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INVESTIGACIÓN GRASEQA: SEGURIDAD ALIMENTARIA

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Veinte años de análisis de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas

ANTONIA GARRIDO FRENICH*, ROBERTO ROMERO-‐GONZÁLEZ, PATRICIA PLAZA-‐BOLAÑOS Y JOSÉ LUIS MARTÍNEZ-‐VIDAL

UNIVERSIDAD DE ALMERÍA, Departamento de Química y Física, Escuela Politécnica Superior y Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Almería, 04120 Almería. E-‐mail: [email protected]

El análisis de residuos de plaguicidas (RPs) en los últimos años ha experimentado un gran avance, incrementando la capacidad de los laboratorios de análisis tanto en el número de muestras analizadas por unidad de tiempo como en el de analitos determinados simultáneamente. A este avance ha contribuido por un lado la simplificación de las etapas de tratamiento de la muestra, con la implementación de métodos de extracción genéricos (por ejemplo QuEChERS), así como el acoplamiento de las técnicas cromatográficas, de gases y/o de líquidos, con distintos analizadores de espectrometría de masas (MS), lo cual también ha contribuido a la mejora en la seguridad de los procesos de identificación y confirmación. Dicho acoplamiento ha permitido además llevar a cabo análisis retrospectivos así como identificar compuestos desconocidos o no incluidos inicialmente en la lista objeto de análisis, ampliando de manera significativa las capacidades en los laboratorios de rutina. En el presente artículo se pretende describir la situación actual del análisis de RPs en vegetales, incidiendo en los principales avances llevados a cabo en los últimos 20 años y que han supuesto un significativo impulso en este ámbito.

1. Introducción

Como es bien sabido, una amplia variedad de productos fitosanitarios se aplican en la producción hortofrutícola con el objetivo de incrementar la cantidad y calidad de los productos. Sin embargo, los plaguicidas pueden permanecer como residuos en las frutas y hortalizas, incluso después de ser lavadas, almacenadas y procesadas [1]. Por ello, a fin de garantizar la seguridad alimentaria, organizaciones internacionales y diversos países han establecido límites máximos de residuos (LMRs) para una gran variedad de combinaciones plaguicida/matriz [2,3]. Teniendo en cuenta el alto número de plaguicidas aplicados en agricultura a nivel mundial, así como la diversidad de matrices, no en todos los países están establecidos los LMRs para todos los posibles binomios plaguicida/matriz. Para estos casos se ha establecido un LMR por defecto, aunque dicho valor varía de un país a otro, siendo de 0.01 mg/kg en la Unión Europea y Japón, y de 0.1 mg/kg en Nueva Zelanda [4].

Hoy en día en la mayoría de países desarrollados hay establecidos programas de control de residuos de plaguicidas (RPs), tanto en productos nacionales como importados, los cuales son de interés mutuo para productores, comerciantes y consumidores. Los métodos de análisis utilizados para dicho control deben de presentar una serie de características, tales como (i) permitir la determinación simultánea de un gran número de plaguicidas, es decir métodos multi-‐residuo (MMR); (ii) presentar alta sensibilidad y selectividad; (iii) ofrecer confirmación de la identidad; (iv) permitir la cuantificación de cualquier residuo detectado, y (v) proporcionar información analítica en el menor tiempo posible. Para alcanzar este último objetivo es fundamental la reducción del tiempo tanto en la etapa de preparación de la muestra como en la del análisis instrumental por técnicas de cromatografía de gases (GC) o de líquidos (LC). En este sentido, dichos métodos deben de cumplir una serie de requisitos en cuanto a su funcionamiento y validación [5,6] y disponer de actividades de control de calidad interno y externo y, los laboratorios que los aplican, estar acreditados según la Norma UNE-‐EN ISO 17025 [7]. Todo


BOLETÍN GRASEQA Nº 7 – ENERO 2014

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ello pretende asegurar la calidad y fiabilidad del resultado analítico, y lleva asociado un considerable coste económico para los laboratorios de ensayo.

Sin duda en las últimas dos décadas se ha producido un gran avance en el campo del análisis de RPs en frutas y hortalizas. Dichos avances han ido de la mano del desarrollo y mejora de la instrumentación analítica (fases estacionarias, cromatógrafos, detectores, etc.). En consecuencia, en este trabajo se presenta la evolución en cuanto a: (a) métodos de extracción, observando un cambio desde de técnicas clásicas como la extracción sólido-‐líquido, que presentan un gran consumo de disolventes orgánicos y largos tiempos de procesado, a métodos genéricos como el QuEChERS (acrónimo de sus cualidades en inglés, rápido, fácil, barato, efectivo, robusto y seguro) que minimizan ambas características anteriores, y (b) determinación por LC y GC, evolucionando desde detectores clásicos, UV-‐vis, fluorescencia, captura de electrones (ECD) o nitrógeno-‐fósforo (NPD), a detectores de espectrometría de masas (MS). Finalmente todo ello se enmarca en el escenario de los costes económicos asociados a la aplicación de dichos métodos al análisis de muestras en laboratorios de ensayo acreditados.

2. Evolución de los métodos de extracción Durante estos últimos veinte años los métodos de extracción para análisis de RPs en frutas y hortalizas han experimentado una evolución consistente con los cambios habidos en el problema analítico. En la Figura 1 puede observarse una representación del incremento de la complejidad de los servicios analíticos demandados a los laboratorios de análisis de RPs, desde los métodos mono-‐residuo, a los MMR (monofamilia y multifamilia) y métodos multiclase, en los que además de plaguicidas, se analizan de manera simultánea otras familias de compuestos como medicamentos veterinarios, micotoxinas, etc.

El aumento de la complejidad ha seguido una doble pauta. Por una parte ha crecido el número de analitos y de familias de compuestos con diferentes características físico-‐químicas objeto de análisis; por otra parte, se ha ampliado el número de matrices bajo control, de acuerdo con lo establecido por la Guía SANCO [6], oscilando ampliamente en cuanto a su contenido en agua, ácido y grasa. La interacción entre esos dos factores da lugar a un escenario complicado si se tiene en cuenta que un MMR de amplio espectro debe de contar con cerca de 200 compuestos en GC-‐MS y de 300 en LC-‐MS.

Los métodos de extracción y de limpieza han tenido que hacer frente al reto descrito, acentuando el carácter genérico de los mismos, a fin de cubrir una amplia gama de compuestos y matrices y experimentando una evolución hacia la automatización y la miniaturización con el objetivo de disminuir el consumo de disolventes orgánicos, la reducción de costes y el tiempo de manipulación de la muestra.

Así, los métodos tradicionales de Luke y Luke modificado o mini-‐Luke [8,9], desarrollados para extraer plaguicidas organoclorados y organofosforados de muestras alimentarias, emplean acetona y posteriormente un reparto con disolventes no-‐polares, diclorometano y éter de petróleo para el método Luke, y acetato de etilo y ciclohexano para el método Luke modificado. Por tanto, estos métodos consumen un alto volumen de disolvente orgánico y de tiempo por muestra procesada. En los años 90, la Administración Nacional de Alimentación de Suecia propuso un procedimiento basado en el empleo de acetato de etilo como agente extractante (sin posteriores etapas de partición), permitiendo la extracción simultánea de un mayor número de plaguicidas [10], y que hasta hace unos 10 años ha sido ampliamente utilizado en los laboratorios de ensayo. Además el empleo de homogeneizadores de alta velocidad como Polytron [11] han permitido reducir el tiempo de extracción y la cantidad de disolvente empleado.

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compuestos polares y/o no volátiles, y/o termolábiles.

De manera general, para que el análisis de un determinado compuesto sea compatible con GC, no sólo debe mostrar elevada volatilidad a temperaturas por debajo de 350-‐400ºC, sino que también debe ser resistente a la degradación ó a la reacción con otros compuestos a dichas temperaturas [21]. El análisis por GC consta de varias etapas incluyendo la introducción de la muestra (inyección), separación y detección. El desarrollo y la optimización de un método de separación por GC incluye el estudio de numerosas variables como son tipo de inyección, fase estacionaria (longitud, diámetro, fase estacionaria), rampa de temperatura ó gas portador (tipo, flujo) empleados. La inyección de la muestra es sin lugar a dudas un aspecto clave en el análisis por GC, pudiendo distinguir 4 tipos como los más comunes: inyección con división (split), sin división (splitless), en columna (on-‐column) y vaporización a temperatura programada (programmed-‐temperature vaporization, PTV) [22].

Este último modo es de los más utilizados hoy en día para la determinación de RPs debido a sus múltiples ventajas, como reducir la termodegradación de los compuestos, puesto que cada analito migra a la columna a su temperatura óptima. Además el empleo de rellenos inertes (carbofrit) mejora la precisión y la forma de los picos cromatográficos [23], y prolonga los plazos de mantenimiento del instrumento. En relación a la fase estacionaria, las columnas más utilizadas para la separación de RPs son las que contienen una fase estacionaria compuesta por un 5 % de difenilsiloxano y un 95 % de dimetilsiloxano, presentando una longitud promedio de 30 m. Por ejemplo, esta columna se ha empleado para la separación de más de

150 plaguicidas en menos de 30 minutos (Figura 3a).

La aplicación de GC al análisis de RPs se debió principalmente a las características de los compuestos analizados, tales como volatilidad y baja polaridad, proporcionando una buena eficiencia en la separación, sensibilidad y capacidad de identificación de los analitos. Sin embargo, en los últimos años se ha experimentado una creciente tendencia al desarrollo de nuevos plaguicidas con estructuras más complejas y de mayor polaridad, que proporcionan una mejor respuesta mediante LC [24]. De esta forma, aunque LC y GC son técnicas complementarias, existe una clara tendencia hacia el uso de LC [25].

Aunque LC, en su versión denominada cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) ha sido ampliamente utilizada en los laboratorios mundiales durante más de 40 años, en la última década hay una demanda creciente para la disminución del tiempo de análisis, así como de incrementar el número de compuestos analizados, disminuyendo por tanto los costes del análisis. Aunque para alcanzar este objetivo se han desarrollado diversas estrategias como incrementar el flujo de fase móvil o la temperatura de la columna, la que ha tenido un mayor éxito ha sido la utilización de fases estacionarias con un tamaño de partícula inferior a 2 µm, dando lugar lo que se denomina cromatografía de líquidos de ultra alta eficacia (UHPLC), que permite una considerable reducción del tiempo de análisis sin comprometer la eficacia o la resolución de la separación cromatográfica [26], como puede observarse en la Figura 3b, donde se consigue la elución de más de 50 plaguicidas en menos de 10 minutos.

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Otra forma de incrementar la eficiencia y la velocidad de separación es mediante el uso de partículas superficialmente porosas como son las columnas disponibles en el mercado bajo las marcas comerciales Halo, Ascentis, Kinetex o Poroshell [29], y que generalmente se basan en un núcleo de sílice sobre la que se deposita una capa porosa homogénea. Esta tecnología ha permitido alcanzar rendimientos similares a UHPLC pero trabajando a presiones típicas de HPLC.

En relación con las fases móviles empleadas en la cromatografía en fase reversa, indicar que tienen carácter polar, siendo muy frecuente el uso de combinaciones de agua como fase acuosa (con la adición de una

disolución reguladora o ácido/base débil), y de metanol o acetonitrilo como fase orgánica.

En lo que respecta a la detección, GC y LC han sido acopladas a sistemas de detección convencionales. Así GC se acoplaba a detectores ECD [30], que permitían el análisis de plaguicidas conteniendo elementos electronegativos como halógenos (p. ej. DDTs que contienen Cl), y NPD [31,32], que eran empleados para determinar compuestos conteniendo N y/o P, tales como los plaguicidas organofosforados, o detectores de ionización de llama (FID) [33]. Por otro lado, LC se acoplaba a detectores como fluorescencia [34], UV-‐visible [35] o diodos en fila [36].

