Mtodos para la Identificacin Microbiana

Mtodos para la Identificacin MicrobianaBioq. Federico NicolaCEMICSub-Comisin de Antimicrobianos (SADEBAC)Transporte

Comunicacin

Rol actual del profesional bioqumico en el campo de la salud. Perspectiva en la prctica y formacin profesional Primer Congreso Bioqumico del Litoral, Santa Fe 2011 Bioq. Federico Nicola

Laboratorio de MicrobiologaRol actual del profesional bioqumico en el campo de la salud. Perspectiva en la prctica y formacin profesional Primer Congreso Bioqumico del Litoral, Santa Fe 2011 Bioq. Federico NicolaLaboratorio (Qumica clnica)

Nuevas tecnologas aplicadas a la microbiologa clnicaMtodos rpidos para la deteccin de antgenos

Sistemas miniaturizados para identificacin y sensibilidadMedios de cultivo cromognicosEquipos automatizados para hemocultivosSistemas automatizados para identificacin y sensibilidadPCRReal-time PCRMicroarrays

Rol actual del profesional bioqumico en el campo de la salud. Perspectiva en la prctica y formacin profesional Primer Congreso Bioqumico del Litoral, Santa Fe 2011 Bioq. Federico NicolaSecuenciacinMedios de CultivoBaseEnriquecidoDe EnriquecimientoDiferencialSelectivoSelectivo y DiferencialCromognicos

Metodologa utilizada para la Identificacin microbianaFenotpicosManualesGaleras Multi-pruebasAutomatizadosSerolgicosMolecularesRibotipificacinSecuenciacinPirosecuenciacinProtemicaMtodos FenotpicosMorfologa celular y caractersticas de las coloniasPruebas inmediatas (segundos a pocos minutos)Pruebas rpidas (hasta 4-6 hs)Pruebas lentas (18-48 hs)Pruebas de inhibicin o sensibilidad

En el proceso de identificacin bacteriana tradicional, la experiencia del microbilogo es fundamental para la eleccin de una prueba o una batera de pruebas de forma secuencial, en funcin de la fiabilidad de las mismas, del gnero o de la especie bacteriana que se pretende identificar, del origen del aislado bacteriano, as como del costo de las mismas. Los laboratorios deben elaborar y realizar un proceso de identificacin normalizado en su actividad diaria, que utilice de forma secuencial o simultnea un conjunto de pruebas cuyo propsito final sea la identificacin del microorganismo a nivel de gnero y especie y que incluya la mayora de las bacterias desde el punto de vista infeccioso.Mtodos Fenotpicos

Algoritmo inicial para la identificacin de Bacilos gram-Negativos No Fermentadores (BNNF)Ox+ Mov+Oxidan GlucosaOx+ Mov -1243Curso a Distancia sobre Bacteriologa Clnica 2010 Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy Ox - Mov Ox - Mov+Oxidan GlucosaOx+ Mov+NO Oxidan Glucosa5OxidasaINICIOMovilidadGlucosa O.F.Achromobacterxylosoxidanssbsp. xylosoxidans Curso a Distancia sobre Bacteriologa Clnica 2010 Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy Oxidasa +Movilidad +Glucosa + (oxida)FluorescenciaPigm. verdeP. aeruginosa++--ColistinRScomplejoBurkholderia cepaciaSphingomonas Agrobacteriumgpo. amarilloPig. amarilloP. aeruginosaP. fluorescensP. putidaSub-Grupo AIdentificacin de BNNF del Grupo 1(Oxidasa + / Movilidad + / Oxidan Glucosa) 1Lisina +ONPG +Pseudomonas spp.y otras bacterias infrecuentesSH2 +(TSI)Shewanella spp.Roseomonas spp.Methylobacterium spp.Pig. rosadoLisina -ONPG -Arginina -Nitrato +Esculina -Xilosa +Maltosa -PsBuGlucosa(oxidacin)NitratoPigmento verdeFluorescenciaIdentificacin de BNNF Pseudomonas spp.(Movilidad +)PsGelatina +/-Crecimiento a 42CP. aeruginosa++/--+++/--++-Curso a Distancia sobre Bacteriologa Clnica 2010 Bioq. Federico Nicola - Col. Bioq. Pcia. Bs. As. y Univ. Kennedy P. fluorescensP. putidaP. stutzeriP. mendocinaArgininaP. alcaligenesP. pseudoalcaligenes++++----------+---+--/++++/--+----+++-+-+--++++/-Hidrlisis deAcetamidaAlmidn+-+-----------+Oxidasa P. luteolaP. oryzihabitans+++++--++++----+--/+-/++/-----+/---++Esculina------+--FUNDAMENTOS DE LA IDENTIFICACIN FENOTPICALa identificacin fenotpica bacteriana se basa fundamentalmente en la comparacin de las caractersticas fenotpicas de bacterias desconocidas con aquellas de cultivos tipo. La fiabilidad de la identificacin est en proporcin directa al nmero de caractersticas similares. En Microbiologa Clnica, la experiencia y asociacin entre el microorganismo y el sitio y tipo de infeccin es de gran ayuda en la identificacin preliminar.Galeras Multi-Pruebas

