BIOSEPACIONES...Base de las separaciones por transferencia de masa. La tendencia a la difusividad...

BIOSEPACIONESBIOSEPACIONESDOCENTE: ANGÉLICA MORALESE-MAIL : [email protected]

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CEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales

Modalidad de las Clases: Teórico (12 horas)Aprobación: Asistencia obligatoria al 80% de las clases + aprobación de una evaluación de contenidos.

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CONTENIDOS MÍNIMOSCONTENIDOS MÍNIMOS

DownstreamDownstream processingprocessing: Definición. Downstream processing I. Downstreamprocessing II. Técnicas de separación. Rendimiento. Pureza. Performance. Costo.Tabla de purificación.

RupturaRuptura celularcelular:: Definición. Métodos químicos. Métodos físicos. Métodosbiológicos. Ecuaciones de velocidad.

SeparaciónSeparación SólidoSólido--LíquidoLíquido:: Centrifugación. Filtración.

PrecipitaciónPrecipitación:: Métodos generales de precipitación. Salting out. Solventesorgánicos. Precipitación isoeléctrica. Polímeros no iónicos. Polielectrolitos.

ParticiónPartición enen dosdos fasesfases acuosasacuosas: Definición. Coeficiente de partición.

CromatografíaCromatografía..

PurificaciónPurificación dede ProteínasProteínas recombinantesrecombinantes..


INTRODUCCIÓN AL DOWNSTREAM INTRODUCCIÓN AL DOWNSTREAM PROCESSINGPROCESSING

UNIDAD 1UNIDAD 1


BIOTECNOLOGÍA CLÁSICABIOTECNOLOGÍA CLÁSICA

Tecnología de las Tecnología de las Fermentaciones Fermentaciones

Recuperación y purificación de Recuperación y purificación de productosproductosUPSTREAMUPSTREAM

DOWNSTREAMDOWNSTREAM


Downstream Processing…Downstream Processing…

Recuperación y purificación de productosRecuperación y purificación de productos

Downstream I

Downstream II

BioseparacionesBioseparaciones CromatografíaCromatografía


Productos de la biotecnología Productos de la biotecnología modernamoderna

ÁÁrea agrícola rea agrícola (Verde)(Verde)• Quimosina• Tomates larga vida• Plantas transgénicas resistentes a pesticidas

Área industrial (Blanca):Enzimas industriales

ÁÁrea de Saludrea de Salud (Roja):• Kits de diagnostico médico• Proteínas de actividad terapéutica.• Vacunas de nueva generación.• Anticuerpos Monoclonales


Productos de la biotecnología Productos de la biotecnología moderna…moderna…

ÁÁrea marina rea marina (Azul)(Azul)• Se ocupa de la aplicación de métodos moleculares y biológicos a los organismos marinos y de agua dulce.• Aumento de la oferta de productos del mar.• Control de la proliferación de microorganismos nocivos transmitidos por el agua.• Desarrollo de nuevos medicamentos

ÁÁrea Ambientalrea Ambiental (Gris):• Desarrollo de soluciones para mitigar el impacto ambiental.• Biorremediación.


Biotecnologías ParcialesBiotecnologías Parciales

Tratamiento de efluentes: Tratamiento de efluentes: intervención de biológicos en los procesos.Efluente biológico: Métodos fisicoquímicosEfluente mineral: Métodos biológicos

Recuperación y purificación: Recuperación y purificación: A escala comercializable.Productos de seres vivos: Métodos fisicoquímicos (Obtención de albúmina a

partir de plasma humano)Minerales: Métodos biológicos (biolixividación)

Fermentación:Fermentación:Bebidas fermentadas.