Tabla 2. Características de los principales analizadores de espectrometría de masasa

Analizador Características Principales aplicaciones

QqQ Alta sensibilidad en modo de trabajo MRM, sencillez, bajo precio, amplio rango lineal

Determinación cuantitativa de compuestos diana, inferior a 150-‐200 compuestos

IT Alta sensibilidad, capacidad de realizar sucesivas fragmentaciones (MSn), bajo rango de masas de trabajo, número limitado de iones monitorizados de manera simultánea

Determinación cuantitativa de compuestos diana (< 150 compuestos), mayor capacidad de elucidación estructural que QqQ

Q-‐LIT Combina la selectividad de QqQ y la capacidad de realizar sucesivas fragmentaciones (MSn) de IT. Mayor rango de trabajo que IT

Identificación y cuantificación de compuestos diana. Apropiado para identificar compuestos que exhiben una pobre fragmentación

TOF Adquisición en modo barrido completo. Alta resolución y exactitud de masas. Peor sensibilidad que QqQ

Útil en métodos de cribado. Identificación de compuestos desconocidos basados en la exactitud de masas y perfil isotópico. Análisis retrospectivo

QqTOF Adquisición en modo barrido completo o MS/MS. Alta resolución en la medida de iones producto

Útil en métodos de cribado. Identificación de compuestos desconocidos basados en la exactitud de masas, perfil isotópico y fragmentación. Análisis retrospectivo

Orbitrap Adquisición en modo barrido completo. Mayor resolución que TOF

Útil en métodos de cribado. Identificación de desconocidos basados en la exactitud de masas y perfil isotópico. Análisis retrospectivo

a Abreviaturas: IT: Trampa de iones; MRM: Monitorización de reacciones múltiples; MS: Espectrometría de masas; QqQ: Triple cuadrupolo; QqTOF: Cuadrupolo acoplado a tiempo de vuelo; TOF: Tiempo de vuelo.

La principal debilidad de estos sistemas de detección clásicos es la carencia de una confirmación inequívoca de la identidad del compuesto, de manera que es necesario realizar un segundo análisis, bien empleando una columna analítica diferente, o bien realizando un análisis con sistemas de MS [37,38]. En consecuencia, los tiempos de análisis se extienden en exceso. Además, dada la falta de selectividad de estos detectores, se requieren largos métodos de extracción con el objetivo de obtener un extracto lo

suficientemente libre de interferencias para poder llevar a cabo la determinación.

Es por ello que el acoplamiento de las técnicas cromatográficas con MS ha supuesto una gran evolución en el análisis de RPs ya que MS ofrece mejores características en términos de selectividad y sensibilidad, requisitos indispensables en el análisis de residuos y contaminantes a niveles traza en muestras complejas. Además, en función a lo establecido en la Decisión 2002/657/CE [5] de la Comisión Europea, "los métodos de

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información estructural como para dilucidar estructuras complejas, o bien no permiten la identificación de compuestos no incluidos en la lista objeto de análisis. Este inconveniente se solventa usando analizadores híbridos como son el QqTOF o Q-‐Exactive, en los que el tercer cuadrupolo se sustituye por un analizador de alta resolución (TOF u Orbitrap respectivamente). Debido a que estos analizadores adquieren en modo barrido completo (full scan) los hace idóneos para los métodos de cribado y para la identificación de compuestos desconocidos como determinados productos de transformación [49]. Como ejemplo, en la Figura 4, se muestra el caso de la detección e identificación de clorpirifos en una muestra vegetal, en la que se puede observar que el espectro experimental y teórico de dicho compuesto coincide, incluyendo su perfil isotópico.

Estos analizadores están siendo cada vez más utilizados en los laboratorios de ensayo [13,50,51], complementando a los actuales sistemas de espectrometría de masas de baja resolución (LRMS). Esta complementariedad se puede definir desde el punto de vista de: (i) una ampliación de las capacidades de identificación (p.ej. mediante la realización de medidas de masa exacta), y (ii) del alcance de los métodos (p.ej. ampliación de los analitos hasta 500 compuestos en una sola inyección). Si bien es cierto que el número de

laboratorios que emplean analizadores de espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) es reducido, y limitado a laboratorios de amplia experiencia con personal altamente cualificado. Queda por ver si, al igual que ocurrió por ejemplo con los primeros sistemas de LC-‐MS, cuyo uso se extendió muy gradualmente por su elevado coste inicial, podemos asistir a una implementación de la HRMS en los laboratorios de RPs de manera generalizada.

En consecuencia, puede señalarse que, mientras los analizadores de LRMS como Q, IT o QqQ se emplean para el análisis de compuestos diana, los analizadores de HRMS, como Orbitrap, TOF o QqTOF, están enfocados tanto al análisis de compuestos diana (métodos de cribado) como de compuestos desconocidos o no buscados.

Por lo tanto y a la vista de los diferentes tipos de técnicas cromatográficas, sistemas de ionización, analizadores de masas y modalidades de registro de datos (Tabla 3), se puede concluir que la GC-‐MS y LC-‐MS presentan una gran variedad de combinaciones adaptables a las necesidades del laboratorio de análisis de trazas. Además, el empleo de GC-‐MS y LC-‐MS ha influido en los métodos de extracción, de manera que son menos exhaustivos, con una menor dedicación a la etapa de limpieza, gracias a la mayor selectividad proporcionada por la propia técnica de determinación.

Tabla 3. Resumen de las diferentes posibilidades en GC-‐MS y LC-‐MS

Separación Detección-‐Identificación-‐Cuantificación

Introducción e Ionización Analizador Modo de trabajo

GC LC

Ionización Electrónica (EI) Ionización Química (CI) Electronebulización (ESI) Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI) Fotoionización a Presión Atmosférica (APPI)

Cuadrupolo (Q) o Triple Cuadrupolo (QqQ) Trampa de iones (IT) Tiempo de vuelo (TOF) Orbitrap Analizadores híbridos (p. ej. QqTOF)

Barrido completo Monitorización de iones seleccionados (SIM) Espectrometría de masas en tándem (MS/MS)


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4. Perspectiva económica El desarrollo de métodos de análisis para RPs en frutas y hortalizas debe hacer consistente un balance entre el cumplimiento de los criterios normativos, legales y de funcionamiento, con otros requerimientos para la competencia y productividad del laboratorio (p.ej.. alto número de analitos por método y corto tiempo de análisis). Todo ello junto a factores tales como costes asociados al mantenimiento del sistema de calidad, inversión en equipos y su mantenimiento, desarrollo/mejora continua de métodos, control de calidad y costes de personal, influyen poderosamente en la rentabilidad de los laboratorios que realizan análisis de RPs. Estudiando los resultados interanuales de laboratorios acreditados, la “Daily Effective Capacity” [52], entendida como “máximo número de muestras que un laboratorio acreditado puede realizar al día”, podría establecerse en la actualidad en unas 30 muestras/día empleando GC-‐QqQ/MS (para unos 150 analitos en un MMR) y en unas 65 muestras/día empleando UHPLC-‐QqQ/MS (para unos 150 analitos en un MMR); todo ello considerando tiempos de análisis, actividades control de calidad interno y de mantenimiento de equipos.

En estos laboratorios los costes fijos resultan muy altos en comparación con los variables. Ello se debe fundamentalmente a tres factores: (a) necesidad de personal bien formado, (b) baja productividad relativa de los equipos considerando su alto coste y el bajo número de muestras que analizan al día, y (c) costes asociados al sistema de calidad.

5. Conclusiones En el presente artículo se ha descrito el avance experimentado en instrumentación y métodos de análisis para RPs en frutas y hortalizas en los últimos veinte años. Dichos avances han sido consistentes con el desarrollo de normas internacionales a fin de garantizar alimentos libres de RPs. Los métodos de extracción han evolucionado durante este periodo a fin de disminuir tanto el consumo de disolvente como el tiempo dedicado a la extracción, incrementado su

carácter genérico para matrices y familias de compuestos. Los equipos de análisis cromatográfico, tanto de GC como de LC, han incorporado mejoras en cuanto a sistemas de inyección o fases estacionarias. Los actuales sistemas de detección de MS permiten la identificación segura de cientos de compuestos por análisis cromatográfico y su detección a bajos niveles de concentración, cercana en los actuales MMR a 1 µg/kg en equipos de QqQ de última generación. Sin embargo, a pesar de la tendencia al uso de MMR, hay plaguicidas o familias de plaguicidas que por su dificultad se siguen analizando hoy en día mediante métodos mono-‐residuo o monofamilia. Como ejemplos podemos citar: herbicidas ácidos (glifosato); herbicidas de la familia de los quats (paraquat, diquat); herbicidas clorofenoxi ácidos (2,4-‐D, 2,4,5-‐T) y fungicidas de la familia de las ftalimidas (captan, folpet, captafol) o de los ditiocarbamatos (ziram, ferbam), entre otros.

Los criterios de validación de métodos para el control de RPs han sido normalizados a nivel internacional, incorporando la estimación de la incertidumbre de las medidas, a fin de lograr una validación completa de los mismos. Los controles de calidad internos y externos precisos para obtener resultados analíticos comparables figuran como piedras angulares en el proceso de acreditación de laboratorios de análisis. Desde la perspectiva de realizar investigación, a fin de ser transferida a laboratorios de ensayo, el coste real de un MMR debe ser tenido en cuenta a la hora de proponer nuevos métodos de análisis. La inversión en equipos, costes asociados a su mantenimiento y calibración, inversión en patrones, tiempo de análisis y número de analitos en el MRM, entre otros, son factores clave en el escenario de trabajo y a considerar en el desarrollo de las nuevas metodologías.

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Los autores del trabajo son miembros del Grupo de Investigación “Química Analítica de Contaminantes” de la Universidad de Almería. Una de las líneas de trabajo con más tradición en dicho Grupo ha sido la aplicación de técnicas de cromatografía-‐espectrometría de masas al desarrollo, validación y aplicación de métodos de análisis en el campo de la Seguridad Alimentaria. En este ámbito los métodos multi-‐residuo para plaguicidas han ocupado un lugar relevante, aportando mejoras en aspectos tales como número de analitos por análisis cromatográfico, tiempo de análisis o coste del mismo. Así, el Grupo ha pretendido participar durante estos últimos 25 años del avance en instrumentación y metodologías, atendiendo a la transferencia de sus resultados mediante su implantación en laboratorios de ensayo para su acreditación bajo la Norma UNE-‐EN ISO 17025, así como a la formación de postgrado. El Grupo ha dirigido, desde un punto de vista científico técnico, cinco laboratorios de ensayo para análisis de residuos de plaguicidas en la provincia de Almería durante este tiempo, y finalmente ha creado una empresa de base tecnológica, LAB, que cuenta actualmente con una plantilla cercana a los 40 trabajadores, de los cuales un apreciable número son doctores, y que en el año 2013 ha analizado unas 30.000 muestras. Asimismo, el Grupo ha participado en diversos proyectos (internacionales, nacionales y regionales) en el campo de la Seguridad Alimentaria. Conscientes del importante reto que significa la internacionalización mantenemos colaboraciones con grupos de investigación ubicados en distintos países, tanto europeos, de América Latina, Estados Unidos, Marruecos o Túnez. Todo ello ha contribuido al hecho de que la Universidad de Almería se haya significado en publicaciones y avances a nivel internacional en este campo de trabajo.


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Control de micotoxinas en alimentos NATALIA ARROYO-‐MANZANARES, JOSÉ F. HUERTAS-‐PÉREZ, LAURA GÁMIZ-‐GRACIA

y ANA M. GARCÍA-‐CAMPAÑA* UNIVERSIDAD DE GRANADA, Departamento de Química Analítica, Grupo de Investigación

FQM-‐302-‐Calidad en Química Analítica Alimentaria, Ambiental y Clínica (www.ugr.es/~fqm302/), Campus de Fuentenueva s/n, 18071 Granada

E-‐mail: [email protected]

1. Introducción Las alarmas alimentarias en Europa han generado un gran interés y preocupación en los consumidores respecto a los productos y su suministro, siendo cada vez más necesario el establecimiento de medidas adecuadas de control que garanticen un consumo seguro del alimento. En la Unión Europea (EU) se han implantado estrategias prioritarias para asegurar la inocuidad de los alimentos, recogidas en el Libro Blanco sobre Seguridad Alimentaria [1].

El Libro Blanco establece que el análisis del riesgo debe ser la base política de la seguridad alimentaria, mediante sus tres componentes: evaluación del riesgo (asesoramiento científico y análisis de datos), gestión del riesgo (reglamentación y control) y comunicación del riesgo. Los alimentos pueden contener organismos o sustancias peligrosas, que formen parte del mismo o hayan sido introducidas durante las operaciones de procesamiento, que se denominan agentes químicos de riesgo. Su presencia puede deberse a, entre otras causas, residuos procedentes de la adición intencionada de sustancias (como los plaguicidas, los medicamentos veterinarios y otros productos utilizados en la producción primaria) o sustancias tóxicas presentes naturalmente en los alimentos (como las micotoxinas). Las micotoxinas son metabolitos secundarios altamente tóxicos producidos por ciertos hongos que se desarrollan en productos agrícolas y cuya ingestión, inhalación o absorción cutánea reducen la actividad, hacen enfermar o

incluso causan la muerte de animales y personas [2].

