudo haber evolucionado porque
estos constituyentes comunes de las paredes celulares microbiales tienen funciones, y
estructuras que son distintas de los carbohidratos de la superficie celular de eucariotas (Mc
Blane, J.F. et al., 1995).
Los receptores de los linfocitos B reconocen conformaciones de antígenos, que
pueden ser proteínas, carbohidratos, ó simplemente grupos químicos, mientras que la
mayoría de los receptores de los linfocitos T reconocen sólo péptidos, los cuales derivan de
antígenos proteicos que se unen a proteínas de la superficie celular denominados complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I (Engelhard, V.H., 1994 ) y clase II
(Cresswel, P., 1994).
1.1.2.- RELACIONES ENTRE LA INMUNIDAD INNATA Y LA
ADQUIRIDA: RECEPTORES TOLL
Los mecanismos de defensa inmune constan de dos tipos de respuestas: innata y
adaptativa. Los vertebrados poseen linfocitos B y T como un sistema inmunoadaptativo
contra la infección de microorganismos, que producen respectivamente inmunoglobulinas
y receptores de células T. La inmunidad innata juega un papel principal en la fase temprana
de los mecanismos de defensa y se encuentra presente tanto en vertebrados como en
invertebrados, además está mediada por macrófagos y células dendríticas (DCs), que
aunque carecen de receptores similares a los de las células B y T reconocen antígenos
microbiales.
Actualmente se ha demostrado que un conjunto de moléculas de superficie, al cual
pertenece la familia de receptores Toll (TRL), funcionan como modelo de receptores de
reconocimiento de antígenos (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).
1.1.2.1.- Características y funcionalidad del receptor Toll en Drosophila
La proteína Toll fue originalmente identificada en Drosophila como una proteína
transmembrana tipo I que juega un papel crítico durante el desarrollo embrionario
(Hashimoto, C. et al., 1998, Belvin M.P. y Anderson, K.V., 1996). Posee dos dominios
intracelulares que contiene regiones repetitivas ricas en leucina (LRR) y otro dominio que
presenta cierta homología con la familia de receptores de IL-1 presentes en mamíferos (IL-
1R) (Gay, N.J. y Keith, F.J., 1991; O’Neill, L.A. y Greene, C., 1998 ). Toll se asocia con
una proteína adaptadora citoplasmática denominada Tube y como consecuencia se produce
la activación de Pelle, una serina-treonina-quinasa (figura 1). A continuación tiene lugar la
degradación de Cactus, seguido de la activación de un factor de transcripción denominado
Dorsal. Como se observa en la figura 1 existen similitudes funcionales y estructurales entre
los mecanismos de señalización mediados por los receptores Toll de Drosophila y los IL-
1R de mamíferos (O`Neil, L.A. y Greene, C., 1998). Los factores de señalización de
Drosophila - Tube, Pelle, Cactus y Dorsal - presentan cierta homología con los factores de
mamíferos My D88, IRAK (receptor de IL-1 asociado a kinasas), I-?B y el factor nuclear
NF-?B, respectivamente (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).
1.1.2.2.- Identificación de receptores Toll en mamíferos
Inicialmente se consideró que IL-1R era homólogo al receptor Toll porque la región
citoplasmática del receptor de IL-1 es similar a la de Toll. No obstante, la región
extracelular de IL-1R tiene tres dominios similares a los que se encuentran en los
receptores para inmunoglobulinas pero carece de dominios LRR, sugiriendo que pueden
existir moléculas homólogas a Toll en mamíferos. Esto fue revelado por el grupo de
Janeway en 1997 (Medzhitov, R. et al.,1997). Este grupo de investigación fue el primero
en identificar esta homología con el receptor Toll en humanos, dicho receptor presenta
MyD88
Figura 1.- Similitud entre los caminos de señalización mediados por los receptores Toll de Drosophila y los IL-R de mamíferos (tomado de Kaisho, T. y Akira, S., 2000).
IRAK
I?B
NF-?B (p50/ReIA)
DROSOPHILA MAMÍFEROS
IL-1
IL-R
Pelle
Cactus
Dorsal
Toll
Tube
Spatzle
dominios LRR intracelulares homólogos. Posteriormente se encontraron cinco moléculas
más con estructuras similares (Rack, F.L. et al., 1998, Chandhary, P.M. et al., 1998;
Takenchi, O. et al., 1999) que se denominaron Toll de Drosophila.
El primer receptor Toll humano se denomina TRL4 y la sobre-expresión de este
receptor en líneas celulares permite la producción de citoquinas tales como IL-1, IL-6 e IL-
8 (Medzhitov, R. et al., 1997). Esto es crítico en el establecimiento de la respuesta inmune,
además la familia de receptores Toll en mamíferos puede estar implicada en mecanismos
de defensa, especialmente en la inmunidad innata, la cual puede potenciar
la inmunidad adaptativa (Kaisho, T. y Akira, S., 2000).
1.1.2.3.- Lipopolisacáridos (LPS) y receptores Toll
Los lipopolisacáridos (LPS) son componentes integrales de la membrana externa de
las bacterias gram-negativas. El LPS (figura 2) es un polisacárido hidrofílico que contiene
-
-
Kdo
Kdo P
P
Kdo
GlcN
GlcN
Unidad
POLISACÁRIDO
REGIÓN CENTRAL
FOSFOLÍPIDO
LÍPIDO A CADENA ESPECÍFICA
Hep
Hep
Hep P
P
NH3+
P-
-
-
Figura 2.- Estructura general del LPS de bacterias Gram-negativas. Abreviaturas de residuos de monosacáridos: GlcN, glucosamina; Kdo, ácido 2-keto-3-deoxioctulosónico; Hep, D-glicero-manno-heptosa (tomado de Alexander, C. y Rietschel, E., 2001).
una porción hidrofóbica (lípido A) altamente conservada.
Una vez que el sistema de complemento o los fagocitos llevan a cabo la lisis
bacteriana, el lípido A se pone al descubierto y da lugar a una gran variedad de respuestas
biológicas. Por ejemplo, los macrófagos producen citoquinas inflamatorias tales como:
factor de necrosis tumoral ? (TNF-? ), IL-1 e IL-6 y sustancias efectoras inflamatorias tales
como leucotrienos y óxido nítrico (Morrison, D. C. et al., 1979; Ulevitch, R.J. y Tobias,
P.S., 1995; Medzhitov, R. y Janeway, C.A., 1997a). Además el LPS puede aumentar la
expresión de antígenos de superficie tales como el complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) clase II, CD 80 y CD 86. Estas funciones son importantes para el establecimiento
de la inmunidad innata contra microorganismos. El LPS liberado al flujo sanguíneo es
capturado por la proteína LBP (proteína que se une al LPS). Luego el complejo LPS-LBP
interacciona con CD 14 en la superficie de macrófagos y monocitos. Aunque la unión de
CD 14 con LPS puede ocurrir en ausencia de LBP, en su presencia la unión se ve
facilitada, además a pesar de que las células endoteliales y fibroblastos carecen de CD 14,
pueden utilizar su forma soluble para aumentar la unión con LPS. Después de la
interacción del LPS, LBP y CD 14 se activa el camino de transducción de la señal, que
incluye el factor de transcripción NF-?B y la cascada de quinasas MAP (figura 3) (Haziot,
A. et al., 1996).
1.2.- CÉLULAS Y TEJIDOS DEL SISTEMA INMUNE DE
INVERTEBRADOS
1.2.1.- ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE LAS CÉLULAS
SANGUÍNEAS/COELOMOCITOS
Hay una gran variedad de tipos de células sanguíneas en circulación en los
invertebrados (Ratcliffe, N.A. y Rowley, A.F., 1979; 1981), estas células desarrollan varias
funciones, incluyendo transporte, almacenamiento, síntesis, reparación de heridas y
pigmentación, así como la defensa del organismo. De acuerdo con su papel biológico
CD14
MAPK
LPS
TLR4
MEMBRANA
MyD88
IRAK
MD-2 LBP
Figura 3.- Reconocimiento del LPS en la membrana de fagocitos y activación del camino de transducción de la señal (tomado de Aderem, A. y Ulevitch, R.J. 2000).
presentan las apropiadas especializaciones estructurales, bioquímicas y de
comportamiento. Los crustáceos presentan una relativamente simple célula sanguínea (o
más propiamente hemocito), lo cual facilita mucho el análisis de sus características
bioquímicas y funcionales (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983).
Las células pueden ser separadas convenientemente por centrifugación en
gradientes de densidad realizados con Percoll (Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1933; Smith,
V.J. y Söderhäll, K. 1983; 1991). El análisis funcional y bioquímico de los hemocitos
aislados así, sugiere que hay fundamentalmente tres tipos de células en este grupo: las
células hialinas, las células semigranulares y las células granulares (figura 4) (Söderhäll, K.
y Smith, V.J., 1983; 1986a; Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; 1991).
CÉLULAS HIALINAS: carecen de grandes gránulos distintivos y presentan una gran actividad fagocítica. TIPOS DE HEMOCITOS CÉLULAS SEMIGRANULARES contienen grandes gránulos intracelu- lares que pueden descargarse cuando la célula se expone a materiales reco- CÉLULAS GRANULARES nocidos como no propios. Figura 4.- Tipos de hemocitos
Las células hialinas (hialinocitos) carecen de grandes gránulos distintivos. “In
vitro” se anclan y se extienden rápidamente sobre la superficie del cristal, y además
presentan una gran actividad fagocítica (Bauchau, A.G., 1981; Smith, V.J. y Söderhäll, K.,
1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b).
Las células semigranulares y granulares contienen grandes gránulos intracelulares
que pueden descargarse cuando la célula se expone a materiales reconocidos como no
propios (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b). Las células
semigranulares contienen menos gránulos que las células granulares, y quizás como una
consecuencia de esto, se unen y se extienden sobre la superficie del cristal más
rápidamente (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983).
Las células semigranulares (pero no las granulares) pueden presentar actividad
fagocitaria (Smith, V.J. y Söderhäll, K., 1983; Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1986b).
Una importante característica de las células granulares y semigranulares de
crustáceos es la presencia dentro de los gránulos de profenoloxidasa, la enzima responsable
de la síntesis de melanina (Söderhäll, K y Smith, V.J., 1983).
No está claro si los hemocitos en los crustáceos derivan de una única célula
progenitora común, y constituyen una serie de desarrollo en la que las células incrementan
su grado de granulación, a medida que van madurando. La amplia variedad en su número y
en el grado de granulación, comúnmente apreciada en las células semigranulares, ha sido
tomada a veces como soporte de esa hipótesis (Jhonston, M.A. et al., 1973; Bauchau, A.G.,
1981). No obstante, la confirmación “in vitro” de esta idea es difícil por la falta de técnicas
de mantenimiento en cultivo a largo plazo de las líneas celulares sanguíneas de crustáceos.
No se han detectado hemocitos en división celular en circulación, y la localización del
tejido hematopoyético es conocida en pocas especies (Bauchau, A.G., 1981; Ratcliffe,
N.A. et al., 1985). En los crustáceos la proporción de células hialinas, semigranulares y
granulares varía con el grupo taxonómico del organismo.
En los Brachyura (cangrejos auténticos) por ejemplo; los hialinocitos y las células
granulares tienden a predominar, mientras que en cangrejos de agua dulce, langostas y
otros miembros de los Macrura, los tipos celulares principales son generalmente las células
semigranulares y granulares (Söderhäll, K. y Smith, V.J., 1983; Smith, V.J. y Söderhäll,
K., 1983; 1991).
No se conoce la razón por la que se producen esas diferencias en la distribución de
los hemocitos en los crustáceos, pero no parece influir en el tipo de reacciones de defensa
desarrolladas por estos animales. Es importante subrayar que a diferencia de los
vertebrados, los invertebrados no tienen linfocitos T y B especializados, y no expresan
inmunoglobulinas como parte de sus mecanismos de defensa. En cambio, la inmunidad en
invertebrados se basa en reacciones no específicas de la sangre o fluidos corporales, así
como en estrategias tales como fagocitosis, encapsulación y liberación de factores
antimicrobianos (Smith,V.J., 1991).
1.2.2.- CÉLULAS FIJAS
La mayoría de los invertebrados tienen una variedad de células fijas que pueden
desempeñar alguna función en el mecanismo de defensa humoral y/o celular. En esas
células se incluyen las células cloragógenas de los anélidos (Cooper, E.L. y Stein, E.A.,
1981), las células reticulares, podocitos, porocitos y células de la cubierta sinusal de los
gasterópodos (Buchholz, K. et al., 1971; Boer, H.H. y Sminia, T., 1976; Sminia, T., 1977),
nefrocitos de los crustáceos (Doughtie, D.G. y Rao, K.R., 1981; Ratcliffe, N.A. et al.,
1982), células pericárdicas de insectos (Crossley, A.C., 1972; Ratcliffe, N.A. et al., 1982)
y nefrocitos de los tunicados (Millar, R.H., 1953).
Los nefrocitos de crustáceos e insectos están implicados en el secuestro de material
particulado pequeño y soluble de la sangre (Crossley, A.C., 1972) lo cual es consistente
con el hecho de que esas células estén implicadas en el proceso de excreción (Ratcliffe,
N.A. et al., 1985). Los porocitos de los gasterópodos también se encargan de la producción
de hemocianina (Boer, N.H. y Sminia, T., 1976; Sminia, T., 1977).
1.2.3.- DEFENSAS HUMORALES
El suero de los invertebrados, aunque carece de inmunoglobulinas, tiene una serie
de factores que desarrollan actividades líticas, aglutinantes y antimicrobianas frente a
diferentes agentes biológicos. Esos factores pueden estar presentes de forma natural y/o
formarse después de una estimulación antigénica, pero generalmente no muestran las
propiedades anamnésicas de las inmunoglobulinas. Estas sustancias se pueden clasificar en
cuatro grandes grupos: lisinas, aglutininas, sustancias similares a linfoquinas y factores
antimicrobianos; aunque realmente un factor químico determinado puede desarrollar varias
funciones.
HEMOLISINAS
En los vertebrados, la lisis de los parásitos microscópicos y macroscópicos es
llevada a cabo inicialmente por los componentes del sistema del complemento. Hasta hace
unos años, este sistema se había considerado ausente en la mayoría de los invertebrados,
pero trabajos de Bertheussen, K. (1983) demostraron la existencia de un sistema similar al
complemento, termolábil y calciodependiente en el sistema circulatorio del erizo de mar
Strongylocentrotus droebachiensis. Desgraciadamente, se conoce muy poco sobre la
naturaleza molecular de este sistema en invertebrados.
Las investigaciones sobre el sistema lítico de invertebrados se han concentrado
pricipalmente en su capacidad de lisar eritrocitos de vertebrados in vitro. Las hemolisinas
se han encontrado en muchos invertebrados, entre los que se incluyen moluscos (Anderson,
R.S., 1981; Wittke, M. y Renwrantz, L., 1984), anélidos (Roch, P., 1979; Parrinello, N. y
Rindone, D., 1981; Roch, P. et al., 1981; Dales, R.P., 1982), sipuncúlidos (Weinheimer,
P.F. et al., 1970), crustáceos (Cenini, P., 1983) y equinodermos (Parrinello, N. et al.,
1979). En general, las hemolisinas de los invertebrados son proteínas termolábiles, que se
inactivan a 56?C, son sensibles a las enzimas proteolíticas, pueden ser inhibidas por
agentes quelantes como el EDTA y requieren cationes divalentes (principalmente calcio)
para desarrollar su actividad óptima.
Varios artículos referidos a diferentes invertebrados muestran que tales factores son
inducibles, pero la especificidad y longevidad de sus reacciones son extremadamente
limitadas (Anderson, R.S., 1981).
Chateaureynaud-Duprat, P. e Izoard, F. (1977) han sugerido que en la lombriz
Eisenia foetida, los factores hemolíticos son sintetizados y liberados por las células
cloragógenas, mientras que en Mytilus edulis tales factores son producidos por los
hemocitos (Wittke, M. y Renwrantz, L., 1984). En relación con esta actividad lítica, se han
detectado en invertebrados componentes del sistema de complemento. Este sistema es un
grupo de proteínas solubles que se asocian a componentes de la superficie celular. Hay tres
caminos para la activación del complemento: el camino clásico, el camino alternativo y el
camino de las lectinas. Estos dos últimos caminos no están implicados en la unión de los
componentes del complemento al complejo antígeno-anticuerpo y son los que
posiblemente se encuentran en invertebrados (Du Pasquier, L., 2001).
AGLUTININAS
Muchos invertebrados poseen sustancias humorales capaces de aglutinar partículas
extrañas como pueden ser bacterias (Bretting, H. et al., 1978, Rostan-Abadi, H. y Pistole,
G.H., 1979, 1982; Pistole, T.G., 1982), protozoos (Pereira, M.E. et al., 1981; Ingram, G.A.
et al., 1983), eritrocitos y leucocitos de vertebrados, esperma (Ratcliffe, N.A. et al., 1985),
linfocitos (Cohen, E., 1980) y metazoos parásitos (Stein, P.C. y Basch, P.F., 1979; Lackie,
A.M., 1981).
Las aglutininas no se encuentran únicamente en invertebrados, por ejemplo, las hay
también en plantas y en el suero de los vertebrados (Harisdangkul, V. et al., 1972; Gold,
E.R. y Balding, P., 1975), donde operan juntamente con las inmunoglobulinas. Parece por
tanto razonable concluir que tales sustancias han podido evolucionar y pueden cumplir
muchas funciones diferentes, algunas de las cuales presumiblemente no son
inmunológicas.
SUSTANCIAS SIMILARES A LINFOQUINAS
Las linfoquinas fueron definidas por Dumonde, D.C. et al., (1982) como no-
anticuerpos proteicos generados por la activación de los linfocitos, que actúan como
mediadores intercelulares de la respuesta inmunológica. Esta definición orientada
únicamente hacia los vertebrados, podría dar razones a los puristas para negar la
posibilidad de que sustancias similares se encuentren en los invertebrados, donde no se ha
demostrado aún concluyentemente la existencia de linfocitos. Diferentes grupos de
investigación han comentado la presencia de factores similares a las linfoquinas en
invertebrados (Mohring, W. y Schittek, D., 1979; Leclerc, M. et al., 1981) y en este
contexto el término es utilizado para nombrar a factores que median procesos inmunes.
Uno de los más completos y convincentes estudios fue llevado a cabo por Robert
Prendergast y su grupo, trabajando con la estrella de mar Asterias forbesi (Prendergast,
R.A. y Suzuki, M., 1970; Willenborg, D.O. y Prendergast, R.A., 1974; Prendergast, R.A. et
al., 1974; 1983), ellos demostraron primero la existencia de una sustancia proteica aislada
a partir de coelomocitos de A. forbesi, a la que nombraron como factor de la estrella de mar
(Sea Star Factor, SSF), la cual, exhibió muchas propiedades características de las
linfoquinas de vertebrados, como por ejemplo la inhibición de la migración y la activación
de los macrófagos.
En estudios posteriores, el SSF fue aislado y caracterizado parcialmente; se vió que
era una proteína básica de 39.000 daltons, constituida por un par de cadenas (pesada y
ligera). Más tarde, Prendergast, R.A. et al., (1983) mostraron que tanto el SSF como las
linfoquinas liberadas por las células T actúan de forma similar cuando se aplican a la
estrella de mar, provocando un incremento en la adherencia y en la agregación de los
coelomocitos; sin embargo queda pendiente una cuestión, y ésta es la siguiente ¿cómo
actúa el SSF en equinodermos? y ¿verdaderamente es homólogo en estructura y función a
las linfoquinas de vertebrados?.
FACTORES ANTIMICROBIANOS
Varias conclusiones pueden ser extraídas del trabajo realizado hasta el momento
sobre estos factores:
1.- Pueden matar/lisar bacterias (bactericidas/bacteriolíticos) o pueden actuar como
desinfectantes generales inhibiendo el crecimiento de las bacterias (bacteriostáticos).
2.- Las bacterias patógenas tienen tendencia a ser resistentes a los factores
antimicrobianos producidos por sus huéspedes normales.
3.- Investigaciones realizadas sobre los factores antimicrobianos encontrados en los
invertebrados marinos, han mostrado que cuando se incuban bacterias tanto de origen
terrestre como de origen marino con estos factores, las bacterias terrestres muestran
normalmente una mayor resistencia (Johnson, P.T. y Chapman, F.A., 1970). Además, la
mayoría de las bacterias marinas son Gram-negativas y los factores antimicrobianos de los
invertebrados marinos presentan muy baja o ninguna actividad frente a las formas Gram-
positivas.
4.- Aunque los factores antimicrobianos son producidos probablemente por los
hemocitos/coelomocitos, puede haber implicados otros tipos celulares. Por ejemplo en la
langosta Homarus americanus, el hepatopáncreas produce un potente factor
antimicrobiano (Mori, K. y Stewart, J.E., 1978).
5.- No todo el mundo está de acuerdo con la “relativa” efectividad de los
mecanismos humorales frente a los celulares en la eliminación de bacterias y otros
microorganismos de la circulación.
6.- Hay una falta general de información sobre muchos aspectos de los factores
antibacterianos. Por ejemplo, ¿cuáles son los mecanismos mediante los que esos agentes
matan?, y también ¿cómo varía su estructura química dentro de los invertebrados?.
