ARN PI-5/03 - osti.gov

ARN PI-5/03

Evaluación in vitro de la radiosensibilidad individual en linfocitos de pacientes oncológicos y su correlación con reacciones tardías adversas a la radioterapia

Di Giorgio, M.; Sardi, M.; Busto, E.; Roth, B.; Menéndez, P.; Bonomi, M.; Vallerga, M.; Taja, M.R. y Mairal, L.

AUTORIDAD REGULATORIA NUCLEAR Av. del Libertador 8250

(C1429BNP) Ciudad de Buenos Aires, ARGENTINA Tel.: (011) 6323-1356

Fax: (011) 6323-1771/1798 http://www.arn.gov.ar

3

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA RADIOSENSIBILIDAD INDIVIDUAL EN LINFOCITOS DE PACIENTES ONCOLÓGICOS Y SU CORRELACIÓN

CON REACCIONES TARDÍAS ADVERSAS A LA RADIOTERAPIA

Di Giorgio, M.1; Sardi, M.2,3; Busto, E.2; Roth, B.4; Menéndez, P.4; Bonomi, M.4; Vallerga, M.1; Taja, M.R.1 y Mairal, L.3

1 Autoridad Regulatoria Nuclear

2 Hospital Italiano 3 Mevaterapia

4 Instituto de Oncología “Ángel Roffo”

Argentina

BACKGROUND Y OBJETIVO

La radiosensibilidad individual es una característica inherente al sujeto individual, asociada con una reacción aumentada a las radiaciones ionizantes. Distintos endpoints biológicos tales como sobrevida clonogénica, formación de aberraciones cromosómicas y capacidad de reparación del daño radioinducido han sido aplicados en la evaluación de la radiosensibilidad in vitro.

Se ha observado que del 5 a 7% de los pacientes sometidos a protocolos de irradiación tera-péutica desarrollan efectos adversos en los tejidos sanos en el volumen de irradiación, denomi-nados “respuesta clínica” e incluye los efectos agudos y tardíos (con dosis inferiores a la dosis de tolerancia en tejidos sanos) e inducción de cáncer [1]. Se sugiere que la incidencia y severi-dad de estas reacciones está principalmente influenciada por la susceptibilidad genética a la radiación [2], aunque también contribuirían otros factores. Adicionalmente, la naturaleza de los desórdenes genéticos asociados con hipersensibilidad a las radiaciones (mutaciones en los genes ATM y NBS, relacionados con Ataxia Telangectasia y Nijmegen breakage síndrome res-pectivamente) sugiere que los mecanismos de reparación del ADN se hallan involucrados. Consecuentemente, la caracterización de la reparación del ADN en los linfocitos mediante la aplicación del test de micronúcleos con bloqueo de la citocinesis (MN) y el ensayo de cometa (electroforesis en gel de células individuales) podrían ser aproximaciones apropiadas para eva-luar la radiosensibilidad in vitro. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) evaluar la radio-sensibilidad in vitro en linfocitos de dos grupos de pacientes oncológicos (prospectivamente y retrospectivamente evaluados) utilizando el test de MN y ensayo de cometa y su correlación con la respuesta clínica observada y 2) evaluar el potencial predictivo de ambas técnicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Fueron evaluados 38 pacientes con cánceres de cabeza-cuello (n = 25) y cervix (n = 13), some-tidos a esquemas de radioterapia.

19 pacientes fueron evaluados previamente, durante y al finalizar la terapia radiante (grupo prospectivo) y

19 pacientes fueron evaluados de 6-18 meses después del tratamiento (grupo retrospectivo).

En el grupo prospectivo se evaluó, mediante el test de MN, la atenuación del efecto citogenéti-co, F(MN), como función del tiempo, di, entre una exposición y el muestreo, estimándose un factor de recuperación citogenético k y su correlación con la respuesta clínica. [3]

F(MN)=∑( MNi . e –di.k )

4

En el grupo retrospectivo, las muestras de sangre fueron irradiadas in vitro con 0 (control) y 2 Gy utilizando una fuente de cobalto 60 y analizadas mediante el test de MN. Los datos citogenéti-cos fueron analizados comparando las frecuencias esperadas de micronúcleos (curva de calibración de individuos sanos) con los valores observados después de la irradiación in vitro.

