4.6 BASES MOLECULARES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA.

Genética.

La Genética es la ciencia que estudia lo relacionado con la herencia, esto incluye qué son los genes, cómo ellos llevan esa información, cómo se replican y pasan a las generaciones posteriores y cómo la expresión de su información dentro de un organismo determina sus características particulares.

Naturaleza del material genético.

Los cromosomas son estructuras celulares que llevan la información hereditaria; en estos cromosomas están contenidos los genes.

Recordemos entonces que el ADN es una macromolécula constituida por unidades repetitivas de nucleótidos. Cada nucleótido consta de una base nitrogenada (adenina (A), timina (T), citosina (C), o guanina (G)), una pentosa (desoxirribosa) y un grupo fosfato. El ADN es una molécula de doble cadena de nucleótidos, las dos cadenas se mantienen unidas mediantes puentes de hidrógeno entre sus bases nitrogenadas. El apareamiento de las bases nitrogenadas ocurre siempre en una forma específica: la adenina siempre se aparea con la timina y la citosina siempre se aparea con la guanina, debido a esto la secuencia de las bases de una cadena determina la secuencia de otra, a esto se le denomina complementariedad. Esta propiedad es importante porque permite la replicación de la molécula de ADN conservando fielmente la información. Para que este apareamiento sea posible ambas cadenas están orientadas en dirección opuesta, una con respecto a otra, a eso se le dice que son antiparalelas.

De la misma manera la información contenida en el ADN puede ser copiada por partes, en moléculas específicas de ARN denominadas ARN mensajeros (ARNm), este proceso se denomina transcripción. La información codificada en el ARNm es luego traducida en una secuencia específica de aminoácidos que forman una proteína. Este último proceso se denomina traducción.

Imagen 4.6. 1 Cadena de ADN.

1. Replicación.

En la replicación del ADN, una molécula original del ADN de doble cadena es convertida en dos moléculas hijas de ADN idénticas. La clave para entender esta replicación del ADN es la estructura complementaria de las secuencias de los pares de bases en las dos cadenas del ADN, una cadena sirve de molde para la producción de otra.

La replicación requiere la presencia de proteínas celulares complejas que dirigen una secuencia particular de eventos. Cuando comienza la replicación, las dos cadenas se desenrollan y se separan una de otra en un pequeño segmento de la molécula. Los nucleótidos libres presentes en el citoplasma de la célula se unen a las bases expuestas del fragmento de ADN de cada cadena simple expuesto de la molécula original. Donde hay T en la cadena original se incorporará una A, y donde hay una G se incorporará una C.

Imagen 4.6. 2 Replicación del ADN.

La replicación del ADN comienza siempre en el mismo punto llamado punto de iniciación u origen. En este punto de iniciación y zonas cercanas a él, se unen a las cadenas de ADN moléculas de proteínas desenrolladas, las cuales hacen que el ADN en esa zona se abra formando una especie de burbuja, en este momento una ARN polimerasa ADN dependiente se une al punto de iniciación mediante la ayuda de una o más proteínas iniciadoras específicas, las cuales son las que reconocen el punto de iniciación. Aparentemente este punto de iniciación está anclado a la membrana celular y dicho anclaje parece ser necesario para ayudar a compensar las fuerzas de torsión que se originan cuando el cromosoma se desenrolla para ser copiado.

Imagen 4.6. 3 Punto de iniciación de la replicación.

El desenrollamiento de la doble hélice y el de las dos cadenas se mantengan separadas es posible por varias proteínas especializadas. Enzimas conocidas como helicasas desenrollan fragmentos cortos de ADN por delante de la horquilla de replicación. El desenrollamiento del ADN requiere energía que es aportada por la hidrólisis de dos moléculas de ATP. Tan pronto como una secuencia corta se ha desenrollado, varias moléculas de unas proteínas que se unen al ADN de simple cadena se unen fuertemente a cada una de las cadenas simples manteniéndolas separadas para que puedan actuar las enzimas de la replicación.

En la siguiente tabla se resume el papel de las principales proteínas que participan en la replicación del ADN señalando el sustrato y la función.

Proteína Sustrato Función

Proteínas que se unen al ADN de cadena simple

ADN de cadena simple Mantiene separadas las cadenas

Topoisomerasas (girasas)

ADN de cadena doble, requiere ATP

Superenrollamiento negativo del ADN

Helicasa ADN de cadena doble Desenrolla el ADN en la horquilla de replicación

Primasa (ARN polimerasa ADN dependiente)

ADN de cadena doble, trifosfato-5-ribonucleótidos

Forma el ARN cebador (primer)

ADN polimerasa III

(1) Sintetasa ARN cebador en el extremo 3’, trifosfato-5-desoxirribonucleótidos

Forma las nuevas cadenas

(2) ADN exonucleasa Bases apareadas en forma incorrecta

Corrige errores

ADN polimerasa I

(1) ARN exonucleasa

(2) ADN exonucleasa

ARN cebador (5’3’)

Bases apareadas en forma incorrecta

Remueve el ARN cebador

Corrige errores

(3) Sintetasa ADN de cadena simple Reemplaza el ARN cebador con ADN

ADN ligasa Fragmentos de ADN de cadena simple

Une los extremos

Imagen 4.6. 4 Esquema de la replicación.

