UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOFACULTAD DE CIENCIAS

Prácticas de Biología de Animales III. Práctica del procedimiento

Histológico del Grupo de vertebrados: Aves (Gallus gallus

domesticus – gallina)Apartado 2: Práctica de fecundación en M. aurantiaca (almeja chocolata)

Elena Coria Ortega, Jovana Jasso Martínez, Nadieznha Medina Cantú, Marco A. Ruvalcaba Knoth.

20/11/2012

Introducción (faltan las citas de la introuccion y ponerlas en la bibliografía)

La importancia de conocer la Histología es que te permite asomarte a un mundo microscópico, en el cual puedes estudiar las características propias de cada órgano, en este caso el órgano reproductor del ave.

Pero antes de adentrarnos de esta disciplina es necesario conocer un poco acerca de las aves.

La aves son vertebrados que surgieron en la era Mesozoica, a partir de los dinosaurios carnívoros, con los que sus primeros representantes guardan un gran parecido, al grado que actualmente predomina la tenencia a clasificarlos junto con ellos en la clase Dinosauria. Entre sus características están la presencia de plumas (tanto para termorregularse, como para volar), de pico, de metabolismo alto, de esqueleto que ha tendido a la ligereza y a la fusión de sus componentes y a la modificación de sus extremidades (las anteriores con reducción de dedos y las posteriores compuestas por tres segmentas, tendiendo a reducir la musculatura en el último, en el que predominan los tendones).El estudio de la evolución de la clase Aves se enfrenta al problema de que sus representantes siempre han sido muy malos candidatos a fosilizar, debido a la presencia de un esqueleto delicado y frágil, generalmente adaptado a sus costumbres aéreas, su pequeño promedio etc. En cuanto a su sistemática se han dividido en dos subclases que parecían claramente diferenciadas, sin embargo los recientes descubrimientos de físiles en China y Europa de formas intermedias ya no han hecho tan clara esta separación:

Archaeornithes (†), que incluyen organismos con más parecido anatómico a los dinosaurios que a sus parientes actuales. Están típicamente representados por Archaeopteryx, que eran aves que tenía cráneo diapsido, su columna vertebral no estaba fusionada y se alargaba formando una cola con un hueso.

Neornithes, que comprenden a todas las aves modernas, abarcando algunos representantes fósiles; todas las aves actuales se caracterizan por pérdida de la dentición, la desaparición de la cola vertebral, la tendencia a fusionar la cintura pélvica, la desaparición de las fosas temporales. Los Neornitas se dividen en Paleognathae y Neognathae; las primeras comprenden a las aves terrestres no voladoras, como las avestruces, los casuarios y los emúes, con plumaje suave y amplias áreas de piel desnuda en la cabeza, el cuello y las patas.Los neognathas incluyen a las aves voladoras con el plumaje adaptado a esta función, el esqueleto muy ligero para reducir peso, presentando huesos pneumáticos (o huecos), el esternón con una prolongación llamada quilla, muy desarrollada para permitir la inserción de la musculatura del vuelo.

Debido al escaso registro fósil poco se sabe de sus relaciones filogenéticas, por lo que su clasificación es muy variable, pero en general se consideran más de 20 ordenes, aunque actualmente la biología molecular ha permitido avances en el establecimiento de una sistemática con mayor sentido filogenético.

Se encuentran en prácticamente cualquier ambiente y son de distribución cosmopolita. Su reproducción es estrictamente ovípara y entre ellas se encuentran los vertebrados con dimorfismo sexual más marcado y conductas complejas

En cuento a sus características de reproducción, las aves son organismos que “ponen” huevos, es decir son ovovíparas, lo que hace que presenten

características reproductivas diferentes a los mamíferos. Otro aspecto importante en las aves es el hecho de que la hembra posee el sexo heterogamético, con lo que durante el proceso de la ovogénesis, y no en el de espermatogénesis queda determinado el sexo del futuro embrión.

Aparato genital masculino: En las aves los órganos reproductores del macho incluyen los testículos, las vías deferentes (integradas entre otros por los epidídimos y conductos deferentes) y el órgano copulador (Fig. 1) (Rodríguez, F., 2003).

