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LaboratoriodeBiologaCelularyMolecularFacultaddeCienciasVeterinariasUniversidadNacionaldelLitoral

MecanismodeAccindelosReceptoresdeHormonasEsteroides.

Dra.NataliaR.Salvetti

MaestraenCienciasVeterinariasBiologaCelularyMolecular2012

Los receptores de hormonas nucleares son miembros de lasuperfamilia de activadores transcripcionales dependientes deligando.

Regulan la expresin de genes especficos en respuesta apequeas molculas lipoflicas (ligando u hormona) que incluyen:

HormonasEsteroides

HormonasTiroideas

cidoRetinico

VitaminaD

ReceptoresNucleares

Repaso:transcripcin

Regionesdecontroltranscripcional: secuenciasdelADNquepermitenlaunindeprotenasqueregulanelprocesodetranscripcin,aquseincluyenpromotores,elementosproximalesalpromotoryamplificadores.

SitiodeIniciodelatrascripcin: lugarendondelaARNPOLIIinicialatrascripcindandoorigenalaprimerabasedelexndelARNmqueseestatranscribiendoensentido5a3.

Promotor: secuenciaroarribadeliniciodelatranscripcindondeseuneelcomplejodetranscripcinincluyendolaRNApolimerasa.(TATAbox)

5 3

TATA box o elemento iniciador: secuencia que indica a la ARN POLII en donde ubicarse. TATA box es la ms encontrada y generalmente se encuentra a 25-35 pb del sitio de inicio de la trascripcin en direccin 5.

Elementos proximales al promotor: regiones de control (dentro del ADN) que se encuentran entre 100-200pb en direccin 5 del sitio de inicio de la trascripcin.

Amplificadores: son elementos de control de la trascripcin que amplifican la trascripcin. Pueden estar muy alejados del sitio de inicio de la transcripcion, en direccin 5 o 3.

Repaso: transcripcin

Figura 6-16 (parte 1 de 3) Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

TBP

ADN

Repaso:transcripcin

Repaso:transcripcin

Factores de transcripcin: protenas que regulan la expresin gnica,se unen a secuencias del DNA ro arriba del sitio de inicio de latranscripcin o al complejo de transcripcin, estimulando oreprimiendo la actividad del complejo.

Ligando ReceptorEstradiol Receptor de Estrgenos (RE)

Progesterona Receptor de Progesterona (RP)

Cortisol Receptor de Glucocorticoides (RG)

Aldosterona Receptor de Mineralocorticoides (RM)

Testosterona y DHT Receptor de Andrgenos (RA)

Vitamina D Receptor de Vit D (VDR)

T3 y T4 Receptor de hormonas tiroideas (TR)

cidos Retinoicos 9- Cis Receptor de cido retinoico (RAR)

cidos Retinoicos trans Receptor de retinoide X (RXR)

Existen mas de 60 factores de transcripcin dependientes de ligando,entre los que se pueden encontrar:

Receptores Nucleares

La superfamilia de los receptores hormonales nucleares

Los genes regulados por los receptores nucleares estnrelacionados con una gran variedad de procesos incluyendometabolismo, desarrollo, crecimiento y diferenciacin.

Los receptores nucleares estn constituidos por tres principalesdominios funcionales adems de dos zonas de activacintranscripcional:

Dominio de Unin al ADN (DBD): C

Dominio de Unin al Ligando (LBD): E

Dominio Amino Terminal

Dominios de activacin transcripcional: AF (AF1 y AF2)

Dominio de unin al ADN (DBD): la estructura del DBD consiste en dos dedosde zinc formados por cuatro residuos de cistenas con un tomo de zinc. Laregin aminoterminal del dedo de zinc contacta con el surco mayor de la doblehlice de DNA, constituyendo la caja P. La especificidad de la unin del receptora la secuencia del Elemento de Respuesta a Hormona (ERH) del ADN vienetambin determinada, en parte por los tres aminocidos adyacentes al primerdedo de zinc. El segundo dedo de zinc en la regin carboxiterminal tambin esnecesario para la unin del DNA, ya que mutaciones en esta regin generan unreceptor inactivo.

