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7/30/2019 ASPECTOS MECANSTICOS DE LA BIOSNTESIS DE NANOPARTCULAS DE PLATA POR VARIAS CEPAS DE FUSARIUM OX

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ASPECTOS MECANSTICOS DE LA BIOSNTESIS DE NANOPARTCULAS DE PLATA POR VARIAS

CEPAS DE FUSARIUM OXYSPORUM

Resumen

Produccin extracelular de las nanopartculas de metal por varias cepas del hongo Fusariumoxysporum se llev a cabo. Se encontr que los iones de plata acuosas cuando se exponen a

varias cepas de Fusarium oxysporum se reducen en la solucin, lo que conduce a la formacin

de hidrosol de plata. Las nanopartculas de plata se encontraban en el intervalo de 20-50 nm

de dimensiones. La reduccin de los iones de metal se produce por un nitrato reductasa

dependiente de quinona y un proceso de transporte extracelular. Las potencialidades de este

diseo nanotecnolgico basada en la biosntesis de fuga de nanopartculas para varias

aplicaciones tcnicas son importantes, incluido su potencial como material antibacterial.

Antecedentes

La desasimilatoria frrico reductasa, que se encuentra en las bacterias son una parte esencial

de los ciclos de hierro [1] y son esencialmente intracelular, pero una a una extracelular se aisl

a partir de Mycobacterium paratuberculosis [2]. Otro mecanismo posible podra ser activo en

este proceso, ya que se descubri que algunas bacterias reducen Fe3 + por xidos de producir

y secretar compuestos pequeos, difusibles redox que pueden servir como lanzadera de

electrones entre el microbio y el sustrato de hierro insoluble [3]. El papel de los compuestos

excretados en la transferencia de electrones extracelular fue revisado recientemente [4].

La presencia de hidrogenasa en hongos como Fusarium oxysporum se demostr con

suspensiones de clulas lavadas que haban sido cultivadas aerbicas y anaerbicas en un

medio con glucosa y sales modificado con nitrato de [5].

La nitrato reductasa fue aparentemente esencial para la reduccin de hierro frrico [6].

Muchos hongos que exhiben estas propiedades caractersticas, en general, son capaces de

reducir Au (III) o Ag (I) [7]. Adems de estas enzimas extracelulares, naftoquinonas varios [8-

10] y antraquinonas [11] con excelentes propiedades redox, se inform en F. oxysporum que

podra ser actuar como lanzadera de electrones en las reducciones de metal [3].

Aunque se sabe que los microorganismos tales como bacterias, levaduras y hongos juegan

actualmente un papel importante en la remediacin de metales txicos a travs de la

reduccin de los iones de metal, se consider que era interesante como nanofbricas muyrecientemente [12]. El uso de estas propiedades desasimilatoria de hongos, la biosntesis de

los nanomateriales inorgnicos utilizando organismos eucariotas como los hongos pueden ser

utilizadas para el cultivo de nanopartculas de oro [13] y la plata [14] intracelular en clulas de

hongos Verticillium [15]. Recientemente, se ha encontrado que los iones acuosos cloroaurato

puede reducirse extracelularmente usando el hongo F. oxysporum, para generar oro

extremadamente estable [16] o de nanopartculas de plata en agua [17]. Otro proceso, que se

describe en la literatura, se relacion para producir nanopartculas de plata a travs de catlisis

oligopptidos, precipitando las partculas con varias formas (hexagonal, triangular y esfrica)

[18]. Sin embargo, en la reduccin de hongos de iones Ag llev suspensin coloidal, de manera

diferente que en el caso de oligopptidos. A continuacin, los aspectos mecansticos siguen


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siendo una cuestin abierta, sin embargo, este proceso ocurre en el caso de hongos

probablemente, ya sea por accin reductasa o por quinonas lanzadera de electrones o ambos.

Nuestros objetivos en este estudio son comparar los diferentes cepas de F. oxysporum a fin de

comprender si la eficacia de la reduccin de iones de plata est relacionada con una accin

reductasa o quinona.

Figura 1

UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa

de 10-3 M AgNO3 con la biomasa fngica (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la

regin de longitud de onda baja.