La Organización para la Agricultura y la Alimentación (FAO) estima que las micotoxinas afectan a una cuarta parte de los cultivos a nivel mundial, incluyendo alimentos básicos, piensos o cultivos de gran valor como el café. Según datos publicados por el Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (RASFF) [3], las micotoxinas son las sustancias tóxicas o contaminantes que mayor número de notificaciones presentan, seguidos por los de origen biológico y los plaguicidas. Esto ocasiona importantes pérdidas económicas debido a sus efectos sobre la salud de las personas, la productividad de los animales y el comercio nacional e internacional. En los países en desarrollo, donde los alimentos básicos (como el maíz y frutos secos) son susceptibles de contaminación, la población puede verse también afectada de forma significativa por la morbilidad y las muertes prematuras relacionadas con las micotoxinas si no se toman medidas.

En la actualidad hay más de 300 micotoxinas conocidas de muy diferentes estructuras químicas y diferentes modos de acción en los seres vivos, siendo las más importantes desde el punto de vista de la seguridad alimentaria las toxinas producidas por mohos de los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium, entre las que se encuentran las aflatoxinas, ocratoxina A, las fumonisinas y los tricotecenos. En la Tabla 1 se encuentra una clasificación de los distintos tipos de micotoxinas en función del hongo productor y del alimento en el que su aparición es frecuente.

http://www.ugr.es/~fqm302/



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Tabla 1. Principales tipos de micotoxinas, hongo productor y alimentos afectados

Tipo de hongo Micotoxinas producidas Alimentos afectados

Aspergillus parasiticus Aflatoxinas B1, B2, G1, G2

Maíz, sorgo, arroz, trigo, semillas oleaginosas, especias y frutos secos (almendras, pistacho, nuez, coco, nuez de Brasil, etc.)

Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 y B2 Idem

Metabolito de aflatoxina B1 en mamíferos

Aflatoxina M1 Leche y productos lácteos

Fusarium sporotrichioides Toxinas T-‐2 y HT-‐2 Cereales y derivados

Fusarium graminearum Deoxinivalenol (o nivalenol) Zearalenona

Cereales y derivados

Fusarium moniliforme (F. verticillioides)

Fumonisinas B1 y B2 Maíz y derivados, sorgo, espárrago

Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus

Ocratoxina A Cereales, vino, frutas, café

Penicillium expansum Patulina Manzana, zumos y derivados

Aspergillus, Penicilium y Monascus

Citrinina Cereales, arroz rojo, frutas y quesos

Aspergillus versicolor Esterigmatocistina Cereales, café, jamón, pimienta y queso

Hypocreales (Claviceps purpúrea), Eurotiales

Alcaloides ergóticos (o del cornezuelo de centeno)

Cereales

La presencia de estas micotoxinas en los alimentos puede ser individual o simultánea con otras, lo que puede provocar efectos sinérgicos en su acción sobre el organismo, aumentando así su toxicidad. Elevados niveles de micotoxinas en la dieta pueden causar efectos adversos agudos o crónicos sobre la salud del hombre y una gran variedad de especies animales, afectando a distintos órganos, aparatos o sistemas, especialmente al hígado, riñón, sistema nervioso, endocrino e inmunitario. Los síntomas causados por las micotoxinas suelen ser tan diferentes unos de otros como lo son las propias estructuras químicas de dichas toxinas [4] (Figura 1). En cuanto a la toxicidad crónica, la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (International Agency for Research on Cancer, IARC) [5] clasifica varias micotoxinas como carcinógenas o potencialmente carcinógenas para el hombre, siendo las aflatoxinas las que presentan un mayor riesgo como agentes carcinógenos. Dentro de las aflatoxinas se han

identificado unos 16 compuestos, pero sólo las aflatoxinas B1 (AFB1), B2 (AFB2), G1 (AFG1), G2 (AFG2) y M1 (AFM1) se analizan rutinariamente, siendo la más peligrosa de todas la AFB1 [6]. Los animales que consumen alimentos contaminados por aflatoxinas B son capaces de metabolizarlas, hidroxilándolas en una posición determinada. Así, a partir de la AFB1 se forma la AFM1, y a partir de la AFB2 se forma la aflatoxina M2 (AFM2) y estos metabolitos son secretados en la leche.

Instituciones nacionales y organizaciones internacionales, como la Comisión Europea, la Food and Drug Administration (FDA) de EE.UU., la Organización Mundial de la Salud (WHO) y la FAO han reconocido los potenciales riesgos para la salud de los animales y humanos que plantea la contaminación de alimentos por micotoxinas, abordando este problema mediante la adopción de límites reglamentarios para los compuestos más relevantes. Así, la EU tiene establecidos unos contenidos máximos

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2. Métodos de análisis La obligación de aplicar los límites reglamentarios ha impulsado el desarrollo de métodos analíticos para la identificación y cuantificación de micotoxinas en alimentos, piensos y matrices biológicas. Esto implica el empleo de métodos de análisis contrastados que cumplan con unos requerimientos de calidad establecidos y con los sistemas de control de seguridad alimentaria con el fin de preservar la salud de la población [11]. Existen diversos métodos de análisis recomendados para la determinación de micotoxinas en alimentos, como los Métodos Oficiales de Análisis de la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales (AOAC) [12] donde se pueden encontrar más de cincuenta métodos validados para la determinación de diversas micotoxinas en gran variedad de alimentos, o los métodos normalizados propuestos por la Organización Internacional para la Normalización (ISO) y el Comité Europeo de Normalización (CEN). Los análisis requieren un alto grado de exactitud y por esta razón se usan métodos recomendados o se lleva a cabo la validación de los nuevos métodos propuestos a través de procedimientos que garanticen la calidad de los resultados, incluido el uso de materiales de referencia certificados, o de comparaciones interlaboratorio.

Los métodos analíticos publicados en la última década para la determinación de micotoxinas en alimentos y sus principales aplicaciones, han sido recopilados en diversos artículos de revisión [13-‐20], siendo los más numerosos los que emplean cromatografía de líquidos (HPLC) con detección UV o fluorescencia (FL), ya que ciertas micotoxinas (OTA, aflatoxinas) presentan fluorescencia nativa y este tipo de detección ofrece ciertas ventajas, como mayor sensibilidad y selectividad. Existen numerosos métodos HPLC-‐FL para la determinación de OTA sin derivatización previa en distintas matrices, principalmente en vinos, café o cerveza. En el caso de las aflatoxinas, su fluorescencia se muestra atenuada en presencia de ciertos disolventes, siendo necesaria su derivatización bien precolumna con ácido trifluoroacético, o

postcolumna mediante una disolución de yodo o bromo, o mediante hidrólisis por fotodegradación usando una lámpara UV y un reactor [21-‐24]. Otras micotoxinas que no presentan fluorescencia nativa también se han determinado usando HPLC-‐FL con derivatización, como es el caso de las fumonisinas [25,26] o T-‐2 y HT-‐2 [27]. El acoplamiento de HPLC y la espectrometría de masas (MS) mediante técnicas de ionización a presión atmosférica (Atmospheric Pressure Ionization, API), como la ionización por electrospray (Electrospray Ionization, ESI) o la ionización química a presión atmosférica (Atmospheric-‐Pressure Chemical Ionization, APCI), ha permitido el desarrollo de nuevas metodologías para la determinación de micotoxinas [28].

Algunos artículos de revisión recogen los métodos de determinación de micotoxinas mediante HPLC-‐MS [15,29]. Además, mediante el empleo de MS en tándem (MS/MS), usando detectores como la trampa de iones (Ion Trap, IT) y el triple cuadrupolo (QqQ), es posible la identificación y cuantificación de los analitos en mezclas complejas, siendo imprescindibles para la confirmación de resultados positivos obtenidos con otras detecciones. HPLC-‐MS/MS ha permitido también el establecimiento de métodos multirresiduo, que abarquen micotoxinas de diferentes familias. En este contexto, recientemente se han propuesto métodos HPLC-‐MS/MS para, por ejemplo, la determinación simultánea de OTA, ácido micofenólico y fumonisina B2 (FB2) en productos cárnicos [30], 27 micotoxinas y otros metabolitos secundarios en maíz [31], 49 micotoxinas diferentes en diversos alimentos [32] o 21 micotoxinas en alimentos infantiles [33]. En los últimos años el empleo de fases estacionarias con un tamaño de partícula inferior a los 2 m ha originado el desarrollo de la cromatografía de líquidos de ultra resolución (UHPLC), mejorando la eficacia del proceso cromatográfico al trabajar a altos flujos de la fase móvil sin pérdida de la calidad de la separación cromatográfica, reduciendo notablemente el tiempo de análisis para la determinación simultánea de un elevado número de compuestos. Son cada


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vez más numerosas las aplicaciones de esta técnica acoplada a detección MS/MS; como ejemplo, la determinación simultánea de micotoxinas de varias familias en cerveza [34,35]. En nuestro grupo de investigación hemos aplicado esta técnica al control de micotoxinas en productos botánicos [36], frutos secos [37], cereales y pseudocereales [38] y melazas de cereal [39].

Además, en los últimos años las técnicas de separación miniaturizadas han cobrado gran interés debido a las numerosas ventajas que presentan, tales como la reducción del consumo de disolventes, bajo volumen de muestras requerido, incremento en la resolución e incluso una mejorada sensibilidad. Dentro de los sistemas miniaturizados se incluyen los que utilizan columnas de reducido diámetro interno (HPLC capilar) o capilares de sílice fundida (electroforesis capilar, CE). A pesar de las ventajas de la HPLC capilar respecto a la HPLC convencional la única aplicación de este tipo de cromatografía en el análisis de micotoxinas es la desarrollada en nuestro grupo usando la detección por fluorescencia inducida por láser (LIF) para la determinación de OTA en vinos [40,41]. En cuanto al empleo de la CE, los bajos límites de detección requeridos para la determinación de estos contaminantes en alimentos hacen que la LIF sea igualmente una técnica ideal para su detección, empleándose por ejemplo, en la determinación de ZEN en maíz [42], en la determinación semicuantitativa (screening) de aflatoxinas [43] o para su cuantificación en arroz, sin necesidad de procesos de derivatización previos y con límites de detección comprendidos entre 0.04 y 0.52 µg Kg-‐1 [44].

3. Extracción de micotoxinas y purificación de extractos

Las micotoxinas en los alimentos presentan una distribución poco uniforme por lo que se requiere, además de un proceso de toma de muestra adecuado, una cuidadosa homogeneización de ésta, previa a la extracción de estos residuos que además se suelen encontrar en concentraciones muy

bajas. Por otra parte, la complejidad de los alimentos, donde se encuentran presentes cantidades importantes de proteínas, lípidos, hidratos de carbono, agua y otros componentes minoritarios, requiere generalmente una purificación de los extractos, para eliminar las sustancias interferentes antes de realizar la medida analítica.

El empleo de columnas de inmunoafinidad (Immuno Affinity Column, IAC) [45] constituye el método de extracción más común hoy en día en los laboratorios de rutina para la extracción y purificación de micotoxinas [46], siendo además el seleccionado por la mayoría de los métodos recomendados, incluido el de la Farmacopea, para la determinación de AFB1

[10]. Esta técnica consiste en el empleo de columnas empaquetadas con un relleno en el que se inmoviliza un anticuerpo específico frente al analito que se quiere determinar. La carga de la muestra en la columna da lugar a la captura selectiva del analito gracias a la especificidad del reconocimiento antígeno-‐anticuerpo, mientras que otros componentes de la muestra eluyen sin retenerse en la columna. Posteriormente pueden eliminarse restos de extracto indeseables mediante un disolvente de lavado adecuado, y por último la etapa de elución permitirá obtener el analito aislado para su determinación. Las micotoxinas tienen, por lo general, un peso molecular bajo, comportándose como haptenos. Los anticuerpos producidos (monoclonales) requieren una unión a distintos transportadores tales como la agarosa, sefarosa o dextrano (soporte), para fijarlo en la fase estacionaria. Actualmente se comercializan IACs para aflatoxinas del grupo B, G y M, OTA, DON, fumonisinas, T-‐2 y ZEN. También se han desarrollado IACs que permiten la extracción y la purificación simultánea de varias micotoxinas, como la OchraAflaprep para aflatoxinas y OTA. Sin embargo, las IACs presentan como principales inconvenientes su elevado coste, lentitud y, en ocasiones, bajas recuperaciones, además de su limitado uso en determinaciones multirresiduo.