Estructura Molecular de los Receptores de Hormonas Esteroides

Dominio N DBD H LBD

AF-1Regin Bisagra

N C

AF-2


Dominio N DBD H LBDAF-1 Regin BisagraN CAF-2


Dominio de unin a la hormona (LBD): est localizado en la regincarboxiterminal del receptor. Aqu se ubican las protenas inhibidoras (HSP90)para evitar la activacin del receptor.

Dominios de transactivacin (AF1 y AF2): son esenciales para latransactivacin y actan independientemente de la posicin que ocupen. El AF2es dependiente del ligando, no as el AF1.


Los receptores nucleares han sido clasificados en cuatro clasesde acuerdo a:

Interaccin con HSPs

Tendencia a formar homodmeros o heterodmeros

Especificidad de unin al ADN


Tienen largos dominios A/B.

Cuando no estn unidos al ligando permanecen secuestrados porgrandes heterocomplejos 9S (proteasa resistentes) que contienen HSP(HSP70, HSP90, p23,p60), inmunofilinas (CyP40, etc) y otras chaperonas.

Luego de la unin del ligando se produce la disociacin delheterocomplejo y los receptores pueden dimerizar y unirse al ADN.

En ausencia del ligando los receptores se trasladan entre el ncleo y elcitoplasma con una cantidad constitutiva citoplasmtica dependiendo deltipo de receptor.

Ligandos y receptores: Los receptores de esteroides (Receptores deAndrgenos, Estrgenos, Progesterona, Mineralocorticoides,Glucocorticoides).

Clase I:


Tienen cortos dominios A/B.

No se relacionan con Heat Shock Proteins

Permanecen unidos a elemento de respuesta del ADN formandohomodmeros o monmeros pero de preferencia formando heterodmeroscon RXR.

Esperan in situ la unin y consiguiente activacin por el ligando.

Ligandos y receptores: hormona tiroidea (RT), dihidroxivitamina D (VDR),cidos retinoicos trans (RXR), y la mayora de los receptores hurfanos.


Clase II:

Funcionan primariamente como monmeros aunque pueden dimerizarcon RXR.

Producen transcripcin constitutiva.

Ligandos y receptores: Factor esteroidognico -1 (SF-1).


Clase III:

Muestran caractersticas similares a los de clase I y II pero se unen alADN exclusivamente como monmeros en medios sitios con repeticionesdirectas.

Ligandos y receptores: Algunos de los receptores hurfanos tales comoel HNF-4 (Factor nuclear de hepatocitos 4)

Clase VI:

Receptores de Estrgenos (RE)

Receptores de Andrgenos (RA)

Receptores de Progesterona (RP)

Receptores de Mineralocorticoides (RM)

Receptores de Glucocorticoides (RG)

Receptores de Hormonas Esteroides

Los receptores de hormonas esteroides se clasifican dentro de los de Clase I.

En los mamferos, las adrenales, las gnadas y la placenta producencinco grandes grupos de hormonas esteroides.

Estas hormonas regulan numerosos procesos fisiolgicos en las clulasblanco equipadas con los correspondientes receptores hormonales.

Estrgenos Progesterona Andrgenos

Mineralocorticoides Glucocorticoides


Ligando ReceptorEstradiol Receptor de Estrgenos (RE)

Progesterona Receptor de Progesterona (RP)

Cortisol Receptor de Glucocorticoides (RG)

Aldosterona Receptor de Mineralocorticoides (RM)

Testosterona y DHT Receptor de Andrgenos (RA)

Factores de transcripcin dependientes de ligando: Hormonas Esteroides.