Un paciente que manifestó toxicidad tardía fue adicionalmente evaluado mediante el ensayo de cometa aplicando un software de análisis de imágenes, CASP [4]. Las células fueron irradiadas in vitro con 2 Gy. Se evaluó la capacidad de reparación del ADN después de intervalos de tiempos de reparación de 0 – 80 minutos.

El daño inducido en el ADN y la capacidad de reparación fueron cuantificados mediante el mo-mento de la cola del cometa [5], cuya distribución fue ajustada a una distribución de Weibull [6] y se utilizó el parámetro alfa (valor característico) para describir los perfiles de reparación del ADN del paciente analizado y los donantes sanos control, utilizados como muestra de referen-cia.

Las reacciones tardías en los tejidos sanos, incluidos en el volumen de irradiación, fueron eva-luadas y correlacionadas con la respuesta citogenética individual proveniente de los test de radiosensibilidad in vitro aplicados (MN y ensayo de cometa).

Las integrales de dosis en el volumen de irradiación fueron derivadas de las curvas de isodosis del paciente, obtenidas de la evaluación por tomografía. Para este fin, el volumen de tejido que recibió cada dosis fue calculado y multiplicado por el valor de dosis. La integral de dosis en la región irradiada (kg. Gy) fue obtenida sumando todos los productos dosis-volumen para todas las dosis. La dosis equivalente a todo el cuerpo fue calculada dividiendo la integral de dosis por el peso corporal individual.

Test de MN: Se incubaron 0,8 ml a 1 ml de sangre entera, extraída por venopunción, en 8,5 ml de medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero fetal bovino (Gibco) al 25% (v/v) a 37°C durante 72 a 74 horas. Los linfocitos fueron estimulados a dividirse con fitohemagluti-nina M 3% (Gibco). A las 44 h de cultivo se agregó citoca-lasina B (6 µg/ml concentración final, Sigma) a fin de blo-quear la citocinesis. A las 72-74 horas de incubación las células fueron colectadas por centrifugación y tratadas con solución hipotónica, según método de Iskandar (NaCl 0,9%

/ kCl 0,075 M, 9:1), para lograr la preservación del citoplasma. La fijación se realizó con meta-nol / acético (3:1) y se coloreó con Giemsa al 5% (pH 6,8). Se estableció la frecuencia de MN evaluando 500 a 1000 células binucleadas por muestra y por dosis, aplicando los criterios de Fenech, M. [7] para la identificación de células binucleadas y MN.

Ensayo de Cometa Alcalino: Se realizó de acuerdo a las técnicas de Singh [8] y Tice [9] con modificaciones. Se preparó una fina capa de agarosa de punto de fusión normal al 1,5% sobre portaobjetos. Después de la irra-diación, ≈25 000 células en 50 µl fueron mezcladas con 120 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% y co-locadas sobre los vidrios. Los vidrios fueron sumergidos en solución de lisis fría a pH 10 (NaCl 2,5 M; Na2EDTA

100 mM, Tris 10 mM pH 10; Tritón X-100 1%; DMSO 10%) y mantenidos a 4°C durante 60 min. A fin de permitir la desnaturalización del ADN y la difusión del buffer de lisis fuera del gel, los vidrios fueron mantenidos en buffer de electroforesis alcalino a pH 13 (Na2EDTA 1 mM /NaOH 300 mM) durante 25 min. Subsecuentemente, los vidrios fueron transferidos a una cuba de

5

electroforesis con buffer fresco y la corrida se realizó a 1,33 V/cm durante 25 min a 4°C (20 V-125 mA). Los vidrios se neutralizaron en Tris 0,4 M pH 7,5 durante 5 min, se tiñeron con bromu-ro de etidio 20 µg/ml. Todo el proceso fue realizado en oscuridad y a 4°C para impedir daño adicional del ADN.

Para la visualización del daño, las observaciones se realizaron con objetivo de 20x utilizando un microscopio de epifluorescencia con filtro de excitación: 510-560 y filtro barrera de 590. Se evaluaron 50 a 100 cometas por muestra. El daño inducido en el ADN y la capacidad de repa-ración fueron cuantificados mediante el momento de la cola del cometa de Olive [5].