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Dadas las limitaciones de las IACs, en los últimos años se han propuesto tratamientos de muestra alternativos para mejorar la eficacia de los procedimientos de extracción de micotoxinas y limpieza de los extractos, considerando las tendencias actuales en cuanto a simplificación y miniaturización de los sistemas de tratamiento de muestra, introduciendo disolventes menos contaminantes y disminuyendo en lo posible las cantidades de disolventes orgánicos utilizados, en línea con los principios de la llamada Química Verde, que implican una mayor seguridad y un menor coste en relación a los procesos convencionales. Además, se han propuesto procedimientos de extracción genérica multirresiduo que permitan su posible automatización y/o aumentar la rapidez de tratamiento. A continuación se describen algunos de los tratamientos de muestras propuestos en los últimos años para el análisis de micotoxinas.

3.1. Extracción en fase sólida dispersiva (dSPE)-‐QuEChERS

QuEChERS es una metodología rápida y barata de tratamiento de muestra muy aplicada durante los últimos años, introducida para la determinación de pesticidas, pero que está siendo empleada para la extracción y purificación de otros compuestos, como antibióticos y micotoxinas [47]. Esta metodología QuEChERS presenta varias ventajas, como su simplicidad y su eficiencia en la limpieza de muestras complejas para análisis multirresiduo [48]. Este tratamiento

consta de dos etapas: la primera etapa consiste en una extracción con disolvente orgánico y reparto de la fase acuosa y orgánica mediante salting-‐out, seguido de una limpieza usando extracción en fase sólida dispersiva (dSPE) con diferentes sorbentes (C18, amina primaria y secundaria, PSA, carbón grafitizado, etc.).

Recientemente se ha empleado en la determinación de micotoxinas de Fusarium [49] y en el desarrollo de métodos multirresiduo en cereales [38, 50-‐54] y en melazas de cereales [39]. Esta metodología también ha sido utilizada en métodos multirresiduo para la determinación conjunta de distintas familias de contaminantes, entre las que se incluyen micotoxinas [55-‐57]. En nuestro laboratorio se ha comparado este tratamiento con otros aplicados a la extracción de OTA en vino [41]. En la Figura 2 se muestra el esquema de tratamiento de muestra y la naturaleza de los disolventes y sales usados para la extracción. Para su determinación se empleó HPLC capilar con detección por LIF (láser He-‐Cd con excitación a 325 nm), añadiendo a la fase móvil un medio micelar aniónico para aumentar la intensidad de fluorescencia y mejorar la eficacia. El límite de cuantificación (LOQ) fue 286 ng L-‐1, la desviación estándar relativa (DER) fue inferior al 6.0 % y se obtuvieron recuperaciones por encima del 81% para vinos blanco, rosado y tinto.

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comportamientos químicos muy diferentes a las micotoxinas de origen, no siendo detectadas en los análisis de rutina. Este fenómeno ocurre fundamentalmente en las toxinas de Fusarium (tricotecenos, ZEN y fumonisinas), aunque se han descrito también para otras micotoxinas. Así, como mecanismo detoxificador, algunas plantas son capaces de convertir los relativamente apolares tricotecenos y ZEN en derivados más polares a través de conjugación con azúcares, aminoácidos o grupos sulfato, con objeto de compartimentarlos en vacuolas. No obstante, estas formas podrían ser hidrolizadas a sus precursoras en el tracto digestivo de los animales, pudiendo presentar efectos tóxicos comparables a los de las micotoxinas libres.

Igualmente los procesos tecnológicos tienen un papel importante en los mecanismos de enmascaramiento, fundamentalmente en productos derivados de cereales, ya que pueden inducir reacciones con macromoléculas tales como azúcares, proteínas o lípidos, o la liberación de las formas nativas por descomposición de los derivados enmascarados. Los datos toxicológicos relativos a micotoxinas enmascaradas son escasos, pero varios estudios ponen de relieve la amenaza potencial que supone la presencia de estos compuestos para la seguridad de los consumidores. En particular, la posible hidrólisis de la micotoxina enmascarada (generando la micotoxina inicial) durante la digestión de los mamíferos sería un factor de riesgo a tener en consideración. Así, productos con una aparentemente baja contaminación por micotoxinas, han inducido efectos tóxicos debido a la presencia de fumonisinas "ocultas", liberadas tras la hidrólisis. De este modo, las micotoxinas enmascaradas pueden contribuir cuantitativamente a la cantidad total de micotoxinas presentes en matrices como el maíz y sus productos derivados. Por lo tanto, es prioritario que se desarrollen métodos analíticos para la determinación multiclase de micotoxinas que incluyan a sus distintos productos de transformación, con objeto de evaluar el riesgo que suponen para la salud del consumidor [79,80].

Otro aspecto de gran interés es la evaluación de la presencia en los alimentos de las llamadas micotoxinas emergentes derivadas de hongos del género Fusarium, como fusaproliferina, moniliformina, beauvericina y eniatinas, cuya presencia es frecuente en alimentos procedentes del norte de Europa y paises del Mediterráneo. A diferencia de otras micotoxinas mucho más estudiadas, actualmente no existen contenidos máximos permitidos para estas micotoxinas debido fundamentalmente a la escasez de datos relacionados con su presencia en alimentos, nivel de contaminación y toxicidad. Aunque no hay descritos casos de micotoxicosis debidos a la ingesta de estas micotoxinas, algunos estudios (la mayoría in vitro) revelan la posible toxicidad de estos compuestos, que podría verse aumentada como consecuencia de la interacción de varias micotoxinas presentes en el mismo alimento. En este sentido la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha emitido diversos informes sobre su posible riesgo en alimentos y piensos [81]. Es por ello que, con el fin de evaluar mejor el riesgo que suponen para la salud pública estas micotoxinas emergentes, será necesario disponer de métodos analíticos sensibles y selectivos para distintas matrices de alimentos [82,83].

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33

molécula, aumentándose así el espectro antimicrobiano y mejorando la actividad contra gram-‐positivos, anaerobios y microbacterias. Cuarta generación. En los últimos años han aparecido nuevas quinolonas que incorporan pequeñas modificaciones estructurales respecto a las quinolonas de tercera

generación, sin embargo algunas publicaciones han propuesto que este grupo de quinolonas pertenecen a una cuarta generación. El principal rasgo diferenciador de esta generación es una mayor potencia antibacteriana y mayor biodisponibilidad oral que sus antecesores.

Tabla 1. Clasificación de las quinolonas por generaciones No fluoradas Fluoroquinolonas

Primera Generación Segunda Generación Tercera Generación Cuarta Generación Ácido nalidíxico Ácido oxolínico Ácido piromídico Ácido pipemídico

Cinoxacina Resoxacina

Norfloxacina Enoxacina Perfloxacina Ciprofloxacina Ofloxacina

Flerofloxacina

Difloxacina Amifloxacina Temafloxacina Lomefloxacina Esparfloxacina Levofloxacina Tosufloxacina Clinafloxacina Sarafloxacina

Trovafloxacina Gatifloxacina Moxifloxacina Balofloxacina Gemifloxacina Pazufloxacina

El uso de los antibióticos en veterinaria para el tratamiento de enfermedades en el ganado destinado al consumo humano, así como su utilización en forma de aditivos en granjas industriales, han dado como resultado que deba considerarse su presencia potencial de estos compuestos en alimentos de origen animal. Los residuos de antibióticos en alimentos pueden provocar reacciones alérgicas en individuos hipersensibles, pero

sobre todo, la administración de bajos niveles de antibióticos puede dar lugar a la aparición de bacterias resistentes, que pueden llegar a los humanos a través de dichos alimentos [4, 5] (Figura 2). Este hecho hace inútiles fármacos que hace algunos años podían ser muy efectivos en el tratamiento de ciertas infecciones. Además de estos efectos adversos inmediatos, podrían existir también efectos a largo plazo, aún desconocidos.

Figura 2. Transmisión de resistencia a quinolonas de animales a seres humanos

Por los motivos anteriormente mencionados, organismos encargados de la vigilancia de la salud pública, como la European Agency for the Evaluation of Medical Products (EMEA) de la Unión Europea o la Food and Drug Administration (FDA) de los Estados Unidos, han desarrollado normativas de control de estos compuestos en diferentes tejidos animales, destinados al consumo humano,

estableciendo unos Límites Máximos de Residuos (LMR). El LMR representa aquella concentración permitida de un principio activo en alimentos de origen animal (músculo, hígado, riñón, grasa, leche, huevo, etc.) que al ser ingerida por el ser humano, no constituye ningún riesgo para su salud. En la Tabla 2 se recogen los LMR para quinolonas de uso veterinario establecidos por la EMEA.

Consumo de carne y leche

contaminadas

Resistencia bacteriana a las quinolonas


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Tabla 2. Límites Máximos de Residuos (LMR) de quinolonas de uso veterinario establecidos por la EMEA Sustancia Especie animal LMR (µg kg-‐1) Tejido Danofloxacina Ganado ovino, bovino

y caprino Aves de corral Resto

200 100 400 30 200 100 400 100 50 200

Músculo Grasa Hígado, Riñón Leche Músculo Grasa Hígado, Riñón Músculo Grasa Hígado, Riñón

Sarafloxacina Pollos Salmónidos

10 100 30

Piel + Grasa Hígado Músculo + Piel

Ciprofloxacina + Enrofloxacina

Ganado ovino, bovino y caprino Ganado porcino y conejos Aves de corral Resto

100 300 200 100 200 300 100 200 300 100 200

Músculo, Grasa, Leche Hígado Riñón Músculo, Grasa Hígado Riñón Músculo, Grasa+piel Hígado Riñón Músculo, Grasa Hígado, Riñón

Difloxacina Aves de corral Ganado ovino, bovino y caprino Ganado porcino Resto

300 400 1900 600 400 100 1400 800 400 100 800 300 100 800 600

Músculos Grasa + Piel Hígado Riñón Músculo Grasa Hígado Riñón Músculo Grasa Hígado, Riñón Músculo Grasa Hígado Riñón

Marbofloxacina Ganado bovino y porcino Ganado bovino

150 50 75

Músculo, Hígado, Riñón Grasa Leche

Flumequina Ganado bovino, ovino, caprino y porcino Ganado bovino, ovino y caprino Aves corral Peces Resto

200 300 500 1500 50 400 250 800 100 600 200 250 500 1000

Músculo Grasa Hígado Riñón Leche Músculo Piel + Grasa Hígado Riñón Músculo + Piel Músculo Grasa Hígado Riñón

Ácido oxolínico Todas especies destinadas a producción de alimentos

100 50 150

Músculo Grasa Hígado, Riñón


35

En este contexto, se hace necesario llevar a cabo un control de los alimentos destinados al consumo humano para así garantizar la salud del consumidor. De ahí, el desarrollo en los últimos 20 años de una gran variedad de métodos analíticos capaces de cuantificar residuos de quinolonas en productos alimenticios de origen animal, con el objetivo final de permitir un control tóxico-‐sanitario de los alimentos destinados al consumo humano.