La unin de las hormonas esteroides (HE) a los receptores nuclearesde esteroides (RNE) se realiza segn un modelo de dos pasos:

1. Unin de la hormona al receptor especfico dentro de laclula blanco (puede ser en el citoplasma o en el ncleo,de acuerdo al receptor).


2. Activacin del complejo hormona-receptor para inducir laexpresin gnica en respuesta a hormonas.

Homologa en las secuencias de los distintos receptores de hormonas esteroides

Las hormonas esteroides cumplen su funcin mediante la activacin delos receptores hormonales, los cuales van a unirse, luego de ladimerizacin, al Elemento de Respuesta a Hormonas (ERH) localizadoen promotores de los genes blanco.

Los receptores GR, MR, AR y PRse unen al mismo ERHoriginalmente denominado ERG(Elemento de Respuesta aGlucocorticoides). Este estcompuesto por mitades invertidas(palindrmicas, IR3= invertedrepeat 3) de la secuencia TGTYCT(esta ultima base poco conservada)separadas por tres pares de basesno conservadas NNN. Y= cualquier base pirimdica (C o T)

R= cualquier base purnica (G o A)

Regulacin de la transcripcin gnica mediada por Receptores de hormonas esteroides

Los receptores de estrgenos as como tambin los receptoresrelacionados a estrgenos (receptores hurfanos, RRE) interaccionancon elementos de respuesta especficos, ya sea como homodmeros oheterodmeros (cada monmero se une a una mitad).

Los receptores ER y los RRE seunen al ERE (Elemento derespuesta a estrgenos). Este estcompuesto por mitades invertidas(palindrmicas, IR3= invertedrepeat 3) de la secuencia TGRCCseparadas por tres pares de basesno conservadas NNN.

Y= cualquier base pirimdica (C o T)R= cualquier base purnica (G o A)



El descubrimiento de los hurfanos RRE y (receptores relacionadosa estrgenos) llev a la identificacin de un elemento de respuestaexclusivo para estos.

Los RRE y (receptoresrelacionados a estrgenos) se unenal ERRE (Elemento de respuestarelacionado a estrgenos) comomonmeros o dmeros. Adems elRE puede unirse comohomodmero a este. El ERRE estcompuesto por una mitad del EREque contina hacia el extremo 5,separada por 1 par de bases N.

Y= cualquier base pirimdica (C o T)R= cualquier base purnica (G o A)

Correguladores

Los correguladores son protenas que interactan con factores detranscripcin y modulan su actividad positiva o negativamente, y quedesde un punto de vista funcional se clasifican en dos tipos:

Coactivadores. Correpresores.

Los coactivadores, no interactan directamente con el DNA sino quelo hacen de manera indirecta a travs de su asociacin con factoresde transcripcin, entre los que se encuentra el receptor deestrgenos.

Se sabe que la unin del ligando al ER genera un cambioconformacional en su LBD, formando una cavidad hidrofbica quepermite la interaccin con coactivadores a travs de una secuencia omotivo LxxLL (donde L es leucina y x es cualquier aminocido)llamada caja NR. Esta caja NR est presente en una o varias copiasen un gran nmero de coactivadores.

Correguladores

Los co-activadores usualmente se presentan en complejosmultiproticos que interactan con factores de transcripcin ymodifican la cromatina para facilitar la transcripcin, a travs demecanismos de:

Remodelacin de cromatinaAcetilacin y metilacin de histonas.Facilitacin del reclutamiento de la maquinaria general de latranscripcin y la activacin de Pol II.Estabilizacin de los complejos sobre el DNA.Estabilizacin del ARNm.Regulacin del recambio de complejos proteicos sobre lospromotores.

Correguladores

Los correpresores: Cuando los receptores nucleares (RN) actan comorepresores transcripcionales, los correpresores tienen un papelimportante en esta regulacin negativa. Muchos de los RN reprimen latranscripcin en ausencia de su ligando o en presencia de ligandosantagonistas, como el tamoxifeno. Esta regulacin negativa estmediada en parte por los co-represores.