2. Transcripción.

La transcripción ocurre cuando en la célula se requiere una determinada proteína, ésta se forma a partir de la información contenida en el ADN. El ADN se localiza exclusivamente en el núcleo de la célula; la información que codifica para

la síntesis de la proteína, la envía hacia el citoplasma a través del ARNm (ácido ribonucleico mensajero); por ello, el ADN primero sintetiza a éste en un proceso que se llama transcripción.

La transcripción se inicia cuando la doble cadena de ADN se separa en un punto determinado, para servir como plantilla para la formación de los nucleótidos que van a formar el ARNm.

Los nucleótidos libres del ARNm se empiezan a aparear con los nucleótidos del ADN que quedaron expuestos cuando la doble cadena se abrió. De esta manera, tomando como base los nucleótidos de un tramo de una de las cadenas del ADN, se forma el ARNm, el cual consta de una sola cadena, una vez formado, el ARNm se separa del ADN y queda listo para viajar al citoplasma. Una vez que el ADN se separó la cadena del ARNm, la doble cadena de ADN vuelve a unirse en el mismo orden en que estaba.

Cuando la transcripción del ARNm termina, las dos cadenas del ADN vuelven a unirse.

Imagen 4.6. 5 Transcripción del ADN: a) las dos cadenas que forman el ADN se separan en un punto determinado; b) los nucleótidos de ARN que andan libres se aparean con los nucleótidos del ADN; c) queda formado el ARNm que viaja

al citoplasma para codificar los aminoácidos.

Como se puede observar, la molécula de ARNm es una sola cadena de nucleótidos, cuya secuencia de bases fue determinada por el ADN; en esta secuencia va indicado el tipo de aminoácido que se va a codificar, de acuerdo a como lo determinó el ADN. El ARN difiere del ADN porque:

En lugar de timina contiene uracilo. En lugar de desoxirribosa contiene ribosa. Se forma de una sola cadena de nucleótidos.

La síntesis de una molécula de ARN complementaria a la cadena de ADN, se denomina transcripción.

3. Traducción.

Ahora veremos de qué manera la información que ha sido transcrita en una molécula de ARNm se traduce en una secuencia de aminoácidos.

La traducción inicia cuando el ARNm sale al citoplasma y establece contacto con los ribosomas. El ARNm contiene codones para codificar los diferentes aminoácidos. En el citoplasma se encuentra otro tipo de ARN, conocido como ácido ribonucleico de transferencia (ARNt).

La función del ARNt es la de recoger del citoplasma los aminoácidos libres y llevarlos al ribosoma donde se encuentra el ARNm. Hay diferentes moléculas de ARNt porque cada una de ellas se combina con un solo tipo de aminoácidos; hay un ARNt para cada codón de ARNm.

El ARNt conduce un aminoácido específico en un extremo, y en el otro tiene un grupo de tres bases, llamado anticodón, que habrán de ensamblarse con las bases que forman el codón en el ARNm. El ARNm con sus codones se coloca en el ribosoma, y cada codón va ensamblando con el anticodón del ARNt.

Imagen 4.6. 6 Ensamble de aminoácidos para formar proteínas.

La secuencia nucleótida que determinó el ADN y que envió a través de la molécula de ARNm se completó con los anticodones del ARNt para finalmente dar lugar a la proteína anterior.

A medida que ensambla el anticodón del ARNt con el del ARNm, este último se separa del aminoácido y se aleja. Los aminoácidos, a su vez, se van uniendo por enlaces peptídicos para formar las largas cadenas que constituyen la proteína. De esta manera se originan los miles de diferentes proteínas que un organismo necesita.

Imagen 4.6. 7 El ARNm sale del núcleo y se une a los ribosomas. El ARNt lleva aminoácidos y aparea sus anticodones con los codones de ARNm. Los aminoácidos se unen químicamente en cadenas polipeptídicas que crecen hasta formar

una proteína.

Generalidades sobre Ingeniería Genética.

Existen complicadas definiciones legales de lo que es ingeniería genética. Tal vez una definición sencilla y clara sea la que se entiende por ingeniería genética como la introducción de una planificación humana en la formación de nuevos genes y nuevas combinaciones de genes.

