UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ

FACULTAD DE CIENCIAS MATEMÁTICAS, FÍSICAS

Y QUÍMICAS.

CARRERA DE ING. QUÍMICA

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DE LA CÁTEDRA DE

BIOPROCESOS

AUTORES:

BARREIRO CHERREZ JAIME ANDRES

ZAMBRANO ROMERO CARLOS JAVIER

MENDOZA CARREÑO CARLOS ALBERTO

HUIZA MENENDEZ JHON FERNANDO

CATEDRÁTICO:

Ing. Ulbio Alcívar

FECHA DE ENTREGA:

Portoviejo, 01 de Septiembre del 2015

TEMA: BIOPRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO A PARTIR DE

RESIDUOS DE CÁSCARA DE NARANJA: PROCESOS DE

SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

1. ANTECEDENTES

Los sistemas productivos actuales tienden a un aprovechamiento lo más completo posible de

las materias primas, ya que se considera que la generación de subproductos no aprovechables

supone una pérdida económica que puede llegar a ser muy importante cuando se trabaja en

sectores como la industria alimentaria donde los márgenes comerciales son muy pequeños,

esta materia prima de bajo costo se utiliza en procesos biotecnológicos para la obtención de

productos químicos finos que se perfila como una opción atractiva para reducir la

dependencia del petróleo y, al mismo tiempo, obtener nuevos compuestos que son económica

o técnicamente inviables de obtener por síntesis química.

En el Ecuador, la provincia que posee mayor producción de naranja es Manabí especialmente

en los cantones Chone y Flavio Alfaro. La producción de la naranja en el país ha aumentado

en los últimos años, de acuerdo a la fuente del Instituto Nacional de Estadísticas y Censos, en

el país se genera un gran volumen de desechos sólidos (cáscara y bagazo), producto de la

obtención de jugo de naranja dulce, siendo deseable su aprovechamiento para la producción

de productos de alto valor agregado y la eliminación de una fuente de contaminación

importante. Actualmente, existen varios estudios encaminados al aprovechamiento de la

fracción sólida de la naranja, como substrato de bio reacción en fase sólida para la producción

a bajo costo de ácidos orgánicos, particularmente ácido L (+) láctico

2. JUSTIFICACIÓN

En la actualidad han aumentado los esfuerzos en la investigación de la producción del ácido

láctico, enfocados a disminuir costos a través de nuevos sustratos, nuevas tecnologías de

fermentación y separación, así como también nuevos microorganismos capaces de alcanzar

altas concentraciones de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades, esto es

debido al uso tan versátil que posee.

El ácido láctico es el hidroxiácido más sencillo que existe. Su molécula contiene un átomo de

carbono asimétrico. Presenta isomería óptica: L(+) o D(-), aunque es más común encontrarlo

como mezcla racémica. Está presente en alimentos como yogurt, suero de leche, panes, queso

y muchos otros alimentos fermentados (Menéndez-González, 1999) y es uno de los

principales intermediarios metabólicos en la mayoría de los organismos vivos, desde

procariotas anaerobios hasta humanos. El ácido láctico es ampliamente utilizado en las

industrias alimentaria, médica, farmacéutica y cosmética, como materia prima para síntesis

orgánica, como purgante en forma de lactato de calcio o lactato de magnesio, como

removedor de sales de calcio, en el curtido de pieles, en la producción de plásticos

biodegradables, agroquímicos, etc. En soluciones acuosas, el ácido láctico no ionizado existe

en equilibrio con los aniones lactato y los iones hidrógeno (Kulprathipanja y Oroskar, 1991).