2. Análisis de quinolonas en alimentos de origen animal

2.1. Propiedades fisicoquímicas El desarrollo de metodologías analíticas para la determinación de quinolonas parte de las propiedades fisicoquímicas más relevantes de estos compuestos. Las quinolonas son química y térmicamente estables, siendo resistentes a la hidrólisis y a las altas temperaturas. Presentan como parte de su estructura grupos ionizables que determinan sus propiedades ácido-‐base, de modo que dependiendo del pH, estos compuestos pueden ser neutros, catiónicos, aniónicos o anfóteros. Otra propiedad que presentan es que absorben radiación UV, mostrando dos bandas de absorción: una entre 300 y 350 nm, que es común para todas las quinolonas, y una segunda banda entre 245 y 290 nm que es más específica para cada sustancia [6]. Las quinolonas también se caracterizan por presentar fluorescencia nativa, su espectro de excitación coincide con el espectro de absorción molecular, mientras que su espectro de emisión consta de una banda ancha centrada entre 350 y 400 nm en el caso de quinolonas ácidas, y entre 440 y 500 nm en el de las anfóteras. Es importante destacar que, a medida que aumenta el pH del medio, la intensidad de fluorescencia disminuye, de manera que la forma aniónica no presenta fluorescencia nativa [7]. 2.2. Métodos de extracción

Para llevar a cabo la determinación de residuos de quinolonas en alimentos de origen animal se requiere, en primer lugar, de

una técnica de extracción que permita purificar y aislar las quinolonas del resto de la matriz. Las quinolonas son sustancias solubles en disolventes orgánicos polares, no siéndolo en disolventes muy apolares como el hexano o el tolueno. Teniendo en cuenta sus propiedades ácido-‐base, su solubilidad en agua pura es limitada, pero pueden disolverse fácilmente en medio ácido y/o básico, dependiendo de las características de la quinolona. Así pues, los agentes extractantes más usados tradicionalmente han sido los disolventes orgánicos polares y las disoluciones acuosas o hidroorgánicas a pH adecuado. En muchos casos la extracción se ha llevado a cabo mediante simple agitación [8-‐10], aunque también se han empleado técnicas más complejas como ultrasonidos (US) [11-‐13], extracción con fluidos supercríticos (SFE) [14], extracción con disolventes presurizados (PLE) [15-‐17], extracción asistida con microondas (MAE) [18, 19] y dispersión de matriz en fase sólida [20]. Recientemente, con el objetivo de reducir los volúmenes de disolvente empleados e incrementar los factores de enriquecimiento, se han propuesto técnicas de microextracción tales como la microextracción líquido-‐líquido dispersiva (DLLME) y la microextracción en fase sólida dispersiva (DMSPE) [21]. 2.3. Métodos de limpieza (“clean-‐up”) Como consecuencia de la naturaleza compleja de las muestras objeto de estudio, normalmente se requiere de una etapa previa de limpieza antes de la determinación analítica. La mayoría de los tratamientos descritos en la bibliografía especializada consisten en extracciones líquido-‐líquido (LLE) y/o extracciones en fase sólida (SPE). Sin embargo, el procedimiento de limpieza puede variar ampliamente, sin tener necesariamente que depender de la matriz o del disolvente usado en la etapa de extracción; mientras que algunos autores describen extensos tratamientos de limpieza que involucran varias etapas de extracción líquido-‐líquido o combinaciones de extracciones líquido-‐líquido con extracciones en fase sólida, otros autores


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realizan etapas de limpieza más sencillas e incluso algunos llegan a prescindir de dicha etapa [14]. La extracción líquido-‐líquido es la técnica de limpieza más empleada cuando la extracción de las quinolonas se lleva a cabo con disolventes orgánicos puros. Puede tratarse de una limpieza simple con hexano, para eliminar grasas, pero gracias a las características ácido-‐base de las quinolonas, se pueden realizar extracciones líquido-‐líquido en las que el analito se trasfiere de una fase a otra por control del pH [22, 23]. También es habitual la combinación de estas particiones ácido-‐base con la etapa de lavado con hexano [24, 25]. Los procedimientos de limpieza basados en SPE se aplican fundamentalmente después de la extracción de las quinolonas con disolventes polares. El algunos casos, previa a la SPE, se lleva a cabo una etapa de LLE con hexano. Los cartuchos de SPE más usados para llevar a cabo la etapa de limpieza han sido los de sílice de fase reversa, principalmente los C18 [10, 26, 27]; los poliméricos, como ENV+ y HLB [11,13] y en menor grado los de sílice de intercambio catiónico [28], para quinolonas que pueden encontrarse como especies catiónicas. Recientemente se han empleado los polímeros de impresión molecular (MIPs), dando lugar a la técnica de extracción en fase sólida basada en los mismos (MISPE). Esta técnica es altamente selectiva, aunque no se ha sido muy empleada en el análisis de residuos de quinolonas en alimentos. Tan sólo Yan y Row [29] describen su aplicación en la determinación de enrofloxacina y ciprofloxacina en músculo de pollo. 2.4. Técnicas de determinación La mayoría de los métodos usados para la determinación de residuos de quinolonas en alimentos de origen animal emplean la cromatografía de líquidos (LC) para llevar a cabo la separación de los analitos, mientras que la detección se lleva a cabo habitualmente mediante el uso de la espectrofotometría de absorción molecular UV-‐visible, la espectrofluorimetría o la espectrometría de masas (MS). Otras técnicas

de uso menos frecuente han sido la electroforesis capilar (CE) y sobre todo la cromatografía de gases (GC). 2.4.1. Métodos de cromatografía de gases Las quinolonas son sustancias muy polares y no volátiles, como consecuencia, para su análisis mediante GC deben obtenerse previamente derivados volátiles. Existen muy pocos trabajos publicados donde se emplee la GC como método de análisis de quinolonas. En ellos se emplea la reducción con NaBH4, puesto que la esterificación daría lugar a compuestos excesivamente polares [30, 31].

2.4.2. Métodos de electroforesis capilar Una técnica que ha experimentado un gran auge en los últimos años es la CE debido a su gran capacidad y versatilidad para la resolución de mezclas complejas de compuestos. Esto se debe a que los capilares empleados tienen mayor número de platos teóricos que las columnas cromatográficas. Sin embargo, el número de publicaciones dedicadas a la determinación de quinolonas en alimentos es en la actualidad todavía bajo. Sus principales aplicaciones se han establecido empleando como sistema de detección la espectrofotometría de absorción molecular UV-‐visible [32, 33]. Como resultado de la baja sensibilidad inherente a la detección UV-‐Vis, se han adoptado diversas estrategias para mejorar los límites de detección. Entre ellas se encuentra el empleo de la detección fluorescente inducida por láser [34, 35]; el uso de técnicas de preconcentración on-‐line, como el denominado “sweeping” [36]; o el empleo de dispositivos de preconcentración in-‐line, como los concentradores de analito [16]. Con respecto a los acoplamientos CE–MS, indicar que comúnmente se han llevado a cabo utilizando mediante electrospray (ESI). Aunque en auge actualmente, la CE–MS ha sido escasamente usada para la determinación de quinolonas en alimentos de origen animal [37, 38].

2.4.3. Métodos de cromatografía de líquidos La LC ha sido la técnica más empleada para la determinación de residuos de quinolonas en


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alimentos de origen animal. La separación se ha llevado a cabo principalmente con columnas de fase reversa C18 y C8, aunque también se han empleado las fases fenilo y amida. Las fases móviles han consistido principalmente en mezclas binarias ACN-‐H2O, aunque también se han utilizado de forma habitual las mezclas ternarias de ACN-‐MeOH-‐H2O, ACN-‐THF-‐H2O y ACN-‐Dimetilformamida-‐H2O. En relación al pH, habitualmente se mantiene en el rango de 2 a 4 para reducir así la ionización de los grupos silanol y minimizar su interacción con los analitos, que estarán presentes como especies catiónicas. La disolución reguladora de fosfatos ha sido la más usada para ajustar el pH. En el caso de la detección con MS, los aditivos más empleados son el acetato de amonio y los ácidos fórmico, acético y trifluoroacético. Para la detección se ha descrito el uso de diferentes técnicas espectroscópicas, tales como la espectrofotometría de absorción UV-‐Vis [39-‐41], la espectrofluorimetría [11, 42] y la espectrometría de masas [10, 15, 17, 20, 25, 43, 44]. Si se realiza un estudio cronológico de los tipos de detección empleados a lo largo de los años, los primeros métodos dedicados a la determinación de quinolonas en muestras de alimentos usaban casi exclusivamente la detección UV; posteriormente se optó por usar la detección fluorimétrica, debido a su mayor sensibilidad y selectividad; y actualmente, debido a su alta especificidad, la detección mediante espectrometría de masas es la opción más elegida para análisis de confirmación.

3. Conclusiones Durante los últimos 20 años se han dedicado un gran número de trabajos científicos al análisis de residuos de quinolonas en productos animales destinados al consumo humano. Aunque muchos de estos métodos se han desarrollado para el análisis de quinolonas individuales o para dos o tres compuestos en el mejor de los casos, la tendencia actual es al desarrollo de métodos multi-‐residuo, que ofrecen grandes ventajas para propósitos de control. El tratamiento de muestra para el análisis de quinolonas varía ampliamente de unos métodos a otros, sin dependencia de la matriz o los analitos de interés. La tendencia en los últimos años ha sido reducir el tiempo de análisis y el volumen de disolvente empleado en la extracción dando lugar a métodos más amigables con el medio ambiente. Por último, debido a que las quinolonas son compuestos polares, y la mayoría de ellas fluorescentes, la cromatografía de líquidos con detección fluorescente ha sido una técnica analítica muy usada para análisis de rutina. Sin embargo, para fines reguladores y debido a su inherente capacidad de caracterización, actualmente se prefiere y recomienda la espectrometría de masas acoplada a la cromatografía de líquidos. Agradecimientos Los autores agradecen al Instituto de Salud Carlos III la concesión de un contrato postdoctoral “Sara Borrell” a la Dra. Inmaculada Jiménez Díaz.

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Inmaculada Jiménez Díaz es Doctora en Ciencias Químicas por la Universidad de Granada desde marzo de 2009. Su Tesis Doctoral estuvo centrada en el estudio de tensioactivos y sus productos de degradación en muestras ambientales mediante el uso de distintas técnicas separativas (LC-‐UV, LC-‐FD, GC-‐MS). Tras doctorarse, disfrutó de un contrato como técnica de investigación del Ciber de Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), dedicándose primordialmente al desarrollo de metodología analítica para la determinación de disruptores endocrinos en placentas humanas mediante LC-‐MS/MS y su aplicación a muestras de la Cohorte INMA (Infancia y Medio Ambiente). Posteriormente, fue investigadora postdoctoral del Proyecto Europeo CONTAMED (Contaminant mixtures and human reproductive health -‐ novel strategies for health impact and risk assessment of endocrine disrupters). Actualmente disfruta de un contrato postdoctoral “Sara Borrell” del Instituto de Salud Carlos III estando su trabajo, centrado en el análisis de diferentes familias de disruptores endocrinos en muestras biológicas humanas (orina, suero, placenta, grasa, etc).

Alberto Zafra Gómez es Profesor Titular del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Granada desde 2011, habiendo estado anteriormente contratado por las empresas Puleva Biotech S.A durante 5 años como investigador y NeuronBioPharma S.A. durante 3 como responsable del Área de Química de Productos Naturales y de gestión de la I+D+i, Calidad y Seguridad y Salud Laboral. Es un reconocido especialista en técnicas cromatográficas, experto en el manejo de numerosas técnicas de extracción y en validación de metodologías analíticas, tal y como demuestran las publicaciones realizadas en los últimos años. Ha dirigido 11 trabajos fin de máster y 5 tesis doctorales. Actualmente codirige 3 tesis doctorales que se encuentran en fase experimental. Ha publicado 68 trabajos en revistas científicas internacionales con alto índice de impacto y es co-‐inventor de 4 patentes (2 nacionales y 2 internacionales). Es coautor de más de 70 comunicaciones a congresos nacionales e internacionales y participa y/o ha participado en 16 proyectos y contratos de investigación financiados en convocatorias públicas y privadas, tanto nacionales como internacionales. Su Tesis Doctoral obtuvo el Premio Extraordinario de Doctorado en 2001.

Oscar Ballesteros García es Profesor Titular del Departamento de Química Analítica de la Universidad de Granada desde 2009. Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Granada en 2001. Su Tesis Doctoral estuvo centrada en el análisis de quinolonas en muestras de orina humana y animal mediante el uso de distintas técnicas separativas (LC-‐UV, LC-‐FD, LC-‐MS). Desde principios de 2003 hasta finales de 2004 estuvo contratado por DSM Deretil S.A. como investigador. Entre 2005 y 2007 desarrolló su trabajo como investigador postdoctoral dentro del programa “Juan de la Cierva” y desde 2007 hasta 2009 como Profesor Ayudante Doctor. Es un reconocido especialista en técnicas cromatográficas, experto en el manejo de numerosas técnicas de extracción, y en validación de metodologías analíticas, tal y como demuestran las publicaciones realizadas en los últimos años. Ha dirigido 6 trabajos fin de máster y 5 tesis doctorales. Actualmente codirige 2 tesis doctorales que se encuentran en fase experimental. Ha publicado 55 trabajos en revistas científicas internacionales con alto índice de impacto. Es coautor de más de 100 comunicaciones a congresos nacionales e internacionales y participa y/o ha participado en 15 proyectos y contratos de investigación financiados en convocatorias públicas y privadas, tanto nacionales como internacionales.