RESULTADOS

Evaluación prospectiva:

Figura 1. Correlación entre la frecuencia de MN y la dosis equivalente a todo el cuerpo, en los pacientes evaluados prospectivamente

La Figura 1 muestra que la frecuencia de MN aumenta linealmente con la dosis equivalente a todo el cuerpo. Sin embargo, con el aumento de la dosis física la frecuencia de MN en los pa-cientes fue menor que la esperada, determinada a partir de la curva de calibración del laborato-rio, a partir de individuos sanos (Figura 2). Este fenómeno puede ser atribuido al fraccionamien-to de la dosis más que a la condición de irradiación inhomogénea. Para el tratamiento fraccio-nado en partes del cuerpo que tienen gran volumen y flujo sanguíneo se sugiere que la recircu-lación de los linfocitos contribuye a la homogeneización final de la dosis total absorbida. Por lo tanto, se puede suponer que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenéti-ca parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3 4 5Dosis equivalente [ Gy]

∆ Fre

cuen

cia

MN

(obs

erva

da -

espo

ntán

ea)

Pacientes que presentaron toxicidad tardía

y = 0.0242 + 0.038 DR2 = 0.9093

0

0.1

0.2

0.3

0.4


∆ Fre

cuen

cia

MN

(obs

erva

da -

espo

ntán

ea)


y = 0.0242 + 0.038 DR2 = 0.9093

0

0.1

0.2

0.3

0.4


∆ Fre

cuen

cia

MN

(obs

erva

da -

espo

ntán

ea)


y = 0.0242 + 0.038 DR2 = 0.9093

0

0.1

0.2

0.3

0.4


∆ Fre

cuen

cia

MN

(obs

erva

da -

espo

ntán

ea)


y = 0.0242 + 0.038 DR2 = 0.9093

6

Figura 2. Comparación de los datos citogenéticos de los pacientes con la curva de calibración

En la evaluación prospectiva, el factor k correlacionó con la radiosensibilidad individual (Figura 3). Dos pacientes con baja capacidad de recuperación del efecto citogenético desarrollaron toxicidad tardía (fibrosis y rectitis actínica).

Figura 3. ∆ Frecuencia de MN vs. factor de recuperación citogenético k

Un bajo valor de k (k→0) demuestra alta radiosensibilidad del pool de linfocitos, es decir, un sujeto con dificultades en la reparación del daño radioinducido en el ADN.

Evaluación retrospectiva:

En la evaluación retrospectiva, la respuesta citogenética individual sugiere una correlación con el grado máximo de toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus).

∆ ∆ ∆ ∆ Fr

ecue

ncia

de

MN

∆ ∆ ∆ ∆ Fr

ecue

ncia

de

MN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 1 2 3 4 5Dosis equivalente [Gy]

Pacientes con cáncer decervixPacientes con tumores de cabeza-cuelloFrecuencia de MN esperada

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 1 2 3 4 50 1 2 3 4 5Dosis equivalente [Gy]




∆ ∆ ∆ ∆ Fr

ecue

ncia

de

MN

∆ ∆ ∆ ∆ Fr

ecue

ncia

de

MN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0

0.1

0.2

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0.5

0.6

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0

0.1

0.2

0.3

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0.5

0.6

0.7

0.8

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8






Radiosensibilidad individual+ –Pacientes con respuesta clínica normalPacientes con toxicidad tardía

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120k

∆ ∆∆∆Fr

ecue

ncia

de

MN

Radiosensibilidad individual+ –Pacientes con respuesta clínica normalPacientes con toxicidad tardía

Radiosensibilidad individual+ –Radiosensibilidad individual+ –Pacientes con respuesta clínica normalPacientes con toxicidad tardía

Pacientes con respuesta clínica normalPacientes con toxicidad tardía

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120k

∆ ∆∆∆Fr

ecue

ncia

de

MN

7

Tabla 1. Frecuencias de MN espontáneas y radioinducidas (irradiación in vitro con 2 Gy de cobalto 60) en los linfocitos de los pacientes evaluados retrospectivamente, analizadas median-te el test de χ2 .