Es fuertemente higroscópico y la presencia de dos grupos funcionales en su estructura (-OH, -

COOH) lo hace formar, espontáneamente, dímeros y polímeros de ácido láctico (Bello-Gil,

2007). Es soluble en éter, miscible con agua y alcohol e insoluble en cloroformo, éter del

petróleo y disulfuro de carbono. Sus dos grupos funcionales permiten llevar a cabo diferentes

reacciones químicas de oxidación, reducción, condensación y substitución del grupo alcohol

(Vaidya y col., 2005). En cuanto a las reacciones de condensación, las más importantes, por

los altos rendimientos de producto, son: Esterificación, deshidratación y aminólisis

(KirkOthmer, 2001). El ácido láctico puede producirse por biotransformación (biorreacción) o

síntesis química. Normalmente, la síntesis química requiere de caros y complejos

procedimientos de obtención y separación para lograr la pureza deseada del producto final, así

como costos significativos asociados con la disposición de los desechos (Yin y col., 1997). La

producción de ácido láctico se ha incrementado en épocas recientes, llegando a alcanzar en el

año 2002 una producción mundial de 100,000 ton/año en los sectores farmacéutico, cosmético

y químico (Purac, 2002).

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

• Desarrollar experimentalmente un proceso de obtención de ácido L (+) láctico por

medio de la biotransformación utilizando el microorganismo (Rhizopus spp.) en

medio sólido a partir de residuos de naranja

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Estudiar los distintos métodos de remoción de color e impurezas en el efluente,

tomando en cuenta el grado de perdida de ácido láctico que provocan.

Evaluar procesos de separación solido-liquido determinando cual es el método más

efectivo para la recuperación de la fas liquida del producto de la bioreaccion.

Calificar el proceso de producción de ácido láctico, a partir de la

fermentación de residuos de naranja por (Rhizopus spp.), a través de cinéticas de

producción de biomasa y ácido láctico, y de consumo de sustrato para demostrar que

el proceso es técnicamente viable.

4. HIPÓTESIS

H1: Existen microorganismo (Rhizopus spp.) capaces de producir acido L (+) láctico a partir de

residuo de naranja

H0: No existen microorganismo en medio solido productores de ácido L (+) láctico

5. VARIABLES

Variables Independientes

Variables Dependientes Temperatura

Cinética microbiana

PH

Producción de ácido láctico

Producción de biomasa

6. REVISIÓN DE LITERATURA

ÁCIDO LÁCTICO

Generalidades

El ácido láctico o ácido 2-hidroxipropanoico (CH3CHOHCOOH), fue aislado e identificado por

el químico Scheele en 1780 de leche agria, en 1847 fue reconocido como producto de fermentación

por Blondeaur, sin embargo no fue hasta 1881 que Littlelon inicio la producción por fermentación a

escala mundial (Altiok et al., 2006, Serna y Rodríguez, 2005).

Molécula de ácido láctico vista desde diferente perspectiva

El ácido láctico tiene un carbono asimétrico (Figura 1) lo cual da lugar a actividad óptica. Existen dos

isómeros ópticos, el D(-) ácido láctico y L(+) ácido láctico, además de una forma racémica

constituida por fracciones equimolares de las formas L(+) y D(-). A diferencia del isómero D(-), la

configuración L(+) es metabolizada por el organismo humano (Altiok, 2004). Tanto las dos formas

ópticamente activas como la forma racémica se encuentran en estado líquido, siendo incoloros y

solubles en agua. En estado puro son sólidos altamente higroscópicos de punto de fusión bajo, el cual

es difícil de determinar debido a la extrema dificultad de producir el ácido de forma anhidra; es por

esta razón que se manejan rangos de 18- 33°C. El punto de ebullición del producto anhidro esta

entre 125-140°C. Ambas formas isoméricas del ácido láctico pueden ser polimerizadas y se pueden

producir polímeros con diferentes propiedades dependiendo de la composición. Las propiedades

fisicoquímicas del ácido láctico se muestran en la Tabla 1 (Serna y Rodríguez, 2005).