Supongamos que queremos clonar un gen de una célula donadora que llamaremos célula A en una célula receptora que denominaremos célula B. Para ello debemos extraer el ADN total de la célula A y transformar con él la célula B seleccionando posteriormente aquellas células ϶ que hayan tomado el gen que deseamos clonar. Esto sobre el papel es muy sencillo, pero en la práctica tropezaríamos con muchas dificultades. La principal de ellas radica en el hecho que la simple introducción del ADN exógeno tal cual de la célula receptora se produce con una deficiencia muy baja, prácticamente no entra, y si lo hace es degradado en su mayor parte. Para proteger el ADN exógeno de la degradación se hace preciso introducirlo en el interior de otra molécula de ADN denominada vector. Este ADN recombinante gen-vector ya puede penetrar con facilidad, conservándose de forma estable en el citoplasma de la célula receptora.

Vamos a profundizar un poco más en los vectores de clonación. Son plásmidos o virus en los que se inserta el gen que se desea clonar. Deben cumplir las siguientes propiedades:

a) Ser capaces de penetrar la membrana citoplasmática de la célula receptora.

b) Ser estables en el citoplasma de la célula receptora por poseer un origen de replicación que les permita independizar su proliferación de la división nuclear.

c) Estar relacionado con el ADN de la célula receptora para no ser degradado.

d) Contener algún gen que le confiera características fenotípicas que permitan seleccionar fácilmente las células receptoras que lo posean.

Un caso típico de vector es el plásmido pBR322 (Imagen 4.6.8). Construido en el laboratorio de forma artificial, posee genes que confieren resistencia a ampicilina y tetraciclina. Al transformar con él células receptoras podremos distinguir claramente las que lo tomen de las que no lo hacen cultivándolas en medio adicionado de ambos antibióticos. Sólo las portadoras de pBR322 crecerán merced a su capacidad de inactivar los antibióticos.

Imagen 4.6. 8 Mapa físico del plásmido pBR322, un clásico vector de clonación.

Para poder insertar el gen a clonar en el vector se precisa de una serie de enzimas implicadas en el metabolismo del ADN. De todos ellos los más importantes son sin lugar a dudas las endonucleasas de restricción. Estas enzimas reconocen secuencias palindrómicas de cuatro a seis pares de bases en el ADN cortándolas generalmente en un extremo. Si disponemos de dos ADN de diferente origen digeridos con la misma enzima podremos unirlas gracias a la

complementariedad de bases adenima-timina y guanina-citosina que sus extremos presentan (Imagen 4.6.9). Esta unión se verá favorecida por la presencia de otra enzima importante: la ADN ligasa, la cual cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 3’hidroxilo y 5’fosfato adyacentes en el ADN.

Imagen 4.6. 9 Utilización de las enzimas de restricción en la formación de ADNs recombinantes. La digestión de dos ADNs de diferentes orígenes con la enzima EcoRI genera en ambas moléculas extremos cohesivos de secuencia

complementaria que pueden unirse por la actuación de laADN ligasa.

Con todo ello se logran ADNs recombinantes gen-vector con los que se transforman células receptoras. Estas pueden ser de cualquier tipo: bacterias, levaduras, hongos, células vegetales o células animales. Hay que destacar que el emplear un tipo u otro depende del experimento. Si bien la inmensa mayoría de los mismos se diseña para el trabajo con bacterias por la facilidad de su manipulación.

Estrategias para la clonación de genes.

Cada experimento de ingeniería genética precisa de una estrategia de clonación propia, por lo que es muy difícil establecer generalidades. Ahora bien, se puede hablar de sistemas clásicos para la clonación de genes. En concreto hay tres de ellos de los cuales dos toman como material de partida para obtención del gen ADN mientras que el otro toma ARN.

La primera estrategia (Imagen 4.6.10) consiste en digerir tanto el ADN de la célula donadora como el vector con una enzima de restricción que produzca un único punto de corte en este último. Ambas preparaciones se ponen en contacto

en presencia del ADN ligasa, con lo que tal y como antes veíamos se forman los ADNs recombinantes. Con el conjunto de los mismos se transforma una célula receptora obteniéndose un número de clones de los cuales identificaremos aquel que porte el gen que se desea clonar.

Imagen 4.6. 10 Método directo para clonación de genes. Se aísla en ADN total de una célula y se digiere con una enzima de restricción. Por otra parte un plásmido vector se digiere con el mismo enzima. Ambas poblaciones

moleculares se ponen en contacto en presencia de ADN ligasa lográndose una colección de ADNs recombinantes de los que se habrá que aislar el que porte el gen deseado.