Testículos: Existen dos testículos con forma ovalada y tamaño, en función de la actividad sexual, de 1 a 4 cm de longitud (fig.1). Están situados en la cavidad abdominal (endorquidia fisiológica), en posición cefálica con respecto a los riñones y por debajo de ellos. Su temperatura es la misma que la temperatura corporal del animal (41-43° C). Los testículos de las aves tienen tubos seminíferos, pero no presentan septos de separación ni lobulillos. Están suspendidos de la pared dorsal de la cavidad abdominal por un ligamento, el mesorquio.

Vías deferentes: Los epidídimos se desarrollan muy poco, siendo, por tanto, su papel fisiológico muy escaso. Se prolongan hacia los conductos deferentes, que están muy desarrollados y se extienden a lo largo de 12 a 15 cm hasta desembocar en una cavidad común al aparato digestivo y al génito-urinario denominado cloaca. Este conducto deferente, dado que es el lugar donde maduran y se almacenan los espermatozoides puede ser comparado al epidídimo de los mamíferos (Rodríguez, F., 2003).

Órgano copulador: El falo o pene situado en la línea media ventral de la cloaca y formado por pliegues cloacales, es muy rudimentario en el gallo, el pavo y la pintada, existiendo solamente en el momento de cópula un contacto entre las cloacas del macho y la hembra. En cambio esta muy muy desarrollado (6-8 cm de erección) en las palmípedas (pato y ganso), en forma de cuerpo retorcido en espiral, produciéndose una verdadera penetración en el momento de la cópula.A diferencia de los mamíferos las aves carecen de las principales glándulas de Cowper o bulbo-uretrales (Rodríguez, F., 2003).

Aparato genital femenino: En las aves, el aparato reproductor de las hembras puede considerarse impar, ya que en el ave adulta solamente el ovario y el oviducto izquierdos son funcionales. A pesar de que estos órganos del lado derecho están formados en los estadios embrionarios, no se desarrollan ni entran en actividad, aunque en muchas especies no domésticas (como en aves de rapiña) persiste el ovario derecho (Rodríguez, F., 2003).

Fig. 1 Aparato genital de la gallina ponedora

(Tomado de Sauveur y Reviers, 1992).

Ovario: El ovario está situado en la parte superior de la cavidad abdominal, en relación con el riñón y el pulmón del mismo lado. En periodos de inactividad sexual, su longitud oscila entre 2 y 3 cm. El ovario está muy vascularizado y recibe sangre de la arteria ovárica corta, rama procedente de la arteria renal izquierda. Las venas anterior y posterior del ovario, drenan en la vena cava posterior.El ovario adulto, en el que no se distingue entre la médula y la corteza, toma el aspecto de racimo de uvas debido a una acumulación de folículos de diferente tamaño. El ovocito y la esfera de vitelo nutritivo que lo engloba, están rodeados por varias capas de folículo ovárico, produciéndose la ovocitación por una zona folicular denominada estigma, prácticamente avascular (Rodríguez, F., 2003).

Oviducto: El oviducto del ave es un tubo relativamente largo (desde 30 cm en un periodo de descanso, hasta 70 cm en periodo de actividad sexual), contorneado y muy dilatable constituido por cinco partes claramente diferenciadas, que van desde su conexión con el ovario hasta la parte posterior (fig. 2) (Rodríguez, F., 2003):  

Fig. 2 Aparato genital de la gallina ponedora

(Tomado de Sauveur y Reviers, 1992).

a) Infundibulum o también llamado embudo, ya que su parte  superior tiene forma de un cono y se estrecha en la siguiente unión con el Mágnum.b) Mágnum es la parte más larga del oviducto, su pared interna posee varios pliegues  y es rica en células y glándulas secretoras. c) Istmo, es una zona relativamente corta con diámetro reducido y con pocos repliegues a comparación del mágnum. d) Útero tiene forma sacciforme o bolsa con una pared muy gruesa y muscular.e) Vagina, es una parte muy estrecha y muscular que comunica al útero con la mitad izquierda de la cloaca.