Aplicaciones

Actualmente la demanda mundial de ácido láctico está en aumento, debido a sus

múltiples aplicaciones en el campo alimentario y no alimentario, en especial en la fabricación

de biopolímeros (Cui et al., 2012). Esto se debe en gran medida por la propiedad única de

tener presente en su estructura un grupo ácido carboxílico y un hidroxilo, lo cual hace

posible su participación en una ampliavariedad de reacciones químicas como

esterificación, condensación, polimerzación, reducción y sustitución, y esto contribuye a su

gran potencial como plataforma química para una amplia gama de productos con extensas

aplicaciones industriales (Altiok 2004; Pal et al., 2009).

El ácido láctico se utiliza en muchos alimentos; en su mayoría es empleado para la

producción de emulsificantes, aditivos alimentarios, aplicaciones farmacéuticas y de

cosméticos. Es un ácido orgánico muy importante con un gran mercado debido a sus

múltiples propiedades (Altiok et al., 2006). Por ejemplo, el ácido láctico y sus sales son

preferidos a otros ácidos orgánicos en la industria de alimentos ya que no dominan otros

sabores, es no volátil, no tiene olor y es clasificado como GRAS por la FDA en Estados

Unidos y por otras agencias reguladoras en otros países, algunos de sus usos es como

conservador, acidulante y potenciador de sabor en muchos alimentos o bebidas (ej., cerveza,

gelatina, quesos, entre otros) (John et al., 2007). Por otra parte, la posibilidad de la conversión

directa de ácido láctico a ácido acrílico, lo ha convertido en una importante materia prima

para la industria química (Alonso et al., 2010).

Recientemente la producción de plásticos biodegradables a partir de ácido láctico ha

acelerado la investigación sobre su producción como materia prima a granel (Altiok et

al., 2006). Algunos ejemplos de productos derivados del ácido láctico que han tenido una

gran demanda en los últimos años, son: termoplásticos biodegradables (ej., ácido poliláctico),

solventes verdes (ej., etil, propil, butil) y químicos oxigenados (ej., glicol de propileno) (Pal

et al., 2009; Young-Jung y Ryu, 2009).

Producción mundial

La producción mundial de ácido láctico en 2011 fue mayor a 300 000 toneladas y se estima

un incremento promedio del 10% anualmente (Higson, 2011). En la última década,

la producción de ácido láctico ha crecidoconsiderablemente, debido principalmente al

desarrollo de nuevas aplicaciones del ácido láctico, como la síntesis de ácido poliláctico y al

avance de tecnologías para su producción, donde el 90% de la producción se lleva a cabo

mediante procesos de fermentación (Cui et al., 2012).

Las principales empresas manufactureras de ácido láctico en el mundo incluyen a CCA

Biochemical BV con plantas en Europa, Brasil y Estados Unidos, Archer Daniels Midland

(ADM) y NatureWorks LLc en Estados Unidos, Musahino Chemical en Japón, Purac en

Holanda, Galactic en Bélgica, entre otras. Las cuales emplean vías tecnológicas para la

producción de ácido láctico (Datta y Henry, 2006; John et al., 2007).

Procesos de producción

El ácido láctico puede ser producido por síntesis química o biotecnológica. La producción

química, está basada en la reacción de acetaldehído con ácido cianhídrico (HCN) lo cual

produce un lactonitrilo que puede ser hidrolizado a ácido láctico (Amrane y Prigent, 1994).

Otro tipo de reacción se basa en la reacción a alta presión de acetaldehído con monóxido de

carbono y agua en presencia de ácido sulfúrico como catalizador (González et al., 2008). Este

proceso es costoso debido a que el petróleo es la base de la materia prima. Además que, las

rutas de la síntesis química producen una mezcla de L-ácido láctico y D-ácido láctico. Los

problemas de alto costo de materia prima así como la dependencia de otras industrias para su

obtención aunado a la impureza del producto, hacen de los procesos basados en

fermentaciones la mejor opción para producir ácido láctico (Narayanan et al., 2004; Fontes et

al., 2010).