Aplicando el test de χ2, valores > 3,84 (GL = 1; p < 0,05) indican diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias de MN observadas y esperadas, permitiendo la identificación de individuos radiosensibles (Tabla 1).

Figura 4. Comparación de las frecuencias de MN observadas con las esperadas a partir de la curva de calibración

Dosis = 0Gy Dosis = 2Gy

χχχχ²Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

123456789

10111213141516171819

Paciente

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservada


χχχχ²Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

123456789

10111213141516171819

Paciente

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservada


χχχχ²Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

123456789

10111213141516171819

Paciente

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservada


χχχχ²Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

123456789

10111213141516171819

Paciente

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservadaχχχχ²

Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

36.153.521.051.150.970.70

29.261.712.910.791.453.270.425.000.802.150.885.717.51

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

χχχχ²Test

134.061.171.111.592.44

19.60140.62

2.1812.673.150.200.343.157.15

14.8213.3012.100.14

111.23

123456789

10111213141516171819

Paciente

123456789

10111213141516171819

Paciente

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.04230.00950.02160.01280.01320.01380.03980.01190.01020.01360.01230.00980.02000.00800.01360.01120.01340.02720.0287

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservada

0.34120.16940.19840.20120.20530.12400.34500.20410.13580.16000.17800.19200.20820.14780.13190.13460.13690.17900.3272

FrecuenciaObservada

Dosis [Gy]

Frec

uenc

ia d

e M

N

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3Dosis [Gy]

Frec

uenc

ia d

e M

N

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 30

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3Dosis [Gy]

Frec

uenc

ia d

e M

N

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3Dosis [Gy]

Frec

uenc

ia d

e M

N

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 30

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3

8

Los linfocitos de 3 de los 4 pacientes que desarrollaron toxicidad tardía (osteonecrosis, fibrosis y trismus) resultaron significativamente más radiosensibles que los del resto de los pacientes y donantes sanos (Figura 4.).

El daño inducido en el ADN del paciente adicionalmente analizado mediante el ensayo de co-meta fue medido hasta 80 minutos en intervalos de 5, 10, 20, 30, 50 y 80 min. Para cada indivi-duo, paciente y donantes sanos control, los datos del momento de la cola del cometa fueron ajustados a una función mono-exponencial:

(1)

donde,

TM = Momento de la cola del cometa

TM0 = TM inicial reparable

TMR = TM residual no reparable

T1/2 = tiempo medio de reparación, tiempo medio requerido por los linfocitos para reparar 50% del daño inicial

t = tiempo de incubación después de la exposición a 2 Gy in-vitro

El paciente que manifestó osteonecrosis, adicionalmente evaluado mediante el ensayo de co-meta, mostró reducción en la capacidad de reparación del ADN. El daño observado en los lin-focitos del paciente, a los 10 minutos post irradiación in vitro con 2 Gy, resultó 9,5 veces mayor que el de los controles sanos (Figura 5).

Figura 5. Perfiles de reparación evaluados mediante ensayo de cometa en linfocitos de un paciente y control

Mom

ento

de

la c

ola

del

com

erta

(a

lfa d

eW

eibu

ll)

tiempo [min.]

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Paciente que manifestó osteonecrosis

Pool donantes sanosτ1/2 = 2 min.

τ1/2 = 27.8 min.

Mom

ento

de

la c

ola

del

com

erta

(a

lfa d

eW

eibu

ll)M

omen

to d

e la

col

a de

lco

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ta

(alfa

de

Wei

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tiempo [min.]

0

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10

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25

30

0 10 20 30 40 50 60 70 80



τ1/2 = 27.8 min.

tiempo [min.]

0

5

10

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0 10 20 30 40 50 60 70 80



τ1/2 = 27.8 min.

0

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20

25

30

0

5

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15

20

25

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0 10 20 30 40 50 60 70 800 10 20 30 40 50 60 70 80




τ1/2 = 27.8 min.

Mom

ento

de

la c

ola

del

com

erta

(a

lfa d

eW

eibu

ll)

tiempo [min.]

