Biotecnología módulo 6
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BIOTECNOLOGÍA ANIMAL BIOTECNOLOGÍA ANIMAL LCPA - 425 LCPA - 425 Módulo. 6 Prof. Dr. Reinaldo de Armas PhD.
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BIOTECNOLOGÍA ANIMAL BIOTECNOLOGÍA ANIMAL LCPA - 425LCPA - 425Módulo. 6
Prof. Dr. Reinaldo de Armas PhD.
Módulo 6.Técnicas básicas en las Módulo 6.Técnicas básicas en las áreas de biología molecular y áreas de biología molecular y
biotecnología biotecnología
Técnicas de determinación de ADN y ARN.Reacción en cadena a la polimeraza.Técnicas de aislamiento de colonias. Técnicas de cultivo in vitro.
OBTENCIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN POR RESTRICTASAS(RFLP) -El ADN de cualquier organismo puede ser cortado en fragmentos (fragmentos de restricción) lo suficientemente pequeños para ser analizados y manipulados, gracias a las restrictasas.
-Las restrictasas son endonucleasas que poseen muchas bacterias y que tienen la propiedad de cortar el ADN extraño que penetra en la célula. Lo cortan por sitios específicos llamados secuencias de reconocimiento, formadas por cuatro u ocho pares de bases, que, en la bacteria original, están protegidas para evitar que se destruya su propio ADN.
-Estas enzimas 'tijeras biológicas' cortan el ADN de forma que en cada extremo queda un trozo de hebra monocatenaria formada por las bases de la secuencia de reconocimiento.
Estos extremos se llaman adherentes o cohesivos, ya que es por ellos por donde se pueden unir a otros fragmentos de ADN cortados por la misma enzima de restricción, al ser sus bases complementarias.
-Los fragmentos así obtenidos se pueden separar para su estudio.
Técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa):
-Gracias a esta técnica se replican pequeños fragmentos de ADN 'in vitro', a una velocidad mucho mayor que mediante la clonación molecular. (A título anecdótico, se produce un ciclo cada 4 o 5 minutos, lo que supone aproximadamente unos 100.000 millones de copias en una sola tarde...)
-El procedimiento PCR requiere conocer las secuencias de bases del fragmento de ADN que se pretende replicar.
Con estas secuencias se deben sintetizar pequeñas cadenas complementarias de ADN (de unos 20 nucleótidos), que actuarán como cebador o primer para la ADN-polimerasa.
-En resumen, la técnica PCR se desarrolla así:
a) El fragmento de ADN a replicar se introduce en una disolución que contiene ADN-pol.
b) Se añaden desoxirribonucleótidos en cantidad y las moléculas de cebador sintetizadas.
c) Al calentar, se separan las hebras complementarias de los fragmentos de ADN.
d) Si se enfría, se unen los cebadores a las hebras simples de nucleótidos, lo cual es reconocido por la ADN-pol que comienza a añadir nucleótidos formando la hebra complementaria.
e) Calentando y enfriando alternativamente la solución, se pueden obtener millones de copias de ADN en períodos de tiempo cortos.
SECUENCIACIÓN DEL ADN
-Una de las técnicas más empleadas para la determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN es la conocida 'técnica de terminación de Singer (Nobel Química, 1980) o también llamada 'técnica del didexosi' (basada en la síntesis del ADN).
Se la califica así porque precisa de didesoxirribonucleótidos, que no son más que nucleótidos que han perdido el grupo -OH del carbono 3'.
Así pues, lo que va a suceder cuando los nucleótidos se unen es que si en un momento dado se encuentran con un 'didesoxi', la unión no se realizará y la cadena terminará ahí.
Para llevar a cabo la secuenciación se necesita:
a)Una de las cadenas del fragmento de ADN que se quiere secuenciar y que se utiliza como 'molde'. b) Un cebador complementario del extremo de la cadena.
c) Los cuatro desoxirribonucleótidos correspondientes (dAMP, dTMP, dCMP y dGMP).
d) Los cuatro 'didesoxis' (ddAMP, ddTMP, ddCMP y ddGMP). -Supongamos que el fragmento que deseamos secuenciar y el cebador son los siguientes:
Entonces, el proceso de secuenciación lo ejecutamos así...
1) Iniciamos el proceso añadiendo dos componentes:
a)ADN pol, para que comience la polimerización en el cebador b)un 'didesoxi', por ejemplo, ddCMP
2) La síntesis de la nueva hebra se detendrá cuando se incorpore el ddCMP.
Esto indicará que, en la cadena original de ADN, en ese lugar estará el nucleótido complementario que lleva guanina (G). Nos quedará, por tanto, un pequeño fragmento de ADN de 5 nucleótidos (sin contar el cebador).
3) Continuamos la síntesis añadiendo más ADN pol y ddCMP. Volverá a interrumpirse cuando nuevamente vuelva a incorporarse el 'didexosi' ddCMP, por la misma razón que antes. Nos quedará un fragmento de 7 nucleótidos (sin contar el cebador).