Objetivos

Objetivo general:

Introducir al estudiante a comprender la microanatomia de las células, tejidos y del órgano reproductor femenino del grupo de Aves y correlacionar la estructura y microestructura con la función.

Objetivos específicos:

Identificar en el grupo de vertebrados compuesto por las aves la estructura del aparato reproductor.

Realizar preparaciones histológicas del órgano reproductor obtenido. Conocer el proceso de realización de las preparaciones (inclusión en

parafina, cortes, tinción y preparaciones fijas).

Resultados (incluyendo metodología)

Disección y frotis sanguíneo.

La disección (Fig. 6) en el laboratorio se realizó con un espécimen hembra de Gallus gallus domesticus (gallina), el organismo disectado era un juvenil ya que su aparato reproductor era muy pequeño, además de que no se obtuvo el oviducto, antes de que la sangre coagulara se procedió a realizar 10 frotis (Fig. 7), estos frotis solo se fijaron en formol para posteriormente realizar la tinción.

: Fig. 4 Gallina dormida con cloroformo al 10%. Fig.5 Desplumado, para poder realizar el corte.

Fig.6 Disección de la gallina. Fig. 7 Frotis de la sangre fresca del organismo

Fig. 8 Extracción de aparato reproductor (no se obtuvo oviducto). Fig. 9 Ovario (en medio) y riñones (a los lados).

Fijación

El primer paso en la preparación de una muestra de tejido u órgano es la fijación para conservar la estructura, en general mediante el empleo de sustancias químicas, esto para conservar la estructura del tejido en forma permanente, la fijación se utiliza para abolir el metabolismo celular, destruir los microorganismos patógenos (bacterias, hongos o virus) y para endurecer el tejido como consecuencia de la formación de enlaces cruzados. En este caso la muestra se fijó con formaldehido, luego de la fijación la muestra se procedió a colocarla dentro del Histoquinet (Fig.10), el cual hace el procedimiento de lavar y deshidratar esto se llevó acabo en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar el 100% de alcohol.

Fig. 10 Histoquinet

También en este aparato se lleva a cabo el aclarado, donde se utiliza un solvente orgánico que es misible en la parafina, para extraer el alcohol al 100% antes de la filtración de la muestra con parafina.

Inclusión

El segundo paso la muestra se dispone para su inclusión en parafina con el fin de permitir su corte, se infiltro con un medio de inclusión (parafina) (Fig. 11) , la inclusión se realizó el aparato de inclusión, este contiene la parafina fundida a 600° C y mediante un botón es despachada para colocarla dentro del cubo de metal (donde se encontraba el tejido) posteriormente se procedió a sacarle el

Ovario

Riñones

aire con un aguja de disección, para que cuando se realizara el corte un hubiese problemas con él. Y finalmente se dejó enfriar (Fig.12 y 13).

Fig. 11cAparato de inclusión. Fig.12 Bloque de parafina (tejido incluido).

Fig.13 Bloque de parafina incluido.

Finalmente en la inclusión de los bloque se obtuvieron 2 para el grupo de las aves.

Corte

Para la preparación de los cortes histológicos de tejido de aparato reproductor femenino de aves se siguieron los siguientes pasos:

Después de la inclusión del tejido en parafina, se coloca el cubo en el micrótomo de rotación (Fig. 14), se calibra el micrótomo para graduar el grueso de los cortes, en este caso fue de 7 micras, comienza a girarse con una palanca para que el cubo vaya avanzando poco a poco hasta que la navaja comience a cortar (Fig. 15), se retiran los cortes cuidadosamente con la ayuda de pinzas o agujas de disección (Fig. 16), al tener el corte seleccionado se hecha en un baño de flotación (Fig. 17), el cual consta de grenetina y agua

caliente esto con el objetivo de expandir el tejido, se deja remojando breve tiempo y se retira de nuevo con la ayuda de pinzas (Fig. 18), posteriormente, se coloca en los portaobjetos previamente embarrados de albúmina, esto con la finalidad de que el tejido se adhiera mejor y sea más fácil montarlo, conviene tener a la mano un hielo cubierto de un trozo de tela y agregarle a esto unas gotas de glicerina para colocarlo sobre el tejido incluido en el cubo de parafina, esto puede ayudar a hidratar el tejido y que los cortes salgan mejor y no se rompan.