Biotecnología RecombinanteBiotecnología Recombinante

Ingeniería Genética

Tecnología de las Fermentaciones

Recuperación y Purificación

Tratamiento de efluentes


Sistemas de expresión de proteínas Sistemas de expresión de proteínas recombinantesrecombinantes

Microorganismos Microorganismos → Bacterias, levaduras y hongos

Células de mamífero Células de mamífero → CHO, BHK

Células de insectos Células de insectos → sistema baculovirus

Animales transgénicos Animales transgénicos → Vacas productoras para producciónde insulina humana

Plantas transgénicas Plantas transgénicas → Vacuna de VFA en alfalfa

Reemplazar sistemas mamíferos


Sistemas de expresión de proteínas Sistemas de expresión de proteínas recombinantesrecombinantes

Product Company Host System Status (U.S. approval)Humulin Eli Llly E. coli 1982

Protropin Genentech E. coli 1985

Recombivax Merck Yeast 1986

Activase Genentech Mammalian cells 1987

Epogen Amgen Mammalian cells 1989

Pulmozyme Genentech Mammalian cells 1993

Nutropin Genentech E. coli 1994

Avonex Biogen Mammalian cells 1996

Antithrombin III Genzyme Transgenics Goats

Alpha-1-antityrpsin PPL Therapeutics Sheep

Alpha-glucosidase Pharming Cow

Avicidin antibody IPT/NeaRxCom


Características del producto a obtenerCaracterísticas del producto a obtener

COSTOCOSTO razonable (Negocio)

RENDIMIENTORENDIMIENTO máximo

PUREZAPUREZA adecuada

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y BIOLÓGICAS deseadas

Axioma de la Biotecnología:Axioma de la Biotecnología:

NO HAY QUE PURIFICAR MÁS DE LO NECESARIO !!!

Porque…. Aumenta los costos.Baja la competitividad del producto.


Costos de Recuperación y PurificaciónCostos de Recuperación y Purificación(% respecto al costo total de producción)(% respecto al costo total de producción)

Dependiendo del producto el costo de recuperación y purificación puede ser hasta un 80% del costo de producción.

Depende principalmente de la complejidad del proceso de purificación.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Etanol

Penicilina

Proteína

Proteína Recombinante

ETOH → Des laciónPenicilina → Extracción por solventeProteína → Cromatogra aProteína Recombinante → Calidad inyectable, > pureza


Rendimiento total vs Número de etapasRendimiento total vs Número de etapas


Factores que influyen en el costo de un Factores que influyen en el costo de un proceso de purificaciónproceso de purificación

Número de etapas de purificación

Tipo de etapa

Rendimiento de cada etapa

Composición del Medio de cultivo

FermentaciónFermentación PurificaciónPurificación

- Alta eficiencia de producción - Retirar los aditivos agregados

- Agregado de aditivos al medio de cultivo - Repercusiones en la purificación

Tipo de producto

Concentración del producto

Pureza requerida

Reciclado de matrices cromatografías


Precio de venta vs. concentración en el Precio de venta vs. concentración en el material de partidamaterial de partida


Ejemplo. Tipo de producto según su ubicación en Ejemplo. Tipo de producto según su ubicación en el productorel productor

• Fácil purificación• Medio de cultivo diluye el producto extracelular

• Romper la células• Contaminación con proteínas de la célula


Técnicas de SeparaciónTécnicas de Separación

RECUPERACIÓN (1ra Etapa)Aislamiento, enriquecimiento

PURIFICACIÓN (2da Etapa)

Características generales Características particulares

Grandes volúmenes Sofisticado

Lento

Pequeños volúmenes

TÉCNICA RECUPERACIÓN PURIFICACIÓN

Centrifugación X

Filtración X

Ultrafiltración X X

Precipitación X X

Partición X X

Cromatografía X


Parámetros de evaluación de un proceso Parámetros de evaluación de un proceso de purificaciónde purificación

RendimientoRendimiento : :

Pureza:Pureza:

Porcentaje (%)

Cantidad de producto al final de la purificación x 100Cantidad de producto en el material de partida

Actividad Específica (AE):