Entre estos factores antimicrobianos cabría señalar las didemninas encontradas en
los tunicados (Rinehart, K. et al., 1981), compuestos que inhiben el crecimiento de ARN y
ADN virus. También se ha encontrado un factor antitripanosomal en la hemolinfa de
Glossina spp (Croft, S.L. et al., 1982; East, J.S. et al., 1983; Ratcliffe, N.A. et al., 1985).
1.3.- SISTEMA DE RECONOCIMIENTO NO-CLONAL.
INMUNIDAD INNATA
El sistema inmune ha evolucionado por la presión selectiva impuesta por los
microorganismos infecciosos; como resultado de ello, todos los organismos multicelulares
han desarrollado varios mecanismos de defensa que tienen la capacidad de ser disparados
por la infección y que protegen al organismo destruyendo los microbios invasores y
neutralizando sus factores de virulencia. Ese filogenéticamente antiguo mecanismo de
defensa, también conocido como sistema inmune innato, utiliza receptores codificados
frente a líneas de gérmenes para el reconocimiento de microbios patógenos. Este hecho,
diferencia el sistema inmune innato del otro componente de la inmunidad, el sistema
inmune adaptado, presente sólo en vertebrados.
La inmunidad adaptada se basa en la presencia de receptores generados por
mecanismos somáticos, durante la ontogenia de cada organismo individual. Estos
mecanismos generan un repertorio diverso de receptores antigénicos con especificidades
aleatorias, los cuales se encuentran distribuidos clonalmente sobre dos tipos de linfocitos:
células T y células B. Consecuentemente, la especificidad de los receptores expresados
sobre cada linfocito no está predeterminada, y tampoco esta respuesta puede ser inducida
en linfocitos antes de la unión del antígeno a sus receptores. Sin embargo, la inducción de
una respuesta inmune es sólo apropiada si el antígeno reconocido se deriva o pertenece a
un organismo patógeno. La activación de linfocitos específicos por autoantígenos, o por
inocuos antígenos ambientales persistentes, puede provocar la aparición de problemas
autoinmunitarios y de reacciones de hipersensibilidad respectivamente. Además, la
protección frente a diferentes grupos de patógenos puede requerir la inducción de bastantes
tipos de respuestas diferentes. Por otra parte, la activación de efectores inadecuados que no
proporcionan protección contra los agentes patógenos, a menudo conduce al desarrollo de
inmunopatologías.
Por lo tanto, la respuesta inmune adaptada requiere señales que proporcionen
información sobre el origen del antígeno y el tipo de respuesta que debe ser inducida.
Evidencias acumuladas en estos años, sugieren que esas señales son proporcionadas por el
sistema inmune innato (Janeway, C.A., 1989, Fearon, D.T. y Locksley, R.M., 1996;
Medzhitov, R. y Janeway, C.A., 1997b).
1.3.1.-MECANISMOS DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO
Las estructuras moleculares que son esenciales para la supervivencia de los
microbios, no están sujetas a variabilidad pues las mutaciones que afectan a esas
estructuras son letales para los microbios. La conservación de esas estructuras moleculares
implica que sean producidas por grandes grupos de patógenos. Por ejemplo, la estructura
general del lipopolisacárido (LPS) está presente en todas las bacterias Gram-negativas.
Este ejemplo ilustra otro hecho del reconocimiento inmune innato, los blancos de
reconocimiento están representados por patrones moleculares llamados PAMPs (por
Pathogen-Associated Molecular Patterns) más que por estructuras particulares (Janeway,
C.A., 1989).
Los organismos hospedadores han desarrollado un grupo de receptores que pueden
especificamente reconocer PAMPs, a los que se conoce por PRRs (de Pattern Recognition
Receptors). Esta estrategia evolutiva del huésped, previene la generación de microbios
mutantes que puedan escapar, y al mismo tiempo permite, con un número limitado de
receptores codificados, reconocer una gran variedad de estructuras moleculares asociadas
con patógenos (Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A., 1997b).
Otro factor que puede haber jugado un importante papel durante la evolución del
reconocimiento inmune innato, está relacionado con el efecto del reconocimiento, esto es,
la destrucción del blanco.
Posiblemente las estructuras seleccionadas para el reconocimiento inmune deberían
ser muy diferentes de los auto-antígenos, para evitar el daño de las células y tejidos
propios. La consecuencia de este requisito es la capacidad del sistema inmune innato para
discriminar entre lo propio y lo extraño (Janeway, C.A., 1992). Realmente, todos los
productos microbianos conocidos que dan lugar a una actividad inmunoestimuladora,
presentan estructuras invariables formadas por grupos amplios de microorganismos, y son
absolutamente esenciales para la supervivencia de los microbios; así: los ácidos teicoicos y
LPS son componentes comunes de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
respectivamente; una doble cadena de RNA es una señal estructural de varios grupos de
RNA-virus, y los mananos son componentes conservados de las paredes celulares de las
levaduras. Ninguno de esos compuestos son producidos por el organismo huésped, y todos
ellos son esenciales para la fisiología y supervivencia de los microbios que los poseen
(Janeway, C.A., 1989).
1.3.2.-RECEPTORES DEL SISTEMA INMUNE INNATO
El reconocimiento inmune innato está mediado por un estructuralmente diverso
grupo de receptores que pertenecen a varias familias proteicas diferentes. Algunos
receptores (PRRs) reconocen directamente PAMPs, mientras otros (receptores del
complemento) reconocen los productos (CD14, colectinas) generados por el
reconocimiento de PAMP (figura 5).
INFECIÓN
PAMP
PRR
Insectos
Mamíferos
NF
?B
?
NF
? ? ?
Péptidos antimicrobianos Péptidos antimicrobianos,
B7, IL-1, IL-6, IL-8
TollToll
Figura 5.- Ruta general de defensa del sistema inmune (tomado de Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A. 1997b).
Funcionalmente, los PRRs pueden ser clasificados en tres tipos: proteínas
humorales circulantes en el plasma, receptores endocíticos expresados sobre la superficie
celular, y receptores señalizantes que pueden ser expresados tanto sobre la superficie
celular como intracelularmente (Fearon, D.T. y Locksley, R.M., 1996; Medzhitov, R.M. y
Janeway, C.A., 1997b).
Los PRRs celulares son expresados sobre las células efectoras del sistema inmune
innato, en células del sistema inmune adaptado, y también en las células que se van a
encontrar en primer lugar con los patógenos durante la infección, como las células
epiteliales superficiales.
Este tipo de expresión permite que estos receptores induzcan directamente los
mecanismos efectores innatos, y también alerten al organismo huésped sobre la presencia
de agentes infecciosos, induciendo la expresión de un grupo de señales endógenas tales
como citoquinas inflamatorias y quimoquinas. Esta última función permite una
movilización eficiente de los efectores para combatir a los invasores microscópicos. Con el
desarrollo de la inmunidad adaptada, las señales inducidas por receptores no clonales
adquirieron nuevas funciones como por ejemplo, el control de la activación y
diferenciación de linfocitos producidos clonalmente con receptores de antígenos
específicos (Medzhitov, R.M. y Janeway, C.A., 1997b).
1.4.- CITOQUINAS EN LA RESPUESTA INMUNE
Las respuestas inmunes son el resultado de una compleja interacción entre una gran
variedad de células. Además hay una continua interacción entre los sistemas inmune,
nervioso y endocrino.
Moléculas como las hormonas, neuropéptidos y citoquinas están implicadas en la
transmisión de señales. Estás últimas se han clasificado según su origen o función. Hoy en
día, el término general de "citoquina" se usa para todas estas moléculas señal y sus
principales características son las siguientes: (1) son producidas por células del sistema
inmune, tales como linfocitos y monocitos, pero también por células del sistema
neuroendocrino (Nisticò, G., 1993; Schöbitz, B. et al., 1994), (2) son glucoproteínas de
pequeño peso molecular (10-20 kDa) y la mayoría son sintetizadas de novo por células
activadas durante la fase eferente de la respuesta inmune, (3) el principal papel de las
citoquinas es funcionar como mediadores y moduladores de la respuesta inmune y la
inflamación; recientemente se ha visto que las citoquinas juegan un importante papel como
moléculas señal en el sistema neuroendocrino (Nisticò, G., 1993; Blalock, J.E., 1994;
Schöbitz, B. et al., 1994), (4) desde el punto de vista funcional, las citoquinas se
caracterizan por ser pleiotrópicas y redundantes - la misma citoquina puede tener diferentes
blancos celulares y diferentes citoquinas pueden realizar una misma función; (5) actúan
sobre blancos celulares por mecanismos autocrinos, paracrinos y endocrinos; las citoquinas
se unen a receptores específicos de la membrana plasmática, los cuales muestran un cierto
grado de promiscuidad (Kishimoto, T. et al., 1994; Paul, W.E. y Seder, R.A., 1994;
Ottaviani, E. et al., 1994a,1995a), (6) en varios tipos celulares, las citoquinas actúan como
factores de crecimiento regulando la proliferación e inhibición de la apoptosis (Manfredini,
R. et al., 1993; Kroener, G., 1995).
Las citoquinas están presentes en prácticamente todos los organismos y
tejidos del cuerpo, incluyendo además del sistema nervioso, la piel, los intestinos, etc. De
este modo, las citoquinas parecen ser más moleculas señal que mediadores inmunes y
juegan un papel principal en fenómenos fisiológicos y patológicos, tales como reabsorción
de médula, producción de proteínas en fase aguda e inflamación. No obstante, las
citoquinas son los principales actores del sistema inmune e intervienen y modulan los
principales fenómenos inmunes, incluyendo proliferación y diferenciación de linfocitos y
otras células inmunes, muerte celular y apoptosis, citotoxicidad etc. (Brozek, C.M. y Ley,
R.D., 1991).
Por otra parte, se ha detectado la presencia de moléculas similares a citoquinas en
invertebrados tales como moluscos, insectos, anélidos, equinodermos y tunicados. Al igual
que en vertebrados estas moléculas están presentes en diferentes tejidos y órganos.
Moléculas similares a IL-1? , IL-1? , IL-2, IL-6 y TNF-? se han encontrado en hemocitos y
en la hemolinfa (Hughes, T.K. et al., 1990, 1991a, 1992; Stefano, G.B. et al., 1991;
Ottaviani, E. et al., 1993a; Granath, W.O. et al., 1994; Ouwe-Missi-Oukem-Boyer, O. et
al., 1994).
El sistema hematopoyético debe responder ante situaciones tales como una
infección o una pérdida de sangre; esta respuesta se lleva a cabo mediante la elaboración
de factores humorales que promueven una rápida expansión y maduración de grupos
específicos de células hematopoyéticas en los sitios afectados.
Las principales fuentes de factores humorales que desencadenan esta
hematopoyesis inducida son las células T activadas y los macrófagos (Miyajima, A. et al.,
1988). Mastocitos, células endoteliales y probablemente células B producen esos mismos y
otros grupos diferentes de factores. Esos factores son glucoproteínas tales como IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, GM-CSF, G-CSF, IFN-?, TNF-? y linfotoxina,
que intervienen en diferentes respuestas inmunes e inflamatorias (tabla 2).
Interleuquinas CSFS y otros Interferones IL-1? GM-CSF INF-? IL-1? G-CSF INF-? IL-2 M-CSF IFN-? IL-3 EPO IL-4 TNF-? GF IL-5 TNF-? (LT) IL-6 LIF EGF IL-7 Steel Factor TGF-? IL-9 (p40 TCGF) aFGF IL-10 (CSIF) Familia TGF-? bFGF IL-11 KGF TGF-?1 PDGF-A Factores quimiotácticos TGF-?2 PDGF-B TGF-?3 NGF-? Inhibina IGF-I IL-8 (NAP-1) Actibina IGF-II MCP I Tabla 2.- Citoquinas (tomado de Miyahima, A. et al., 1992).
Asimismo, factores producidos por células estromales tales como M-CSF, IL-7,
LIF e IL-11 también participan en esas respuestas.
Junto con el IFN-? , IFN-? , TGF-? y TGF-? esas moléculas se denominan
colectivamente citoquinas. Entre ellas, las interleuquinas son citoquinas que transmiten
señales entre linfocitos. Por tanto, las citoquinas están implicadas en la respuesta a las
infecciones virales (como los interferones), a la inflamación y la inmunidad (como las
monoquinas y linfoquinas) y en la hematopoyesis (como los factores estimulantes de
colonias (CSFs)) (Arai, K. et al., 1990).
Las citoquinas producidas por los macrófagos y las células endoteliales pueden ser
importantes en el establecimiento de la inmunidad innata, respuesta inmune definida como
un sistema antimicrobiano no específico para autolimitar la respuesta inflamatoria. Por otra
parte, las linfoquinas producidas por células T activadas (y probablemente también por
células B) son los componentes responsables de la inmunidad adquirida. A diferencia de
las inmunoglobulinas, las citoquinas no presentan la capacidad de reconocer a un antígeno
específico (Miyajima, A. et al., 1992).
1.4.1.-ESTRUCTURA DEL RECEPTOR DE CITOQUINAS Y
TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES
En general, un receptor funcional se puede dividir en varios componentes: una
unidad de unión, un transductor, un efector y una unidad reguladora.
Un receptor hormonal complejo se compone de un receptor de hormonas (con 7
segmentos transmembranales), una proteína G heterotrimérica (subunidades ? , ? , ?) como
transductor, y un efector que genera señales intracelulares (Benovic, J.L. et al., 1988).
En otros casos, como los receptores de factores de crecimiento como EGF, PDGF y
FGF, los receptores están constituidos por una cadena polipeptídica sencilla con motivos
estructurales comunes; con un gran dominio extracelular de unión del ligando, un dominio
sencillo situado dentro de la membrana, y un gran dominio citosólico con actividad quinasa
(figura 6) (Ullrich, A. y Schelessinger, J., 1990).
¿Cuál es la estructura de los receptores de citoquinas y, cómo transducen sus
señales?
Figura 6.- Estructura de los receptores de citoquinas. A) Receptores de citoquinas
heteromultiméricos que requieren por los menos dos subunidades distintas para formar un receptor de alta
afinidad. B) Receptores de citoquinas que tienen una alta afinidad por el ligando, bien por sí mismos o
formando homodímeros (tomado de Miyahima, A. et al., 1992).
Es importante señalar que una misma citoquina puede actuar tanto como señal
positiva como negativa, dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco
(Arai, K. et al., 1990). Igualmente, diferentes citoquinas mediante diferentes receptores
dan lugar a aparentemente idénticas respuestas biológicas.
Una estructura constituida por multisubunidades es un hecho común a varios
receptores de citoquinas, como los receptores de IL-2, IL-3, IL-5, IL-6 y GM-CSF
(Hatakeyama, M. et al., 1989a; Kitamura, T. et al., 1991; Takaki, S. et al., 1991; Hibi, M.
et al., 1990; Hayashida, K. et al., 1990; Devos, R. et al., 1991). Todos esos receptores de
alta afinidad están constituidos por al menos dos componentes distintos, ? y ? . Las
subunidades ? son proteínas de unión de citoquina, y las subunidades ? por sí mismas no
unen o unen citoquinas muy débilmente.
Tanto los receptores de alta afinidad como de baja afinidad cuando se expresan en
fibroblastos, son incapaces de transducir señales de proliferación (Hatakeyama, M. et al.,
1989b; Hayashida, K. et al., 1990), por lo tanto son necesarios componentes adicionales,
presentes en las células hematopoyéticas, para promover el crecimiento celular. Existen
varios esquemas posibles para explicar el comportamiento de los receptores funcionales y
de alta afinidad: a) la proteína que une citoquinas con baja afinidad, interacciona
extracelularmente con una segunda molécula que genera una señal intracelular. b) uno de
los componentes de los receptores heteromultiméricos (probablemente la subunidad ? )
genera señales intracelulares funcionando como transductor y/o efector. c) el mismo
receptor heteromultimérico interacciona con un tercer componente, como por ejemplo una
tirosina quinasa, para generar señales intracelulares (Miyajima, A. et al., 1992).
La interacción de las citoquinas con su receptor específico en la superficie celular
desencadena la activación de caminos de señalización intracelulares que desencadenan
respuestas celulares.
Las quinasas Janus (JAKs) son mediadores centrales en la transducción de la señal
y fosforilan residuos de tirosina dentro de dominios intracelulares del receptor, creando
lugares cercanos para el reclutamiento de componentes adicionales en la señalización,
incluyendo el dominio SH2 que contiene transductores de señales y activadores de factores
de transcripción (STAT). Un gran número de citoquinas, factores de crecimiento y
hormonas activan el camino JAK/STAT. Este camino puede ser regulado por múltiples
mecanismos, hay tres principales reguladores negativos en la señalización a través de
JAK/STAT; SHP-1, una tirosina fosfatasa, la cual actúa provocando una regulación por
degradación proteolítica de la actividad JAK seguida de una autoactivación; proteínas
inhibidoras de STATs activadas (PIAS), las cuales se unen a STATs activadas e inhiben su
actividad transcripcional; y las proteínas supresoras de la señalización de citoquinas
(SOCS), las cuales son blancos transcripcionales en las STATs y funcionan en un feedback
negativo para atenuar la señalización a través de JAK/STAT (figura 7) (Kile, B.T. et al.,
2000).
La activación de las quinasas JAK tiene lugar mediante la fosforilación de residuos
de tirosina en los receptores a los que se asocian. Estas fosfotirosinas pueden servir como
lugares de anclaje para moléculas de señalización incluídas las proteínas STAT
(Greenlund, A.C. et al., 1995). Después de la dimerización del receptor y de la activación
Figura 7.- Reguladores negativos en el camino de señalización a través de JAK/STAT. Las líneas en forma de T representan inhibición y las flechas representan activación (tomado de Kile, B.T. et al., 2000).
P
P
Stat
SOCS-3
CIS
Stat
Stat
JAK JAK
PStat
SHP-1
PIAS
SOCS-1
Transcripción de genes
de las JAKs, los factores de transcripción STAT son reclutados, activados y translocados al
núcleo donde estimulan la transcripción de genes que afectan a la respuesta biológica
(Darnell, J.E. et al., 1994; Darnell, J.E., 1997; Horvath, C.M. et al., 1997).
1.5.- SISTEMA IL-2/IL-2R
La interleuquina 2 (IL-2) desempeña un papel fundamental en la proliferación de
las células T al unirse a un receptor específico que se expresa en la superficie celular
(Smith, K.A., 1988). Además la IL-2 modula las funciones inmunológicas de células T, B
y NK (Waldmann, T.A., 1989) con lo que podemos concluir que desempeña un papel
fundamental en la fisiología del sistema inmune.
La IL-2 es producida por una subpoblación de células T conocida como células
TH1. Esta glucoproteína, de 133 aminoácidos, presenta una gran heterogeneidad con
respecto al peso y la carga debido a los distintos grados de glucosilación y sialización
(Taniguchi, T. et al., 1983; Robb, R.J. y Smith, K.A., 1981).
Para ejercer su efecto biológico, la IL-2 interacciona con su receptor específico en
la superficie celular. Este receptor está formado por tres subunidades denominadas en
función de su peso molecular: p55 (subunidad ? ), p70 (subunidad ? ) y p64 (subunidad ?),
que al combinarse forman el receptor de baja afinidad (p55, Kd 10-8M), afinidad media
(p70/p64, Kd 10-9M) y alta afinidad (p55/p70/p64, Kd 10-11M) (figura 8) (Leonard, W.J. et
al., 1984; Nikaido, T. et al., 1984; Hatakeyama, M. et al., 1989a).
Figura 8.- Representación esquemática del receptor de IL-2
(tomado de Taniguchi, T. y Minami, Y. 1993)
La caracterización y la clonación de la subunidad p55 del receptor de IL-2 se hizo
gracias a la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos (Leonard, W.J. et al.,
1984; Nikaido, T. et al.,1984; Uchiyama, T. y Border, S., 1981). Originariamente esta
subunidad se describió con un peso molecular de 33 kD, pero por modificaciones
postranscripcionales, entre las que se encuentran N y O-glucosilaciones, su peso molecular
pasa a ser de 55 kD.
La subunidad p55 puede ser detectada también como forma soluble en el medio de
cultivo de linfocitos que expresan el receptor de alta afinidad (Rubin, L.A. et al., 1985); o
en el suero tras la activación de células T “in vivo” (Osawa, H. et al., 1986). Esta
subunidad soluble es una forma truncada de la proteína que se expresa en la membrana y
tiene capacidad de unir IL-2 (Baran, D. et al., 1988) con la misma afinidad que la forma
? IL-2R
jun
)
?
??
gen c- myc
gen c- fos / c-
src -familia PTK (p56lck, p59fyn .)
(p21 ras IL-2R
IL-2R
IL-2
anclada a la membrana (Kd 10-8M). La liberación de p55 soluble es un fenómeno asociado
a la activación celular y parece que desempeña un papel importante en la regulación de la
respuesta inmune. La presencia de niveles elevados de p55 soluble en suero puede ser
utilizada como un indicador de una posible enfermedad o anomalía, ya que se ha
comprobado que individuos con determinadas enfermedades autoinmunes y neoplasias
presentan niveles anormales en la expresión del receptor de IL-2 (Ishida, H. et al., 1987;
Tsudo, M. et al., 1987).