Resultados y Discusin

Los matraces Erlenmeyer con la biomasa de F. oxysporum eran de un color amarillo plido

antes de la adicin de los iones Ag + y esto cambi a un color pardusco en la terminacin de la

reaccin con los iones Ag + de 28 h. La aparicin de un color amarillo es el color marrn en

solucin que contiene la biomasa sugiri la formacin de nanopartculas de plata [21]. Los

espectros UV-Vis registrada de los vasos de reaccin 07SD F. oxysporum cepa (Mtodo A) a

diferentes tiempos de reaccin se presenta en la figura 1. La fuerte resonancia de plasmn

superficial centrado en aproximadamente. 415-420 nm aumenta claramente en intensidad con

el tiempo. La solucin fue extremadamente estable, sin evidencia de floculacin de las

partculas incluso varias semanas despus de la reaccin. La insercin de la figura 1 muestra

espectros UV-Vis en la regin de longitud de onda mnima registrada del medio de reaccin

mostr una banda de absorcin a aproximadamente. 265 nm y fue atribuido a los aminocidos

aromticos de las protenas. Es bien sabido que la banda de absorcin a ca. 265 nm surgedebido a excitaciones electrnicas en residuos de triptfano y tirosina en las protenas. Esta


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observacin indica la liberacin de protenas en solucin de F. oxysporum y sugiere un posible

mecanismo para la reduccin de los iones metlicos presentes en la solucin [17].

La Figura 2 muestra los espectros de emisin de fluorescencia de hongos filtrado de una de la

cepa (07SD). Una banda de emisin centrada a 340 nm se observ. La naturaleza de la banda

de emisin indica que las protenas unidas a la superficie de las nanopartculas y los presentesen la solucin de existir en la forma nativa [22]. Los resultados similares fueron observados

para todas las cepas estudiadas, como se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 1, la cepa 07SD

apareca como el ms eficiente en la produccin de nanopartculas de plata. Aparentemente,

las diferentes eficiencias estn relacionados con la reductasa y / o para la generacin de

quinona y se discutir ms adelante. Una desestabilizacin de las nanopartculas es evidente

en el caso de F. oxysporum 534, 9114 y 91248 cepas en 28 horas, como se indica por una

disminucin en la absorcin de 420 nm.

Figura 2

Espectro de emisin de fluorescencia registrada de la mezcla de reaccin nanopartculas de

plata-hongo. La longitud de onda de excitacin fue 260 nm.

De manera similar, cuando la biomasa se sumergi en agua y slo el fngica filtrado (Mtodo

B) se aadi a una solucin de AgNO3 10-3 M, la solucin acuosa inicialmente incolora cambi

a un color marrn amarillento plido dentro de 28 h de reaccin (datos no mostrados ),

indicando claramente que la reduccin de los iones se produce extracelularmente a travs de

agentes reductores liberados en la solucin de F. oxysporum como lo muestra el espectro de

UV-Vis para la cepa 07SD (Fig. 3).


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Figura 3

UV-Vis espectros registrados como una funcin del tiempo de reaccin de una solucin acuosa

de 10-3 M AgNO3 con el fngica filtrado (07SD). El recuadro muestra la absorcin UV-Vis en la

regin de longitud de onda baja.

Las figuras 4 y 5 se muestra la micrografa SEM registrados a partir de la nanopartcula de plata

(Mtodo A). Esta imagen muestra los agregados de nanopartculas de plata. En esta

micrografa, nanopartculas esfricas en el intervalo de tamao de 20-50 nm se observaron.

Las nanopartculas no estaban en contacto directo, incluso dentro de los agregados, lo que

indica la estabilizacin de las nanopartculas por un agente de proteccin terminal. Esto

corrobora con la observacin anterior de Ahmad et al. [17] en su estudio sobre F. oxysporum.

La micrografa misma en el Mtodo B se observ (no mostrada). En el anlisis por

espectroscopia de dispersin de energa (EDS) de las nanopartculas de plata se confirm la

presencia de la seal de plata elemental (Figura 6).

La TLC (Cromatografa de Capa Fina) anlisis en gel de slice de 60 placas utilizando cloroformo-

metanol-cido actico (195:5:1) mostr una mancha con valor de Rf de 0,65, y utilizando

benceno-nitrometano-cido actico (75:25: 2) mostr una mancha con valor de Rf de 0,85, que

corresponde a 2-acetil-3, 8 - dihidroxi-6-metoxi antraquinona o sus ismeros en 2 - acetil-2,8-

dihidroxi-6-metoxi antraquinona (Esquema 1). Esto fue corroborado por el espectro de

fluorescencia del filtrado (Mtodo A), lo que indica un resto antraquinona fluorescencia [11].