0

5

10

15

20

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CONCLUSIONES

Los datos citogenéticos muestran que el ensayo de MN es apropiado para mediciones biodo-simétricas en personas sometidas a radioterapia en regiones corporales con alto flujo sanguí-neo o que incluyen médula ósea.

Los resultados obtenidos sugieren correlación entre los test in vitro (MN y ensayo de cometa) y la toxicidad tardía.

La comparación de la tendencia media de los datos citogenéticos de los pacientes evaluados prospectivamente con la curva de calibración muestra que para dosis equivalentes a todo el cuerpo superiores a 2 Gy, la frecuencia de MN observada resulta menor que la esperada. Este comportamiento se atribuye al fraccionamiento de la dosis. Se sugiere que con irradiaciones fraccionadas existe una recuperación citogenética parcial respecto del efecto inducido por una única exposición, como función del tiempo entre la exposición y la toma de la muestra. Si el valor de frecuencia de MN observado se aproxima a la curva de calibración, esto indicaría po-bre recuperación del efecto citogenético, k tiende a cero, y alta radiosensibilidad del pool de linfocitos y por lo tanto del paciente.

El ensayo de MN en la evaluación prospectiva presenta la limitación como ensayo predictivo de requerir la acumulación de una dosis equivalente superior a 1,8 – 2 Gy (más de 10 fracciones) para poner significativamente de manifiesto la capacidad de reparación del ADN, medida me-diante el parámetro k que representa el nivel de recuperación citogenética.

En la evaluación retrospectiva, tanto las frecuencias espontáneas de MN como las frecuencias radioinducidas (2 Gy in vitro) resultaron significativamente mayores, respecto de las esperadas a partir de la curva de calibración proveniente de individuos sanos, sólo en aquellos pacientes que desarrollaron toxicidad tardía.

La evaluación retrospectiva mediante la aplicación del ensayo de MN permitiría predecir la toxi-cidad tardía en pacientes que requirieran tratamientos de re-irradiación.

La aplicación del ensayo de cometa en la evaluación retrospectiva de un paciente permitió con-firmar la correlación entre los ensayos in vitro aplicados y la respuesta clínica. Estudios de nuestro laboratorio, aplicando el ensayo de cometa en pacientes hetrocigotas y homocigotas con síndromes de hipersensibilidad a las radiaciones ionizantes indican que este ensayo podría ser una herramienta apropiada para poner de manifiesto defectos en la capacidad de repara-ción del ADN.

El ensayo de cometa permitió determinar el daño inicial en el ADN, la velocidad de reparación (tiempo medio de reparación) y el daño residual después de un tiempo de reparación específico (80 min). El ensayo provee información de los valores medios (parámetro α de la distribución de Weibull para el momento de la cola del cometa) y de la distribución (histogramas de fre-cuencia), a nivel de células individuales.

La utilización del ensayo de cometa en estudios prospectivos permitiría identificar precozmente subgrupos más radiosensibles con los consecuentes beneficios en el tratamiento radiante.

La extensión de estos estudios a un mayor número de pacientes y la aplicación de múltiples factores biológicos pronóstico, incluyendo mediciones de radiosensibilidad en células normales, proliferación tumoral y oxigenación tumoral permitirá obtener información más completa de la radiosensibilidad individual y de la aplicabilidad de ensayos rápidos y de fácil implementación en el laboratorio clínico que puedan ser predictivos de la respuesta del paciente a la radiotera-pia, permitiendo la elección de un protocolo de radioterapia personalizado para cada paciente, que pueda brindarle una mejor evolución.

Adicionalmente, la aplicación de estos ensayos predictivos permitirá a los radioterapeutas ajus-tar la terapia radiante tanto en los pacientes radiosensibles como en los radioresistentes con la consecuente mejora en la relación terapéutica

Aunque las diferencias en radiosensibilidad celular y de tejidos normales es de gran importan-cia en la determinación de la severidad de la respuesta de los tejidos normales, también deben ser considerados: factores clínicos extrínsecos, pequeñas diferencias en la dosis física y facto-res que intervienen en la fibrosis, no asociados a la radiosensibilidad intrínseca.

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