BIOSENSORES PARA LA

DETECCIÓN DE MERCURIO EN

SUELOS CONTAMINADOS

Lucy L. Coria OriundoTecnologías de Remediación Ambiental

Dr. Adolfo La Rosa Toro Gómez

ESQUEMA DE LA PRESENTACIÓN

Resumen Introducción Materiales y Métodos

Muestras de Suelos

Biosensores de células

Biosensores de proteínas

Plantas sensor

Sensor iso-enzima

Análisis de Hg total en plantas y muestras de suelo

Resultados y Discusiones

Plantas sensor

Biosensores de células

Biosensores de proteínas

Conclusiones

RESUMEN

Biosensores: Conjunto de células bacterianas y proteínas bacteriales que enlacen a metales

pesados.

Muestra: Recolectada de un jardín

contaminado desde hace 25 años.

Sensores: Biosensor basado en proteínas,

basado en conjunto de células bacterianas y un sensor de plantas.

La concentración de mercurio total es comparada con la obtenida por AAS.

INTRODUCCIÓN

EL MERCURIO un metal sumamente

usado y alarmantemente

tóxico.

Las plantas pueden tomar metales pesados del suelo por medio de su raíz. Crecen en un medio contaminado de elevadas concentraciones de metales.

Métodos clásicos: AAS, AFS, AES, ICP-SM.

Métodos Electroquímicos: ISE, ASV, PSA, CSP, DPV.

Mercurio biodisponible: parte de la cantidad total que esta disponible para

el organismo vivo.

Se muestran métodos para la

determinación de Hg biodisponible en

muestras de suelo, con diferentes tipos

de sensores, y la comparación de

resultado de Hg total por AAS

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras de Suelos

En 1997, se recolectaron muestras de suelo de un jardín contaminado en Denmark, donde fue derramada Hg por accidente.

Tam

izad

o: 2

mm

(4ºC

)

Mez

cla

y ho

mog

eniz

ació

n:

10 m

uest

ras

pH =

6.5

Figura Nº1: Tratamiento de la muestra.

Tabla Nº1: Características del suelo en peso seco.

Conjunto de células bacterianas

El gen lux fue fusionado con un gen mer para

inducir Hg, e introducidos en Escherichia Coli

(CM2624). Las cepas fueron almacenadas congeladas y

secas.

La cepa resultante emitía luz en presencia de iones

mercurio.

La muestra de suelo se suspendió en un medio de reconstitución (RM). La bioluminiscencia se

mide después de 5 horas de incubación usando un

luminómetro ANTHOS LUCY1 a 23°C.

Biosensor de proteínas

Se trabaja con la fusión de proteínas GST-SmtA.

- Se auto-ensambla una monocapa de ácido tióctico sobre un electrodo de Au.- Tratamiento con 1-decanotiol

Construcción del Biosensor

- Electrodo de trabajo: Biosensor- Contralectrodo: Pt- Electrodo de Referencia: Ag/AgCl- Electrolito: Buffer de borato, pH 8.75- Velocidad de flujo: 0.25mL/min- Muestras: Relación Buffer-Suelo 1:1

Sistema Electroquímico

- Parámetro evaluado: Capacitancia- Pulso de potencial: 50mV

- Frecuencia de toma de datos: 50 kHz- Total de valores: 10

Análisis Electroquímico

Plantas Sensor

Se evaluaron los suelos con potencial fitotoxicidad usando diferentes

bioensayos (Morfológicos – bioquímico)

El frijol fue usado como planta de prueba. En esta prueba se integra

completamente la fitotoxicidad debido a la alta sensibilidad y especificidad sobre los parámetros morfológicos y

bioquímicos.

Las semillas se sumergieron en agua durante 1,5 días, y se plantaron con

500g de suelo contaminado con Hg. Se cultivaron a 22°C y 65% de humedad.

Después de 2 semanas, se cosecharon, y se congelaron o secaron al aire a T

ambiente.

Análisis de Iso-enzima

- Tejido vegetal congelado, 0.1M de Tris-HCl, 1mM de ditiotreitol y 1mM de EDTA- Material: Mortero- pH = 7.8

Homogenización- Filtrado: Malla de Nylon- Centrifugado: 10 minutos, 10000xg, 4°C- Objetivo: Sobrenadante

Separación- Parámetro evaluado: Capacidad enzimática- Método: Espectrometría- Enzimas: Peroxidasa, Enzima málica , Glutamato deshidrogenasa y Citrato de iso-deshidrogenasa- Unidad: mU/g de peso seco

Análisis Bioquímico

Análisis de Hg total en muestras de suelo

Toma de muestra:• 5g de sub-muestras

uniformemente. • Mezclado• Transferido a

recipiente de teflón: 1g de la sub-muestra

Digestión• Agua regia, 16mL• Sistema de digestión

de microondas• Programa: 1 min, 315

W; 4 min, 441 W; 60 min , 630 W

• Presión: Menor a 170 psi

Análisis• Dilución a 100mL• Análisis por AAS• Resultados:

convertidos en base a peso seco (105°C)

Análisis de Hg total en Plantas

Toma de muestra:• Muestras entre

0.17-0.4g – Duplicado

Digestión• Agua regia• Disolución

total, sin residuos.

Análisis• Análisis por

AAS

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Plantas Sensor

Tabla Nº2: Contenido de mercurio en suelo y hojas de frijol determinado por AAS.

Figura Nº2: Parámetros biológicos en hojas de frijol vs. Mercurio total. (A) Por encima de la biomasa aérea de las plantas de frijol. (B) Masa de hojas, (primer

par) de las plantas de frijol. (C) Masa radicular de las plantas de frijol.

Plantas Sensor

Figura Nº3: Parámetros biológicos en hojas de frijol vs. Mercurio total. (D) Actividad de la enzima málica en las hojas (círculos abiertos) y raíces (círculos cerrados). (E) Actividad de la

peroxidasa en las hojas (círculos abiertos) y raíces (círculos cerrados). (F) Actividad del citrato des-hidrogenasa en las hojas. (G) Actividad del glutamato dehidrogenasa en raíces.

Plantas Sensor

Figura Nº4: Relación entre el Hg total del suelo medido por AAS y la presencia de Hg biodisponible en el suelo medido con el biosensor de

conjunto de células. Muestras B1-B10, muestras de suelo individuales. R, coeficiente de correlación

Biosensor de conjunto de células

Figura Nº5: (A) Concentración de Hg biodisponible del suelo determinado usando el biosensor de proteínas vs la concentración de Hg total en suelo con AAS. (B)

Comparación de la concentración de Hg biodisponible del suelo determinado con el biosensor de proteínas y el biosensor de conjunto de células.

Biosensor de proteínas

CO

NC

LU

SIO

NES

Se logró detectar la concentración de

Hg en muestras de suelos con los biosensores de

conjunto de células y de proteínas

Solo se encontraron

concentraciones bajas en las hojas de frijol.

Las plantas sensor se

consideran indicadores

pobres para el Hg del suelo.