La producción biotecnológica está basada en procesos de fermentación de sustratos ricos

en carbohidratos por bacterias u hongos, y tiene la ventaja de formar enantiómeros D(-) y/o

L(+), ópticamente activos, o una mezcla racémica, dependiendo del microorganismo

involucrado en el proceso, la inmovilización o recirculación del microorganismo, el pH, la

temperatura, la fuente de carbono y nitrógeno, el modo de fermentación empleado y la

formación de subproductos, siendo de mayor interés el isómero (L) porque puede ser

asimilado por el organismo y la mezcla racémica, la cual se emplea para la elaboración de

polímeros y para uso industrial (Hofvendahl y Hanh, 2000; Litchfield, 2009).

Ambos métodos para la producción de ácido láctico, químico y biotecnológico, son

asequibles, sin embargo la producción biotecnológica ofrece un gran número de ventajas

comparada con la síntesis química como el bajo costo de sustratos, temperaturas de operación

moderadas, y bajo consumo de energía (John et al., 2007). Por otra parte, la producción de

ácido láctico por procesos de fermentación ha incrementado su demanda de mercado,

particularmente en industrias alimentarias, dado a la preferencia de productos de origen

natural por parte de los consumidores, así como también en la industria de polímeros, debido

a las perspectivas de respeto al medio ambiente y por el uso de fuentes renovables en

lugar de petroquímicos (John et al., 2007).

Recientemente se ha investigado la aplicación de diferentes microorganismos en los

procesos de fermentación, así como mezclas de éstos con el objetivo de alcanzar altas

concentraciones de ácido láctico, altos rendimientos y altas productividades en un menor

tiempo. Los microorganismos mayormente investigados se encuentran dentro del grupo de las

bacterias ácido lácticas (BAL) como el Lactobacillus helveticus y más recientemente el

Lactobacillus casei (John et al., 2007).

RHIZOPUS SPP

Rhizopus es un género de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en

el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos.

Diagrama equemático de Rhizopus spp

Las especies de Rhizopus producen esporas asexuales y sexuales.

Las esporangiosporas asexuales se producen dentro de una estructura aguzada, el

esporangium, y son genéticamente idénticas a su padre. En Rhizopus, el esporangio es

soportado por una gran columela apofisada, y el esporangióforo asoma entre rizpodes

distintivos. Zigosporas negras se producen después de dos fusiones compatibles

de micelios durante la reproducción sexual. Y hacen colonias que pueden ser genéticamente

diferentes de sus padres.

Algunas spp. de Rizopus son agentes oportunistas de zigomicosishumana. Pueden causar

serias (y con frecuencia mortales) infecciones en humanos y en animales debido a su rápido

crecimiento a relativamente altas temperaturas. Algunas especies son patógenos vegetales.

Dos son usados en fermentación:Rhizopus oligosporus, en la producción de tempeh, un

alimento fermentado derivado de grano de soja; R. oryzae se usa en la producción de bebidas

alcohólicas, en partes de Asia y de África. Hongo filamentoso que presenta esporangióforos

sin ramificar (de hasta 2 mm x 20 µm), de color pardo oscuro que nacen de un gran nudo de

rizoides bien desarrollados. Esporangios esféricos negros (de hasta 275 µm de diámetro) con

columela. Esporangiosporas negras de 8 a 15 µm. Abundantes rizoides y zigosporas esféricas

de pared gruesa, desnuda (de hasta 200 µm de diámetro). Clamidosporas ausentes.

7. DISEÑO METODOLÓGICO

7.1. MÉTODO

La metodología de investigación que se va a aplicar tiene un enfoque de tipo cualitativo, el

cual usa la recolección de datos.

7.2. TÉCNICA

Las diferentes técnicas de ensayo de laboratorio se conoció de la metodología descrita en la

literatura (Gil-Horán, 2007; Pacho-Carrillo y Domínguez-Espinosa, 2005).

7.3. TÉCNICAS DE ANÁLISIS

Las técnicas a ser utilizadas se resumen a continuación con un breve procedimiento y fórmulas

a utilizar.