Alberto Navalón Montón es Catedrático de Química Analítica de la Universidad de Granada desde 2009. Licenciado (1979) y Doctor (1986) en Ciencias Químicas por la Universidad de Granada, ha desarrollado su labor docente e investigadora durante más de 33 años en el Área de Química Analítica. Es responsable del grupo de investigación FQM-‐338 “Química Analítica y Ciencias de la Vida”, reconocido por la Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía. Ha co-‐dirigido 10 Tesis Doctorales, 5 Memorias de Licenciatura y 5 Tesis de Master. Es co-‐autor de 130 artículos científicos publicados en revistas recogidas en el JCR y co-‐autor de 150 comunicaciones a congresos internacionales y nacionales. Igualmente, es co-‐inventor de una patente y co-‐autor de 7 capítulos de libro. Ha participado en 15 proyectos de investigación financiados con fondos europeos, nacionales y regionales así como en 2 proyectos de innovación docente y 5 contratos de investigación con empresas. Su actividad investigadora se centra actualmente en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para la caracterización, identificación y cuantificación de residuos de fármacos y disruptores endocrinos químicos en diferentes matrices, tanto biológicas como ambientales, mediante el empleo de técnicas separativas avanzadas y nuevos procedimientos de tratamiento de muestra.

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equipamiento un espectrómetro de masas Q-‐TOF. La actividad científica del Grupo se centra en el desarrollo de metodologías analíticas para el análisis de contaminantes emergentes en muestras biológicas y ambientales. Actualmente, una de las líneas prioritarias es el desarrollo de procedimientos de microextracción en fase líquida y por electromembranas en diferentes configuraciones y haciendo uso de diversos materiales como soporte de las membranas líquidas; cabe destacar en este campo, el desarrollo y aplicación de soportes natroestructurados, altamente difusivos y versátiles, con inclusión de nanopartículas metálicas, para la microextracción en fase líquida y electrocinética de principios activos farmacológicos, disruptores endocrinos, pesticidas, etc, tanto en muestras medioambientales como biológicas. El grupo mantiene una estrecha relación con el Grupo FQM-‐141 “Análisis Medioambiental y Bioanálisis” así como con otros grupos europeos de prestigio (Universidades de Lund (Suecia) y de Copenhague (Dinamarca)). Colabora con la empresa granadina NanoMyP en el desarrollo y aplicación de nuevos soportes para sistemas de extracción, con la finalidad de canalizar transferencia de resultados. .

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN ACTUALES

1.-‐ DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS DE MICROEXTRACCIÓN EN FASE LÍQUIDA Microextracción en fase líquida utilizando fibras huecas (HF-‐LPME) Microextracción con electromembras (EME) Desarrollo y caracterización de materiales nanoestructurados para microextracción en fase

líquida Extracción con polímeros de impronta molecular (MIPs)

2.-‐ SEGURIDAD ALIMENTARIA Análisis de antibióticos pertenecientes a las familias de las fluroroquinolonas,

tetraciclinas, sulfamidas y cefalosporinas en alimentos frescos y procesados, tanto de origen animal como vegetal.

Análisis de disruptores endocrinos, PAHs, en alimentos frescos y procesados, de origen animal y vegetal.

Análisis de metabolitos y compuestos desconocidos en alimentos y bebidas. 3.-‐ ANALISIS MEDIOAMBIENTAL

Análisis y seguimiento de principios activos farmacológicos en los procesos convencionales de depuración.

Análisis de contaminantes emergentes en aguas y sedimentos. Análisis de disruptores endocrinos, pesticidas, PAHs, y otros contaminantes en muestras

ambientales. Análisis de productos de transformación y compuestos desconocidos en muestras

ambientales Seguimiento de la presencia de contaminantes emergentes en exposiciones controladas

de bioindicadores acuáticos. Estudio de los procesos de alteración de materiales empleados en la construcción de

monumentos 4.-‐ ANÁLISIS BIOMÉDICO

Análisis de principios activos farmacológicos en fluidos biológicos humanos. Análisis de metabolitos y desconocidos en fluidos biológicos.

5.-‐ TRANSFERENCIA DEL CONOCIMIENTO Contratos de I+D con empresas Caracterización analítica de proteínas terapéuticas.

TESIS DOCTORALES GRASEQA

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“APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE BAJA, MEDIA Y ALTA RESOLUCIÓN PARA LA

DETERMINACIÓN DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES EN MUESTRAS ALIMENTARIAS”

MARÍA DEL MAR AGUILERA LUIZ (Universidad de Almería) DIRECTORES: JOSE LUIS MARTÍNEZ VIDAL, ANTONIA GARRIDO FRENICH y ROBERTO ROMERO GONZÁLEZ GRUPO: FQM-‐170 FECHA: 31/05/2013 En esta Tesis Doctoral se ha evaluado el potencial analítico y la aplicabilidad del acoplamiento instrumental de la técnica de UHPLC a analizadores de masas de baja resolución (low resolution mass spectrometry, LRMS) así como con analizadores de y media/alta resolución (medium/high resolution mass spectrometry, M/HRMS), para la determinación de residuos de medicamentos veterinarios (VDs), plaguicidas y toxinas naturales (micotoxinas) en alimentos de origen animal y vegetal, en productos derivados de éstos y en piensos. Asimismo, se han evaluado y optimizado diferentes procesos de tratamiento y extracción de muestra de forma que resulten lo más rápidos y sencillos de aplicar. El trabajo se organiza en cuatro bloques. El primer bloque, referido al empleo de UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para la determinación de residuos de VDs: Empleo de la metodología QuEChERS y UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para el análisis de 18 VDs en leche. Uso de SPE y UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para la extracción y análisis multi-‐residuo de 17 VDs en miel. Comparación de la eficacia de diferentes técnicas para la extracción simultánea de 25 VDs en huevo y

posterior análisis por UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS. Uso de la metodología QuEChERS y UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para el análisis de 20 VDs en alimentos para bebés. Desarrollo y comparación de dos métodos de cribado para el análisis rápido de 21 VDs en leche mediante

UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS empleando modos de adquisición diferentes.

El segundo bloque se basa en el uso de analizadores de M/HRMS para el análisis de VDs: Desarrollo de dos métodos de cribado basados en el uso de los analizadores QqTOF y Orbitrap acoplados a

UHPLC para la detección rápida de 29 VDs en leche Uso de Turboflow acoplado a UHPLC-‐Orbitrap para la extracción y análisis de 36 VDs en miel.

El tercer bloque engloba la determinación de micotoxinas mediante UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS: Análisis de 12 micotoxinas en cereales y productos derivados mediante SLE con disolvente

UHPLC-‐QqQMS/MS. Uso de SPE y UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para la extracción y análisis de 12 micotoxinas en cerveza. Uso de HF-‐LPME y UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS para la extracción y análisis de la T-‐2 y HT-‐2 en bebidas alcohólicas.

Finalmente, el cuarto bloque se enfoca en el análisis de un número elevado de residuos y contaminante en alimentos. Análisis multi-‐clase de 6 micotoxinas y 42 residuos de plaguicidas en leche mediante UHPLC-‐QqQMS/MS. Desarrollo de un método genérico para el análisis de residuos de plaguicidas y VDs en pienso para animales

mediante UHPLC-‐QqTOF. REFERENCIAS M.M. Aguilera-‐Luiz, J.L. Martínez Vidal, R. Romero-‐González, A. Garrido Frenich. Multi-‐residue

determination of veterinary drugs in milk by ultra-‐high-‐pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of chromatography A 1205 (2008) 10–16.

J.L. Martínez Vidal, M.M. Aguilera-‐Luiz, R. Romero-‐González, A. Garrido Frenich. Multiclass analysis of antibiotic residues in honey by ultra performance liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry.


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Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (2009) 1760-‐1767. Garrido Frenich, M.M. Aguilera-‐Luiz, J.L. Martínez Vidal, R. Romero-‐González. Comparison of several

extraction techniques for multiclass analysis of veterinary drugs in eggs using ultra-‐high pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta 661 (2010) 150-‐160.

J.L. Martínez Vidal, A. Garrido Frenich, M.M. Aguilera-‐Luiz, R. Romero-‐González.Development of fast screening methods for the analysis of veterinary drug residues in milk by liquid chromatography-‐triple quadrupole mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry 397 (2010) 2777-‐2790.

M.M. Aguilera-‐Luiz, J.L. Martínez Vidal, R. Romero-‐González, A. Garrido Frenich.Multiclass method for fast determination of veterinary drug residues in baby food by ultra-‐high-‐performance liquid chromatography– tandem mass spectrometry. Food Chemistry 132 (2012) 2171-‐2180.

R. Romero-‐González, M.M. Aguilera-‐Luiz, P. Plaza-‐Bolaños, A. Garrido Frenich, J.L. Martínez Vidal. Food contaminant analysis at high resolution mass spectrometry: Application for the determination of veterinary drugs in milk. Journal of Chromatography A 1218 (2011) 9353-‐9365.

M.M. Aguilera-‐Luiz, R. Romero-‐González, P. Plaza-‐Bolaños, J.L. Martínez Vidal, A. Garrido Frenich. Rapid and semiautomated method for the analysis of veterinary drug residues in honey based on turbulent-‐flow

spectrometry (TFC-‐UHPLC-‐Orbitrap-‐ MS). Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (2013) 829-‐839. Garrido Frenich, J.L. Martínez Vidal, R. Romero-‐González, M.M. Aguilera-‐Luiz. Simple and high-‐throughput

method for the multi-‐mycotoxin analysis in cereals and related foods by ultra-‐high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Food Chemistry 117 (2009) 705712.

R. Romero-‐González, J.L. Martínez Vidal, M.M. Aguilera-‐Luiz, A. Garrido Frenich. Application of conventional solid-‐phase extraction for multi-‐mycotoxin analysis in beers by ultrahigh-‐performance liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (2009) 9385-‐9392.

R. Romero-‐González, A. Garrido Frenich, J.L. Martínez Vidal, M.M. Aguilera-‐Luiz. Determination of ochratoxin A and T-‐2 toxin in alcoholic beverages by hollow fiber liquid phase microextraction and ultra high-‐pressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta 82 (2010) 171-‐176.

M.M. Aguilera-‐Luiz, P. Plaza-‐Bolaños, R. Romero-‐González, J.L. Martínez Vidal, A. Garrido Frenich. Comparison of the efficiency of different extraction methods for the simultaneous determination of mycotoxins and pesticides in milk samples by ultra high-‐performance liquid chromatography-‐tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry 399 (2011) 2863-‐2875.

M.M. Aguilera-‐Luiz, R. Romero-‐González, P. Plaza-‐Bolaños, A. Garrido Frenich, J.L. Martínez Vidal. Wide scope analysis of veterinary drug and pesticide residues in animal feed by liquid chromatography coupled to quadrupole-‐time of flight mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry 405 (2013) 6543-‐6553.

CURRICULUM VITAE

María del Mar Aguilera Luiz (Almería, 1984) se licenció en Ciencias Químicas en la Universidad de Almería entre 2002-‐2007. En 2007 comenzó a trabajar con una beca de colaboración en el grupo de investigación “Química Analítica de Contaminantes” (FQM-‐170). Una vez acabada la licenciatura y tras publicar un artículo en una revista de ámbito internacional consigue una beca FPU para comenzar su Tesis Doctoral en el mismo grupo de investigación la cual ha defendido en el año 2013. Dicha Tesis Doctoral estuvo centrada en el desarrollo de metodologías analíticas para el análisis de residuos y contaminantes en diversas muestras alimentarias usando técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas de baja y media/alta resolución. Además, durante este periodo realizó una estancia de 4 meses en “Department of Food Chemistry and Analysis of Institute of Chemical Technology” en Praga, en el que trabajó con equipos de alta resolución para la búsqueda de metabolitos en alimentos. Actualmente disfruta de un contrato puente concedido por la Universidad de Almería para continuar labores de investigación.