La unin de antiestrgenos causa un cambio conformacional en AF-2diferente al creado por la unin de ligandos agonistas lo cual bloquea lainteraccin con coactivadores de AF-2 y permite la entrada decorrepresores. Los correpresores se unen a los receptores por medio deuna caja CoRNR que tiene una secuencia similar a las cajas RN: LxxxI/HIxxxI/L.

Correguladores

Los correpresores forman parte de complejos multiproticos y reclutandesacetilasas de histonas (HDAC) que evitan el acceso a factores detranscripcin crticos sobre el ADN, y as se ve reprimida la transcripcin.El reclutamiento de complejos que contienen HDAC est implicado en larepresin por un nmero de silenciadores en mamferos.

Existen otros represores que inhiben la actividad transcripcional de losreceptores nucleares mediante diferentes mecanismos. Estos incluyen:

Interrumpir la unin al DNA o la translocacin al ncleo del receptor.Inhibir las interacciones entre los receptores y sus coactivadores.Interrumpir el reclutamiento de la maquinaria basal de transcripcin.

Correguladores

Correguladores

Co-activadores

A- Remodeladores y modificadores de cromatina:

La cromatina juega un papel importante en la regulacin de la actividadbasal de muchos promotores, y molculas diseadas para vencer lascoacciones termodinmicas que esto produce, son reclutadas en unpunto temprano en el modelo de accin del RE. Quizs el mejorcaracterizado entre estas molculas es el complejo de protenasSWI/SNF que relajan la cromatina con gasto de ATP.

Co-activadores

B- Actividad de acetilasa de histonas:

Las histonas mantienen un ambiente heterocromtico (represivo detranscripcin) debido a las cargas electrostticas conferidas por las cargaspositivas de las lisinas de histonas y por las cargas negativas de los gruposfostato del DNA. Miembros de la familia SRC y protenas de unin a CREB(CBP) y p300, poseen actividad como acetilasas de histonas.

Son consideradas las responsables de interrumpir las interacciones que mantienen la regin del promotor en un estado cerrado, es decir relajan la cadena del DNA, convirtiendo un ambiente heterocromtico en eucromtico, promoviendo as el inicio de la transcripcin.

Co-activadores

C- Actividad de metilasa:

En regiones silenciosas, donde el DNA est fuertemente empaquetadopor la histona H3, los genes estn inactivados. Por el contrario, en lasregiones activas donde los genes se expresan, existe una variedadlevemente distinta de la histona H3, debido a que la histona H3 tienemetilado el aminocido lisina de la posicin 9 en regiones cerradas,mientras en las regiones activas o abiertas tiene metilado la lisina 4.

Co-activadores

C- Actividad de metilasa:

Adems de las marcas sobre las lisinas, tambin puede existir metilacinsobre las argininas, como es el caso del coactivador metiltransferasaarginina 1 (PRMT1) que metila la arginina 3 de la histona 4, que es unamarca de cromatina abierta. Otro ejemplo es la metil-transferasa arginina2 (PRMT2), que interacciona con ER, activando la transcripcin degenes blanco de E2 y el CARM1 (coactivator associated arginine (R)methyltransferase).

Co-activadores

D- Adaptadores de Maquinaria basal de la Transcripcin (MBT):

Los co-activadores pueden estabilizar la unin o ayudar a reclutar factoresde transcripcin basal, ya que presentan interaccin directa concomplejos iniciadores como es el caso de las protenas asociadas alreceptor de hormonas tiroides (TRAPs) y las protenas que interactancon la vitamina D (DRIP).

Algunos estudios han demostradoque complejos que contienenTRAP/DRIP son capaces demejorar la actividad transcripcionalde varios tipos de receptores.