Cantidad de proteína de interésCantidad total de proteínas

1) Peso: mg proteína después de la purificaciónmg proteína total

Unidades:

2) Unidad de Enzima: Unidad enzimática mg de proteínas totales

3) Unidad de Enzima: Unidad Enzimamg de N proteico

4) Unidad de Enzima: Unidad EnzimaAbs 280nm


Parámetros de evaluación de un proceso Parámetros de evaluación de un proceso de purificaciónde purificación

Performance:Performance:

CostoCosto

Factor de Purificación (FP):

AE luego de la purificaciónAE antes de la purificación

Cálculo de cuanto se purifica de la proteína con respecto al paso anterior


Tabla de purificaciónTabla de purificación

Operación Volumen(ml)

Cantidad de Proteína

Total (mg)

ActividadTotal (U)

Actividad Específica

(U/mg)

Rendimiento (%)

Factor de Purificación

1

2 ↓ ↓ ≈ ó ↓ ↑ ↓ ↑

3

4

5

Concentración del producto

Reduce los contaminantes

Cantidad de proteína de

interés

Depende del paso

[proteína total] * VActividad enzimática

Prot. totalesAE n *100%

AE n-1

AE final * 100%AE inicial

Unidad Enz. n * 100%Unidad Enz. n-1

Unidad Enz. final * 100%Unidad Enz. inicial


Tabla de purificaciónTabla de purificación


Ejemplo proceso de purificación Ejemplo proceso de purificación

Figure 1. SDS-PAGE analysis of expression and purification of recombinant L-asparaginase II from E. coli IBs. Samples were analyzed on 12% polyacrylamide gel. Lane M; low molecular weight marker proteins (Pharmacia, Sweden) in (A–E). Arrow indicates recombinant asparaginase. (A) Lane 1: uninduced cell lysate; lane 2: induced cell lysate. (B) Lane 1: purified IBs.(C) Lane 1–9: supernatants of solubilized asparaginase from IBs in 0 to 8 molar urea respectively in 50 mM Tris pH 8.5 buffer. (D) Eluted fractions of asparaginase from DEAE ion exchange chromatography. Lanes 1–9 are eluted fractions 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, and 17 from DEAE ion exchange chromatography. (E) Lane 1: purified recombinant asparaginase after S-200 gel chromatography.

Table 1. Purification of recombinant E. coli L-asparaginase II from IBs (culture volume 1 liter).


Downstream Processing…Downstream Processing…

Recuperación y purificación de productosRecuperación y purificación de productos

Downstream I

Downstream II

BioseparacionesBioseparaciones CromatografíaCromatografía


BioseparaciónBioseparación

BIOSEPARACIÓN…BIOSEPARACIÓN…

La ingeniería de las ingeniería de las BIOSEPARACIONES BIOSEPARACIONES se refiere al estudio sistemático de los

principios científicos y técnicos utilizado para la purificación a gran

escala de productos biológicos

Operaciones y técnicas Operaciones y técnicas utilizadas para los procesos

de purificación de productos biológicos

Ruptura celular

Separación Sólido-Líquido

Precipitación

Partición en dos fases acuosas

Destilación


Fundamentos de las técnicas de Fundamentos de las técnicas de BioseparaciónBioseparación

1. Tamaño de partícula →→ Filtración / Separación por membrana

2. Densidad →→ Centrifugación / Sedimentación / Flotación

3. Difusividad →→ Separación por membranas / Extracción

4. Forma →→ Sedimentación / Centrifugación

5. Polaridad →→ Extracción

6. Solubilidad →→ Extracción / Precipitación / Cristalización

7. Cargas electrostáticas →→ Membrana electrostática / Electroforesis

8. Volatilidad →→ Evaporación / Volatilidad

Low-resolution + high-throughput High resolution + low-throughputCell disruption Ultracentrifugation