Los conocimientos que se tienen sobre la subunidad p70 son más recientes
(Hatakeyama, M. et al., 1989b; Tsudo, M. et al., 1989). La región extracelular de esta
proteína tiene 214 aminoácidos, tamaño comparable con el de la subunidad p55 (219
aminoácidos). Ambas subunidades reconocen epitopos distintos en la molécula de IL-2
(Rebollo, A. et al., 1992). La región citoplasmática tiene 286 aminoácidos, y no contiene
secuencias con actividad tirosina-quinasa.
La transfección de esta subunidad en células que no responden a la IL-2 y expresan
la subunidad p64 permite la recuperación de la capacidad de proliferación en respuesta a la
IL-2 (Doi, T. et al., 1989). Estos resultados sugieren que la subunidad p70 y
probablemente la subunidad p64, son las subunidades implicadas en la transmisión de
señales mediadas por IL-2.
Las subunidades p55 y p70 no están unidas covalentemente. No está claro si el
receptor de alta afinidad existe como un heterodímero en ausencia de IL-2 (Saragovi, H. y
Malek, T.R., 1988) y si existe una interacción funcional entre ambas subunidades.
La subunidad p64 del receptor de IL-2 tiene 347 aminoácidos y un peso molecular
estimado de 40 kD. La región extracitoplasmática (254 aminoácidos) incluye seis sitios
posibles de glucosilación y la secuencia consenso que la incluye dentro de la familia de
receptores para factores de crecimiento. La región citoplasmática tiene 86 aminoácidos y
parece que está implicada en la transmisión de señales junto con la subunidad p70. Esta
subunidad participa en la formación del receptor de media y alta afinidad, así como en los
procesos de internalización, y es capaz junto con la subunidad p70, de unir IL-2 (Kumar,
A. et al., 1987).
1.5.1.- MECANISMOS MOLECULARES DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES
MEDIADAS POR IL-2
Se tiene muy poca información acerca de cuáles son los mecanismos que transmiten
las señales mediadas por la IL-2 desde la superficie celular al núcleo.
Cuando la IL-2 se une a su receptor de alta afinidad este complejo se internaliza
rápidamente (Kumar, A. et al., 1987). La internalización es un paso necesario pero no
suficiente en el proceso de proliferación mediada por IL-2, lo que parece indicar que
probablemente esta molécula no interacciona de una forma directa con las vías de
transmisión de señales (Kono, T. et al., 1990).
La interacción de la IL-2 con su receptor desencadena varios sucesos de
señalización intracelular, incluyendo la fosforilación de proteínas en restos de tirosina y la
subsiguiente inducción de varios protooncogenes críticos para la proliferación celular
(Minami, Y. et al., 1993a; Minami, Y. et al., 1993b; Kono, T. et al., 1993). Ninguna de las
tres subunidades del receptor de IL-2 posee actividad catalítica. Las subunidades ? y ?
juegan un papel esencial en el desarrollo de la señalización inducida por IL-2 (Minami, Y.
et al., 1993a; Hatakeyama, M. et al., 1989a; Kawahara, A. et al ., 1994; Nakamura, V. et
al., 1994; Nelson, B.H. et al., 1994). El receptor de IL-2 puede reclutar múltiples PTKs:
p56lck y p59fyn de la familia src, syk de la familia syk/ZAP-70 y Jak1 y Jak3 de la familia
Jak (Hatakeyama, M. et al., 1991; Minami, y. et al., 1993b; Kobayashi, N. et al., 1993;
Minami, Y. et al., 1995; Russell, S.M. et al., 1994; Miyazaki, T. et al., 1994).
El dominio citoplasmático de la cadena ? se asocia con p56lck , Syk y Jak1, mientras
que la subunidad ? se asocia con Jak3 (Hatakeyama, M. et al., 1991; Minami, Y. et al.,
1993b; Minami, y. et al., 1995; Russell, S.M. et al., 1994; Miyazaki, T. et al., 1994). Estas
interacciones ocurren a través de la región rica en serina de la subunidad ? y la región C-
terminal de la cadena ? (Miyazaki, T. et al., 1994; Kawahara, A. et al., 1995), aunque se ha
propuesto un camino alternativo para la activación de Stat que está mediada por la
interacción de Jak y Stat (Fujitani, Y. et al., 1997).
La IL-2 desencadena la activación de PTK e induce la fosforilación en tirosina de
una proteína adaptadora denominada Shc. La fosforilación de Shc crea una región
consenso para el dominio SH2 de otra proteína adaptadora, Grb2, la cual está compuesta
por un dominio SH2 flanqueado a ambos lados por dominios SH3, esta proteína adaptadora
interacciona con SOS un factor de intercambio de nucleótidos de guanina. Por un
mecanismo desconocido, se forma el complejo trimolecular Shc-Grb2-SOS que
desencadena la transformación de GDP en GTP provocando la activación de Ras. La forma
activa de Ras desencadena la cascada de serina/treonina quinasas. Aunque la interacción de
Ras-Raf es necesaria para la activación de Raf, la interacción no activa la actividad
catalítica de Raf. Después de la activación de esta proteína tiene lugar la fosforilación y
activación de MEK el cual finalmente fosforila a MAPK. Estas fosforilaciones activan a
MAPK, la cual retransmite la señal a sistemas efectores por fosforilación de múltiples
sustratos citoplasmáticos, incluyendo otras serina/treonina quinasas. Además MAPK se
transloca al núcleo y fosforila ciertos factores de transcripción. Por otra parte, Jak también
transduce señales directamente al núcleo por fosforilación de Stat3 y/o Stat5. La
fosforilación induce la dimerización de STAT, que desencadena la posterior translocación
al núcleo (figura 9) (Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).
Además de estas proteínas quinasas, la IL-2 provoca la activación de PI3-quinasa
(Augustine, J.A. et al., 1991; Merida, I. et al., 1991; Remillard, B. et al., 1991; Karnitz,
L.M. et al., 1994). Una vez activada, esta quinasa fosforila al fosfoinositol (PI) 4,5-P2 para
Figura 9.- La IL-2 induce la activación de Ras y Stat (tomado de Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).
P
IL-2R?
IL-2R? IL-2
Jak3 Jak1
Stat3/5
Src-familia PTK Y P Grb 2
SOS
Ras GTP
MEK
MAP Kinasa
Raf
Transcripción de genes y progresión del ciclo celular
Shc
?C
P Stat3/5
P Stat3/5
YY
producir un segundo mensajero lipídico, PI-3,4,5-P3 el cual activa a otros efectores
(Karnitz, L.M. y Abraham, R.T., 1996).
1.6.-TRANSMISIÓN DE SEÑALES MEDIADAS POR DIFERENTES
EFECTORES
1.6.1.- PKC
La proteína quinasa C es una familia multigénica de serina-treonina-quinasas que se
agrupa en tres secciones diferentes en base a características estructurales similares y a
requisitos de activación (tabla 3).
La PKC puede interaccionar con varios sistemas de señalización incluyendo el
camino a través de Ras-Raf-MAP y el dependiente de calcio-calmodulina y puede regular
FAMILIA
ISOFORMAS
COFACTORES
Clásicas
? , ? I, ? II, ?
Ca2+, DAG, PS, PMA
Nuevas
?, ?, ? , ?
PS, DAG, PMA
Atípicas
?, ?/?
PS
Tabla 3.- Clasificación de las isoenzimas de la familia PKC.
de forma positiva o negativamente la disponibilidad de sus propios cofactores lipídicos.
(Keenan, C. et al., 1997).
La hidrólisis de fosfolípidos de membrana es un mecanismo común para la
transducción de varias señales extracelulares en la célula como hormonas,
neurotransmisores, antígenos y algunos factores de crecimiento. La fosfolipasa C está
implicada en la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) que produce dos
segundos mensajeros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), el cual libera calcio de depósitos
intracelulares, (Berridge, M.J. e Irvine, R.F., 1984) y diacilglicerol (DAG) el cual activa la
proteína quinasa C (figura 10).
Figura 10.- Activación de células diferenciadas e indiferenciadas a través de PKC (tomado de Kanashiro, A.C. y Khalil, R.A., 1998).
Ca2+
P MAPK Sustrato Sustrato
c-myc c-jun c-fos
Núcleo Proliferación
celular
Respuestas celulares
Contracción
MEK
IP3
PIP 2 DGA
PS
PLCPKC
PKC Ras
Raf
G
GTP GDP
Retículo Endoplasmático
Se han asignado algunas funciones fisiológicas a la PKC incluyendo su implicación
en la secreción y exocitosis, contracción del músculo liso, expresión de genes y
proliferación celular, además la PKC ejerce un control negativo en varias etapas del
proceso de señalización celular (Nishizuka, Y., 1992).
La implicación de la PKC en el control del crecimiento y diferenciación es
evidente, pues varios efectores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento
derivado de plaquetas y en algunos casos EGF pueden involucrar a la PKC en su proceso
de transducción de señal (Kanashiro, A.C. y Khalil, R.A., 1998).
1.6.2.- PKA
La proteína quinasa dependiente de AMPc (proteína quinasa A, PKA; E.C. 2.7.1.37)
fue descubierta por el grupo de Krebs, durante el estudio de la regulación de la glucógeno
fosforilasa (Walsh, D.E. et al., 1968; Krebs, E.G., 1993a, 1993b).
En su estado inactivo, la enzima es un tretámero formado por dos subunidades
reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C). La unión de AMPc a las primeras
promueve la disociación de la holoenzima en un dímero de subunidades reguladoras y dos
subunidades catalíticas monoméricas y activas que pueden fosforilar restos de serina o
treonina de un amplio espectro de proteínas, dependiendo del tipo de célula y de su estado
de diferenciación, lo que se traduce en numerosos efectos biológicos (Zetterquist, O. et al.,
1990).
En relación a los caminos de transducción de señales se ha observado que la IL-1?
y TNF-? pueden activar la PKC o la PKA, vía fosfolipasa C y adenilato ciclasa
respectivamente (Dinarello, C., 1991; Vilcek, J. y Lee, T.H., 1991). La activación o
inhibición de la adenilato ciclasa es una de las funciones mejor estudiadas en cuanto a la
modulación de efectores a través de receptores hormonales acoplados a proteínas G (figura
11) (Herrera, E., 1993).
El LPS también induce la activación de varios caminos de transducción de señales
en los que está implicada la proteína quinasa A. El complejo LPS-LBP se une a su receptor
de membrana, esta asociación induce la expresión de COX-2 (ciclooxigenasa-2), la
posterior formación de PGE2 (prostaglandina E2), la producción de AMPc y la activación
de la PKA (figura 12) (Chen, C. et al., 1999).
Figura 11.- Sistemas de la adenilato ciclasa y del fosfatidilinositol en la respuesta hormonal. Abreviaturas: PKA y PKC, proteína quinasa A y C; PDE, fosfodiesterasa de fosfatidilinositol; PI, PIP,PIP2 , fosfatidilinositol, fosfatidilinositol 4-fosfato y fosfatidilinositol 4.5- bisfosfato; IP3,inositol-1,4,5 trifosfato; DG, diacilglicerol; AC,adenilato ciclasa.
G PDE
PKC
PKA
PI PIP PIP 2
DG
ATP AMPC
Fosforilaciónde proteínas
IP 3
Movilización de Ca2+
G
GTP
AC
1.6.3.- LIPOPOLISACÁRIDOS BACTERIANOS (LPS)
Los lipopolisacáridos bacterianos son los principales componentes de la mayoría de
las bacterias Gram- negativas y actúan como fuertes estimuladores de la inmunidad innata
o natural en diversas especies eucarióticas desde insectos a humanos.
COX-2
PGE2
AMPC
PKA
LBP LPS
mCD-14
Figura 12.- Representación esquemática de la activación de la PKA inducida por LPS. Abreviaturas: LPS, lipopolisacáridos; LBP, proteína que se une al LPS; COX-2, ciclooxigenasa 2; PGE2, prostaglandina E2; AMPc, adenosín monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; mCD14, complejo diferenciado de membrana
La membrana externa de las bacterias Gram-negativas (figura 13) es asimétrica.
Las caras interna y externa son diferentes y constan principalmente de lípidos y proteínas.
(Nikaid, H. y Vaara, M., 1987; Hayashi, S. et al., 1990; Dmitriev, B.A. et al., 1999). Los
lipopolisacáridos son componentes integrales de la membrana externa de estas bacterias y
contienen un dominio hidrofóbico conocido como lípido A (figura 2) (Ulevitch, R.J. y
Tobias, P.S., 1995).
La capa de lipopolisacáridos de la membrana externa está estabilizada por la
asociación de cationes divalentes y representa una barrera permeable frente a factores de
estrés externos (Vaara, M., 1992).
Figura 13.- Membrana externa de las bacterias Gram-negativas.
El lípido A representa el centro inmunoreactivo del LPS debido a la especificidad y
al reconocimiento altamente sensible de la estructura lipídica por numeros componentes
celulares y humorales de la inmunidad innata (Medzhitov, R., y Janeway, C.A.Jr., 1998;
Hoffmann, J.A. et al., 1999; Medzhitov, R. y Janeway, C.A.Jr., 2000).
El LPS induce un amplio espectro de efectos biológicos en varios organismos
eucarióticos. El blanco celular primario del LPS en mamíferos son los fagocitos de la
inmunidad innata o natural, monocitos periféricos, macrófagos y neutrófilos, los cuales
expresan el antígeno CD 14 así como TRL4 (Haziot, A. et al., 1988; Kitchens, R.L., 2000;
Zhanf, F.X. et al., 1999 ; Muzio, M. et al., 2000).
Los macrófagos llevan a cabo funciones críticas en el sistema inmune. Actúan
como reguladores de la homeostasis y como células efectoras en la infección e intervienen
en la curación de heridas (Celada, A y Nalhan, C., 1993). A diferencia de otras células del
sistema inmune, los macrófagos muestran una pronunciada dualidad en su respuesta
biológica; tampoco proliferan o se hacen activos, experimentando un paro en su
crecimiento y comienzan a llevar a cabo sus funciones especializadas en el contexto de la
respuesta inmune (Vairo, G. et al., 1992). El LPS activa macrófagos e induce la secreción
de metabolitos de ácido araquidónico, intermediarios del nitrógeno y citoquinas tales con
TNF-? , IL-1 e IL-6 (Adams, D.O. et al., 1984; Morrison, D.C. et al., 1987), las cuales
juegan un papel importante en la respuesta inmune.
En macrófagos, el LPS desencadena la activación de varios caminos de
transducción de señales en los que están implicados proteínas G, tirosina-quinasas,
fosfolipasa C (PLC), proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKC) (Sweet, M.J.
et al., 1996; Fujihara, M. et al., 1994; Liu, M.K.P. et al., 1994, Shapira, L. et al., 1994)
EL LPS también activa diferentes cascadas de proteínas quinasas activadas por
mitógenos (MAPK), incluyendo las proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares
(ERK) (Reimann, T.D. et al., 1994; Weinstein, S.L. et al., 1992). Para la actividad de
MAPK es necesaria la fosforilación de residuos de tirosina y treonina (Boulton, T.G. et al.,
1991). ERK activa fosforila y regula varias proteínas quinasas adicionales, componentes
del citoesqueleto, fosfolipasa A2 , y factores de transcripción nuclear (c-Jun) (Treisman, R.,
1996).
MAPK fosfatasa–1 (MKP-1) es un miembro inducible de doble especificidad
(Charles, C.H. et al., 1993; Keyse, S.M. et al., 1992; Noguchi, T. et al., 1993). MKP-1
desfosforila residuos de tirosina y treonina en ERK1/2 (Alesi, D.R. et al., 1993; Sun, H. et
al., 1993), de este modo permite la inactivación de estas quinasas. MKP-1 desfosforila e
inactiva c-Jun y p 38 (Chun, Y. et al., 1996). La expresión de MKP-1 no es dependiente de
la activación de MAPKs y ERK 1 / 2 en respuesta al LPS. En cambio, la inducción de esta
fosfatasa necesita la activación de tirosina quinasas y de la isoforma ? de la PKC. Esto
sugiere que, en macrófagos, la PKC? juega un papel importante en el control negativo de la
actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1 (figura 14) (Valledor,
A.F. et al., 2000).
La activación de la PKC está asociada con la translocación de la enzima desde el
citosol a la membrana. El LPS estimula la actividad de la PKC en macrófagos de dos
maneras. La primera, es rápida y ocurre sólo a altas concentraciones de LPS. La segunda
manera es más lenta y tiene lugar tanto a dosis bajas como altas del efector. Además, hay
una fuerte evidencia que sugiere que la PKC? es la principal isoforma implicada en la
respuesta de los macrófagos a la estimulación por LPS (Shapira, L. et al., 1997).
Figura 14.- Control negativo de la actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1. Las líneas sólidas representan interacción directa y las discontínuas representan la presencia de pasos intermedios. Las líneas en forma de T representan inhibición. Los círculos representan formas activas y los cuadrados formas inactivas.
PTK PKC?
MKP-1
ERK-1 ERK-2
ERK-1 ERK-2
NÚCLEO
c-jun p38
c-jun p38
1.6.4.- CORTICOTROPINAS
El factor liberador de corticotropinas (CRF) parece ser una molécula señal
potencialmente importante en procesos autoinmunoreguladores y neuroinmunes de
vertebrados e invertebrados (Smith, E.M. et al.,1992a).
Recientes estudios muestran que ciertos neuropéptidos participan en procesos
reguladores en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados (Van Epps, D.A., 1984;
Fisher, E.G. y Falke, N.E., 1986; Stefano, G.B. et al., 1989). Además varios neuropéptidos
endógenos, estimulan la adherencia, cambios conformacionales, y actividad locomotora en
humanos y en inmunocitos de invertebrados (moluscos, insectos) (Stefano, G.B., 1989).
Por otra parte el CRF parece inducir inmunosupresión celular a través de su propio
receptor (Smith, E.M. et al., 1992b)
Los hemocitos de invertebrados son capaces de responder a CRF y a fragmentos de
ACTH (hormona adrenocorticotrópica) proporcionando evidencias de una complejidad en
la señalización intracelular dentro del sistema inmune en animales relativamente primitivos
(Genedani, S. et al., 1994).
El estrés en vertebrados, ocurre en parte, a través de neuropéptidos, u otras
moléculas señal, particularmente CRF y pro-opiomelanocorticoides (POMC), los cuales
son sintetizados por el sistema inmune y nervioso (Blalock, J.E., 1989). El fenómeno de
estrés también ocurre en invertebrados (Ottaviani, E. et al., 1992; 1993; Stefano, G.B. et
al., 1990) y la influencia de la respuesta inmune parece estar mediada por neuropéptidos y
moléculas señal similares a las implicadas en la respuesta al estrés en vertebrados (Leung,
M.K. y Stefano, G.B., 1987; Ottaviani, E. et al., 1990a; 1991).
Recientemente, Ottaviani, E. et al., demostraron que el fragmento ACTH 1-24 y las
? - endorfinas pueden estimular la locomoción de hemocitos y la fagocitosis (Ottaviani, E.
et al., 1990; 1991b).
El ACTH debería de ser considerado un importante inmunoregulador que forma
parte del complejo mosaico de relaciones entre el sistema inmune y el neuroendocrino.
Esta molécula es capaz de neutralizar directa o indirectamente agentes que pueden
perturbar la homeostasis del cuerpo. El efecto del ACTH en las células inmunes es
compleja y está influenciada por varios factores, tales como su concentración , presencia
de citoquinas, etc. Este efector puede ejercer efectos directos o indirectos a varios niveles,
modulando la transducción de señales en la membrana plasmática o alterando la
producción de factores de crecimiento y la diferenciación celular, ej: TNF-? (Hughes, T.K.
y Smith, E.M., 1989).
La hormona adrenocorticotrópica (ACTH) induce cambios en la forma de los
inmunocitos de moluscos por la via adenilato ciclasa/AMPc /PKA y también provoca la
activación de la PKC. Sin embargo estos efectos desaparecen al añadir inhibidores de las
proteínas G , de la adenilato ciclasa, o de la PKA. Además se ha demostrado que ACTH
induce movilidad en hemocitos fagocíticos de Vivíparus ater por modificación de
componentes del citoesqueleto, también induce la secreción de glucocorticoides adrenales
y puede afectar a diferentes sistemas y comportamientos. En concreto está implicada en las
funciones del sistema cardiovascular de células inmunocompetentes y juega un papel
importante en la inflamación, termorregulación, alimentación y en el comportamiento
social y sexual. De este modo, ACTH, puede tener una importancia central en el
mantenimiento de la homeostasis del organismo (Ottaviani, E. et al., 1999).
El equilibrio homeostático de los organismos está en constante cambio y es
amenazado por diversos efectores. Para mantener la homeostasis, los animales estresados
desencadenan una serie de respuestas fisiológicas y de comportamiento denominadas
"respuestas al estrés" para adaptarse a situaciones amenazantes (Wingfield, J.C. and
Ramenofsky, M., 1999).
Una vez detectado por los órganos sensores, el estrés es el resultado de la
estimulación de dos principales ejes neuroendocrinos en vertebrados: el eje celular
hipotalámico-pituitaria y el eje celular hipotalámico-sistema nervioso simpático (Chousos,
G.P. y Gold, P.W., 1992; Wendelaar Bonga, S.E., 1997).