Co-activadores

E- Actividad de Ubiquitina ligasa:

Algunos co-activadores pueden reclutar a enzimas con actividad deligasas de ubiquitina, como es el caso de E6-AP que estimula latranscripcin por medio de ER de manera dependiente al ligando.

Este corregulador est involucrado enmarcar un sustrato para ser procesado porel sistema de degradacin ubiquitina-proteasoma y as renovar el ciclotranscripcional de los genes blanco. Esteproceso asegura el recambio de loscomplejos de la transcripcin unidos a lospromotores blanco.

Co-activadores

F- Adaptadores de splicing:

Aun no est bien dilucidado este mecanismo; sin embargo, se ha sugeridoque protenas como la helicasa p72 o el coactivador PGC-1, puedan estarinvolucradas en este tipo de procesamiento del mRNA en algunos genesblanco para estrgenos.

Heterodmeros de RXR-VDR

Co-activadores

Estas protenas se unen de manera hormonodependiente a un ampliorango de receptores hormonales, en la zona AF2 (zona de activacin de latranscripcin dependiente de ligando) para intensificar la trascripcin.

Los componentes de esta familia son denominados Coactivadores deReceptores Esteroides (SRC), y esta compuesta por tres miembrosestrechamente relacionados:

SRC-1 (interacciona principalmente con RP)

SRC-2 (GRIP-1 y TIF-2, interaccionan con el RG)

SRC-3 (relacionado con RE en SNC)

Coactivadores de la familia p160 (SRC)

Los SRC son protenas que

presentan solo un 40% de homologa

entre los componentes de la

familia pero presentan dominios

altamente conservados en

cuanto a las funciones que

cumplen.



Regin N-terminal (bHLH/PAS): es indispensable para la unin alreceptor

Dominio de interaccin con los receptores nucleares (NID): contiene 3porciones LXXLL denominadas NR boxes que interactan con el LBDdel RN en AF-2 para mejorar la transcripcin (el motivo NR boxes decada miembro de SRC tiene afinidad por distintos receptores).

Dominios de activacin dela transcripcin autnoma:AD1 y AD2. Estosinteractan con otroscoactivadores (AD1: CBP,p300; AD2:CARM1)


SRC-1 y SRC-3 tienen actividad enzimtica de acetiltransferasa de histonas.

CARM1 es un coactivador secundario que trabaja asociado a p160 para aumentar la transcripcin por medio de reacciones de metilacin de Histona 3.

Si bien la accin principal de los componentes de la familia p160 es atravs de AF-2, existe algo de activacin a travs de AF-1, sobretodoel RA que utiliza este factor de transcripcin como el principal en lainteraccin con SRC, siendo el AF2 menos eficiente.


Mecanismo de Accin de los coactivadores p160: Los coactivadores actan en una secuencia de dos pasos:

1- Primero promueven el remodelamiento de la estructura de lacromatina y habilitan el acceso al ADN de los factores generales detranscripcin.

2- Reclutan y estabilizan los factores asociados a la maquinaria detranscripcin basal de la ARN polimerasa II mediante interaccionesprotena-protena directas o indirectas.


Mecanismo de Accin de los coactivadores p160

Coactivadores que actan a travs de AF-1

p68 ARN helicasa: interacta con AF-1 del RE selectivamente (con ningn otro).

SRA (steroid receptor RNA coactivator): interacta con AF-1 deReceptores Esteroides pero no con los de otras clases de receptoresnucleares, lo hace a travs de su unin con SRC-1.

Co-represores

A- Remodelacin de cromatina:

Mecanismo por el cual se mantiene una heterocromatina (cromatinacerrada), evitando as la transcripcin de genes susceptibles a E2. Paraello la cromatina sufre tanto cambios estructurales como bioqumicos.Actividades de HDAC (desacetilasas de histonas) o metilacin dehistonas y/o DNA, evitan la entrada de los complejos transcripcionalessobre el promotor cerrado.