7.4. MATERIALES Y MÉTODOS

La cepa utilizada fue Rhizopus oryzae, que ha sido usada para producir ácido láctico.

Se utilizó la fermentación en estado sólido) de cáscara y bagazo de naranja con Rhizopus

orizae para la producción de ácido láctico, se llevó a cabo en un birreactor de 500ml

siguiendo la metodología descrita en la literatura (Gil-Horán, 2007; Pacho-Carrillo y

Domínguez-Espinosa, 2005). Lotes de 400 g de harina de naranja fueron adicionados con

(NH4)2SO4 como fuente de nitrógeno y CaCO3 como regulador de pH para ajustar el pH

inicial a 5

Los residuos sólidos de naranja que fueron obtenidos del mercado número 1 de Portoviejo

fueron cortados y los dejamos secar hasta alcanzar una humedad de 12% (base seca). Y

cortadas en pequeñas partículas

Los residuos de naranja fueron colocados dentro del birreactor junto con la solución de espora

durante un periodo de 8 días a 37ºC

Para la extracción del ácido de la materia sólida se lo hizo por prensado mecánico,

posteriormente se utilizó operaciones de intercambio iónico (zeolita catiónica ácida y/o

carbón activado) como pasos intermedios para la reducción de impurezas.

Luego de la biorreacción, se obtuvo ácido láctico en forma de lactato con un pH 3.4 y Así

mismo, el producto sólido obtenido presentó un exceso de azúcares no consumidos por el

Rhizopus oryzae.

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Luego de la biorreacción, se obtuvo ácido láctico en forma de lactato de calcio. El

producto obtenido presentó un pH de 3.4 con alto grado de hidrólisis. El rendimiento

másico obtenido de ácido láctico en la biotransformación fue de 8.2 mg/g equivalente al

0.82%.

La duración de la biorreacción de 192h puede ser extendida para lograr una mayor hidrólisis

del material biotransformable; sin embargo, para el propósito de esta investigación, que no

era el de optimizar esta fase del proceso, el tiempo de biorreacción definido fue adecuado

para producir cantidades adecuadas del producto. Naturalmente, se tuvo la desventaja de la

presencia de los productos no deseados de la hidrólisis del material biotransformable como

azúcares, proteínas, ácidos orgánicos secundarios, cationes Ca+2 y NH +1 y aniones CO3-2

y SO4 así mismo el producto solido obtenido presentó un exceso de azúcares no consumidos

por el Rhizopus oryzae (13,722.95 ppm p/v), el cual también debe tomarse en cuenta para

una segunda etapa de optimización de la biotransformación a nivel de laboratorio.

En las pruebas de separación sólido-líquido resultó que el mejor método para la recuperación

de la fase líquida del producto de biorreacción fue el prensado mecánico. Adicionalmente, se

obtuvo que la máxima cantidad de agua que puede ser utilizada para la homogeneización del

producto sólido para la posterior recuperación de la fase líquida es de 8 mL por cada gramo de

sólido en base seca obteniendo así una recuperación máxima en el prensado mecánico del 85%

del ácido láctico producido en la biotransformación.

PRENSADO MECANICO

CENTRIFUGACION FILTRACION0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

%DE

REC

UPER

ACIO

N DE

ACI

DO LA

CTIC

O

OPERACION PRINCIPALES IMPUREZAS

RETENIDAS

ACIDO LACTICO

% DE PERDIDA

CARBON ACTIVADO Azúcares, ésteres, proteínas,

Ca+2, color, ácidos orgánicos

secundarios

33.12

ZEOLITA CATIONICA NH+1 y Ca+2, proteínas, ácidos

orgánicos

58.16

CA + ZC Todas las anteriores 62.66

( Tecnol.  Ciencia  Ed.  (IMIQ)  vol.   23  núm.  2,,   2008)