Fig. 14 Microtomo con el bloque incluido.

Fig. 15 Corte del Bloque Fig.16 Seleccionando el corte que se pasaría al baño maría.

Fig.17 Baño de flotación Fig. 18 Se retira la muestra con un porta objetos.

Fig. 19 Cortes Finales.

Tinción

Tinción para el aparato reproductor de ave.

La siguiente fue teñir la muestra para permitir su examinación, esto se realizó primero disolviendo y extrayéndose la parafina con xilol, posteriormente los tejidos tenían que rehidratarse mediante el uso de una serie de alcoholes de concentración creciente. Luego el tejido se tiño con hematoxilina en agua, como el colorante de contraste, eosina es más soluble en alcohol que en agua, se volvió a deshidratar la muestra en diferentes soluciones alcohólicas y después se tiño con eosina en alcohol.

Finalmente se hacen pasar por xileno y posteriormente se les coloco bálsamo de Canadá y cubrirlo con un cubreobjetos. Finalmente de la tinción de los tejidos se obtuvieron 20 muestras.

Fig. 21 Tren de tinción de tejidos del aparato reproductor de ave.

Tinción para el frotis ave.

Los frotis obtenidos de la sangre de la ave se fijaron en alcohol metílico (de 2 a 3 min), posteriormente se tiñeron con Mac Grunwald (aproximadamente 10 gotas sin dejar que se secaran) el tiempo que se dejó fue de 3 min. aproximadamente, posteriormente se le agregaron 10 gotas de agua destilada en cada frotis (1 min) (Fig. 22), posteriormente se escurrió y se agregó la solución de Giemsa, después se lavó con agua de llave y se dejó secar para finalmente cubrirlo con bálsamo de Canadá y se cubrió con un cubreobjetos (Fig. 23).

De las muestras de frotis 10 fueron teñido, aun que quedaron con un azul muy fuerte esto pudo haber sucedido porque se dejó teñir de más.

Fig. 22 Tinción del frotis.

Fig. 23 Frotis fijado.

Observación.

Finalmente se obtuvieron las muestras de tejido y de frotis se procedió a la observación, primero para ver que muestras habían quedado bien montadas y posteriormente comenzar a localizar estructuras.

Observación del Frotis.

En el caso del frotis solo 2 muestras quedaron bien teñidas, y en estas se observaron los eritrocitos y en la muestra 2 se alcanzó a observar un Leucocito agranulocito: linfocito.

Fig. 24 Frotis sanguíneo de ave (visto a 10x), donde se observan varios eritrocitos.

Fig. 25 Frotis sanguíneo de ave, donde se observan eritrocito (visto a 40x).

Diagrama del tipo celular en la sangre.

Eritrocitos

Eritrocitos

Leucocitos agranulocito: linfocito.

Cortes del aparato reproductor.

Los cortes que el equipo realizo se muestran en las Fig 26-28 donde se observa el ovocito en crecimiento (previtelogénico).

Sangre (glóbulos blancos, leucocitos

Granulocitos

Agranulocitos

Neutófilos

Eosinofilos

Basófilos

Monocitos

Linfocitos

Elementos figurados

Plaquetas

Trombocitos

Fig. 26 Ovocito de gallina en crecimiento. Previtelogénico. 40x.

-Núcleo

-Tejido conjuntivo

Fig. 27 – Ovocitos de gallina. 40x.

-Núcleo-Epitelio simple plano-Tejido conjuntivo

Imágenes de preparaciones aportadas por la profesora:

-Luz del túbulo-Periferia del túbulo-Tejido conjuntivo

Fig. 28 Ovocito previtelogénico de gallina. 40x.

-Núcleo-Citoplasma-Epitelio simple plano-Tejido conjuntivo

Fig. 29 y 30 Corte de testículo de ave (paloma). Izq. 10 x (Fig. 4). Der 40x (Fig. 5). Túbulos seminíferos.