NCoR (Correpresor nuclear),SMRT, RIP140, etc son algunosde los correpresores que poseenactividad desacetilasa.

Co-represores

B- Regulacin de la maquinaria basal de la transcripcin:

Uno de los mecanismos involucrados en la actividad represora de los RNes mediada por el efecto que los co-represores ejercen sobre lamaquinaria basal transcripcional, por ejemplo, NCoR interacta confactores de transcripcin basal, impidiendo que las uniones entre estosfactores sean estables.

Adicionalmente, BRCA-1 se ha encontradopresente en el complejo de la RNA Pol II. SAFBIse une al dominio C-terminal de la RNA pol II.Estas interacciones hacen suponer que loscorrepresores inhiben la accin de la maquinariabasal de la transcripcin, y as evitan latranscripcin de genes blancos ER-dependientes.

Co-represores

C- Competencia con protenas co-activadoras:

Los correpresores compiten con los coactivadores por los sitios de uninen los RN. Ejemplos claros de competencia directa son REA y SHP quecompiten con los coactivadores SRC-1 y TIF-2, respectivamente. RIP140y TIF2 han mostrado competencia por la unin a c-Jun y a ER, paramodular la actividad transcripcional E2-dependiente por medio de AP-1.Otro ejemplo es el del correpresor erbB2, que se expresa en ausencia deestrgenos o en presencia de antiestrgenos, el cual secuestra a SRC-1

Co-represores

D- Procesamiento de RNA:

Se ha demostrado que las hormonas esteroides pueden afectar elprocesamiento del RNA y que los coreguladores pueden estarntimamente relacionados en estos procesos. An cuando no se conocemucho sobre este mecanismo, se ha demostrado en diferentescorrepresores la presencia de motivos de unin a RNA (RRM), tal es elcaso de SHARP, RTA y SAFB1/2.

E- Secuestro del RN en el citoplasma:

Una medida para evitar que RN acte sobre su gen blanco, es evitar laentrada de este al ncleo, tal es el caso del corregulador MTA1s, quesecuestra al ER antes de su translocacin al ncleo.

Co-represores

F- Bloqueo de la dimerizacin de ER y su unin al DNA:

Como ya se mencion, es necesario que el ER forme dmeros oheterodmeros para poder ser activado y unirse a los promotores blancos.Correguladores como TR2 y SHP, inhiben la dimerizacin de ER y otroscomo SHP, TR2 o p53, evitan la unin del ER al DNA.

Tambin existen otros tipos de mecanismos por los cuales loscorrepresores podran influir sobre la actividad de RN. BRCA-1 yNEDD8, desestabilizan al ER o simplemente actan como protenas deandamiaje para reclutar complejos multiproteicos inhibidores como es elcaso del correpresor SHARP.

G- Otros mecanismos:

Receptores de Estrgenos

Se conocen dos subtipos: RE y . Provienen de diferentes genes y asu vez expresan isoformas mediante splicing alternativo.

Se encuentran en el ncleo y en el citoplasma, hasta que se producela unin con el ligando. Una vez unido el ligando se produce ladimerizacin (hetero u homodimerizacin)

Mecanismo Clsico (el ms estudiado):El complejo E2-RE se une directamente al EREs en los promotores gnicos.

Mecanismo de Unin Indirecto al ADN : Accin Genmica independiente del ERE. Interacciones protena-protena con otros factores de transcripcin (SP1).

Accin Genmica independiente de ligandoCiertos factores de crecimiento activan la cascada de la protein-quinasa llevando a la fosforilacin del RE al ERE.

Mecanismo No Genmico:Acciones mediadas por los RE asociados a la membrana.

ER ER

ERE

ERTF

ER ERP P

X

TFP

Interacciones Receptor de Estrgenos-ADN

Receptores de

Estrgenos

Asociacin con otros factores de transcripcin

Unin Directa con ERE como homo o heterodmeros


ER ER

ERER

Muchas Gracias!

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