4) Repetimos la operación y nos vuelve a quedar un fragmento de 13 nucleótidos (sin contar el cebador).
5) Volvemos a preparar las mismas reacciones con los otros tipos de 'didesoxis', y obtenemos: a) con ddGMP: fragmentos de 1, 4, 10 y 15 nucleótidos. b) con ddTMP: fragmentos de 3, 8, 9 y 12 nucleótidos. c) con ddAMP: fragmentos de 2, 6 11 y 14 nucleótidos.
6) Cada uno de estos fragmentos, mediante determinadas técnicas se separan y 'radiografían' y, entonces, la 'sucesión de bandas' de cada una de las reacciones con los cuatro tipos de 'didesoxi', comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN (como puede observarse en el esquema adjunto).
En la actualidad, los estándares aceptados para la detección de microorganismos se basan en su cultivo a partir del hasta llegar a su aislamiento e identificación en medios selectivos. Es un proceso sencillo pero que requiere de mucho tiempo. Los análisis microbiológicos tradicionales se complementan con tecnologías rápidas de biología molecular que son capaces de identificar los microorganismos contaminantes
MICROPROPAGACIÓN
Micropropagar es el proceso de multiplicar plantas in vitro.A través de la micropropagación, a partimos de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia.
Este proceso incluye varias fases:
FASE 0 : Preparacion de la planta madre FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia FASE II : Multiplicación de brotes FASE III : Enraizamiento FASE IV: Aclimatación
FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado.Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses, en un invernadero, en que se va a intentar cultivar la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición, del fotoperíodo y de la irradiancia recibida.
FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA
Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos.Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantos del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo, para poder controlar la sanidad y la viabilidad de los explantos.
FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES
Durante esta fase se espera que los explantos que sobrevivieron de la FASE I originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varios entrenudos.Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.
FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS
Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:
ENRAIZAMIENTO IN VITRO Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar. Este método permite ser mas flexible a la hora de escoger los brotes, ya que éstos obtienen del medio la fuente de energía para enraizar, y por tanto no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.
ENRAIZAMIENTO EX VITROLos explantos se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.Los explantos deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos en 'multipots' dentro de un invernadero en un área sombreada con "fog-system" o "mist-system".
Tanto si los explantos fueron enraizados in vitro como ex vitro, en el momento en que se extraen los explantos de los recipientes de enraizamiento están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantos han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecación del explanto. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada, la barrera para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.
La utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o tejidos a los tejidos u órganos dañados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina Regenerativa del futuro. El establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en determinados casos, incluso, imposible. Por ello, desde el punto de vista clínico sería innegable el avance que supondría la posibilidad de poner a punto técnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las células troncales puede resultar fundamental.
En el organismo humano adulto se estima que existen unos 200 tipos de células diferentes cuyo origen se puede retrotraer a las células troncales embrionarias pluripotentes indiferenciadas presentes en la masa celular interna (MCI) del embrión en fase de blastocisto. Desde el punto de vista científico, la cuestión está en llegar a conocer cuáles son las instrucciones por las que una célula pluripotente indiferenciada se diferencia hacia un determinado tipo celular.
CULTIVO DE CELULAS MADRECULTIVO DE CELULAS MADRE
La utilización de la terapia celular, basada en la transferencia de células o tejidos a los tejidos u órganos dañados, es una de las grandes esperanzas de la Medicina Regenerativa del futuro. El establecimiento de cultivos celulares de tejidos humanos en el laboratorio es a veces difícil y en determinados casos, incluso, imposible. Por ello, desde el punto de vista clínico sería innegable el avance que supondría la posibilidad de poner a punto técnicas que permitieran obtener cualquier tipo de cultivos de tejidos y, acaso, de órganos. En este contexto, no cabe duda que el uso de las células troncales puede resultar fundamental.
En el organismo humano adulto se estima que existen unos 200 tipos de células diferentes cuyo origen se puede retrotraer a las células troncales embrionarias pluripotentes indiferenciadas presentes en la masa celular interna (MCI) del embrión en fase de blastocisto. Desde el punto de vista científico, la cuestión está en llegar a conocer cuáles son las instrucciones por las que una célula pluripotente indiferenciada se diferencia hacia un determinado tipo celular.
Las células Madres pueden obtenerse esencialmente de tres fuentes:
1) de la masa celular interna (MCI) de embriones obtenidos por fecundación in vitro (FIV) con el único propósito de obtener cultivos de tejidos;
2) de la MCI de embriones sobrantes de programas de FIV;
Terapia celular utilizando células embrironarias
3) de la MCI de embriones somáticos obtenidos por técnicas de clonación mediante transferencia de núcleos: método idóneo para evitar el rechazo inmunológico del trasplante al facilitar un posible autotrasplante. Este sería el caso de la aplicación de la técnica de clonación no reproductiva con fines terapéuticos (clonación terapéutica).
Técnica de clonación terapeútica para la obtención de cultivos de tejidos a partir de las células troncales pluripotentes de la masa celular interna de la vida".