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“APLICACIÓN DE TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS ACOPLADAS A ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA LA DETERMINACIÓN DE RESIDUOS Y

CONTAMINANTES ORGÁNICOS EN AGUAS RESIDUALES Y SUELOS” MARÍA DE LAS NIEVES BARCO BONILLA (Universidad de Almería)

DIRECTORES: JOSÉ LUIS MARTÍNEZ VIDAL, ANTONIA GARRIDO FRENICH y ROBERTO ROMERO GONZÁLEZ GRUPO: FQM-‐170 FECHA: 14/06/2013 La Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio del potencial analítico de la cromatografía, tanto de gases (GC) como líquidos (LC), acopladas a espectrometría de masas (MS) para la determinación de residuos y contaminantes orgánicos en muestras medioambientales. Por un lado, GC acoplada a espectrometría de masas en tándem con un analizador de triple cuadrupolo (GC-‐QqQ-‐MS/MS) se utilizó para el análisis de plaguicidas apolares, hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), compuestos fenólicos y compuestos orgánicos volátiles (VOCs). Por otro lado, la LC de ultra alta eficacia acoplada a espectrometría de masas en tándem con un analizador de triple cuadrupolo (UHPLC-‐QqQ-‐MS/MS) y la LC de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas con un analizador de cuadrupolo simple (HPLCQ-‐MS) se usaron para la determinación de plaguicidas polares y DEHP, respectivamente. Por otro lado, para la determinación de difeniléteres polibromados (PBDEs) se utilizó GC acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) con un analizador de tipo sector magnético. Estos estudios se llevaron a cabo en suelos, aguas superficiales y efluentes de aguas residuales destinados a la reutilización. Adicionalmente, se evaluaron y optimizaron varios procedimientos de tratamiento de muestra y de extracción con el fin de desarrollar métodos simples y rápidos que permitan aumentar el rendimiento de la muestra y facilitar su uso en análisis de rutina. Esta Tesis Doctoral se organizó en cuatro partes: La primera parte se centró en el desarrollo y validación de metodologías analíticas para el análisis de contaminantes orgánicos en suelos y aguas superficiales:

Desarrollo de un método basado en GC–QqQ-‐MS/MS para la determinación de 24 PAHs, comparando la extracción con líquidos presurizados (PLE) con ultrasonidos (USE).

Desarrollo de un método basado en HPLC-‐Q-‐MS para la determinación de DEHP en aguas superficiales y suelos, utilizando extracción en fase sólida (SPE) y PLE, respectivamente.

En la segunda parte, se desarrollaron y validaron varias metodologías para el análisis de 139 plaguicidas apolares, 39 plaguicidas polares, 24 PAHs, 13 compuestos fenólicos y 19 VOCs en efluentes de aguas residuales con diferentes propiedades físico-‐químicas procedentes de distintas tecnologías. También se realizó un estudio de distribución de estos compuestos entre la fase acuosa y la materia particulada en suspensión para establecer la necesidad de analizar ambas fases, o únicamente una de ellas. En esta parte hay que resaltar la necesidad de optimizar métodos de extracción específicos para cada efluente de aguas residuales basándose en sus características físico-‐químicas, así como la necesidad de llevar a cabo una evaluación exhaustiva del efecto matriz, probando los diferentes métodos de calibrado que se pueden aplicar para minimizarlo. La tercera parte se focalizó en la aplicación de las metodologías desarrolladas y validadas para monitorizar 226 compuestos, incluyendo plaguicidas, PAHs, compuestos fenólicos y VOCs, en efluentes de estaciones de tratamiento de aguas residuales (ETARs) de Andalucía. Los estudios realizados en esta parte incluyen: La evaluación de la presencia de 226 contaminantes orgánicos en efluentes de aguas residuales procedentes de tratamientos secundarios de 12 ETARs localizadas a través de un área semiárida caracterizada por una elevada actividad turística y agrícola, como la provincia de Almería (sureste de España), en tres campañas de muestreo llevadas a cabo durante 2011.

Un estudio exhaustivo de la presencia de 226 compuestos orgánicos en muestras de efluentes de 21 ETARs urbanas procedentes tanto de tratamientos secundarios como terciarios en las cuencas Mediterránea y


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Atlántica andaluzas. En la cuarta parte se desarrolló y validó una metodología analítica basada en SPE para el análisis de los 6 PBDEs especificados por la Directiva 2008/105/EC de aguas de la Unión Europea. Los análisis finales se realizaron mediante un método basado en GC-‐HRMS utilizando un analizador de tipo sector magnético, que fue también optimizado para detectar los compuestos objeto de estudio en muestras de aguas a concentraciones inferiores a las normas de calidad ambiental establecidas por la legislación europea (por debajo del ng/L).

REFERENCIAS

Nieves Barco-‐Bonilla, José Luis Martínez Vidal, Roberto Romero-‐González, Antonia Garrido Frenich. Comparison of ultrasonic and pressurized liquid extraction for the analysis of polycyclic aromatic compounds in soil samples by gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta (2009), 78, 156–540.

Antonia Garrido Frenich, Nieves Barco-‐Bonilla, Juan Carlos López Martínez, José Luis Martínez Vidal,

Roberto Romero González. Determination of di-‐(2-‐ethylhexyl)phthalate in environmental samples by liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Journal of Separation Sciences (2009), 32, 1383–1389.

Nieves Barco-‐Bonilla, Roberto Romero González, Patricia Plaza Bolaños, Antonia Garrido Frenich, José

Luis Martínez Vidal Analysis and study of the distribution of polar and non-‐polar pesticides in wastewater effluents from modern and conventional treatments. Journal of Chromatography A (2010), 1217, 7817–7825.

Nieves Barco-‐Bonilla, Roberto Romero González, Patricia Plaza Bolaños, José Luis Fernández Moreno,

Antonia Garrido Frenich, José Luis Martínez Vidal. Comprehensive analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in wastewater using stir bar sorptive extraction and gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta (2011), 693, 62–71.

Juan Antonio Padilla Sánchez, Patricia Plaza Bolaños, Roberto Romero González, Nieves Barco-‐Bonilla,

José Luis Martínez Vidal, Antonia Garrido Frenich. Simultaneous analysis of chlorophenols, alkylphenols, nitrophenols and cresols in wastewater effluents, using solid phase extraction and further determination by gas chromatography–tandem mass spectrometry. Talanta (2011), 85, 2397–2404.

Nieves Barco-‐Bonilla, Patricia Plaza Bolaños, José Luis Fernández Moreno, Roberto Romero González,

Antonia Garrido Frenich, José Luis Martínez Vidal. Determination of 19 volatile organic compounds in wastewater effluents from different treatments by purge and trap followed by gas-‐chromatography coupled to mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry (2011), 400, 3537–3546.

Nieves Barco-‐Bonilla, Roberto Romero González, Patricia Plaza Bolaños, Antonia Garrido Frenich, José

Luis Martínez Vidal, Juan José Salas, Isabel Martín. Study of the distribution of 204 organic contaminants between the aqueous phase and the suspended particulate matter in treated wastewater for proper environmental control. Desalination and Water Treatment (2013), 51, 2497–2515.

Nieves Barco-‐Bonilla, Roberto Romero González, Patricia Plaza Bolaños, José Luis Martínez Vidal,

Antonia Garrido Frenich. Systematic study of the contamination of wastewater treatment plant effluents by organic priority compounds in Almeria province (SE Spain). Science of the Total Environment (2013), 447, 381–389

Nieves Barco-‐Bonilla, Roberto Romero González, Patricia Plaza Bolaños, José Luis Martínez Vidal,

Antonio J. Castro, Isabel Martín, Juan José Salas, Antonia Garrido Frenich. Priority organic compounds in wastewater effluents from the Mediterranean and Atlantic basins of Andalusia (Spain). Environmental Science: Processes & Impacts (2013), 15, 2194-‐2203


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Nieves Barco-‐Bonilla, Patricia Plaza Bolaños, Noelia María Valera Tarifa, Roberto Romero González,

José Luis Martínez Vidal, Antonia Garrido Frenich. Highly sensitive determination of polybrominated diphenyl ethers in surface water by gas chromatography coupled to high resolution mass spectrometry according to the EU Water Directive 2008/105/EC.. Journal of Separation Science (2014), 37, 69-‐76

CURRICULUM VITAE

Mª Nieves Barco Bonilla (Laujar de Andarax, Almería, 1984) se licenció en Ciencias Químicas en la Universidad de Almería (2002-‐2007). En 2009 comenzó su Tesis Doctoral en el grupo de investigación “Química Analítica de Contaminantes” (FQM-‐170), la cual ha defendido en el año 2013. Dicha Tesis Doctoral estuvo centrada en el desarrollo de metodologías analíticas para el análisis de residuos y contaminantes orgánicos en aguas residuales y suelos usando técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas de baja y alta resolución. Además dichas metodologías fueron aplicadas para la realización de estudios de contaminación de efluentes de aguas residuales procedentes de diferentes tratamientos secundarios y terciarios en Andalucía, así como específicamente en la provincia de Almería. Además, se realizó una estancia de 3 meses en el Instituto de Estudios Medioambientales (IVM) de la Universidad de Ámsterdam (Holanda). Al finalizar su Tesis Doctoral, desempeñó la tarea de profesora del curso denominado “Aplicación de técnicas avanzadas de cromatografía-‐espectrometría de masas para análisis de residuos de plaguicidas y medicamentos veterinarios en alimentos” (ceiA3 Training Networks), impartido en la Universidad de Almería. En la actualidad disfruta de un año de contrato posdoctoral financiado por la Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo de la Junta de Andalucía en el grupo de investigación antes mencionado.


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“Principios y Aplicaciones de Metrología en Química. Aspectos prácticos de la ISO-‐17025”

Los pasados días 17 y 18 de octubre tuvo lugar en Zaragoza la VI edición del Curso “Principios y Aplicaciones de Metrología en Química. Aspectos prácticos de la ISO-‐17025”, que se enmarca dentro del Programa de la Unión Europea TrainMiC (Training in Metrology in Chemistry), cuyo principal objetivo es la formación sobre la interpretación de la norma ISO/IEC 17025 en el análisis químico aplicado en diferentes sectores (medioambiente, alimentación, protección al consumidor, etc.).

El primer curso TrainMiC tuvo lugar en Maribor (Eslovenia) en 2001 y desde entonces se han celebrado más de 280 cursos en toda Europa, en los que han participado más de 8300 científicos y personal técnico. El programa se inició en uno de los centros JRC de la Comisión Europea, el Institute of Reference Materials and Measurements, JRC-‐IRMM (Geel, Bélgica) con el fin de mejorar la calidad de los resultados analíticos mediante la promoción y desarrollo de una formación armonizada en Metrología química a través de una red de equipos nacionales que comparten recursos (materiales y sistemas de enseñanza). Este material se comparte por los equipos de muchos países europeos y ha sido desarrollado por expertos de toda Europa trabajando bajo la supervisión de un consejo editorial y ha sido traducido a 14 idiomas. Los cursos de formación están orientados a personal de laboratorio, investigadores, profesores, acreditadores y cualquier persona relacionada con resultados analíticos y su uso final.

El equipo TrainMiC español comenzó a trabajar en el año 2007 y desde entonces se han llevado a cabo 6 cursos (Madrid, Cádiz, Alicante, Bilbao, Madrid y Zaragoza) en los que se han formado más de 100 asistentes, con un alto grado de satisfacción. En la fotografía se muestran los asistentes a la edición celebrada en Zaragoza, para la que se ha contado con la colaboración de la empresa INYCOM.

El enfoque de los cursos es aplicado, con una introducción teórica a las cuestiones más importantes de la metrología química y ejemplos prácticos para el cálculo de incertidumbres y validación de procedimientos con una discusión final de los resultados obtenidos. De esta forma, los participantes tienen una serie de referencias en las que basarse para poder trabajar cuando se enfrenten a estas cuestiones en su lugar de trabajo con sus casos particulares. (C. Moreno, UCA)

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“Cien años de Química en Granada” Luis Fermín Capitán Vallvey, Universidad de Granada

El pasado año 2013 se celebró el centenario de la implantación de los estudios de Química en la Universidad de Granada. Celebración, que además de la connotación tanto festiva como formal que tiene la palabra, ha servido como punto de reflexión colectiva, de excusa para conocer la pequeña historia escondida y sus personajes, con sus claros y oscuros, y para saber –intuir-‐ en qué dirección nos encaminamos.

Ocurrió en 1913. El primero de enero de 1913 se firmó la R.O. por la que se creaban formalmente los estudios de licenciatura en ciencias químicas siendo fugaz ministro de Instrucción Pública y Bellas Artes, el liberal Antonio López Muñoz, del gabinete del conde de Romanones; R.O. que fue publicada el 13 de enero de ese año.

Los primeros estudios de química en Granada comenzaron en el siglo XVIII y a cargo del Estado; en concreto, en 1776 dentro del nuevo plan de estudios universitario para los estudios de medicina, donde se explicaba en primer curso química junto con botánica y farmacia en Materia Médica, aunque con escaso éxito al ser asignatura eminentemente libresca.

También hubo enseñanza de química en Granada en el contexto de sociedades ilustradas relacionadas con la Sociedad Económica de Amigos del País; es el caso de la Academia de Química y Botánica que tuvo actividad docente en Granada, aunque de manera irregular, entre 1797 y 1807, y de la que fue regente José Ponce de León, catedrático de la universidad granadina.