En el primer camino están implicados neuropéptidos y glucocorticoides como
principales mensajeros, mientras que en el segundo camino están implicadas las
catecolaminas (CA). De tal modo que, los glucocorticoides y las catecolaminas inducen
respuestas secundarias, incluyendo incrementos en los niveles de oxígeno, movilización de
sustratos y relocalización de energía ajena a la requerida en los procesos fisiológicos, tales
como crecimiento, reproducción y determinadas funciones inmunes (Wendelaar Bonga,
S.E., 1997).
En moluscos, las catecolaminas juegan un papel esencial en varios procesos
fisiológicos, incluyendo alimentación (Teyke,T. et al., 1993), locomoción ( Sakharov, D.A.
y Salänski, J., 1982), respiración (Syed, N.I. y Winlow, W., 1991), reproducción
(Martínez, G. y Rivera, A., 1994) y en el asentamiento de las larvas y metamorfosis en
especies marinas (Pires, A. et al., 1997), sin embargo, se conoce poco, sobre como influye
el estrés en la secreción de catecolaminas y en el metabolismo de estos animales.
Las catecolaminas también desempeñan un papel importante en los moluscos
bivalvos. Estudios fisiológicos y farmacológicos indican que las catecolaminas afectan al
músculo (Greenberg, M.J., 1960; Hidaka, T. et al., 1977; Muneoka, Y. y Kamura, M.,
1982) y a la actividad ciliar (Aiello, E., 1990; Beiras, R. y Widdows, J., 1995; Paparo, A y
Aiello, E., 1970). Aunque el sistema nervioso de bivalvos no ha sido extensivamente
examinado neurofisiológicamente, mucha información de los efectos de catecolaminas en
gasterópodos puede aplicarse a bivalvos (Walker, R.J., 1986) , indicando posibles papeles
como transmisores en el sistema nervioso central. Estudios histológicos han informado de
un abundante contenido de catecolaminas en células del sistema nervioso central y en
algunos tejidos periféricos de bivalvos (Smith, S.A. et al., 1998; Stefano, G.B. y Aiello, E.,
1975; Sweeney, D.C., 1968). Además de la implicación de catecolaminas en el control de
la alimentación, respiración y digestión.
Las concentraciones de catecolaminas en varios tejidos están relacionadas con la
época de desove en bivalvos (Martínez, G. y Rivera, A., 1994; Osada, M. y Nomura, T.,
1989; Paulet,Y-M. et al., 1993). Además, recientes estudios han demostrado que varios
agentes farmacológicos pueden tener largos y duraderos efectos sobre la concentración de
catecolaminas en bivalvos "in vivo" (Pani, A.K. y Croll, R.P., 1998), abriéndose, de este
modo, nuevos caminos en la investigación de la acción de las catecolaminas (Smith, S.A. y
Croll, R.P., 1997).
1.6.5.- FACTORES DE CRECIMIENTO
Factores de crecimiento, factores de diferenciación y hormonas son componentes
importantes en el sistema regulador que coordina el desarrollo de organismos
multicelulares. Algunos de estos factores median sus acciones pleiotrópicas por la unión y
activación de receptores de la superficie celular con proteínas intrínsecas que presentan
actividad tirosina quinasa (Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).
Los factores de crecimiento desencadenan una serie de respuestas celulares. Estas
incluyen estimulación de intercambio Na+/H+, afluencia de Ca2+, activación de fosfolipasa
C-? y estimulación del transporte de glucosa y aminoácidos. La estimulación de la
fosfolipasa C-? permite la generación de metabolitos de fosfatidilinositol, tales como
inositol 1,4,5- trifosfato, el cual provoca la liberación de Ca2+ desde compartimentos
intracelulares y la generación de diacilglicerol, un activador natural de la PKC (figura 15)
(Nishizuka, Y., 1988).
La fosfatidilinositol 3-quinasa (Varticovski, L. et al., 1989) y las proteínas ras
(Molloy, C.J. et al., 1989) son sustratos directos de algunos receptores que presentan
actividad tirosina quinasa (Morrison, D.K. et al., 1989).
El PDGF está formado por dos tipos de cadenas: una cadena A y una cadena B. En
su forma activa el PDGF es un dímero de dos monómeros que puede presentar todas las
Figura 15.- Mecanismo de activación del fosfatidilinositol por receptores de tirosina quinasas. Abreviaturas: PMA, forbol 12-miristoato 13-acetato; PIP2, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, DG, diacilglicerol; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato, IP3 R, receptor de IP3
(tomado de Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).
EGF
ATPG PLC?
PMA Ca+2
PIP2 DG
IP3
IP3 R
PKC
SUSTRATOS
combinaciones posibles (ej: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB) (figura 16) (Bowen-Pope,
D.F. et al., 1989; Hart, C.E. et al., 1990; Claesson-Welsh, L., 1994).
El receptor de PDGF tiene dos subunidades: la subunidad ? (PDGF? r) y la ?
(PDGF? r). Las subunidades tienen un peso molecular de 170 y 190 kDa respectivamente.
La unión de PDGF con sus receptores induce la dimerización de las subunidades del
receptor (Ullrich, A. y Schlessinger, J., 1990).
El PDGF inicia un camino definido de transducción de la señal. La unión del
ligando a cualquiera de las subunidades induce la autofosforilación del receptor (Ek, B. y
Heldin, C.H., 1982). A su vez, la estimulación del receptor de PDGF activa una cascada de
enzimas como PKC, Ras, Raf, MAPK y finalmente desencadena la división celular
(Bornfeldt, K.E. et al., 1995; Hart, K.C. et al., 1995).
B
? ?
A A A B B
? ? ? ?
Dímeros de PDGF
Dímeros del receptor
Figura 16.- Interacción del PDGF con su receptor.
La activación de la cascada Ras-Raf-MAPK induce la proliferación celular
(Bornfeldt, K.E. et al., 1995) (figura 17). De este modo, MAPK juega un papel crítico en el
control del crecimiento y diferenciación celular.
Un camino alternativo para estimular la actividad MAPK es a través de la PKC
(Sözei, O. et al., 1992; Kolch, W. et al., 1993; Li, X. et al., 1995).
Cuando el PDGF se une a un receptor, rápidamente estimula un grupo de respuestas
"tempranas" que ocurren en minutos. Esto incluye la activación de tirosinas-quinasas,
Figura 17.- Caminos de transducción de señales iniciados por PDGF (tomado de Luo, J. y Miller, M.W., 1999).
Núcleo
PDGF? r
PDGF-BB PDGF-AA
PDGF? r
MAPK
?
Dominios efectores SH2
Ras
Raf-1
MEK
Etanol
PKC
hidrólisis de fosfatidilinositol (PI), alteraciones en el pH celular, incremento en los niveles
de calcio citosólico, incremento en la expresión de determinados genes e internalización y
degradación del receptor (Lewis, T.W., 1989). El factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF) estimula la transcripción de c-fos y c-myc a través de al menos dos
caminos, uno de ellos está mediado por la proteína quinasa C y el otro no. Los mecanismos
moleculares de estos caminos no han sido aclarados, pero parece que ambos culminan en la
modificación covalente de una proteína que une directamente DNA ó bien a otra proteína
que se une a la región reguladora del mismo. Los pasos que intervienen pueden consistir en
una cascada de reacciones quinasa en las que estarían implicadas tirosina, serina y
treonina quinasas ( Lewis, T. W., 1989).
Por otra parte, miembros de la familia del factor de crecimiento transformante ?
(TGF-? ) se unen a receptores serina/ treonina quinasas del tipo II y tipo I, los cuales
inician señales intracelulares a través de la activación de proteínas Smad. Las funciones de
Smads son reguladas por otros caminos de señalización, tales como MAPK. Además, estas
proteínas interaccionan y modulan varios factores de transcripción que son blancos de
otros caminos de señalización (Miyazoho, K. et al., 2000).
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es una llave reguladora del crecimiento
y diferenciación celular en algunas células de mamíferos (Carpenter, G., 1987). Los pasos
en la transducción de señales, parecen ser similares en diferentes células: la unión de EGF
a su receptor induce la dimerización de éste y la activación de su actividad tirosina-
quinasa, la cual es esencial para la transducción de la señal (Ullrich, A. y Schlessinger, J.,
1990; Sdhlessinger, J. y Ullrich, A. 1992). Como consecuencia de la activación de EGFR,
se desencadenan una variedad de cambios iónicos incluyendo una hiperpolarización
pasajera de la membrana, la alcalinización citoplasmática y un incremento en la
concentración del calcio citosólico (Hesketh, T.R., et al., 1985; Moolenar. W.H., 1986;
Solthoff, S.P. and Cantley, L.C., 1988; Peppelenbosh, M.P., et al., 1991).
En algún tipo de células el EGF también activa la fosfolipasa A2 (PLA2), que
estimula la liberación de ácido araquidónico (AA) y la producción de eicosanoides
(Bonvetre, J.V., et al ., 1990; Goldberg, H.J., et al., 1990; Spaargeren, M. et al., 1992).
1.7.- CÉLULAS INMUNITARIAS EN EL MEJILLÓN
Estudios realizados sobre inmunidad innata en invertebrados han demostrado
similaridades filogenéticas en las estrategias seguidas por esos organismos para responder
rápidamente a una herida o a una infección. El sistema de defensa en los insectos presenta
muchas características similares a las encontradas en la fase aguda de la respuesta en
mamíferos (Hoffmann, J.A., 1995), por tanto los invertebrados pueden ser un sistema
modelo válido para abordar aspectos específicos de la inmunidad innata.
Los hemocitos circulantes juegan un papel clave en las reacciones de defensa de los
invertebrados. Están implicados como fagocitos activos y también en la secreción de
factores humorales (Pipe, R.K. et al., 1997).
Sin embargo, no se tiene un conocimiento detallado de las subpoblaciones de
hemocitos de invertebrados y de su implicación respectiva en los diferentes aspectos de
defensa del huésped. Tal información es particularmente limitada con respecto a los
hemocitos de moluscos bivalvos, que sólo han podido ser clasificados morfológicamente
como células agranulares y células granulares (figura 18) (Cheng, T.C., 1981).
La investigación de los mecanismos de defensa del mejillón, es de particular interés
debido a su prolífica distribución, su importancia en acuicultura y su empleo como modelo
para realizar estudios de polución ambiental (Dyrynda, E.A. et al., 1997).
La clasificación de los hemocitos del mejillón Mytilus edulis, ha recibido
históricamente una considerable atención (Jones, T.W., 1846; Williams, T., 1852; Sabatier,
A., 1877; Flemming, W., 1878; Griesbach, H., 1891; De Bruyne, C., 1896; Kollmann, M.,
1908; Feng, S.Y. et al., 1977; Moore, N.N. y Lowe, D.H., 1977; Rasmussen, L.P.D. et al.,
1985; Pipe, R.K., 1990a; Noël, D. et al., 1994).
En las observaciones iniciales (Jones, T.W., 1846) se clasificaron varias fases de su
desarrollo incluyendo estados granulares finos y gruesos, así como células nucleadas, y
también se incluyeron descripciones de aglomeraciones y la formación de pseudópodos.
Una de las más recientes clasificaciones (Noël, D. et al., 1994) describe la caracterización
Figura 18.- Poblaciones celulares en hemolinfa de mejillón.
antigénica de subpoblaciones con anticuerpos monoclonales y reconoce tres clases de
hemocitos (Pipe, R.K. et al., 1997).
Según Friebel, B. y Renwrantz, L. (1995) los hemocitos de M. edulis pueden ser
divididos en dos grupos, basófilos y eosinófilos, en el primer grupo se incluyen
hialinocitos (células agranulares) y células granulares; en el grupo de los eosinófilos sólo
se encuentran células granulares (Pipe, R.K. et al., 1994). Los hemocitos granulares de M.
edulis contienen dos tipos distintos de gránulos, distinguibles por tamaño, características
de tinción con lectinas y por el contenido enzimático (Pipe, R.K., 1990a; 1990b; Dyrynda,
E.A. et al., 1997).
1.7.1.- LA PROTEÍNA QUINASA C EN MEJILLÓN
En el manto de Mytilus galloprovincialis se ha purificado una proteína de 105 kDa
(p105) que presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina y PMA, e
independiente de Ca2+. Los parámetros cinéticos de esta proteína p105 la asemejan a
isoformas de nPKC de mamíferos. Además el Ca2+ ejerce una inhibición de tipo mixto
sobre la enzima purificada. La proteína p105 es capaz de autofosforilarse, en condiciones
de ensayo, sin mediar la presencia de cofactores lipídicos. Esta proteína también se
encuentra presente en manto, branquias, pie, músculo aductor, hepatopáncreas y hemocitos
de M. galloprovincialis. La estimulación de hemocitos con PMA induce la translocación de
p105 a la membrana plasmática y se regula por degradación (Down-Regulation) en función
del tiempo de exposición. Esta enzima fosforilada contiene residuos de P-Ser. Por otra
parte, se obtuvieron anticuerpos policlonales que reconocen específicamente p105
(Mercado, L., 2001).
1.7. 2.- LA PROTEÍNA QUINASA A EN MEJILLÓN
Se ha caracterizado la proteína quinasa dependiente de AMPc procedente del
mejillón Mytilus galloprovincialis. Al igual que ocurre con su homóloga de mamíferos, la
enzima del molusco está constituída por dos tipos de subunidades: catalítica y reguladora,
que fueron purificadas de forma independiente mediante procesos diferentes.
La subunidad catalítica de la PKA de mejillón mostró unas propiedades tanto
físicas como cinéticas y un mecanismo de regulación, esencialmente idénticos a los
descritos para la proteína homóloga de mamíferos, lo que sugiere un elevado grado de
conservación estructural entre ambas proteínas a pesar de las diferencias en la escala
evolutiva.
En extractos de manto de mejillón, se identificaron tres proteínas que unen
específicamente AMPc, con masas moleculares de 54 kDa, 42 kDa y 37 kDa, que
posteriormente fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a través de AMPc-
agarosa. Sin embargo, de las tres proteínas, solamente la de 54 kDa fue capaz de
reasociarse con la subunidad catalítica de la PKA e inhibir su actividad quinasa, en
ausencia de AMPc, lo que indica que únicamente esta proteína puede actuar como
subunidad reguladora de la proteína quinasa A del molusco.
En relación a las proteínas que unen AMPc de 42 kDa y 37 kDa, incapaces de
inhibir la subunidad catalítica de la PKA, probablemente son fragmentos proteolíticos
procedentes de la subunidad reguladora, tal como indica el hecho de que sean reconocidas
por un anticuerpo generado frente a la proteína de 54 kDa (Cao, J., 1996).
1.7. 3.- LA CADENA ? DEL RECEPTOR DE IL-2 EN MEJILLÓN
En la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis se ha detectado un péptido de
características inmunógenas similares a la IL-2. También se han identificado en la fracción
particulada de la hemolinfa de M. galloprovincialis Lmk. dos tipos de células (hemocitos)
bien diferenciadas, unas (células RH) son redondeadas con un núcleo muy grande en
relación al tamaño celular y las otras (células SH) tienen un citoplasma mucho más
expandido y son las únicas en las que se ha detectado la presencia de un receptor para IL-2.
Este receptor es similar estructuralmente al de las células de vertebrados, está constituído
por tres subunidades (? , ? , ?) cuyas masas moleculares son del mismo orden de magnitud
que las encontradas en vertebrados (Barcia, R. et al., 1999).
La incubación de los hemocitos con IL-2 y/o LPS induce un incremento en la
expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 (Cao, A., 1998).
1.8.- PRESENCIA DE MOLÉCULAS SIMILARES A LAS CITOQUINAS EN
HEMOCITOS DE MOLUSCOS
En la hemolinfa de Planorbarius corneus, se encontraron dos tipos de células: los
hemocitos redondos (RH) y los hemocitos expandidos (SH). Los SH pertenecen a la línea
macrofágica, mientras que los RH presentan características de los linfocitos T (Ottaviani,
E., 1983; Franceschi, C. et al., 1991). En la hemolinfa de Viviparus ater se ha encontrado
únicamente un tipo celular, con las mismas funciones que los hemocitos SH de P. Corneus.
Sólo las células SH de ambos organismos presentan inmunorreactividad positiva
frente a cinco citoquinas (tabla 4), es de notar que estas células pertenecen a una línea
macrofágica y fueron las únicas que presentaron moléculas parecidas a los péptidos
derivados de la pro-opiomelanocortina (Ottaviani, E. et al., 1990b). En vertebrados, los
macrófagos son también los productores más importantes de IL-1, IL-6 y TNF-? .
P.corneus V.ater Citoquinas SH RH SH IL-1? + - + IL-1? + - + IL-2 + - + IL-6 + - + TNF-? + - + SH= hemocitos expandidos ; RH= hemocitos redondos
La presencia de moléculas parecidas a las citoquinas se ha demostrado en otros
invertebrados. En la hemolinfa de Mytilus edulis se han encontrado moléculas similares a
la IL-1 y TNF-? (Hughes, T. et al., 1990).
Experimentos realizados tanto “in vivo” como “in vitro” sugieren que esas
moléculas dan lugar a efectos biológicos similares sobre los hemocitos de moluscos y
granulocitos humanos (Hughes, T. et al., 1990).
Además, también se ha detectado la presencia de IL-1? en las células de la glía
presentes en los ganglios de M. edulis y Nereis diversicolor (Paemen, L. et al., 1992).
Tabla 4.- Citoquinas detectadas en hemocitos de Planorbarius corneus y Viviparus ater (tomado de Ottaviani, E. et al., 1993b).
Realmente, un incremento en las moléculas que reaccionan con el anticuerpo frente
a la IL-1? se obtiene tanto en ganglios como en hemocitos de M. edulis después de la
adición “in vitro” de opiáceos, como algún análogo sintético de la Met-encefalina,
resultados similares a los obtenidos en linfocitos periféricos humanos (Stefano, G.B. et al.,
1991; Ottaviani, E. et al., 1993b).
Se ha visto que diferentes citoquinas (IL-1? , IL-2, TNF-? ) afectan a la misma
célula blanco (el hemocito), incrementando su actividad fagocítica, induciendo la
producción de NOS y liberando bioaminas. Esas múltiples funciones subrayan el hecho de
que una de las características de las citoquinas de los mamíferos, como es su
pleiotropicidad, ha sido preservada a través de la evolución (Akira, S. et al., 1990).
El conocimiento de los mecanismos de defensa y resistencia a enfermedades es
esencial en el estudio de la fisiología y patología animal. El mecanismo de defensa de
moluscos es relativamente poco conocido, y frecuentemente estudios experimentales se
han visto ralentizados por la falta de un adecuado modelo "in vitro" (Stein, H.M. et al.,
1996).
Los cultivos celulares viables, derivados de invertebrados marinos son necesarios
para prometedoras aplicaciones: diagnóstico patológico, estudios del tratamiento de
enfermedades, crecimiento y control en la reproducción de moluscos comerciales, diseños
de nuevos test toxicológicos para vigilar la calidad del agua, etc. Cultivos semejantes
pueden abrir el camino de la producción "in vitro" de moléculas complejas marinas, con
resultados farmacológicos o de interés industrial.
Se han mantenido cultivos primarios de células de invertebrados durante intervalos
de tiempo del rango de varias horas, varios semanas, o varios meses, pero su funcionalidad
es incierta y su crecimiento limitado (Lenoir, L., 1989; Auzoux, S. et al., 1993; Odintsova,
N.A. y Khomenko, A.V., 1991). Aunque algunos autores hablan de incremento en el
número de células (Brewster, F. y Nicholson, B.L., 1979) o de procesos mitóticos (Lenoir,
F., 1989), todavía no se han establecido líneas celulares consecutivas debido al fracaso de
las sucesivas pruebas con estas células.
Pero la mayor dificultad es la frecuente contaminación por protozoos, bacterias y
hongos que provocan la pérdida de la mayoría de los cultivos. Muchos de los autores
indican la carencia de datos relacionados con la fisiología de estas células "in vitro", de la
ausencia de un medio de cultivo apropiado y de condiciones que expliquen la baja
frecuencia de mitosis observada (Domart-Coulum, J. et al., 1994; Mialhe, E. et al ., 1988).
OBJETIVOS
2.- OBJETIVOS
En todos los animales el sistema inmune comprende elementos celulares y
humorales que actúan de manera conjunta para proteger a los organismos de patógenos,
parásitos o células neoplásicas. El componente celular de la inmunidad de invertebrados
está mediado por células sanguíneas (hemocitos), las cuales participan en los mecanismos
internos de defensa (Ratcliffe, N.A. et al., 1985; Smith, V.J., 1991). Sin embargo, no se
tiene un conocimiento detallado de las subpoblaciones de hemocitos de invertebrados y de
su implicación respectiva en los diferentes aspectos de defensa del huésped. Tal
información es particularmente limitada con respecto a los hemocitos de moluscos
bivalvos, que sólo han podido ser clasificados morfológicamente como células agranulares
y células granulares (Cheng, T.C., 1981).
La investigación de los mecanismos de defensa del mejillón, es de particular interés
debido a su prolífica distribución, su importancia en acuicultura y su empleo como modelo
para realizar estudios de polución ambiental (Dyrynda, E.A. et al., 1997).