Fig, 32 Túbulo seminífero de mamíferos (rata). 40x.

Fig. 31 Corte de testículo de mamífero (rata). 10x. Túbulos seminíferos.

-Luz del túbulo-Periferia del túbulo-Tejido conjuntivo

-Espermatozoides en la luz del túbulo.

-Diferentes estadios de células germinales (espermatogonias, espermatocitos 1°s y 2°s, espermatidas y en la luz los espermatozoides)

-Epitelio simple plano.

Fig. 33 Corte de testículo de anfibio. 40x. Vista de un quiste de espermatozoides.

Fig. 34 Corte de testículo de reptil. 40x. Túbulo seminífero.

-Luz del túbulo con espermatozoides.

-Diferentes estadios de células de la línea germinal (espermatogonias, espermatocitos 1°s y 2°s, espermátidas y espermatozoides en la luz)

Fig. 35 Corte de testículo de pez. 40x.

-Quistes con células de la línea germinal en diferentes estadios.

APARTADO 2.

Práctica de fecundación en almeja chocolata (M. aurantiaca)

1: Se abrió la concha de la almeja con ayuda de un desarmador.

2. A partir de cortes al cuerpo de la almeja se identificaron las gónadas.

3. Se hicieron cortes a las gónadas para saber si el organismo era macho o hembra, esto se hizo observando al microscopio el corte y tratando de identificar el tipo de gametos (espermatozoides u ovocitos).

4. Identificación de ovocitos. En este paso se puede asegurar que el espécimen es hembra.

Discusión conclusión.

En esta práctica se observó que es de gran importancia la Histología como disciplina, ya que para los biólogos constituye una gran herramienta pues combina las estructuras microscópicas con las funciones que conocemos de los órganos, por lo tanto nos permite adentrarnos a un nuevo mundo que no se puede ver de manera simple. La práctica de la histología al principio puede ser muy difícil pues no estamos familiarizados con los pasos a seguir, por ejemplo cuando realizamos los cortes o cuando los montamos nos costó mucho trabajo hacerlo (sobre todo con limpieza), algunas de nuestras muestras quedaron mal teñidas o manchadas y comparándolas con las muestras que nos habían prestado con anterioridad nos hacer ver que la histología es una disciplina de práctica.

En cuanto a la disección de organismos para una práctica de aparatos reproductores es un tanto contraproducente tener un organismo juvenil, en el caso de nuestro equipo, el ejemplar de Gallus gallus domesticus que utilizamos pude haber sido de más ayuda si se hubiera encontrado en un estado adulto,

4. Identificación de espermatozoides. En este paso se puede asegurar que el espécimen es macho.

6. Ya que se identificaron los organismos y el trozo de gónada de estos, en un portaobjetos escavado se colocan ambos trozos (asegurando la presencia de gametos femeninos y masculinos) y se añadió una gota de agua de mar. Se observó al microscopio. En este caso no pudimos identificar el evento de fecundación.

no pudimos extraer oviducto y no pudimos ver la característica forma de racimo de uva con los ovocitos en diferentes estadios de desarrollo.

En cuanto a la práctica de fecundación no tuvimos éxito ya que los ejemplares que M. aurantiaca eran hembras a excepción de solo un ejemplar de un equipo del cual obtuvimos todos la muestra de gónada masculina con los espermatozoides, pero estos ya no fueron viables en el momento de montar las muestras en el portaobjetos escavado. El que prácticamente todos los organismos hayan sido hembras puede deberse a la epóca en que estos fueron pescados de su hábitat o bien a la forma de pesca para colectar a estos organismos.

Gracias a estas prácticas podemos familiarizarnos con todo un proceso que se lleva a cabo para el estudio histológico de los organismos y de cómo se lleva a cabo en los diferentes grupos de vertebrados el proceso de desarrollo y el evento de la reproducción.

Fuentes consultadas:

RODRÍGUEZ, F. 2003. Bases de la producción animal. Primera edición. Ed. Universidad de Sevilla. Sevilla.