Precipitation Chromatography

Centrifugation Affinity separation

Liquid-liquid extraction Electrophoresis

Leaching

Filtration

Supercritical fluid extration

Microfiltration

Ultrafiltration

AdsorptionCEBI_E8 Angélica MoralesCEBI_E8 Angélica Morales

Técnicas de BioseparaciónTécnicas de BioseparaciónLas técnicas de bioseparación se dividen principalmenteen dos grandes grupos:

ALTO RENDIMIENTO ALTO RENDIMIENTO (Productividad) / BAJA SELECTIVIDAD BAJA SELECTIVIDAD (Resolución)

BAJO RENDIMIENTO BAJO RENDIMIENTO (Productividad) / ALTA SELECTIVIDAD ALTA SELECTIVIDAD (Resolución)


Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico

1.1. TamañoTamaño

Muchas propiedades se utilizan para su aplicación en bioseparaciones, las más importantes son:

Partículas esféricas → Diámetro

Macromoléculas (Proteínas, ácidos nucleídosProteínas, ácidos nucleídos)Difícil definición del diámetro, son necesarias dos magnitudes.

Ej.: Par culas elipsoidales → Magnitud mayor (Largo)Magnitud menos (Ancho)

Moléculas lineales como el ADN ADN se miden por su longitud

Formas más complejas como anticuerposanticuerpos requieren otro tipo de medida.

Diámetro de StokesStokes--EinsteinEinstein: : Es el diámetro de una esfera que tiene la misma difusividad de una partícula

rSE = RT 6pDmN

Donde:D = difusividad (m2/s)m = viscosidad (kg / m s)N = número de Avogadro

Alpha amylasae

DNA


Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico2.2. Peso molecularPeso molecular

Como una medida del tamaño.Detalle de algunos pesos moleculares de sustancias biológicas:

Material Molecular Weight (kg/kg-mole)

Sodium chloride 58.44

Urea 60.07

Glucose 180

Penicillin G 334.42

Insulin 5,800

Lysozyme 14,100

Myoglobulyn 17,000

Human serum albumin 67,000

Immunoglobulin G 155,000

Dextrans 10,000-1000,000

Catalase 250,000

Collagen 345,000

Myosin 493,000

Tobacco mosaic virus 40590,000

Plasmids Few kilo-base pairs

Chromosomal DNA Hundreads of kilo-base pairs

La mayoría de las muestras biológicas presentan una distribución de pesos.

Se estudia en forma estadística Se estudia en forma estadística siguiendo una distribución de siguiendo una distribución de tamaño.tamaño.


Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico3.3. DifusividadDifusividad

Se refiere al movimiento aleatorio de las moléculas, debido a las colisiones intermoleculares.

Fuerza impulsora Fuerza impulsora entre diferentes concentraciones.

Base de las separaciones por transferencia de masa.

La tendencia a la difusividad está medida por la difusividaddifusividad ó Coeficiente de difusiónCoeficiente de difusión, predicho por la Ley de Fick.Ley de Fick.

Material Diffusitivy in water (m2/s)

Sodium chloride 2.5 x 10 -5

Urea 1.35 x 10 -9

Acetic acid 1.19 x 10 -9

Ethanol 8.4 x 10 -10

Glycerol 7.2 x 10 -10

Lysozyme 10.4 x 10 -11

Human serum albumin 5.94 x 10 -11

Human immunoglobulin G 4.3 x 10 -11

Collagen 0.69 x 10 -11

Tobacco mosaic virus 0.46 x 10 -12


Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico44.. SedimentaciónSedimentación

Tendencia de las macromoléculas y partículas a depositarse en un medio líquido.

Producido por la gravedad ó campos gravitatorios inducidos.

Base de la decantación, centrifugación y ultracentrifugacióndecantación, centrifugación y ultracentrifugación.