Los espectros de excitacin en el mximo de emisin (550 nm) encajan muy bien con el

espectro de absorcin de la antraquinona en la Figura 7.


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Figura 4

Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 11000 magnificacin.


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Figura 5

Micrografa SEM de F. oxysporum cepa 07 en SD 40000 magnificacin.

La Figura 8 muestra la nitrato reductasa a travs de la reaccin de nitrito con 2,3-

diaminophthalene. El espectro de emisin presenta dos picos principales de intensidad defluorescencia a 405 y 490 nm correspondiente a la emisin mxima de la

diaminonapthotriazole y 2,3-, DAN (exceso), respectivamente. La intensidad de estas dos

bandas aument con la adicin de un 0,1% KNO3 solucin, lo que confirma la presencia de la

nitrato reductasa.

Figura 6

EDS espectros de nanopartculas de plata


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Figura 7

Espectro de emisin de fluorescencia de la solucin acuosa de 10-3 M AgNO3 con la biomasa

fngica (07SD). La longitud de onda de excitacin fue 465 nm. El recuadro muestra el espectro

de excitacin de fluorescencia (emisin a 550 nm ).

Parece que la reductasa es responsable de la reduccin de los iones Ag + y la subsiguienteformacin de nanopartculas de plata. La misma observacin se inform con otra cepa de F.

oxysporum y se seal que esta reductasa fue especfico para F. oxysporum. Sin embargo,

Fusarium moniliforme, no dio lugar a la formacin de nanopartculas de plata, ni

intracelularmente ni extracelularmente pero contena reductasas intra y extra celulares en una

manera similar como F. oxysporum [17,23]. Esto es una indicacin de que probablemente las

reductasas en este tipo de Fusarium son importantes para el Fe (III) a Fe (II), pero no a Ag (I) a

Ag (0). Adems, en F. moniliforme derivados de antraquinonas no se detectaron a diferencia

del caso de F. oxysporum. Tanto fusarium eran iguales en la produccin de naftaquinonas [8],

pero difieren en la produccin de antraquinonas. Probablemente, en nuestro caso, Ag (0)

reduccin se debi principalmente a una conjugacin entre la lanzadera de electrones con la

participacin reductasa como se muestra en la Figura 9.

Conclusin

Aunque el oro / plata nanopartculas han sido sintetizados utilizando procariotas tales como

bacterias [24,25] y eucariotas tales como hongos [13,14], las nanopartculas crecer

intracelularmente, excepto en el caso de un reciente informe en el que F. oxysporum fue

utilizado. En ese caso, las nanopartculas creci extracelularmente [17]. En nuestro caso, todas

las cepas de F. oxysporum estudiadas mostraron la capacidad de produccin de nanopartculas

de plata, sin embargo, dependiendo de las relaciones de conexin reductasa / electrn enestas condiciones. Biolgicamente sintetizadas nanopartculas de plata podran tener muchas


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aplicaciones en reas como la ptica no lineal, revestimientos espectralmente selectivos de

absorcin de energa solar y materiales de intercalacin para las bateras elctricas, como los

receptores pticos, catlisis en reacciones qumicas, bio-etiquetado [26], y como capacidad

antibacterianos [27].

Mtodos

Las cepas de F. oxysporum utilizados fueron los siguientes: O6 SD, SD 07, 534, 9114 y 91248 de

la Esalq-USP Gentica y Biologa Molecular Laboratorio-Piracicaba, SP, Brasil. El inculos

fngicos se prepararon en un 2% de extracto de malta y extracto de levadura 0,5% a 28 C en

placas de Petri. El crecimiento de los hongos lquido se llev a cabo en presencia de extracto

de levadura al 0,5% a 28 C durante 6 das. La biomasa se filtr y se resuspendi en agua

estril.

Figura 9

Mecanismos hipotticos de la biosntesis de las nanopartculas de plata


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Plata reduccin y su caracterizacin

Mtodo A: En la reduccin de la plata, la metodologa descrita anteriormente fue seguido [17].