Por este motivo, el objetivo global del presente trabajo es: el estudio del efecto de
diversas citoquinas y otros efectores en la respuesta inmune desarrollada por los
hemocitos de Mytilus galloprovincialis.
Para ello este objetivo general se divide en varios sub-objetivos que deben ser
cubiertos secuencialmente:
1.- Aislamiento de los hemocitos de M. galloprovincialis y estudio de poblaciones
celulares en la hemolinfa.
2.- Cultivo de hemocitos de Mytilus galloprovincialis.
3.- Estudio del efecto de diversos efectores sobre la expresión de la cadena ? del
receptor de IL-2 en hemocitos de mejillón en diferentes épocas del año.
4.- Estudio del efecto de diferentes inductores sobre la expresión de la PKA y PKC
en hemocitos de M. galloprovincialis en distintas épocas del año.
5.- Detección de diferentes catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina)
liberadas al medio, después de la incubación de los hemocitos de mejillón con diferentes
efectores durante los períodos invernal y estival.
MATERIAL Y MÉTODOS
3.- MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.- MATERIAL BIOLÓGICO
Se utilizaron mejillones de la especie Mytilus galloprovincialis Lmk. Los moluscos
fueron recogidos en una planta purificadora localizada en la ría de Betanzos (La Coruña).
Una vez en el laboratorio, se llevó a cabo la extracción de la hemolinfa.
3.2.- REACTIVOS
Para la preparación de las disoluciones y tampones se utilizaron reactivos de las
casas: Merck (Darmstad, Alemania); Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA); Boehringer
Mannheim (Mannheim, Alemania); Montplet & Esteban, Probus, Vorquímica (España). En
todos los casos fueron reactivos de grado analítico. El agua que se usó para las
disoluciones y tampones fue desionizada.
El medio de cultivo Leibovitz L-15 (L-glutamina), y el suero fetal de ternero (FCS)
se obtuvieron de Biochrom K.G., Berlín.
Las electroforesis de poliacrilamida se realizaron con reactivos y aparatos de la
firma Bio-Rad (Richmond, USA), de la misma firma procedía la resina Affi-gel? Blue. Las
membranas de nitrocelulosa para la transferencia de proteínas, así como los sistemas de
quimioluminiscencia (ECL) y el kit de Biotrak utilizado para la detección de diferentes
catecolaminas fueron proporcionados por Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala,
Sweden) de la misma firma procedía la resina SephadexTM G-25 Fine.
El anticuerpo para la identificación de la subunidad ? del receptor de IL-2, fue de la
firma Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, C.A., USA). Los anticuerpos anti IgG de
conejo y anti IgG de ratón conjugados con peroxidasa fueron de la firma Sigma Chemical
Co. (St. Louis, USA). De la misma firma procedían la IL-2 recombinante humana, BSA,
LPS, CRF, ACTH 1-24, TGF-? 1, EGF, PDGF, gentamicina, estreptomicina, penicilina G,
anfotericina B, Azul de Coomassie R-250 e IgG,? de ratón conjugado con R-ficoeritrina.
Suramina, Bisindolilmaleimida I y H-89 fueron obtenidos de Calbiochem? ,
Alemania. Pharmingen (San Diego, USA) proporcionó el anticuerpo monoclonal de ratón
anti IL-2R? humano conjugado con ficoeritrina.
Los anticuerpos anti-PKC de mejillón y anti-PKA de mejillón fueron cedidos por el
Dr. Mercado y el Dr. Villamarín respectivamente.
La membrana Immobilon-P? (PVDF), y los filtros Millex 0,45 ?m y Sterivac TM-
GP10 0,22 ?m fueron de Millipore.
3.3.- APARATOS
Para la manipulación en condiciones estériles se utilizó una campana de flujo
laminar Telstar AH-100.
Las centrifugaciones para el lavado de hemocitos, así como la obtención de lisados
celulares se realizaron en centrífugas Denver Instrument, Centromix Selecta y BHG-
Herma Z229.
Las centrífugas utilizadas para la detección de catecolaminas fueron una Heraeus
Sepatech y una Heraeus Instruments.
Para el mantenimiento de los hemocitos en condiciones estables se utilizó una
estufa P. Selecta.
Para determinar el pH de los tampones se utilizó un pHmetro Crison modelo
microdigit-2001. El osmómetro utilizado para determinar la osmolaridad fue un Osmomat
030 de la casa Gonotec. El autoclave fue de la casa Matachana.
Los tratamientos térmicos, se realizaron en un baño termostatizado Selecta
Precisterm S-138.
El microscopio utilizado en las observaciones celulares fue un Olimpus CX40.
El material fotográfico fue de la firma Kodak (Biomax MS) y Agfa (Curix R2),
realizándose el revelado de las placas con un equipo automático de la firma Agfa-Gevaert,
modelo Gevamatic 60.
Las incubaciones a 4ºC y en movimiento continuo se realizaron en un Mixing Rotor
de la casa Renner GmbH.
El citómetro de flujo Ortho/Cytoron Absolute de Ortho-Clinical Diagnostics
Johnson & Johnson se utilizó para el análisis de las muestras.
Las placas de silicagel utilizadas en la cromatografía en capa fina fueron de Merck.
La visualización de las diferentes catecolaminas a 254 nm se realizó con una
lámpara de la casa Vilber Lourmat.
El contador de centelleo Beckman LS 6000TA se utilizó para la cuantificación de
Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina.
3.4.- PROCEDIMIENTOS GENERALES
Todas las manipulaciones de las células se realizaron en condiciones estériles;
también fueron esterilizados los disolventes y el material empleado en el aislamiento
celular. La esterilización de la solución antiagregante de Alsever (ALS) se hizo por
filtración a través de membrana Millipore de 0,22 ?m al igual que la solución de ALS y
formol 6% utilizada para fijar células.
Las sales añadidas al medio de cultivo se esterilizaron por filtración a través de
filtros Millipore de 0,45 ?m.
3.5.- EXTRACCIÓN DE HEMOLINFA Y OBTENCIÓN DE HEMOCITOS
Para obtener hemolinfa, con ayuda de una lima, se realizó una incisión en la unión
de las dos valvas del mejillón a la altura del músculo aductor posterior.
La hemolinfa fue extraída del seno de este músculo con una aguja y jeringa de 2 ml
estériles que contenía 1 ml de ALS (glucosa 20,0 g/l, citrato sódico 8 g/l, EDTA 3,36 g/l,
ClNa 22,5 g/l, pH 7, 1000 mOs) (figura 19). Esta operación se repitió el número de veces
necesarios hasta extraer la hemolinfa del total de los mejillones, obteniéndose un volumen
final de 40 ml que contenía aproximadamente 9x106 células (hemocitos). El recuento de las
células se realizó en cámara de Thoma empleando como colorante vital Trypan Blue.
Figura 19 .- Extracción de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis.
3.6.- TINCIÓN DE HEMOCITOS DE MEJILLÓN
Los hemocitos se tiñeron con la solución colorante de May-Grünwald.
Técnica de Auffret:
Las células se fijaron durante 5 min en glutaraldehído diluido al 1,25% en tampón
fosfato 0,1 M a pH 7,4 suplementado con ClNa para ajustar la osmolaridad a 1010 mOs.
Después de la fijación y de un lavado en agua (1 min) y secado al aire, las preparaciones se
incubaron en las distintas tinciones como sigue: 3 min en May-Grünwald diluido 1/1 en
tampón fosfato (0,1 M, pH 7,2) y 10 min en Giemsa diluido 1:20 en tampón fosfato (0,1
M, pH 7,2). Al finalizar la tinción, se hizo un lavado en agua (1 min) y se dejaron secar las
preparaciones.
3.7.- MANTENIMIENTO DE HEMOCITOS EN CULTIVO
Una vez lavados los hemocitos y eliminadas las impurezas, se resuspendieron en
medio Leibovitz L-15 comercial modificado al añadir una mezcla de sales esterilizadas por
filtración a través de filtros de 0,45 ?m que contenía: ClNa (20,2 g/l), KCl (0,54 g/l),
CaCl2 (0,6 g/l), MgSO4 x 7 H2O (1g/l), MgCl2 x 6 H2O (3,9 g/l), glucosa (20,8 g/l), (pH 7
y osmolaridad 1000 mOs) también se añadió al medio penicilina G (100 units/ml),
estreptomicina (100 ?g/ml), gentamicina (40 mg/ml) y anfotericina B (0,1 ?g/ml) para
evitar el desarrollo microbial. Posteriormente se mantiene a 4.
El medio Leibovitz L-15 fue utilizado suplementado con FCS (10% v/v) o
hemolinfa (10% v/v) previamente inactivados de la siguiente manera:
a) FCS: se deja 30 min. a temperatura ambiente, posteriormente se pone a 37ºC
para descongelar completamente y a continuación se calienta en un baño a 55ºC durante
una hora o más.
b) Hemolinfa: después de calentarla 30 min. a 56ºC, se centrifuga a 12000g durante
15 min. y posteriormente se filtra a través de filtros de 0,45 ?m.
Una vez resuspendidos los hemocitos en medio Leibovitz L-15 suplementado con
FCS o hemolinfa se mantienen en frascos de cultivo a una temperatura constante de 20ºC
(figura 20).
3.8.- CITOMETRÍA DE FLUJO
3.8.1.- PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE HEMOCITOS
La hemolinfa se almacenó en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Con el fin de lavar los
hemocitos y eliminar restos de impurezas, se centrifugaron tres veces durante 5 min. a
7000 rpm y a temperatura ambiente. Después se añadieron 10 ? l del anticuerpo
monoclonal de ratón anti-IL-2R? humano conjugado con ficoeritrina (8,3 ?g/ml) a las
muestras y 1,3 ? l del anticuerpo IgG,? de ratón conjugado con R-ficoeritrina (8,3 ?g/ml) al
Figura 20.- Mantenimiento de los hemocitos en frascos de cultivo
control. Después de 30 min. de incubación a 4ºC y con agitación, se realizaron dos lavados
con ALS y se añade a los tubos 1 ml de ALS y formol 6% para proceder a su análisis
mediante citometría.
3.8.2.- ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS POR CITOMETRÍA DE FLUJO
(FACS)
En primer lugar se ajustaron los parámetros de dispersión frontal (FS) y de
dispersión lateral (SS) mediante un calibrado con partículas comerciales de tamaño
conocido. Para el tipo de muestra a analizar (hemolinfa de mejillón) se definieron dos
regiones llamadas región A y región B (figura 21). Las células de la región A son de mayor
tamaño y mayor complejidad mientras que las células de la región B son de menor tamaño
y de menor complejidad estructural.
FS
SS
Figura 21.- Distribución de células presentes en hemolinfa de M. galloprovincialis y selección de las regiones de interés FS: dispersión frontal; SS: dispersión lateral.
Una vez seleccionada la región de interés (región A), en donde los hemocitos
expresan la cadena ? del receptor de IL-2, se estudia esta subpoblación celular marcada
por ficoeritrina utilizando histogramas en los que se indica la intensidad de fluorescencia
frente al número de células (figura 22).
Para el análisis de los resultados obtenidos, se utilizaron los histogramas que
representan la fluorescencia en naranja (OR/FL) frente a la fluorescencia en verde
(GR/FL), permitiéndonos una mejor visualización de los datos y una clara diferenciación
en la expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en células control y células activadas
con el efector correspondiente (figura 23).
Figura 22. - Histogramas correspondientes a los hemocitos de mejillón A: Representa el número de células frente a la intensidad de fluorescencia B: Representa la fluorescencia en el naranja frente a la fluorescencia en el verde.
1000
100
10
10 100 1000 1
1
(NONE)/OR-FL
(NONE)/GR-FL
Intensidad de fluorescencia
Número de células
A B
3.9.- WESTERN -BLOTTING
3.9.1.- PREPARACIÓN DEL TAMPÓN DE LISIS CELULAR
Se preparó una disolución de Hepes 20 mM, Triton X-100 al 0,5% (pH 7,4). Esta
disolución se guardó a 4ºC para su utilización posterior en los distintos experimentos.
A
FS
SS
1000
100
10
10 100 1000
1
(NONE)/OR-FL
(NONE)/GR-FL
(NONE)/OR-FL
1000
100
10
1
1 10 100 1000
(NONE)/GR-FL
B
C
Figura 23.- Activación de los hemocitos cultivados en medio L-15 suplementado con FCS durante tres días. A: Distribución de células presentes en hemolinfa de M. galloprovincialis B: Histograma de células no activadas C: Histograma de células activadas con un determinado efector
3.9.2.-TAMPÓN DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DE MEMBRANAS
Se preparó una disolución de MES 20 mM (pH 6,5), EGTA 10 mM, EDTA 2 mM,
sacarosa 250 mM, ? -mercaptoetanol 10 mM, glicerol 10%, Triton X-100 al 1%.
3.9.3.- PREPARACIONES DE LISADOS DE HEMOCITOS
Las suspensiones celulares de hemocitos obtenidas como se ha descrito
anteriormente (apartado 3.5) se lavaron con ALS, centrifugándose durante 5 min. a 7000
rpm y a temperatura ambiente. El sobrenadante se trasvasó a tubos eppendorf y se congeló
para su posterior utilización. El precipitado de células se resuspendió en 150 ? l de tampón
de lisis celular y se mantuvo 15 min. a 4ºC. Posteriormente se centrifugó durante 10 min. a
máxima velocidad retirando 120 ? l de sobrenadante a los que añadimos 25 ? l de Sample
Buffer (agua destilada 2 ml, tampón Tris HCl 1,5 mM (pH 8,8) 2 ml, solución SDS 10 %
1,6 ml, glicerol 1,3 ml, ? -mercaptoetanol 0,4 ml, bromofenolblue 0,05% 0,7 ml). El pellet
restante se resuspendió en 150 ? l del tampón de extracción de proteínas de membrana y se
mantuvo 15 min en agitación. Posteriormente se centrifugó durante 10 min. a máxima
velocidad retirando 120 ? l de sobrenadante a los que añadimos 25 ? l de Sample Buffer.
Las dos muestras (lisados de hemocitos y lisados de membranas) tratadas con Sample
Buffer se calentaron a 90-100ºC durante 5 min., e inmediatamente se enfriaron en hielo.
3.9.3.1.- Cromatografía de afinidad
En el caso particular de la PKA, las muestras de lisados de hemocitos y de
membranas se pasaron a través de dos resinas:
a) Resina SephadexTM G-25 Fine: para la dialización de las muestras.
b) Affi-gel Blue: con el fin de retener proteínas de la familia de la albúmina que
interferían debido a su tamaño con la subunidad reguladora de la PKA.
El tamaño de las columnas utilizadas fue de 9 cm de largo por 6 mm de diámetro.
El procedimiento se realizó de la siguiente manera:
Una vez preparadas las columnas con lana de vidrio en el extremo inferior, se
añadieron 500 ? l de la resina G-25, a continuación, lavamos dos veces con 500 ? l del
tampón A (tampón fosfato 20 mM pH 7,1).
Después de la filtración de las muestras a través de filtros de 0,45 ?m se añaden a
las columnas y se centrifugan a 8000 rpm durante 15 min. Una vez obtenidas las muestras
se les añade 100 ? l del tampón A y se pasan a través de columnas que contienen 500 ? l de
la resina Affi-gel Blue , previamente lavadas con el tampón A, se centrifugan a 8000 rpm
durante 15 min. y la muestra obtenida se trata con Sample Buffer, se calienta a 90 - 100ºC
durante 5 min. e inmediatamente se enfría en hielo.
3.9.4.- ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA-DODECIL SULFATO SÓDICO (SDS-PAGE)
Se realizó según el método de Laemmli (1970) utilizando placas en las cuales se
construyen dos geles de diferentes concentraciones de acrilamida / bisacrilamida. Dichos
geles se prepararon a partir de las siguientes soluciones:
Solución Bis-acrilamida:
Acrilamida: N,N’- Metilenbisacrilamida
(Se utilizó una mezcla comercial de Bio-Rad 30% Acrilamida/Bis Solución 30:0,8)
Tampón Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
(18,15 g de Tris en 100 ml de agua. Conservar a 4ºC).
Tampón Tris- HCl 0,5 M pH 6,8
(Se disuelven 6 g de Tris en un pequeño volumen de agua. Llevar el pH a 6,8 y
enrasar a 100 ml. Conservar a 4ºC).
Solución de SDS 10%
(Se pesa 1 g de SDS y se lleva a 10 ml. Conservar en alícuotas).
Tampón de muestra
Se realizó con los materiales que se describen a continuación y en las proporciones
indicadas para una muestra estándar:
Agua destilada 4 ml
Tris HCl 0,5 M pH 6,8 1,0 ml
Glicerol 0,8 ml
SDS 10% 1,6 ml
? - Mercaptoetanol 0,4 ml
0,05% bromofenol 0,2 ml
Tampón de electroforesis:
Se pesaron 15 g de Tris y 72 g de glicina. Al conjunto se añaden 5 g de SDS y la
mezcla se disolvió en 500 ml de agua. Se valora el pH que debe ser 8,3 y se enrasa la
solución a 1 litro. Esta solución debe diluirse cinco veces antes de utilizarse.
Solución de Persulfato amónico 10%:
(Se disuelven 0,025 g en 250 ? l de agua. Debe ser preparado diariamente)
Preparación del gel:
Todo el material debe ser limpiado cuidadosamente: cubetas, cristales, goma. Una
vez montados los cristales de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se deposita la
mezcla correspondiente al gel de poliacrilamida de la mayor proporción o gel separador. El
depósito se realizó con sumo cuidado, para no formar burbujas. Se añadió un poco de
isopropanol para evitar la formación del menisco y se esperó la polimerización. Una vez
polimerizado se retiró el agua y se depositó el segundo gel, de menor proporción de
acrilamida, o gel concentrador. En este mismo momento se introdujo entre los cristales, el
peine para formar los pocillos de muestra y se dejó polimerizar.
Preparación de los geles:
Gel separador (12%)
Agua milli QR 3,35 ml
Tampón Tris-HCl 1,5M pH 8,8 2,5 ml
Acrilamida 4 ml
SDS 10% 100 ? l
Temed 5 ? l
Persulfato amónico 50 ? l
Gel concentrador (4%)
Agua milli QR 6,1 ml
Tampón Tris-HCl 0,5M pH 6,8 2,5 ml
Acrilamida 1,3 ml
SDS 10% 100 ? l
Temed 10 ? l
Persulfato amónico 50 ? l
Una vez equilibrado el gel, se cargan las muestras y los marcadores de peso
molecular. Se cargó en cada calle el extracto citosólico obtenido a partir de 106 células. Se
rellenaron las cubetas con tampón y se conectó al alimentador de corriente.
La electroforesis se realizó durante unos 45-60 min con un voltaje de 180 V y en
cámara fría con el fin de compensar el aumento de temperatura que se produce por efecto
Joule.
Cuando el marcador de la electroforesis llega a unos dos milímetros del final del gel
se corta el paso de corriente y se extrae el gel para transferir las proteínas a una membrana
de nitrocelulosa, o bien para teñirlo con Coomassie (isopropanol 20%, ácido acético 7% y
coomassie blue R-250 1%) durante una media hora y después desteñirlo ( 400 ml metanol,
100 ml ácido acético, 500 ml Agua milli QR ) y secarlo en el secador de geles.
Como marcadores de peso molecular se utilizaron las siguientes proteínas: Miosina
(200 kDa), ? -galactosidasa (135 kDa), Seroalbúmina bovina (81 kDa), Anhidrasa
carbónica (41 kDa), Inhibidor de la tripsina de soja (31,4 kDa), Lisozima (18 kDa), y
Apoproteína (6,9 kDa) (Bio Rad Kaleidoscope Prestaines 161-0324).
3.9.5.- INMUNODETECCIÓN
Tras realizar la correspondiente electroforesis, las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa de acuerdo con las condiciones del fabricante. Se sumergió el
sandwich con el gel de poliacrilamida y la membrana de nitrocelulosa en tampón de
transferencia (Tris-HCl 20 mM, glicina 150 mM y 20 % metanol pH 8) y se dejó durante
toda la noche con una corriente de 30 V. Tras la transferencia se recoge la membrana y los
lugares no específicos se bloquean mediante incubación con leche en polvo desnatada.
Para comprobar la bondad de la transferencia, la membrana puede ser teñida con
una solución al 0,1 % de Rojo Ponceau en ácido acético al 5 %.
Una vez realizada la transferencia y el bloqueo de la membrana con una solución de
leche descremada al 10 % en TTBS durante 3 a 5 horas a temperatura ambiente, se lavó la
membrana con TTBS durante un minuto para a continuación realizar dos lavados de 10
min.
TBS: Tris-HCl (pH 7,5) 20 mM, 0,15 M ClNa
TTBS: TBS + 0,05 % de Tween 20
Se incubó la membrana con anticuerpo anti IL-2R? diluido en TBS (1/1000)
durante una hora a temperatura ambiente. Seguidamente se lavó la membrana 1 minuto con
TTBS y se realizaron cuatro lavados de diez minutos con la misma solución
A continuación se incubó la membrana con el segundo anticuerpo (anti IgG de
conejo conjugado con peroxidasa (1/4000)) durante una hora a temperatura ambiente.