Video DEMO APIAPI (bioMrieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID systems (Microgen), etc.Video DEMO EnterotubeVideo DEMO Rapid IDSistemas comerciales automatizadosTarjetas multipruebas cuya inoculacin, incubacin y lectura se efectan de modo automatizado. Tambin hay paneles en los que, adems de los sustratos para las pruebas bioqumicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza simultneamente la identificacin y antibiograma del microorganismoMicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc.Video Demo Vitek 2Mtodos MolecularesHibridacin Fluorescente in situ (FISH)

Figure 1. Diagram of a molecular beacon. The hairpin structure contains a fluorescent signal molecule on one end and a signal quencher on the other end. If the probe comes into contact with a PCR product with a complementary nucleic acid sequence, the probe opens up and binds to the PCR product, thus separating the fluorescence-reported dyefrom the quencher, which results in a measurable fluorescent signal.Hibridacin Fluorescente in situ (FISH)

S aureus PNA FISH: sobre muestras de hemocultivos, usa hibridizacin in situ frente a S aureus 16 S rRNA.S:100, E:99.4, VPP:99.4 y VPN:100%Gonzalez Padilla E y col, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 23, 396-8, 2004Takaashi M et al, 1025-8, 2007

Deteccin rpida de ESBL en K pneumoniae usando hibridizacinin situ . TAT: 1 horaPalasubramaian S et al, J Microbiol Methods, 72, 107-9, 2008Utilizacin de PNA FISH para detectar S aureus directo sobre muestras de hemocultivos fue asociado con reduccin de mortalidad (8 vs 17%) ,reduccin de das cama y costos Tam Ly et al, Therap Clin Risk Man, 4(3), 637-640, 28

DNA Microarrays (Microchips)

DNA Microarrays (Microchips)MiniVideoAplicaciones de Microarrays en Microbiologa ClnicaMicrobial Detection and Identificationhuman intestinal bacterial pathogens in human fecal samplesidentification of respiratory pathogensrapid diagnosis of bloodstream infectionsto identify pathogenic yeasts and moldsAntimicrobial ResistanceMRSAdetection of M. tuberculosis strains resistant to rifampin, isoniazid, kanamycin, streptomycin, pyrazinamide, and ethambutolHIV-1 antiretroviral-drug-resistant profiles

PCR PCR MltipleMultiplex permiti identificar 24 organismos adicionalesHemocultivo detect ms bacterias que PCRAmbas tcnicas se complementan Tsalik E et al, JCM, 48: 26-33, 2010 Carver y col estudiaron el impacto clnico de la deteccin del gen mecA directo del cultivo (24 hs antes) en pacientes con bacteriemias por S aureus en dos fases. 64 pac MSSA y 103 con MRSA tratamiento adecuado tardo se asoci a mayor mortalidad relacionada a infeccin y das cama.Carver P et al , JCM, 46, 2381-83, 2008 Ruimy et al usando triplex PCR directo sobre hemocultivosdiferencia S. aureus de SCN y detecta gen mecA evita uso de glucopptidos en 33% de los pacientes. Ruimy R et al, JCM, 46,2045-51, 2008PCR en Tiempo RealLa PCR en tiempo real permite detectar los microorganismos que provocan alrededor de un 90% de las bacteriemias Pfaller, M.A., et al. Diagn Microbiol Infect Dis 1999;33:283-97. Kolleff, M.H., et al. Chest (1999); 115: 462-74.