En pocas palabras, aproximadamente 10 g de F. oxysporum biomasa fue tomada en un matraz

cnico que contena 100 ml de agua destilada. Solucin de AgNO3 (10-3 M) se aadi al matraz

erlenmeyer y la reaccin se llev a cabo en la oscuridad. Peridicamente, las alcuotas de lasolucin de reaccin y se eliminaron las absorciones se midieron usando un espectrofotmetro

de UV-Vis (Agilent 8453 - matriz de diodos).

Mtodo B: Otra prueba se llev a cabo de la siguiente manera: aproximadamente 10 g de F.

oxysporum biomasa fue tomada en un matraz cnico que contena 100 ml de agua destilada,

se mantuvo durante 72 horas a 28 C y despus los componentes de la solucin acuosa se

separaron por filtracin. A esta solucin, AgNO3 (10-3 M) se aadi y se mantuvo durante

varias horas a 28 C.

Las nanopartculas de plata se caracterizaron por microscopa electrnica de barrido (SEM) yespectroscopia de dispersin de energa (EDS) con una tensin de 20 kV (Jeol - JSM-6360LV) y

previamente recubierta con oro a vaco.

Determinacin de los compuestos de electrones-trasladados

Liberacin de electrones-trasladados compuestos se sigui la metodologa descrita

anteriormente [11]: A fin de determinar las quinonas solubles en agua que podran funcionar

como una lanzadera de electrones, los cultivos se filtraron 4-6 semanas, y el filtrado se ajust a

pH 3 con HCl 1 M. La solucin acidificada se pas entonces a travs de una columna con resina

de intercambio inico (Amberlite ) para la absorcin de los pigmentos. Los compuestos se

eliminan de la columna por elucin con acetona, se elimin la acetona utilizando una

evaporacin rotatorio Buchi y la fase acuosa se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Todas las

extracciones de acetato de etilo se combinaron y se redujeron usando el evaporador rotatorio.

Despus de eso, 2 uL muestras fueron vistos repetidamente sobre una placa de gel de slice 60

hasta un punto era visible bajo luz UV a 254 nm. Las muestras fueron resueltas utilizando un

cido cloroformo-metanol-actico (195:5:1) y benceno-nitrometano-cido actico (75:25:2)

sistema diseado para movilizar pigmentos polares. Las placas fueron secadas al aire y las

manchas se visualizaron bajo luz ultravioleta [19].

El nitrato reductasa ensayo

La reduccin de nitrato se demostr en el mismo medio (Mtodo A y B) de la misma caldo de

crecimiento de F. oxysporum con la adicin de 0,1% de KNO3 [6]. La prueba para la nitrato

reductasa se hizo despus de 2 das por el mtodo fluoromtrico [20]. Brevemente, 100 l

hongos filtrado y los 200 l de agua desionizada. Para esto, 10 l de recin preparada 2,3 -

diaminonaphtalene (DAN) (0,05 mg / ml en HCl 1 M) y se mezcla inmediatamente. Despus de

10 minutos de incubacin a 20 C, la reaccin se detuvo con 5 l de 0,1 M NaOH.

La intensidad de la seal fluorescente producida por el producto se maximiza mediante la

adicin de base. la formacin de 2,3-diaminonapthotriazole se midi utilizando un Perkin-

Elmer (LS-55) con espectrofotmetro de luminiscencia y longitud de onda de excitacin a 375nm y la banda de emisin medida a 550 nm [20].


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Determinacin de los residuos de triptfano / tirosina

Presencia de residuos de triptfano / tirosina en las protenas de liberacin que en el filtrado

fngica se analiz por fluorescencia [17]. la mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo en

un espectrofotmetro de luminiscencia Perkin-Elmer (LS-55). La longitud de onda de excitacin

era 260 nm, cerca de mximos transiciones pticas del triptfano y tirosina.

Autores de las contribuciones

ND concibe el estudio, junto con la Oficina de Asuntos Jurdicos y EE y particip en su diseo y

la coordinacin y recogieron todos los datos y escribi el documento. PDM obtenido todos los

puntos de vista de SEM, realizado los ensayos enzimticos, los aspectos de electrones

trasladados y discutieron las tres partes relacionadas en el manuscrito. GIHS realizado todaslas pruebas de hongos y medida de todas las variaciones espectroscpicas de la resonancia de

plasmn de las nanopartculas de plata bajo la supervisin de EE. Oficina de Asuntos Jurdicos

tambin supervis todos los aspectos de las nanopartculas en este trabajo. Todos los autores

ledo y aprobado el manuscrito final.

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