Se repitió el proceso con cuatro lavados de la forma realizada anteriormente y
finalmente se procedió al desarrollo del revelado por luminiscencia, en cámara oscura y
exponiendo una placa fotográfica durante un tiempo variable. Posteriormente la placa
fotográfica se reveló mediante un sistema automático.
Este proceso se realizó exactamente igual para las incubaciones de la membrana
con los anticuerpos: anti PKA (1/3000) y anti PKC (1/500) utilizando en el caso de la PKC
anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa (1/4000) como segundo anticuerpo.
3.10.- DETECCIÓN DE CATECOLAMINAS
Las soluciones empleadas en la detección de catecolaminas fueron las siguientes:
Solución estándar: contiene 500 ? l de una solución de L-noradrenalina, L-
adrenalina y dopamina a una concentración de 100 ?gr/ml en glutation ácido. Conservar a -
20ºC.
Solución estabilizante: contiene 500 ? l de una solución ácida de glutation.
Conservar a -20ºC.
Solución tampón : contiene 2 ml de una solución Tris (pH 8,5) que contiene etileno
glicol-bis N,N'-ácido tretraacético (EGTA) y MgCl2. Conservar a -20ºC.
Solución trazadora ([3H] SAM): contiene S-adenosil-L-[metil-3H]-metionina, 9,25
MBq, 25 ? l Ci en HCl: etanol (9:1) (pH 2,1). Conservar a -20ºC.
Solución COMT: contiene 500 ? l de una solución de catecol-O-metiltrasferasa de
hígado de rata en tampón Tris conteniendo glutation, dihidrocloruro de bencilhidroxiamina
y ditiotreitol. Conservar a -20ºC.
Solución stop: contiene 5 ml de una solución de normetanefrina, metanefrina y
metoxitiramina (4 mM) en tampón que contiene EDTA a pH 11. Conservar a -20ºC.
Solución metaperiodato: contiene 10 ml de una solución al 4 % (w/v) de
metaperiodato de sodio. Conservar a -20ºC.
Solución glicerol: contiene 10 ml de una solución al 10 % (v/v) de glicerol.
Conservar a -20ºC.
Una vez obtenido el sobrenadante del cultivo celular como se ha descrito
anteriormente (apartado 3.9.3) se añaden 20 ? l de la mezcla EGTA/glutation reducido (90
mg/ml EGTA, 60 mg/ml glutation, pH 7,4) por cada ml de muestra. A continuación se
lleva a cabo la mezcla de reacción.
Al blanco se le añade 50 ? l de FCS y 10 ? l de la solución estabilizante (1/10000).
A las muestras se les añade 50 ? l del sobrenadante del cultivo celular y 10 ? l de la
solución estabilizante y a los estándars se les añade 50 ? l de sobrenadante y 10 ? l de la
solución estándar (1/10000). Para finalizar la mezcla de reacción se les añade a todas las
muestras 40 ? l del reactivo mezcla que contiene agua destilada, solución tampón, solución
trazadora y solución COMT. Posteriormente se centrifuga a 300g durante 30 seg., se
incuba una hora a 37ºC, y se llevan los tubos a un baño con hielo. A continuación, se añade
50 ? l de solución stop y 2 ml de la mezcla tolueno-isoamilalcohol (3:2 v/v) a todas las
muestras, se mezclan vigorosamente y se centrifugan a 800g durante 2 min., se congelan
15 seg. en nitrógeno líquido y se decanta la fase orgánica superior en tubos con 100 ? l de
ácido acético 0,1 M y se repite el proceso de mezcla, centrifugación y congelación en
nitrógeno líquido. En el siguiente paso se descarta la fase superior orgánica, se deshiela la
fase acuosa del ácido acético, se añade 1 ml de tolueno-isoamilalcohol y a continuación se
mezcla, centrifuga, congela, y se descarta la fase orgánica superior. Se añade 100 ? l de
etanol absoluto sobre el ácido acético descongelado, se mezcla y se centrifuga a 800g
durante 1 min. A continuación se aplica toda la mezcla en el extremo inferior de la placa
cromatográfica y una vez seca se coloca la placa en el tanque que contiene
alcohol/benceno/metilamina (6:2:3 v/v). Después de que el solvente llege al extremo
superior de la placa, se quita del tanque, se seca y se visualiza a 254 nm, se marca la zona
del silicagel correspondiente a cada catecolamina, se raspa la placa introduciendo el
silicagel en el vial correspondiente y se analiza el contenido de cada catecolamina de
manera diferente:
DOPAMINA
Se añade 1 ml de hidróxido de amonio a cada vial y 4 ml de líquido de centelleo.
ADRENALINA
Se añade 1 ml de hidróxido de amonio a cada vial, 50 ? l de la solución de
metaperiodato de sodio, 50 ? l de glicerol, 1 ml de ácido acético y 2 ml del líquido de
centelleo.
NORADRENALINA
Se añade 1ml de hidróxido de amonio a cada vial, 50 ? l de la solución
metaperiodato de sodio, 50 ? l de glicerol, 1 ml de ácido acético y 2 ml del líquido de
centelleo.
Finalmente se obtuvieron las cuentas por minuto (cpm) en el contador de partículas
? .
Para el cálculo de la concentración de catecolaminas (pg/ml) se utilizó la fórmula:
3.11.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para calcular los valores promedio de la concentración de las diferentes
catecolaminas se utilizó la prueba T de Student.
Los valores promedio, error estándar, así como la prueba T se realizaron con el
paquete estadístico SPSS 10.1 (SPSS Inc.)
cpm (muestra) - cpm blanco
cpm (muestra + estándard) - cpm muestra
pg estándard
vol. muestra (ml)
x
RESULTADOS
4.- RESULTADOS
4.1.- ESTUDIO DE POBLACIONES CELULARES EN HEMOLINFA DE
MEJILLÓN.
En la hemolinfa de M. galloprovincialis Lmk. se han detectado dos tipos diferentes
de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas (células RH)
(figura 24), con un núcleo muy grande y un pequeño volumen de citoplasma que a veces
es tan sólo un halo alrededor del núcleo.
El segundo tipo de células encontradas en la hemolinfa de M. galloprovincialis
presentan un mayor tamaño y un citoplasma expandido (células SH) (figura 25).
.
Figura 24.- Células RH de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk.
4.2.- CULTIVO DE HEMOCITOS DE M. GALLOPROVINCIALIS.
Para el mantenimiento del medio de cultivo en condiciones óptimas se realizó un
antibiograma (tabla 5) en el que se observa que las bacterias presentes en la hemolinfa de
ANTIBIÓTICOS GRAM + GRAM –
AMPICILINA S R
GENTAMICINA S S
CANAMICINA S S
TETRACICLINA S S
ÁCIDO NALIDÍXICO R R
CLORANFENICOL S S
NITROFURANTOÍANA R R
TRIMETROPÍN S R
CEFATAXINA S R
CEFOSITINA S R
Tabla 5 .- R: resistente S: sensible.
Figura 25.- Células SH de hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk.
los mejillones son sensibles a la gentamicina, de ahí que se incorpore al medio de cultivo
este antibiótico. Además también se añadió anfotericina B para evitar el crecimiento de
hongos.
Las figuras 26 y 27 muestran la viabilidad de células mantenidas en medio de
cultivo L-15 con FCS y hemolinfa, respectivamente. Esta viabilidad dependió de las
concentraciones de anfotericina B añadidas al medio, obervándose una mayor viabilidad
(más de 36 días) con la menor concentración del antifúngico.
Figura 26.- Viabilidad expresada en días, de las células mantenidas en medio de cultivo L-15 suplementado con FCS.
0
1
2
3
0 7 17 27 36
DÍAS DE CULTIVO
Nº
DE
CÉ
LULA
(X
1O6
)
Anfotericina B 1 µg/mlAnfotericina B 0,5 µg/mlAnfotericina B 0,25 µg/mlAnfotericina B 0,1 µg/ml
Figura 27.-Viabilidad expresada en días, de las células mantenidas en medio de cultivo L-15 suplementado con hemolinfa.
0
1
2
3
0 7 17 27 36
DÍAS DE CULTIVO
Nº
DE
CÉ
LU
LA
S (X
106 )
Anfotericina B 1µg/ml
Anfotericina B 0,5 µg/ml
Anfotericina B 0,25 µ/ml
Anfotericina B 0,1 µg/ml
Por otra parte, en las figuras 28 y 29 se puede observar, a través de la expresión de
la cadena ? del receptor de IL-2 (con o sin estimulación), una mayor respuesta al tercer
día de cultivo en L-15 suplementado con FCS o hemolinfa respectivamente.
Figura 28.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se activaron incubándose con IL-2 (0,01?g/ml) durante 15 min, manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
20
40
1 3 5 7 9
DÍAS DE CULTIVO
AC
TIV
AC
IÓN
(%)
CONTROL
CÉLULAS ACTIVADAS
Figura 29.-Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se activaron incubándose con IL-2 (0,01?g/ml) durante 15 min, manteniéndose en medio L-15 con hemolinfa.
0
4
8
12
16
1 3 5 7 9
DÍAS DE CULTIVO
AC
TIV
AC
IÓN
(%)
CONTROL
CÉLULAS ACTIVADAS
4.3.- ESTUDIO DEL EFECTO DE DIVERSOS EFECTORES EN
HEMOCITOS DE MEJILLÓN EN DIFERENTES ÉPOCAS DEL AÑO.
4.3.1.- LPS
Después de incubar los hemocitos con LPS (5 ?g/ml) en el período invernal no se
observan cambios en el patrón electroforético (figura 30), ni en la expresión de la cadena
? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 31).
Sin embargo por citometría (figura 32) se observa un incremento en la
concentración de esta subunidad a los 30 segundos de incubación con dicho efector.
6
3
Figura 30.- Electroforesis de células activadas con LPS. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min
5
C C C M M M
1 2 4 6 MA
Figura 31.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.
M
3
50 kDa
2
C C C
1 4 5
M M
6
Como se muestra en la figura 33 al estudiar por western blotting la expresión de la
subunidad reguladora de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) no se observan
diferencias al incubar los hemocitos con LPS, siendo mayor su expresión en el extracto
citosólico que en la membrana, no obstante para la proteína quinasa C (figura 34) se
observa un aumento en la expresión de esta enzima en el extracto citosólico de hemocitos,
pero la translocación de la enzima a la membrana en células activadas durante 30 minutos
y 30 segundos se inhibe.
Figura 32.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con LPS a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS
Figura 33.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 34.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
020406080
100120
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Además, en células estimuladas con LPS y puestas en contacto con
Bisindolilmaleimida I (inhibidor de la PKC) (figura 35) se observa que el efecto provocado
por el LPS desaparece.
Este efector también conduce a una liberación de catecolaminas (tabla 6),
observándose un incremento en la liberación de Dopamina y Noradrenalina a los 30
minutos de estimulación, mientras que para la Adrenalina el mayor incremento se produce
a los 60 minutos de incubar las células con dicho efector.
105
Figura 35.- Western blotting de hemocitos estimulados con LPS e incubados con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 60 min. 3 y 6 Células activadas con LPS y BISINDOLILMALEIMIDA durante 60 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108
kDa
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
2114,45 ? 0,45 ***
160,10 ? 0,10***
3377,25 ? 0,25***
60 MINUTOS
435,02 ? 0,02 ***
234,28 ? 0,28***
931,25 ? 0,25***
Sin embargo, como se puede observar en la tabla 7, las células estimuladas con
LPS y tratadas con inhibidores de la PKC, PKA y proteínas G pierden la capacidad de
liberar catecolaminas.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
LPS
435,02 ?0,02
234,28 ? 0,28
931,25 ? 0,25
LPS + BSM
10,18 ? 0,18***
9,03 ? 0,03***
16,10 ? 0,10***
LPS + H-89
ND
16,10 ? 0,10***
ND
LPS + SURAMINA
ND
ND
ND
Tabla 6.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.
Tabla 7.-: Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS y el inhibidor correspondiente durante 60 minutos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001) ND: no detectado.
Con respecto a los hemocitos estimulados con LPS durante el período estival
tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético (figura 36), sin embargo
después de un período de estimulación de 30 segundos y 30 minutos se observa una mayor
expresión de IL-2R? en el citoplasma celular (figura 37).
En estudios de citometría (figura 38) se ha observado que este efector induce un
incremento en la concentración de la cadena ? del receptor de IL-2 en la membrana celular
después de 3 y 60 minutos de estimulación.
3
Figura 36.- Electroforesis de células activadas con LPS. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.
5
C C C M M M
1 2 4 6 MA
Figura 37.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 60 min.
2 3
50 kDa
1 4 5 6
C C C M M M
Figura 38.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con LPS a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Por otra parte, al estudiar por western blotting la expresión de la subunidad
reguladora de la PKA (figura 39) no se observan diferencias, sin embargo, la concentración
de la PKC (figura 40) disminuye en el extracto citosólico al incubar los hemocitos con
LPS, mientras que en la membrana desaparece.
Como se puede observar en la tabla 8 durante este período la liberación de
catecolaminas inducida por LPS es menor que en invierno.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
67,09 ? 0,09***
1,01 ? 0,01***
32,27 ? 0,27***
60 MINUTOS
110,34 ? 0,34***
45,11 ? 0,11***
200,15 ? 0,15***
Tabla 8.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con LPS en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001). ND: no detectado.
Figura 39.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30 min.
54 kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108
Figura 40.- Células activadas con LPS e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con LPS durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con LPS durante 30min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
4.3.2.- CRF
En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con CRF (100
ng/ml), no se observan cambios en el patrón electroforético (figura 41), sin embargo se
observa una mayor expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico,
después de un período de estimulación de 30 minutos (figura 42).
En estudios citométricos, (figura 43) este efector induce un aumento en la expresión
de IL-2R? en la membrana, después de 30 segundos y 60 minutos de incubación.
1 2 3 4 5 6
Figura 42.- Células activadas con CRF e incubadas con anti -IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
50 kDa
C C C M M M
Figura 41.- Electroforesis de células activadas con CRF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
Como se muestra en la figura 44 al estudiar por western blotting la expresión de la
subunidad reguladora de la proteína quinasa A, se detecta su presencia en el citosol y la
membrana, sin embargo, en el estudio de la proteína quinasa C (figura 45) se detecta una
translocación del citosol a la membrana en hemocitos incubados con dicho efector durante
30 minutos.
Figura 43.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con CRF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
Figura 44.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
54 kDa
Figura 45.- Células activadas con CRF e incubadas con anti- PKC. Calles 1 a 3 : Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se observa en la tabla 9 la liberación de catecolaminas inducida por CRF es
bastante baja.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
19,33 ? 0,33***
11,26 ? 0,26**
37,03 ? 0,03***
60 MINUTOS
11,45 ? 0,45**
ND
0,23 ? 0,23 ns
Después de incubar los hemocitos con CRF en el período estival, no se observan
cambios en el patrón electroforético (figura 46), ni en la expresión de la cadena ? del
receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 47).
Tabla 9.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con CRF en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, **p < 0,01, ns: no significativo). ND: no detectado.
50kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
Figura 47.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min. Figura 46.- Electroforesis de células activadas
con CRF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
Por citometría de flujo, (figura 48) se observa que el CRF induce un incremento en
la concentración de la subunidad ? de dicho receptor depués de 5 y 60 minutos de
estimulación.
Como se puede observar en la figura 49 en hemocitos estimulados con CRF no se
detectan diferencias en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA, mientras que
para la PKC (figura 50) se aprecia una disminución de la expresión de la enzima en la
membrana en hemocitos incubados durante 30 segundos y 30 minutos.
Figura 49.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
54 kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108
Figura 50.- Células activadas con CRF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con CRF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con CRF durante 30 min.
M
1 2 3 4 5 6
C C C M M
kDa
105
Figura 48.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con CRF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Además, la liberación de catecolaminas también es nula en esta época del año.
4.3.3.- ACTH
En hemocitos estimulados con ACTH (100 ng/ml) en invierno, (figura 51) no se
observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión de la cadena ? del receptor
de IL-2 en el extracto citosólico (figura 52).
Sin embargo, como se puede observar en la figura 53, por citometría de flujo dicho
efector induce un aumento de IL-2R? después de la incubación de las células durante 1 y
15 minutos.
Figura 52.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
C
1 2 3 4 5 6
C C M M M
50 kDa
Figura 51.- Electroforesis de células activadas con ACTH. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
1 3 5
C C C M M M
2 4 6 MA
Como se puede observar en las figuras 54 y 55, en células activadas con ACTH no
se observan diferencias en la expresión de la PKA mientras que la PKC desaparece en la
membrana.
No obstante, en relación a la liberación de catecolaminas (tabla 10), se observa una
mayor liberación de Adrenalina a los 60 minutos y de Noradrenalina y Dopamina a los 30
minutos de incubación con dicho efector.
Figura 55.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
Figura 54.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
C
1 2 3 4 5 6
C C M M M
50 kDa
Figura 53.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
70,02 ? 0,02***
25,28 ? 0,28***
213,13 ? 0,13***
60 MINUTOS
49,35 ? 0,35***
69,18 ? 0,18***
104,08 ? 0,08***
En verano, tampoco se han detectado cambios en el patrón electroforético (figura
56), sin embargo, después de un período de estimulación de 30 minutos se observa una
disminución en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en el extracto
citosólico (figura 57).
Tabla 10.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001). ND: no detectado.
50kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
Figura 57.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
Figura 56.- Electroforesis de células activadas con ACTH. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
1 3 5
C C C M M M
2 4 6 MA
Por otra parte, como se observa en la figura 58, estudios de citometría han revelado
un incremento máximo en la expresión de IL-2R? en la membrana celular después de
incubar las células durante 3 minutos.
En hemocitos estimulados con ACTH (figura 59) no se observan diferencias en la
expresión de la subunidad reguladora de la proteína quinasa A, sin embargo (figura 60) al
estudiar la proteína quinasa C se detecta una disminución de la enzima en el citosol y una
clara translocación a la membrana en células incubadas durante 30 minutos con dicho
efector.
Figura 59.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
54 kDa
Figura 60.- Células activadas con ACTH e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con ACTH durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH durante 30 min.
105
1 2 3 4 54
6
C C C M M M
108
kDa
Figura 58.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS
0
10
20
30
40
50
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Como se observa en la tabla 11 , este efector induce además una mayor liberación
de Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina después de 30 minutos de incubación.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
20,45 ? 0,45**
69,27 ? 0,27**
68,32 ? 0,32***
60 MINUTOS
5,39 ? 0,39**
ND
38,40 ? 0,40***
4.3.4.- ACTH 1-24
Después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 (10 ?g/ml) en el período
invernal, (figura 61) no se observan cambios en el patrón electroforético, ni en la
expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 62).
Tabla 11.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedios ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.
Sin embargo por citometría, (figura 63) se observa un máximo en la concentración
de IL-2R? después de incubar las células durante 1 minuto con dicho efector.
Figura 63.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH 1-24 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
Figura 62.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
50 kDa
3
Figura 61.- Electroforesis de células activadas con ACTH 1-24. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min
5
C C C M M M
1 2 4 6 MA
0
20
40
60
80
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se puede observar en las figuras 64 y 65, al estudiar por western blotting la
expresión de la subunidad reguladora de la proteína quinasa A, no se detectan diferencias
en su expresión citosólica, mientras que la PKC desaparece en la membrana.
Como se observa en la tabla 12, el ACTH 1-24 induce un incremento en la
liberación de Noradrenalina después de la incubación de las células durante 60 minutos,
mientras que, la liberación de Dopamina y Adrenalina es nula.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
ND
ND
11,18 ? 0,18***
60 MINUTOS
ND
ND
219,03 ? 0,03***
Tabla 12.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.
Figura 64.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 65.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
Con respecto a los hemocitos estimulados con ACTH 1-24 durante el período
estival, (figura 66) tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético, sin
embargo, como se observa en la figura 67, después de un período de incubación de 30
minutos la IL-2R? no se detecta en el citoplasma celular.
En estudios de citometría, se ha observado que este efector induce un máximo
incremento en la expresión de dicha subunidad después de 30 minutos de incubación
(figura 68).
Figura 66.- Electroforesis de células activadas con ACTH 1-24. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min
5
C C C M M M
1 2 4 6 MA 3
Figura 67.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti- IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
50 kDa
Por otra parte, al estudiar la expresión de la subunidad reguladora de la PKA (figura
69), no se observan diferencias en su expresión, sin embargo la concentración de la PKC
disminuye en el extracto citosólico y desaparece en la membrana (figura 70).
Figura 68.- Porcentaje de células que expresan la cadena ?del receptor de IL-2. Las células se incubaron con ACTH 1-24 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
Figura 69.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKA Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
54 kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108
Figura 70.- Células activadas con ACTH 1-24 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con ACTH 1-24 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
0
10
20
30
40
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Como se puede observar en la tabla 13, en este período del año la liberación de
catecolaminas inducidas por ACTH 1-24 es baja.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
5,43 ? 0,43**
21,20 ? 0,20***
ND
60 MINUTOS
11,37 ? 0,37**
23,22 ? 0,22***
ND
4.3.5.- PDGF
En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con PDGF
(5 ng/ml) (figura 71) no se observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión
de la cadena ? del receptor de IL-2 (figura 72).
Tabla 13.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con ACTH 1-24 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, ** p < 0,01). ND: no detectado.