9. CONCLUSIONES

Se desarrolló experimentalmente un proceso de obtención de ácido L(+) láctico por medio

de la biotransformación en medio sólido de residuos de naranja. En este proceso la

biotransformación y la secuencia de separación juegan papeles muy importantes en el diseño. El

prensado mecánico resultó ser la mejor operación de separación sólido-líquido, utilizada en

conjunto con una relación de homogeneizado de 8:1 agua-sólido en base seca para la extracción

del ácido láctico hacia la fase líquida. Así mismo, en base a la literatura de Ricardo

Heliodoro Gil-Horán, Rosa María Domínguez-EspinoSA , Juan Daniel Pacho-Carrillo se

mostró que es indispensable el uso de carbón activado como método de remoción de color e

impurezas en el efluente. Por otro lado, aunque la zeolita catiónica demostró ser adecuada para la

remoción de impurezas, no se recomienda su uso debido al alto grado de pérdida de ácido láctico

que provoca.

El diseño de fermentación y separación propuesto permitió obtener como producto final

lactato de calcio que al pasar por esterificación debe cumplir los estándares para ácido

láctico grado alimenticio, demostrándose que el proceso es técnicamente viable.

10.RECOMENDACIONES

Se recomienda llevar a cabo estudios más detallados encaminados a obtener mejores

condiciones de biorreacción que lleven al Rhizopus oryzae a consumir los azúcares degradados

durante la hidrólisis de la cáscara de naranja, y que, al mismo tiempo, permitan ofrecer un mayor

rendimiento de producción de ácido láctico durante su desarrollo. Asimismo, la optimización global

del proceso debe LLEVARSE A CABO EN PARTICULAR atendiendo al entorno económico

actual que ofrece incentivos económicos claros para el establecimiento de biorrefinerías.

11.BIBLIOGRAFIA

Menéndez-González, I. 1999. Obtención de ésteres de ácido láctico de interés industrial. Proyecto Fin de Carrera. Universidad de Oviedo. Oviedo, España

Purac. 2002. Lactic acid. Technical Report. Enero 3, 2002. Amsterdam, Países Bajos. Miura, S., Arimura, T., Hocino, M., Dwiarti, L., Okabe, M. 2003. Optimization and scale-up of L(+) lactic acid fermentation by mutant strain Rhizopus sp.

MK-96-1196 in airlift bioreactors. J. Biosci. Bioeng. Pacho-Carrillo, J., Domínguez-Espinosa, R. 2005. Towards circular economy: Utilization

of waste to enhance industrial viability in tropical regions. Presentado en 7th World Congress of Chemical Engineering, Glasgow, Escocia.

Ramachandran, S., Roopesh, K., Nampoothiri, K., Szakacs, G., Pandey, A. 2004. Mixed substrate fermentation for the production of phytase by Rhizopus spp. using oilcakes as substrates. Process Biochem.

Skory, C. 2000. Isolation and expression of lactate dehydrogenase genes from Rhyzopus oryzae. Appl. Environ. Microbiol.

Saito, K., Kawamura, Y., Oda, Y. 2003. Role of the pectinolytic enzyme in the lactic acid fermentation of potato pulp by Rhizopus oryzae. J. Ind. Microbiol. Biotechnol

Soccol, C. R., Stonoga, V. J., Raimbault, M. 1994. Production of L-Lactic acid by Rhizopus species. World J. Microbiol. Biotechnol.

Vaidya, A. N., Pandey, R. A., Mudliar, S., Suresh Kumar, M., Chakrabarti, T., Devotta, S. 2005. Production and recovery of lactic acid for polylactide. An overview. Crit. Rev. Environ. Sci. Technol.

Zacchi, G., Akerberg, C. 2000. An economic evaluation of the fermentative production of lactic acid from wheat flour. Biores. Technol.

Lactic acid bioproduction from orange rind:Separation and purification processesRicardo Heliodoro Gil-Horán, Rosa María Domínguez-Espinosa, Juan Daniel Pacho-Carrillo