La segunda estrategia parte de un ADN donador cuyos extremos son romos. Esto puede deberse a la actuación de determinadas enzimas de restricción o al hecho de que el ADN se haya fragmentado por procedimientos mecánicos. Se puede resolver el problema por diversas vías. La primera de ellas consiste en intentar ligar gen y vector mediante ADN ligasa, a pesar de que los extremos no sean complementarios. Para ello se precisan altas concentraciones de gen, vector y ADN ligasa pudiendo deducirse que se trata de un procedimiento caro. Otra solución se basa en la adición de una cola del polinucleótidos al vector y otra cola del polinucleótido complementario al gen a clonar (Imagen 4.6.11).

Imagen 4.6. 11 Método de la terminal transferasa para la clonación de genes incluidos en insertos de ADN de extremos romos. Gen y vector se tratan con la terminal transferasa pero a uno se le da como fuente de nucleótidos

adenina y al otro timina. Se logran así colas complementarias que en presencia de ADN ligasa se unen.

Ello se logra por la actuación de la enzima terminal transferasa. De esta forma ambos ADNs presentan extremos complementarios y en presencia de ADN ligasa formarán ADNs recombinantes. Una última alternativa para el problema de los extremos romos toma como base el empleo de prendedores. Estos son secuencias de nucleótidos sintetizadas químicamente y que son diana para un enzima de restricción. Se unen a gen y vector, se digieren con la enzima para el cual son diana y de esta forma se disponen de ADNs complementarios en sus extremos (Imagen 4 .6.12).

Imagen 4.6. 12 Empleo de prendedores para la clonación de genes en extremos romos de ADN. Altas concentraciones del gen y del prendedor se ponen en presencia de ADN ligasa. Se seleccionan los fragmentos que hayan tomado

prendedores en ambos extremos y se digieren con la enzima Eco RI con lo que ya se dispone de un fragmento de ADN de extremos complementarios.

La tercera y última estrategia toma como material de partida el ARN mensajero del gen a clonar. Es útil sobre todo a la hora de trabajar con genes de organismos eucariotas, pues permite obviar el problema de los intrones. Para llevar a cabo esta técnica es preciso acudir a buscar el ARN mensajero a su fuente biológica natural apropiada, es decir, sí por ejemplo deseamos clonar el gen de la insulina buscaremos su ARNm con el páncreas. El aislamiento del ARNm se lleva a cabo por cromatografía de oligo deoxitimidina celulosa con lo cual los ARNs mensajeros quedan retenidos al poseer una cola de poliadenina. A continuación se añade a la suspensión de ARNs el enzima transcriptasa inversa el cual es capaz de sintetizar ADN tomando como molde ARN (Imagen 4.6.13). Se formará así un híbrido ARN-ADN. Mediante hidrólisis alcalina se elimina del mismo la hebra de ARN y con la ayuda de una ADN polimerasa se sintetiza un ADN complementario de la hebra de ADN preexistente. El único problema es la

existencia de un codo de ADN de cadena sencilla que se digiere por la actuación del enzima nucleasa SI. Con ello se logran ADNs de extremos romos correspondientes al gen del cual habíamos aislado sus mensajeros. La inserción de un vector se puede llevar a cabo por procedimientos similares a los citados anteriormente.

Imagen 4.6. 13 Método de la transcriptasa inversa. Se aíslan ARNs mensajeros y se someten a la acción de la transcriptasa inversa. Del híbrido ADN-ARN formado se separa el ARN por hidrólisis alcalina. Se sintetiza una hebra

complementaria a la ADN por la acción de una polimerasa y finalmente se elimina el codo por la nucleasa SI.

Selección de los clones transformados.

La selección del clon que porte el gen que se desea clonar varía según el tipo de experiencia. Si el gen clonado es una resistencia a alguna droga bastará con plaquear en medio adicionado de la misma.

Si se trata de algún enzima implicado en una vía metabólica se buscan cepas receptoras mutantes de dicho gen con el objeto de poder complementar la mutación. Por ejemplo si deseamos clonar el gen para la orotidina-5’-fosfato descarboxilasa, un enzima implicado en la vía de síntesis de las uridina, buscaremos una cepa receptora mutante de este gen. Esta cepa no podrá crecer en un medio mínimo sin uridina. Sólo aquellos clones que hayan tomado y expresado el gen de la orotidina-5’-fosfato descarboxilasa podrán crecer y dar colonias.

Finalmente si el gen clonado corresponde a una proteína habrá que acudir a realizar una búsqueda del clon productor de la misma mediante la utilización de anticuerpos marcados radioactivamente contra dicha proteína.

Por ejemplo, la aplicación de las técnicas de clonación molecular en medicina ofrece interesantes posibilidades tanto desde el punto de vista del diagnóstico de enfermedades como desde el de la producción de metabolitos secundarios con interés farmacológico.

http://www.uv.es/enolab/La%20ingenier%ED%20gen%E9tica.pdf

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tema_7_Gen%C3%A9tica.pdf

http://blog.educastur.es/entrelineas/files/2010/05/ingenieria-genetica-lucia-obeso-almeida.pdf