Sin embargo, como se observa en la figura 73, por citometría se detecta un
incremento significativo en la expresión de la IL-2R? después de la incubación de las
células durante 5 minutos.
Figura 72.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
M
3
50 kDa
2
C C C
1 4 5
M M
6
Figura 71.- Electroforesis de células activadas con PDGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
Figura 73.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con PDGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se observa en la figura 74, en células activadas con PDGF no se detectan
cambios en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA y tampoco en la expresión
de la PKC en el citosol, mientras que en membrana esta última desaparece (figura 75).
Como se observa en la figura 76, la translocación de la PKC a la membrana en
células activadas durante 60 minutos se inhibe, sin embargo, en células estimuladas con
PDGF y puestas en contacto con Bisindolilmaleimida I el efecto provocado por dicho
efector desaparece.
Figura 74.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calless 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 75.- Células activadas con PDGFe incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
108
Figura 76.- Western blotting de hemocitos estimulados con PDGF e incubados con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 60 min. 3 y 6 Células activadas con PDGF y BISINDOLILMALEIMIDA durante 60 min.
C C C M M M
1 2 3 4 5 6
105
kDa
Como se observa en la tabla 14, el PDGF también conduce a una mayor liberación
de Dopamina y Noradrenalina a los 30 minutos de incubación.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
316,40 ? 0,40***
ND
552,45 ? 0,45***
60 MINUTOS
217,45 ? 0,45***
ND
203,44 ? 0,44***
Sin embargo, cuando las células son estimuladas con PDGF y tratadas con
inhibidores de la PKC, PKA y proteinas G, los niveles de Dopamina y Noradrenalina
disminuyen mientras que los de adrenalina aumentan (tabla 15).
Tabla 14.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001). ND: no detectado.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
PDGF
217,45 ? 0,45
ND
203,44 ? 0,44
PDGF + BSM
ND
9,48 ? 0,48**
72,22 ? 0,22***
PDGF+H-89 50,40 ? 0,40*** 5,34 ? 0,34**
96,10 ? 0,10***
PDGF+ SURAMINA 3,21 ? 0,21*** 32,50 ? 0,50*** 107,49 ? 0,49***
Con respecto a los hemocitos estimulados con PDGF durante el período estival,
(figura 77) tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético, ni en la
expresión de IL-2R? , sin embargo, se observa un disminución en la concentración de la
subunidad después de un período de estimulación de 30 minutos (figura 78).
Tabla 15.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF y elinhibidor correspondiente durante 60 min. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001, **p <0,01). ND: no detectado.
50 kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
Figura 78.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
Figura 77.- Electroforesis de células activadas con PDGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
En estudios de citometría se ha observado que el incremento de la expresión de IL-
2R? después de la incubación de las células durante 5 y 60 minutos es menor que la
observada en invierno (figura 79).
En células activadas con PDGF, figura 80 y 81, no se observan diferencias en la
expresión de la subunidad reguladora de la PKA, sin embargo, este efector parece bloquear
la expresión de la PKC.
Figura 80.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 81.- Células activadas con PDGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con PDGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con PDGF durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
Figura 79.- Porcentaje de células que exp resan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con PDGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
50
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Como se observa en la tabla 16, el PDGF induce una mayor liberación de
catecolaminas después de 30 minutos de incubación con dicho efector.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
56,19 ? 0,19***
36,36 ? 0,36***
115,38 ? 0,38***
60 MINUTOS
28,42 ? 0,42***
ND
15,14 ? 0,14***
4.3.6.- TGF-ß1
En hemocitos estimulados con TGF-? 1 (0,1 ng/ml) en invierno, no se observan
cambios en el patrón de proteínas (figura 82), ni en la expresión de la cadena ? del
receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 83).
Tabla 16.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con PDGF en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.
Sin embargo por citometría de flujo, dicho efector induce un aumento de IL-2R?
después de 30 minutos de incubación con dicho efector (figura 84).
50kDa
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
Figura 83.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
Figura 82.- Electroforesis de células activadas con TGF-?1. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
1 3 5
C C C M M M
2 4 6 MA
Figura 84.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con TGF-?1 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se observa en las figuras 85 y 86, en células activadas con TGF-? 1 no se
observan diferencias en la expresión de la subunidad reguladora de la PKA ni en la
expresión de la PKC, mientras que en la membrana esta última desaparece.
Sin embargo, con respecto a la liberación de catecolaminas se observa, (tabla 17)
una mayor liberación de Dopamina y Adrenalina a los 30 minutos y de Noradrenalina a los
60 minutos de incubación con dicho efector.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
109,10 ? 0,10***
220,10 ? 0,10***
24,23 ? 0,23***
60 MINUTOS
102,45 ? 0,45***
61,14 ? 0,14***
143,12 ? 0,12***
Tabla 17.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con TGF-?1 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( *** p < 0,001). ND: no detectado.
Figura 86.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
Figura 85.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3:Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
C M
5 1 2 3 4 6
C C M M
54 kDa
En verano como se observan en las figuras 87 y 88, tampoco se han detectado
cambios en el patrón electroforético, sin embargo este efector parece bloquear la expresión
de la IL-2R? .
Estudios de citometría han revelado que este efector induce una mayor
concentración de la cadena ? del receptor de IL-2 en la membrana celular, después de 30
segundos de incubación (figura 89).
Figura 88.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
50 kDa
Figura 89.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con TGF-?1 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Figura 87.- Electroforesis de células activadas con TGF-?1. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
1 3 5
C C C M M M
2 4 6 MA
En hemocitos estimulados con TGF-? 1 no se observan diferencias en la expresión
de la subunidad reguladora de la PKA, ni en la expresión de la PKC (figuras 90 y 91 ).
Este efector induce un incremento en la liberación de Dopamina y Adrenalina y un
descenso en la liberación de Noradrenalina después de incubar los hemocitos durante 60
minutos (tabla 18).
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
17,40 ? 0,40**
18,30 ? 0,30***
32,03 ? 0,03***
60 MINUTOS
7602,10 ? 0,10***
61490,10 ? 0,10***
ND
Figura 90.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg.
3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 91.- Células activadas con TGF-?1 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con TGF-?1 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con TGF-?1 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108 105
kDa
Tabla 18.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con TGF-?1 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos ( ***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.
4.3.7.- EGF
En el período invernal, después de la incubación de los hemocitos con EGF (50
ng/ml) no se observan cambios en el patrón de proteínas, ni en la expresión de la cadena ?
del receptor de IL-2 (figuras 92 y 93).
Sin embargo por citometría (figura 94) se ha detectado un incremento significativo
en la expresión de IL-2R? a los 30 minutos de incubación.
Figura 93.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-IL-2R? Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
6
M
3
50 kDa
2
C C C
1 4 5
M M
Figura 92.- Electroforesis de células activadas con EGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
Figura 94.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con EGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se observa en las figuras 95 y 96, en células activadas con EGF no se
detectan cambios en la expresión citosólica de la subunidad reguladora de la PKA, ni en la
expresión de la PKC, mientras que en la membrana la PKC desaparece y la liberación de
catecolaminas es nula.
En el período estival tampoco se han observado cambios en el patrón
electroforético (figura 97) ni en la expresión de la IL-2R? (figura 98).
Figura 95.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 96.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
1 2 3 4 5 6
Figura 98.- Células activadas con EGF e incubadas con anti -IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
50 kDa
C C C M M M
Figura 97.- Electroforesis de células activadas con EGF. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6 : Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
1
M
3 5
C C C M M
2 4 6 MA
Sin embargo, por citometría (figura 99) se observa un aumento significativo en la
concentración de la subunidad ? en la membrana celular después de un período de
estimulación de 30 minutos.
En células activadas con EGF no se observan diferencias en la expresión de la
subunidad reguladora de la PKA (figura 100), sin embargo al estudiar la PKC se detecta
una clara translocación del citosol a la membrana en células activadas durante 30 minutos
(figura 101). Este efector no induce liberación de catecolaminas.
Figura 100.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
54 kDa
Figura 101.- Células activadas con EGF e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con EGF durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con EGF durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
Figura 99.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con EGF a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
4.3.8.- IL-2
Después de incubar los hemocitos con IL-2 (0,01 ?g/ml) en el período invernal no
se observan cambios en el patrón electroforético (figura 102), ni en la expresión de la
cadena ? del receptor de IL-2 en el extracto citosólico (figura 103).
Figura 102.- Electroforesis de células activadas con IL-2. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
3 5
C C C M M M
1 2 4 6 MA
1 2 3 4 5 6
50 kDa
C C C M M M
Figura 103.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
Sin embargo, por citometría se observa un incremento significativo en la expresión de la
cadena ? de IL-2R después de la incubación de las células durante 3 y 60 minutos (figura
104).
Al estudiar por western blotting la subunidad reguladora de la PKA, no observamos
diferencias en su expresión (figura 105), no obstante en el caso de la proteína quinasa C, se
observa la desaparición de la enzima en el citosol y su aparición en la membrana después
de incubar las células durante 30 minutos (figura 106).
Figura 105.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control. 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
54 kDa
Figura 106.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durnate 30 min.
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
108 105
Figura 104.- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con IL-2 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0102030405060
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
INVIERNO
Como se observa en la tabla 19, este efector también conduce a una liberación de
Adrenalina y Noradrenalina después de 60 minutos de incubación.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
ND
ND
ND
60 MINUTOS
ND
70,10 ? 0,10***
21,40 ? 0,40***
Sin embargo, en células estimuladas con IL-2 se observa un incremento en la
liberación de Dopamina y Noradrenalina cuando se añade un inhibidor de la PKC, mientras
que la adición de inhibidores de PKA y proteínas G provocan una disminución
significativa en la producción de adrenalina y noradrenalina (tabla 20).
Tabla 19.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 en invierno a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (*** p < 0,001). ND: no detectado.
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
IL-2
ND
70,10 ? 0,10
21,40 ? 0,40
IL-2 + BSM
31,45 ? 0,45***
ND
106,01 ? 0,01***
IL-2+H-89 ND 47,10 ? 0,10***
3,07 ? 0,07***
IL-2+ SURAMINA ND 3,25 ? 0,25*** ND
Con respecto a los hemocitos estimulados con IL-2 durante el período estival
tampoco se han observado cambios en el patrón electroforético (figura 107), ni en la
expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, siendo su expresión menor en la
membrana (figura 108).
Tabla 20.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 y el inhibidor correspondiente durante 60 min. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis
ensayos (***p < 0,001). ND: no detectado.
En estudios de citometría, se observa una mayor expresión de IL-2R? a los 3 y 15
minutos de incubación con la citoquina (figura 109).
Figura 107.- Electroforesis de células activadas con IL-2. MA: marcadores de peso molecular. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
3 5
C C C M M M
1 2 4 6 MA
1 2 3 4 5 6
50 kDa
C C C M M M
Figura 108.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-IL-2R? . Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
Figura 109 .- Porcentaje de células que expresan la cadena ? del receptor de IL-2. Las células se incubaron con IL-2 a diferentes tiempos manteniéndose en medio L-15 con FCS.
0
10
20
30
40
50
0 0,5 1 3 5 15 30 60
TIEMPO (minutos)
% A
CT
IVA
CIÓ
N
VERANO
Por otra parte, al estudiar por western blotting la expresión de la subunidad
reguladora de la PKA no se detectan cambios (figura 110), sin embargo, al incubar los
hemocitos con IL-2 se observa que la PKC (figura 111) desaparece en la membrana.
La IL-2 también conduce a una ligera liberación de Adrenalina a los 30 minutos
mientras que para la Dopamina y Noradrenalina el incremento se produce a los 60 minutos
de incubación con dicho efector (tabla 21).
DOPAMINA
(pg/ml)
ADRENALINA
(pg/ml)
NORADRENALINA
(pg/ml)
CONTROL
ND
ND
ND
30 MINUTOS
3,13 ? 0,13**
3,10 ? 0,10**
ND
60 MINUTOS
14,17 ? 0,17***
ND
60,16 ? 0,16**
Tabla 21.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con IL-2 en verano a diferentes tiempos. Se reflejan los valores promedio ? error estándar de seis ensayos (***p < 0,001, **p < 0,01). ND: no detectado.
Figura 110.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKA. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
1 2 3 4 5 6
54 kDa
C C C M M M
Figura 111.- Células activadas con IL-2 e incubadas con anti-PKC. Calles 1 a 3: Citosol. Calles 4 a 6: Membrana. 1 y 4 Control 2 y 5 Células activadas con IL-2 durante 30 seg. 3 y 6 Células activadas con IL-2 durante 30 min.
108
1 2 3 4 5 6
C C C M M M
105
kDa
DISCUSIÓN
5.- DISCUSIÓN
En la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis Lmk. se han detectado dos tipos
diferentes de células. En primer lugar, un grupo de células pequeñas redondeadas (células
RH), con un núcleo muy grande y un pequeño volumen de citoplasma que a veces es tan
solo un halo alrededor del núcleo (figura 24), su morfología es similar a la de las células
RH aisladas a partir de la hemolinfa del gusano Planorbarius corneus (Ottaviani, E., 1998)
o a la de los hialinocitos aislados de la hemolinfa de Mytilus edulis utilizando gradientes de
percoll (Pipe, R. K. et al., 1997).
El segundo tipo de células encontradas en la hemolinfa de M. galloprovincialis
presenta un mayor tamaño y un citoplasma expandido (células SH) (figura 25). Éstas son
muy parecidas a las células SH aisladas de P. corneus (Ottaviani, E., 1983) y recuerdan la
estructura de los macrófagos de vertebrados y de eosinófilos detectados y obtenidos
mediante gradientes de percoll en M. edulis (Pipe, R.K. et al., 1997).
El estudio de enfermedades que afectan a especies de moluscos comercialmente
importantes, ha estado impedido por la falta de sistemas de cultivo apropiados. El cultivo
"in vitro" de células de moluscos marinos ha sido abordado por varios investigadores pero
con éxito limitado (Power, A. et al., 1998). En los últimos años se han desarrollado
cultivos primarios de células de glándula digestiva y de manto de varios moluscos marinos
(Lebel, J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J., 1996). En M. galloprovincialis se
estudió el efecto de diversas citoquinas y otros efectores en la respuesta inmune de
hemocitos. Estas poblaciones no fueron homogéneas ni estables (Ottaviani, E. et al.,
1995b, 1998). Carballal, M.J. et al., (1997) alcanzó una mayor aproximación usando
explantos de hemocitos de mejillón.
Con nuestro método, no se observa una disminución significativa en el número de
células vivas hasta el día 20 de cultivo (figuras 26 y 27). Cuando las células se mantienen
en medio de cultivo con FCS inactivado su supervivencia es similar a la obtenida
utilizando como suplemento hemolinfa inactivada. Es posible que la hemolinfa de
moluscos marinos, al igual que el FCS, contenga ciertos factores de crecimiento que
pueden contribuir a una mayor viabilidad celular (Domart-Coulon, I. et al., 1994; Lebel,
J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J., 1996).
Para mantener la supervivencia celular, es importante que el medio de cultivo no
altere las propiedades de las células. Con frecuencia, la eficiencia fagocitaria de los
hemocitos es usada como control (Lebel, J.H. et al., 1996; Mortensen, S.H. y Glette, J.,
1996). En nuestro caso, optamos por medir la activación celular valorando la expresión de
la cadena ? del receptor de IL-2 (Barcia, R. et al., 1999). Después de la confirmación de
los resultados previamente mencionados, se observó que la eficiencia de la expresión de
IL-2R? era mayor en células mantenidas en FCS que en las mantenidas con hemolinfa. La
mayor expresión se detectó después de tres días de cultivo disminuyendo a los siete días
de mantenimiento en el mismo (figuras 28 y 29). El estudio del cultivo por citometría de
flujo, reveló que sólo las células SH expresan la cadena ? del receptor de IL-2 y que tanto
el LPS como la IL-2 inducen la sobreexpresión de esta subunidad (figuras 32, 38, 104 y
109). Estos resultados fueron similares a los obtenidos en extractos de células frescas
(Barcia, R. et al., 1999).
Algunos autores sugieren que diferentes citoquinas compartirían un receptor
universal el cual actuaría generando respuestas en hemocitos, de tal manera que estas
células desarrollarían una función parecida a la del eje hipotálamo/pituitaria/adrenal de los
vertebrados (Ottaviani, E. y Franceschi, C., 1996; Ottaviani, E. et al., 1997). Sin embargo
una hipótesis posterior sugiere la existencia de receptores específicos para cada citoquina
(Ottaviani, E. et al., 1998). Trabajos realizados en nuestro laboratorio han permitido
detectar la presencia de un receptor para IL-2 exclusivamente en las células SH. Este
receptor es similar estructuralmente al de las células de vertebrados, está constituído por
tres subunidades (? , ? , ?) cuyas masas moleculares son del mismo orden de magnitud que
las encontradas en vertebrados (Barcia, R. et al., 1999).
En vertebrados, las células T son capaces de expresar la cadena ? del receptor de
IL-2 individualmente, sin formar parte del receptor; además las cadenas ? y ? son
constitutivas en células de ratón y humanas, y comunes a otros receptores, tales como los
correspondientes a IL-15, IL-4 o IL-7 (Cao, X. et al., 1993; Takeshita, T. et al., 1992). Por
estos motivos se estudió la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en hemocitos
incubados con diversos efectores en diferentes épocas del año.
Frecuentemente, se comparan los hemocitos de moluscos con macrófagos de
vertebrados, ya que actúan de manera similar. En este sentido, LPS induce en hemocitos de
M. edulis la síntesis de TNF-? e IL-1, citoquinas que provocan movilización celular,
síntesis de NO y producción de aminas biógenas (Ottaviani, E. et al., 1995b).
Como se muestran en las tablas 22 y 23, la incubación de los hemocitos con
diversos efectores en diferentes épocas del año induce un incremento significativo en la
expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, siendo el EGF en invierno el inductor
que provoca un menor grado de estimulación, mientras que el LPS provoca un mayor
incremento en la concentración de esta subunidad.
EFECTORES
CONTROL
INVIERNO
P
LPS 28,55 ? 0,04 100 ? 0,12 ***
CRF ACTH
68,68 ? 0,12 58,01 ? 0,07
88,42 ? 0,06 82,20 ? 0,05
*** ***
ACTH1-24 42,26 ? 0,13 68,46 ? 0,10 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2
68,68 ? 0,12 42,26 ? 0,15 68,68 ? 0,12 41,21 ? 0,13
78,45 ? 0,7 89,65 ? 0,08 70,93 ? 0,13 49,77 ? 0,10
*** *** ** ***
Sin embargo, los efectores que inducen un incremento menos significativo en la
expresión de la cadena ? del receptor de IL-2 durante el período estival, son CRF, ACTH y
PDGF, siendo la IL-2 el que induce una mayor expresión de dicha subunidad en esta época
del año.
Tabla 22 .- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diferentes efectores en invierno. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).
EFECTORES
CONTROL
VERANO
P
LPS 19,85 ? 0,11 30,97 ? 0,25 ***
CRF ACTH
30,55 ? 0,14 38,56 ? 0,09
37,24 ? 0,20 42,26 ? 0,13
** **
ACTH1-24 24,81 ? 0,15 36,03 ? 0,15 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2
27,35 ? 0,08 23,13 ? 0,05 23,85 ? 0,08 37,31 ? 0,10
29,83 ? 0,11 34,38 ? 0,07 33,63 ? 0,03 47,30 ? 0,07
** *** *** ***
Además, como se observa en la tabla 24, al comparar el porcentaje de células que
expresan IL-2R? en diferentes períodos del año se detecta un incremento significativo en
la expresión de dicha subunidad en invierno, con respecto al período estival, siendo este
incremento menos significativo en el caso de la IL-2, mientras que el LPS es el agente que
induce un mayor incremento en la concentración de la cadena ? del receptor de IL-2. Estos
valores en la expresión de IL-2R? son más bajos en verano, que en invierno, hecho que
puede estar relacionado con el ciclo gametogénico.
Tabla 23 .- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diferentes efectores en verano. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).
EFECTORES
INVIERNO
VERANO
P
LPS 100 ? 0,12 30,97 ? 0,25 ***
CRF ACTH
88,42 ? 0,06 82,20 ? 0,05
37,24 ? 0,20 42,26 ? 0,13
*** ***
ACTH1-24 68,46 ? 0,10 36,03 ? 0,15 *** PDGF TGF-?1 EGF IL-2
78,45 ? 0,07 89,65 ? 0,08 70,93 ? 0,13 49,77 ? 0,10
29,83 ? 0,11 34,84 ? 0,07 33,62 ? 0,03 47,30 ? 0,07
*** *** *** **
En los meses de verano, la actividad metabólica del mejillón M. galloprovincialis
es más baja, estas variaciones podrían ser resultado de cambios en las condiciones
medioambientales o en la movilización de reservas de carbohidratos (Robledo, J.A.F. et
al., 1995).