La velocidad de sedimentaciónvelocidad de sedimentación, s, depende de:

Se define el Coeficiente de sedimentación Coeficiente de sedimentación como:

• Las propiedades de la partícula: tamaño y forma.• Las propiedades del solvente: densidad y viscosidad• De la afinidad entre ambos.

s = M (1-nMr)f

Material Sedimentation coefficient

Citochrome c 1.17

Chymotrypsinogen 2.54

Alpha amylase 4.5

Fibrinogen 7.9

Human serum albumin 4.6

Collagen 6.43

Tobacco mosaic virus 198

M = Peso molecular (kg/kg mol)nM = Volumen específico (m3/kg)r = densidad (kg/m3)f = Factor de fricción


Propiedades del Propiedades del mmaterial biológicoaterial biológico5.5. Presión osmóticaPresión osmótica

Si la solución acuosa diluida de un soluto se separa de una concentración por una membrana semipermeable que solo permite el paso de agua, una diferencia de presión se genera a través de la membrana.

Para soluciones diluidas aplica la ecuación de Van`t HoffVan`t Hoff:

Base de separación por membranamembrana.

p = RTcR = constante universal de los gasesT = Temperatura absoluta (K)c = concentración del soluto



Iones tales como Na+ y Cl- llevan cargas electrostáticas en función de su valencia.

Los grupos COOH y NH2 de los aminoácidos pueden ionizarse a COO- y NH3+ además de

otros grupos ionizables en las cadenas laterales.

El grado de ionización grado de ionización de una proteína depende del pH del pKa y pKb de los aminoácidos constituyentes.

Anfóteras: pH bajo → carga +pH alto → carga –

A un dado pH → neutro (Punto isoeléctricoPunto isoeléctrico) → PrecipitaciónPrecipitación

A pH fisiológico, los ácido nucleídos están cargados negativamente.

Base para la separaciones como: Electroforesis, intercambio iónico, cromatografía de Electroforesis, intercambio iónico, cromatografía de adsorción, electrodiálisis y precipitaciónadsorción, electrodiálisis y precipitación.

66.. Cargas electrostáticasCargas electrostáticas

Valor de pH en el que una molécula no tiene carga neta)


Material Isoelectric point

Ovalbumin 4.7

Conalbumin 7.1

Insulin 5.3

Urease 5.0

Lysosyme 11.0

Pepsin 1.0

Myoglobulin 7.0

Collagen 6.7

Fibrinogen 4.8

Human serum albumin 4.9

Hemoglobine 7.1

Prolactin 5.7

Detalle de algunos puntos isoeléctricos de proteínas:



La solubilidad de una sustancia química en el agua, como un solvente estándar, es una de las propiedades fundamentales para los propósitos de caracterización.

Un compuesto polar será más soluble en agua que un compuesto no polar, que será más soluble en solventes orgánicos.

La solubilidad esta influenciada por la T, pH y los aditivos.

Base de las separaciones por extracción, precipitación, cristalización y separación por extracción, precipitación, cristalización y separación por membranamembrana.

7.7. SSolubilidadolubilidad

A tener en cuenta…

Precipitaciones: Precipitaciones: Deben ser reversibles para evitar la desnaturalización.

En el punto isoeléctrico es menor la solubilidad



Es una medida de cómo un compuesto se distribuye entre dos fases líquidas.

Igualación de los potenciales químicos del componente en cada fase.

Base de la separación extracción líquido-líquido y cromatografía de partición

Caracterización: el coeficiente de reparto octanol/agua (Ko/w) decide entre hidrófilos e hidrófobos.

Para identificación y cuantificación.

Soluciones de diferentes sustancias absorben luz a diferentes longitudes de onda.

La longitud de onda en la que un compuesto absorbe la máxima cantidad de luz se conoce como su lmax.

Proteínas en agua: absorben luz ultravioleta, aprox. a 280nmADN en agua absorbe aprox. a 260nm

8.8. Coeficiente de repartoCoeficiente de reparto

99.. Absorción de la luzAbsorción de la luz


GRACIAS!!!

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