Video Demo LightCycler RocheSecuenciacinARNr 16SMarcador housekeeping presente en todas las bacterias. Familia de multigenes u operones cuya funcin no se modifica con el tiempo, con un alto grado de conservacin, y acta como un marcador eficiente de evolucin (cronmetro molecular ). Posee regiones altamente conservadas (primers) y regiones variables especie-especficas.Tamao adecuado para realizar el anlisis de la secuencia de sus bases. Proporciona informacin til y rpida sobre identificacin y filogenia mediante la comparacin con bases de datos pblicas (GenBank) que contienen un amplio nmero de secuencias bacterianas (ms de 2 millones !!).Otros genes utilizadosARNr 16S-23S (ITS = espacio intergnico)ARNr 23SrpoB (subunidad de la ARN polimerasa)gyrB (subunidad de la ADN girasa)

Hps65 (micobacterias)recA (genovariedades de B. cepacia complex)hsp60 (bacterias, arqueas y eucariotas)Secuenciacin

Recomendaciones Cepas a SecuenciarCepas con escasa descripcinCepas con baja frecuencia de aislamientoCepas con fenotipos atpicosCepas de difcil identificacin fenotpicaCepas de crecimiento lento o fastidiosoNuevos patgenosBacterias de difcil cultivoPirosecuenciacin

Figure 2. Schematic diagram of a pyrosequencing reaction, in which light is emitted as each specific base is incorporated into the growing DNA sequence. The light signals are translated into sequence data. ATP, adenosine triphosphate; (d)XMP, deoxynucleotic monophosphate; dXTP, deoxyxanthine triphosphate; PPi, inorganic pyrophosphate.

PirosecuenciacinMetagenmicaStudy diversity in environmental microbial communities using the GS FLX and GS Junior Systems. 454 Sequencing Systems have become the standard for ribosomal RNA identification (i.e. 16S, 18S, etc.) and whole genome surveys having enabled an unprecedented view of microbial diversity in such environments as the human gut and mouth, soil, coral reefs, deep sea thermal vents, drinking water, and much more. The clonal reads provided by 454 Sequencing Systems enable population characterization without laborious cloning protocols.Analyze the relative abundance of microbial species under varying environmental conditionsDiscover new genes and make functional predictions in unculturable speciesPerform gene expression analysis and functional annotation within microbial communitiesIdentify novel pathogens in viral outbreaks by sequencing fragments of amplified RNA from infected individualsTake advantage of the long read lengths to generate the most accurate representation of samplesVideo Demo Secuenciador 454 RocheVideo Demo Secuenciador GenomaLa protemica es el estudio y caracterizacin del conjunto de protenas expresadas por un genoma (proteoma). Las tcnicas de protemica abordan el estudio de este conjunto de protenas y las ms usadas se basan en la electroforesis y en la espectrometra de masasProtemicaMALDI-TOFMatrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)La espectrometra de masas es una tcnica analtica que permite analizar con gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos al permitir la medicin de iones derivados de molculas separndolos en funcin de su relacin masa/carga (m/z)Se basan en la deteccin de protenas ribosmicas S y L (2.000 a 20.000 Da). Se asume que el 80-90% de las seales del espectro de la bacteria son protenas ribosomales.

MALDI-TOF La muestra debe estar embebida en una matriz orgnica. Como fuente de ionizacin emplea un lser. La separacin de los iones se produce segn el tiempo de vuelo. El tiempo de obtencin del espectro es aproximadamente de un MinutoVideo Demo MALDI-TOFLas caractersticas principales de estos sistemas son las siguientes:- Sin procedimiento previo de extraccin => Se utiliza directamenteuna colonia bacteriana. Comparan perfil o huella espectral desconocida frente a las debacterias conocidas => Comparacin de espectros generados con bases de datos previas. Rapidez de la tcnica (aproximadamente 90 microorganismos/hora). Identificacin a nivel de gnero y especie, en ocasiones subespecies.

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