El tipo y el número de hemocitos de M. galloprovincialis se ven influenciados por
factores estacionales (Feng, S.Y.,1965). Fue este autor quien relató que el número de
hemocitos presentes en Crassostrea virginica está influenciado por la cantidad de alimento
y la temperatura. Si la temperatura y la disponibilidad de alimento estaban directamente
relacionados con la densidad de hemocitos, los niveles más altos deberían de observarse en
Tabla 24.- Porcentaje de activación de células SH de M. galloprovincialis activadas por diversos efectores en diferentes épocas del año. Se reflejan los valores promedios ? error estándard de seis ensayos (P: probabilidad; ***p? 0,001; ** p? 0,01).
octubre. Santarém, M.M. et al., (1994) detectan que los niveles de hemocitos en julio son
muy bajos, sugiriendo que la combinación de una concentración alimentaria baja junto con
el período de desove podría contribuir a una menor circulación de hemocitos (Santarém,
M.M. et al., 1994).
Por otra parte, al analizar por citometría la expresión de IL-2R? en hemocitos
estimulados con diversos efectores a diferentes tiempos, se observa que en el período
estival la respuesta tiene lugar después de períodos de incubación del orden de 3 a 30
minutos, mientras que en invierno la respuesta (en general) se produce después de períodos
más cortos de estimulación (figuras 32, 38, 43, 48, 53, 58, 63, 68, 73, 79, 84, 89, 94, 99,
104 y 109). Además, por western blotting no se detectan cambios en la expresión de la
cadena ? del receptor de IL-2, esto puede ser debido a que la proteína se encuentre en una
concentración tan baja que no nos permita su detección, o a una baja especificidad del
anticuerpo o bien a alguna alteración de la proteína que no permita la unión del anticuerpo,
impidiendo la detección de la señal (figuras 31, 37, 42, 47, 52, 57, 62, 67, 72, 78, 83, 88,
93, 98, 103 y 108).
A pesar de que la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) es una proteína
quinasa muy estudiada, existe actualmente muy poca información acerca de la estructura y
funcionamiento de esta enzima en organismos diferentes a los mamíferos. Particularmente
en moluscos bivalvos, aunque se ha demostrado la implicación de procesos de
fosforilación dependientes de AMPc en la regulación de diferentes enzimas (Vázquez-
Illanes, M.D. y Ramos-Martínez. J.I., 1991; Fernández, M. et al., 1994; Michaelidis, B. y
Storey, K.B., 1990, 1991) existe un total desconocimiento, no sólo acerca de las señales
externas que originan estos procesos sino también de los mecanismos implicados en la
transmisión de estas señales al interior de la célula (Cao, J., 1996).
En este trabajo se ha estudiado la expresión de la subunidad reguladora de la PKA
en hemocitos de mejillón estimulados con diversos efectores en diferentes épocas del año,
observándose que ningún inductor de los ensayados provoca cambios en la expresión de
esta subunidad de 54 kDa.
En todos los casos, la concentración de esta subunidad es mayor en el citosol que en
la membrana, y en el caso de hemocitos estimulados con TGF-? 1 durante el período
invernal la subunidad reguladora de la PKA sólo se expresa en el citosol (figuras 33, 39,
44, 49, 54, 59, 64, 69, 74, 80, 85, 90, 95, 100, 105 y 110). Esto puede ser debido a la
distribución de la proteína quinasa dependiente de AMPc dentro de la célula. Se sabe que la
PKA que posee como subunidad reguladora RII (? y ? ) se encuentra fundamentalmente
asociada a la membrana plasmática, a componentes del citoesqueleto, a glándulas
secretoras, al aparato de golgi, centrosomas y posiblemente también al núcleo celular (De
Camilli, P. et al., 1986; Jahnsen, T. et al., 1986a, 1986b; Scott, J.D. et al., 1987; Pariset, C.
et al., 1989; Joachim. S. y Schwoch, G., 1990; Ndubuka, C. et al., 1993) aunque también
se puede encontrar, soluble en el citosol.
En relación a los caminos de transducción de señales se ha observado que tanto la
IL-1? como el TNF-? pueden activar la PKA via adenilato ciclasa (Dinarello, C., 1991;
Vilcek, J. y Lee, T.H., 1991).
La proteína quinasa C es reconocida como una familia de serina/treonina quinasas
que ha sido identificada como el receptor celular para el lípido DAG, es una enzima que
fosforila una amplia variedad de sustratos celulares y es clave en los mecanismos de
transducción de señales, involucrados en la activación de receptores acoplados a
fosfolipasas (Chauhan, V. et al., 1990; Khan, W. et al., 1995; Ron, D. y Kazanietz, M.,
1999).
Por este motivo, se estudió la expresión de la PKC en hemocitos de mejillón
estimulados con diversos efectores en diferentes épocas del año.
El análisis de la PKC de mejillón, evidenció una característica, que comparte con
otras nPKCs descritas en mamíferos, PKC? (Davidson, L. et al., 1994), PKC?
(Leibersperger, M. et al., 1991) y PKC? (Zang, R. et al., 1994). Estas isoformas dan lugar
a una doble banda, detectada mediante western blotting, que es habitualmente un indicador
de un estado diferencial de fosforilación, detectable en extractos crudos de tejidos
(Mercado, L., 2001).
Durante el estudio de esta enzima, se observa que en el período invernal, LPS,
ACTH, ACTH 1-24, PDGF, TGF-? 1 y EGF (figuras 34, 55, 65, 75, 86 y 96) no provocan
cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana
desaparece, es decir, estos efectores bloquean la translocación de la enzima a la membrana.
Por otra parte, en hemocitos estimulados con CRF e IL-2 (figuras 45 y 106), se observa
una desaparición después de 30 segundos de incubación y una clara translocación a los 30
minutos de incubar las células con dichos efectores, a diferencia de lo observado por Lu,
Y. y Durkin, P.J. (1997), los cuales investigando el papel de la PKC en la transducción de
señales mediadas por IL-2 en células T, llegaron a la conclusión de que la estimulación con
este efector no conduce a una translocación de la enzima a la membrana. Sin embargo, en
hemocitos estimulados con LPS y ACTH 1-24 durante el período estival (figuras 40 y 70),
se observa que estos efectores a los 30 segundos bloquean la translocación de la enzima,
mientras que a los 30 minutos de incubación la proteína no se encuentra presente ni en el
citosol, ni en la membrana, posiblemente debido a la degradación de la misma (down
regulation), a diferencia de lo que ocurre con estos efectores en invierno, en donde no se
detectan cambios en la presencia de la PKC en el citosol.
No obstante, en hemocitos estimulados en la época de verano con CRF no se
observan cambios en la presencia de la proteína quinasa C en el citosol, sin embargo este
efector induce una disminución de la concentración de la enzima en la membrana (figura
50), mientras que en invierno este inductor provoca la translocación a la membrana
(figura 45). Al incubar los hemocitos con ACTH en el período estival, la expresión de la
PKC disminuye en función del tiempo de incubación, además este efector induce a los 30
minutos la translocación de la enzima a la membrana en contraste con el período invernal
caracterizado principalmente por la ausencia de la PKC en la membrana (figuras 60 y 55).
Por otra parte, en verano, el PDGF bloquea la expresión de la PKC, sin embargo en
invierno este efector no provoca cambios en la presencia de la enzima en el citosol (figura
81 y 75).
En relación al TGF-? 1, este efector en el período estival, no induce cambios en la
expresión de la PKC, a diferencia de lo que ocurre en el período invernal caracterizado por
la ausencia de la enzima en la membrana (figura 91 y 86). En hemocitos estimulados con
EGF en verano, se observa que este efector induce una translocación de la enzima a la
membrana después de un período de incubación de 30 minutos, mientras que en invierno,
este efector bloquea la translocación (figura 101 y 96).
Sin embargo, en el caso de la IL-2, este inductor, en el período estival, no provoca
cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana
desaparece, después de 30 minutos de incubación con dicho efector (figuras 111 y 106).
En la hemolinfa de moluscos terrestres (V. ater y P. corneus) e invertebrados
marinos (Hughes, T. et al., 1990; Stefano, G.B. et al., 1989) se detectó la presencia de IL-1
y TNF-? . Estas moléculas parecen activar a los hemocitos induciendo un aumento de la
motilidad y superficie celular e incrementando la síntesis de aminas biógenas (Morgan,
D.A. et al., 1976). La IL-2 modula la actividad asesina de los hemocitos (Franceschi, C. et
al. 1991), y junto con IL-1? y ? y TNF-? y ? está implicada en la liberación de aminas
biógenas, un fenómeno considerado como un tipo ancestral de respuesta al estrés
(Ottaviani, E. et al., 1991; 1992; 1994b; 1995a).
En vertebrados la IL-2 desempeña un papel fundamental en la proliferación de las
células T al unirse a un receptor específico que se expresa en la superficie celular (Smith,
K.A., 1988). Además la IL-2 modula las funciones inmunológicas de células T, B y NK
(Waldman, T.A., 1989) con lo que podemos concluir que desempeña un papel fundamental
en la fisiología del sistema inmune. En invertebrados, la IL-2 induce activaciones en
células de la hemolinfa, aunque las activaciones son menos potentes que las inducidas por
IL-1 o CRF (Hughes, T. et al., 1991b), ésto es particularmente notorio en el caso de la
síntesis de aminas biógenas promovidas por citoquinas.
Se ha observado en hemocitos de mejillón M. galloprovincialis, un incremento en
la producción de catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina) después de la
incubación de estas células con LPS, PDGF, ACTH 1-24, ACTH, IL-2, TGF-? 1 y CRF en
diferentes épocas del año.
Durante el período invernal (figura 112), se ha observado un incremento en la
liberación de Dopamina a los 30 minutos de incubación con LPS, PDGF, ACTH, TGF-? 1
y CRF. En el caso de la Adrenalina, el incremento se detecta a los 60 minutos de
incubación con LPS, ACTH e IL-2, mientras que en el caso de hemocitos estimulados con
TGF-? 1 y CRF la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación con
dichos efectores. Sin embargo los inductores que provocan una mayor liberación de
Nordrenalina a los 30 minutos de incubación son LPS, PDGF y ACTH mientras que
ACTH 1-24 y TGF-? 1 provocan una liberación a los 60 minutos. Por lo tanto, en
hemocitos de M. galloprovincialis el CRF provoca la liberación de las tres catecolaminas
analizadas, mientras que ACTH 1-24 sólo induce la liberación de Noradrenalina. Estos
resultados difieren de lo observado por Ottaviani. E. et al., (1992) en P. corneus en donde
ambos efectores inducen la liberación de Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina.
No obstante, durante el período estival, (figura 113) se ha observado en hemocitos
de M. galloprovincialis un incremento en la liberación de Dopamina a los 60 minutos de
incubación con LPS y TGF-? 1, mientras que en hemocitos estimulados con PDGF y
Figura 112.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con diferentes efectores en invierno. A: 30 minutos. B: 60 minutos.
ACTH la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación con dichos
efectores.
.
En el caso de la Adrenalina, este incremento se detecta a los 60 minutos de
incubación con LPS y TGF-? 1, mientras que en el caso de hemocitos estimulados con
PDGF y ACTH la mayor liberación tiene lugar después de 30 minutos de incubación. Sin
Figura 113.- Detección de diferentes catecolaminas después de incubar los hemocitos con diferentes efectores en verano. A: 30 minutos. B: 60 minutos.
embargo, los inductores que provocan una mayor liberación de noradrenalina a los 60
minutos de incubación son LPS e IL-2 mientras que el PDGF, ACTH y TGF-? 1 provocan
un mayor incremento a los 30 minutos.
Por lo tanto, estos resultados sugieren una mayor concentración de catecolaminas
liberadas al medio después de la incubación con diferentes efectores en el período invernal
resultados similares a los obtenidos en Crassostrea virginica (Osada, M. y Nomura, T.,
1989), excepto en el caso de hemocitos estimulados con TGF-? 1, en donde la mayor
liberación de Dopamina y Adrenalina tiene lugar durante el período estival. En el caso de
la vieira los niveles de Dopamina decrecen durante el período de desove mientras que la
Noradrenalina no muestra cambios (Osada, M. et al., 1987). Se sabe que la temperatura y
el fotoperíodo provocan variaciones estacionales en los niveles de monoaminas (Le Bras,
Y.M., 1984) y que en M. edulis los niveles de Dopamina y Noradrenalina son más bajos
durante los meses de invierno que en verano (Stefano, G.B. y Catapane, E.J., 1980).
Estas diferencias en las concentraciones de catecolaminas pueden estar relacionadas
con el ciclo gametogénico. Osada, M y Nomura, T. (1989) y Paulet, Y.M. et al.,(1993) han
encontrado cambios en los niveles de catecolaminas relacionados con la actividad
reproductiva asociada a la época del año. Además en M. galloprovincialis la concentración
de Adrenalina en el período invernal, es menor que la de Dopamina y Noradrenalina,
resultados similares a los observados en Helicella pomatica y H. virgata (Ottaviani, E. et
al., 1992).
Con el fin de analizar los posibles mecanismos de internalización de la señal, se ha
estudiado la presencia de catecolaminas (Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina) después
de incubar los hemocitos con LPS, PDGF e IL-2 y diferentes inhibidores
(Bisindolilmaleimida I, H-89 y Suramin), así como la expresión de la PKC en células
estimuladas con los efectores anteriormente mencionados y puestas en contacto con
Bisindolilmaleimida I, un inhibidor de la PKC.
Durante el estudio de esta enzima, se observa que LPS y PDGF no provocan
cambios en la presencia de la PKC en la fracción citosólica, mientras que en la membrana
desaparece, es decir, estos efectores parecen boquear la translocación de la enzima a la
membrana (figura 34 y 75).
Por otra parte, en células estimuladas con los efectores anteriores, e incubadas con
Bisindolilmaleimida I, se observa que el efecto provocado por LPS y PDGF desaparece, es
decir, la acción de estos efectores queda bloqueada por el inhibidor de la PKC, teniendo
lugar la translocación de la enzima a la membrana (figura 35 y 76). La dinámica del
tráfico de la proteína quinasa C por la membrana plasmática en respuesta a la activación de
receptores de superficie celular ocurre en tres pasos: la translocación a la membrana, el
anclaje y la disociación (Quest, A., 1996; Newton, A. y Jhonson, J., 1998), por lo tanto los
resultados sugieren que el inhibidor de la PKC además de bloquear la acción del LPS y
PDGF impide la disociación de la PKC de la membrana.
Por otra parte, en hemocitos estimulados con IL-2, se observa una desaparición de
la PKC en la membrana después de 30 segundos de incubación y una clara translocación a
los 30 minutos de incubar las células con dicho efector (figura 106).
Como consecuencia de la activación de la PKC se desencadenan una serie de
respuestas entre las que se ha estudiado la liberación de catecolaminas ya que actúan como
mediadoras en una amplia variedad de funciones metabólicas e inmunoreguladoras
(Collins, J.L. et al., 2001).
Las células estimuladas con LPS y tratadas con inhibidores de PKC, PKA y
proteínas G pierden la capacidad de liberar catecolaminas, por lo tanto, los resultados
sugieren que la proteína quinasa C, la proteína quinasa A y las proteínas G parecen estar
implicadas en la liberación de catecolaminas inducida por LPS (tabla 7). Además cuando
las células son estimuladas con PDGF se observa una liberación de Dopamina y
Noradrenalina cuyas concentraciones disminuyen al tratar las células con BSM, H-89 y
Suramin, llegando a la conclusión de que también la PKC, PKA y las proteínas G se hallan
implicadas en este tipo de respuesta inducida por PDGF. Sin embargo, este efector no
induce la liberación de Adrenalina (tabla 15).
No obstante, en células estimuladas con IL-2 se observa una liberación de
Adrenalina que decrece al tratar los hemocitos con BSM, H-89 y Suramin, lo que nos
sugiere una implicación de la proteína quinasa C, proteína quinasa A y proteínas G en la
liberación de Adrenalina. Sin embargo, este efector no induce la liberación de Dopamina.
En relación a la liberación de Noradrenalina se observa una disminución en la
concentración de esta catecolamina después de incubar los hemocitos con IL-2 e
inhibidores de la PKA y proteínas G, lo que nos sugiere una implicación de estas proteínas
en la liberación de Noradrenalina inducida por esta citoquina (figura 20).
Una misma citoquina puede dar lugar a diferentes respuestas (pleitropicidad),
dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco (Arai, K. et al., 1990).
En hemocitos de M. galloprovincialis los resultados sugieren que cada citoquina
interacciona con un receptor específico generando diversas respuestas. Igualmente,
diferentes citoquinas mediante diferentes efectores dan lugar a aparentemente idénticas
respuestas biológicas (redundancia), circunstancia que también se observa en hemocitos de
mejillón. Parece ser, por tanto, que las citoquinas son moléculas funcionalmente
conservadas, que durante el proceso evolutivo han mantenido su pleiotropicidad, su
redundancia en el modo de acción y una alta promiscuidad de sus receptores, resultado
compartido con Ottaviani. E. et al., (1995b).
CONCLUSIONES
6.- CONCLUSIONES
1.- En la fracción particulada de la hemolinfa del mejillón M. galloprovincialis
Lmk., se han identificado dos tipos de células (hemocitos) bien diferenciadas, unas (células
RH) son redondeadas con un núcleo muy grande en relación al tamaño celular y las otras
(células SH) tienen un citoplasma mucho más expandido.
2.- Sólo las células SH expresan la cadena ? del receptor de IL-2.
3.-La incubación de los hemocitos con los diferentes efectores induce un aumento
en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2 en la membrana celular.
4.- El efecto de diversos inductores se muestra variable a lo largo del año,
detectándose cambios en la expresión de la subunidad ? del receptor de IL-2, en la
expresión de la proteína quinasa C, así como en la liberación de diferentes catecolaminas
(Dopamina, Adrenalina y Noradrenalina).
4.-En hemocitos de M. galloprovincialis las citoquinas presentan las mismas
características de mamíferos: pleitropicidad, redundancia en el modo de acción y
promiscuidad del receptor.
BIBLIOGRAFÍA
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ABREVIATURAS
8.- ABREVIATURAS
AA ácido araquidónico
AC adenilato ciclasa
ACTH hormona adrenocorticotrópica
ACTH 1-24 fragmento de ACTH comprendido entre los aminoácidos 1 y 24
ADN ácido desoxirribonucleico
ALS solución antiagregante de Alsever
AMPc adenosina-3'-5'-monofosfato cíclico
BSA seroalbúmina bovina
BSM bisindolilmaleimida I
C citosol
CA catecolaminas
CD complejo diferenciado
COMT catecol-O-metiltransferasa
COX-2 ciclooxigenasa 2
cpm cuentas por minuto
CRF factor liberador de corticotropinas
CSFs factores estimulantes de colonias
DAG diacilglicerol
DCs células dendríticas
EDTA ácido etileno diamino tetraacético
EGF factor de crecimiento epidérmico
EGTA ácido etileno glicol tetraacético
Epo eritropoyetina
ERK proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares
FCS suero fetal de ternero
FGF factor de crecimiento de fibroblastos
FS dispersión frontal
G-CSF factores estimulantes de colonias de granulocitos
GDP guanosín 5'-difosfato
GlcN glucosamina
GM-CSF factores estimulantes de colonias de granulocitos-macrófagos
GR/FL fluorescencia verde
GTP guanosín 5'-trifosfato
Hep D-glicero-mano-heptosa
Hepes ácido 4-(2-hidroxietileno)-1- piperazina-etano sulfónico
IFN interferón
IL interleuquina
IL-R receptor de interleuquinas
IP3 inositol 1,4,5-trifosfato
IRAK receptor de interleuquina-1 asociado a quinasas
JAKs quinasas Janus
Kd constante de disociación
kDa kilodalton
Kdo ácido 2-ceto-3-deoxioctulosónico
L-15 medio de cultivo Leibovitz 15
LBP proteína que se une al LPS
LIF factor inhibidor de leucemia
LPS lipopolisacárido
LRR regiones repetitivas ricas en leucina
M membrana
MA marcadores de peso molecular
MAPK proteínas quinasas activadas por mitógenos
mCD complejo diferenciado de membrana
M-CSF factor de crecimiento de cultivos de macrófagos
MES ácido 2-[n-Morfolino] etanesulfónico
MHC complejo mayor de histocompatibilidad
MKP-1 MAPK fosfatasa-1
ND no detectado
NK células agresoras naturales
NOS óxido nítrico sintetasa
OR/FL fluorescencia naranja
P probabilidad
PAMPs patrones moleculares asociados a patógenos
PDE fosfodiesterasa
PDGF factor de crecimiento derivado de plaquetas
PGE2 prostaglandina E2
PI fosfoinositol
PIAS proteínas inhibidoras de STAT activadas
PIP fosfatidilinositol 4-fosfato
PIP2 fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato
PKA proteína quinasa A
PKC proteína quinasa C
PLA2 fosfolipasa A2
PLC fosfolipasa C
PMA forbol 12-miristoato 13-acetato
POMC pro-opiomelanocorticoides
PRR patrón de reconocimiento de receptores
PS fosfatidil serina
PTK proteínas tirosina quinasas
RH hemocitos redondos
RNA ácido ribonucleico
SAM S-adenosil-metionina
SDS dodecil sulfato sódico
SDS-Page electoforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS
SH hemocitos expandidos
SHP tirosina fosfatasa
SS dispersión lateral
SSF factor de estrella de mar
TBS tampón tris salino
TEMED tetrametiletilendiamina
TGF factor de crecimiento transformante
TNF factor de necrosis tumoral
TRL receptor Toll
TTBS tampón tris salino tween