Ya en el siglo XIX el Plan Caballero (1807) traslada la enseñanza de la química a la Facultad de Artes donde es impartida por la cátedra de Física Experimental. Con la aprobación del plan Pidal en 1845 se divide esa facultad en dos secciones: filosofía y ciencias, que con posterioridad el plan Moyano (1857) transforma en facultades. Esto da lugar al nacimiento de la actual Facultad de Ciencias, cuyo primer decano sería Francisco de Paula Montells y Nadal, primer catedrático de química y uno de los personajes más interesantes de la universidad de Granada del siglo XIX.

Durante muchos años la única Facultad de Ciencias que impartía las diferentes licenciaturas: química, físico-‐matemática y naturales, fue la de la Universidad Central de Madrid. En el resto de universidades, Granada incluida, solo se ofrecían estudios de los dos primeros cursos que conducían al título de Bachiller en Ciencias, habiendo que completar los estudios en la Universidad Central a fin de obtener el título de Licenciado.

El anquilosamiento de la universidad, y de la enseñanza en general, a fin de siglo XIX desemboca en una crisis dando lugar al movimiento regeneracionista. El ministro García Alix al frente del recién creado Ministerio de Instrucción Pública y Bellas Artes, en su reforma de los planes de estudios en 1900, intenta adecuar la preparación en las aulas a las demandas reales de la sociedad. Ello supone la reorganización de las Facultades de Ciencias desdoblando la Sección de Ciencias físico-‐químicas en una de Físicas y otra de Químicas y la reducción de las licenciaturas a cuatro años. Sin embargo, y nuevamente, la mayoría de las universidades de provincias siguen teniendo facultades de ciencias incompletas en las que sólo se dan los cursos preparatorios.


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El deseo de completar los estudios de químicas en Granada hay que contemplarlo dentro del movimiento de reforma surgido en el seno de la Universidad. Regeneración que centrada en autonomía universitaria, asociacionismo estudiantil, planes de estudios y nuevos centros de estudio e investigación, va cobrando fuerza poco a poco en los claustros universitarios, entre ellos el de Granada.

Al estado de opinión creado por este movimiento de renovación hay que sumar la coyuntura económica favorable de las primeras décadas del siglo XX y que en Granada se ejemplifica con la implantación del cultivo de la remolacha azucarera en la vega de Granada que movilizó a la práctica totalidad de la burguesía granadina y tuvo un fuerte impacto en la ciudad.

Ya en 1902, el rector granadino García Sola solicita disponer de nuevos estudios universitarios que ayudasen al desarrollo industrial en su intervención en el acto académico que tuvo lugar en Madrid con motivo de la coronación de Alfonso XIII. En 1910 se volvió a la carga argumentando el poco gasto que suponía; los profesores se comprometieron a dar las clases de forma gratuita y el Ayuntamiento de la ciudad a pagar el material necesario. De nuevo silencio; solo roto en 1911 cuando como resultado de las gestiones realizadas por la Universidad de Sevilla, se autorizaron en ella los estudios de Químicas.

El rector Federico Gutiérrez y el decano de la Facultad de Ciencias, Pascual Nacher, iniciaron entonces una campaña en Madrid para reactivar la petición en la que intervinieron senadores y diputados provinciales y especialmente Natalio Rivas, por entonces subsecretario del Ministerio de Instrucción Pública. No es hasta finales de 1912 cuando este último consiguió que la Comisión de Presupuestos de las Cortes consignara el dinero necesario para la creación de la Sección de Químicas.

El 13 de enero de 1913 se publicó en la Gaceta de Madrid la Real Orden del Ministerio de Instrucción Pública y Bellas Artes por la que se establecían en Granada los estudios de la Licenciatura en Químicas.

Un conjunto de profesores de los diferentes departamentos de la sección de químicas de la Universidad de Granada (Luis Fermín Capitán Vallvey (QA), Antonio Guadix Escobar (IQ), Encarnación Jurado Alameda (IQ), Enrique López-‐Cantarero Vargas (QF), Pedro Luis Mateo Alarcón (QF), Juan Enrique Oltra Ferrero (QO), Juan Manuel Salas Peregrin (QI) y Carmen Valencia Mirón (QA)) empezamos a principios de 2012 a darle vueltas a la posibilidad de conmemorar el centenario; discutimos posibilidades, rechazamos ideas y diseñamos un proyecto. Tanto el rector de la Universidad de Granada, Prof. González Lodeiro, como el decano de la Facultad de Ciencias, Prof. Ríos Guadix, nos dieron su apoyo incondicional y nuevas ideas.

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Comenzamos a hacer ambiente al incluir en la agenda, memoria académica y calendario del curso 2012/2013 de la Universidad de Granada, el tema e imagen del Centenario de los estudios de Químicas.

El inicio de actividades tuvo lugar en una fecha lo más próxima posible a la simbólica del 13/1/13 que al ser en esta ocasión domingo -‐en aquella fue lunes-‐, elegimos el 14 de enero de 2013. El acto inaugural, presidido por el rector de la UGR, contó con una conferencia del Prof. Mayor Zaragoza titulada “Ciencias Químicas: Presente y Futuro”, tras lo cual se presentó el retrato de Pascual Nácher, decano de la Facultad de Ciencias en 1913, y cuyo papel fue de gran importancia para la creación de los estudios de Ciencias Químicas. Retrato que faltaba en la galería de decanos existente en la Facultad de Ciencias.

En el mismo acto se presentó el blog del Centenario de Químicas (http://q100ugr.blogspot.com.es/), que ha recogido todas actividades realizadas y que aloja un interesante archivo fotográfico, así como dos sellos personalizados conmemorativos del centenario. El diseño del primero de los sellos se basa en un tapiz que fue sufragado por profesores y alumnos en noviembre de 1913 como recuerdo de la creación de los estudios. Restaurado en los años setenta, preside en la actualidad la Sala de Claustro de la Facultad de Ciencias.

http://q100ugr.blogspot.com.es/

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ACTUALIDAD GRASEQA

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Con ambas actividades nos hemos obligado colectivamente a reflexionar sobre lo que han supuesto los estudios de químicas, su impacto sobre la propia universidad y sobre la sociedad granadina. Hemos recuperado la memoria y el recuerdo de personas que en su momento fueron decisivos para que hoy contemos con unos estudios firmemente enraizados a través de un conjunto de 125 profesores articulados en cinco Departamentos y 28 grupos de investigación que imparten su docencia, además de en los estudios de Química e Ingeniería Química, en otros diez grados de la Universidad de Granada. Luis Fermín Capitán Vallvey Universidad de Granada E-‐mail: [email protected]


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AGENDA GRASEQA

AGENDA

CONGRESO: 65th Pittsburg Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (PITTCON 2014) FECHAS: 2-‐6 de Marzo de 2014 SEDE: Chicago (EE.UU.). INFORMACIÓN: www.pittcon.org

CONGRESO: 30th International Symposium on Microscale Bioseparations FECHAS: 27 Abril-‐1 de Mayo de 2014. SEDE: Pecs, Hungría. INFORMACIÓN: www.msb2014.org

CONGRESO: 24th Anniversary World Congress on Biosensors (Biosensors 2014) FECHAS: 27-‐30 de Mayo de 2014 SEDE: Melbourne, Australia INFORMACIÓN: www.biosensors-‐congress.elsevier.com

CONGRESO: 62nd ASMS Conference on Mass Spectrometryand Allied Topics FECHAS: 15-‐19 de Junio de 2014 SEDE: Baltimore, EE.UU. INFORMACIÓN: www.asms.org

CONGRESO: The 38th International Symposium on Environmental Analytical Chemistry-‐ISEAC38 (including Conference on Food Safety (food analytics and authencity control) FECHAS: 17-‐20 de Junio de 2014 SEDE: Lausana, Suiza INFORMACIÓN: http://www.iseac38.ch

CONGRESO: XIV Reunión del Grupo Regional Andaluz de la Sociedad Española de Química Analítica (XIV GRASEQA 2014) FECHAS: 26 y 27 de Junio 2014 SEDE: Universidad Internacional de Andalucía, Sede Antonio Machado, Baeza (Jaén). INFORMACIÓN: www.ujaen.es/eventos/graseqa2014

CONGRESO: 10th European Pesticide Residue Workshop (EPRW 2014) FECHAS: 30 Junio al 3 de Julio 2014 SEDE: Dublín (Irlanda). INFORMACIÓN: www.eprw2014.com

CONGRESO: 10th Annual LC/MS/MS Workshop on Environmental Applications and Food Safety FECHAS: 1-‐3 de Julio de 2014 SEDE: Barcelona. INFORMACIÓN: [email protected]

CONGRESO: DIOXIN 2014. 34th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants FECHAS: 31 de Agosto a 5 de Septiembre de 2014. SEDE: Madrid INFORMACIÓN: www.dioxin2014.org

CONGRESO: ISC 2014 (30th International Symposium on Chromatography) FECHAS: 14 al 18 de Septiembre de 2014. SEDE: Salburgo, Austria. INFORMACIÓN: www.isc2014.at

CONGRESO: XIV JAI 2014 (14º Jornadas de Análisis Instrumental 2014 FECHAS: 29 de Septiembre al 3 de Octubre de 2014. SEDE: Barcelona. INFORMACIÓN: www.barter.es/JAI

http://www.pittcon.org/

http://www.msb2014.org/

http://www.biosensors-congress.elsevier.com/

http://www.biosensors-congress.elsevier.com/

http://www.asms.org/

http://www.iseac38.ch/

http://www.ujaen.es/eventos/graseqa2014

http://www.eprw2014.com/


http://www.dioxin2014.org/

http://www.isc2014.at/

http://www.barter.es/JAI

BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN

GRUPO REGIONAL ANDALUZ SOCIEDAD ESPAÑOLA DE QUÍMICA ANALÍITICA

D. / Dª : Departamento / Sección : Institución / Empresa : Cargo : DIRECCIÓN PROFESIONAL Avda. / Calle / Plaza : Nº : Localidad : C.P. : Provincia : Teléfono : Fax : e-mail : DIRECCIÓN PARTICULAR Avda. / Calle / Plaza : Nº : Portal : Esc. : Piso : Puerta : Letra : Localidad : C.P. : Provincia : Teléfono : Móvil :

Fdo. : ENVIAR A Juan Francisco García Reyes (Tesorería GRASEQA )

. ( por e-mail a: [email protected])


BOLETÍN DE INSCRIPCIÓN

GRUPO REGIONAL ANDALUZ SOCIEDAD ESPAÑOLA DE QUÍMICA ANALÍITICA

DOMICILIACIÓN BANCARIA (*)

Caja Ahorros / Banco: Oficina / Sucursal : Dirección : Localidad : Provincia : Código Cuenta Cliente ( 20 dígitos ) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

ENVIAR A Juan Francisco García Reyes (Tesorería GRASEQA )

. ( por e-mail a: [email protected])

* Si ya se ha realizado el pago domiciliado de la cuota correspondiente al año en curso, debe ingresar directamente la cuota en: BANCO POPULAR ESPAÑOL JAÉN Urb. 2 0075 3272 61 0600048022

Caja Ahorros / Banco : Oficina / Sucursal : Dirección : Localidad : Provincia : Muy Sres. míos:

A partir de la presente, agradecería a Vds. se sirvan cargar en mi Cuenta Corriente / Libreta de Ahorros Nº _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ abierta en esta entidad, los recibos de las cuotas anuales extendidas por el Grupo Regional Andaluz de la Sociedad Española de Química Analítica (GRASEQA)

Atentamente les saluda,

Fdo. :

ENVIAR A LA ENTIDAD BANCARIA


SOCIEDAD ESPAÑOLA DE QUÍMICA ANALITICA

Boletín de Inscripción Apellidos

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Dirección Profesional

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C.P. Ciudad

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Fax

Correo electrónico

Domicilio particular

C.P.y Ciudad

Teléfono

Nº de cuenta (20 dígitos)

Tipo de socio Numerario (Cuota 60,10 Euros)

Adherido Cuota: 30,05 Euros

* Jóvenes investigadores (menores de 35 años) / sin contrato de trabajo Enviar por e-‐mail a : [email protected] AVISO LEGAL

Conforme a la Ley Orgánica, 15/1999 sobre Protección de datos de carácter personal, el

firmante autoriza a SOCIEDAD ESPAÑOLA DE QUÍMICA ANALÍTICA al tratamiento de los

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con la finalidad de llevar a cabo la gestión de marketing, comercial y administrativa.

Usted podrá ejercitar los derechos de acceso, rectificación, cancelación u oposición,

dirigiéndose mediante carta o correo electrónico al Responsable del Fichero: [email protected]



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