Bol. Micol. Vol. 23 pp. 1 - 101 Valparaíso (CHILE) Diciembre 2008

CONTENIDO

MICOLOGIA MEDICA

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus

parasiticus en niño inmunocomprometido. R. Salim &

R. Runco. …................................................................……. 1

Caso clínico: Aspergilosis pulmonar invasiva tratada con

Voriconazol en paciente con Sindrome de Inmuno-

deficiencia Adquirida. H. Arias, R. Cruz, M. de la Prida,

W. Jensen, R. Ahumada, M. Huilcaman …............……. 9

Actividad lipasa de especies de Malassezia aisladas en

pacientes sanos y con lesiones dérmicas. M. Sosa, F. Rojas,

S. Toma, M. Mangiaterra, G. Giusiano. …................… 15

Actividad de fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a

Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios de

Cryptococcus neoformans. G. Pérez, G. González & M.

C. Díaz. ..........................................................................…… 21

Especies de Fusarium como agentes de queratitis

micóticas en adultos en Tucumán, Argentina. R. Salim &

R. Runco. …..................................................................……. 27

Zigomicosis cutanea primaria por Rhyzopus oryzae en

una niña con Leucemia Linfoblastica Aguda Tipo B. R.

Salim, R. Runco, C. Alvarez, S. Romano, M. Charre.

……...................................................................................….. 35

Universidad de Valparaíso: Boletín Micológico

www.uv.cl/servicios/externos/lab_micologia/laboratorio_micologia.htm (Texto completo)

Aspergilosis cerebral: reporte de caso. E. Contreras, G.

E. Posada & S. X. Zuluaga ……................................... 43

TAXONOMIA

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link:

Claves para las especies ambientales y clínicas más

comunes. E. Piontelli. …...........................................…… 49

ECOLOGIA

Aeromicota de ambientes internos: Comparación de

métodos de muestreo. T. I., Rojas, E. Martínez, M. J. Aira,

& M. Almaguer. ...................................................….......... 67

Microhongos oportunistas asociados al «musgo Pompon»

desecado (Sphagnum magellanicum Brid.) en Chile. E.

Piontelli, R. Cruz & V. Vivar. …...................................… 75

Notas sobre el género Geastrum Pers. en Chile central.

H. Madrid. ….....................................................................…. 87

REVISTA DE REVISTAS, RESUMENES DE

CONGRESOS, CURSO .................................................. 93

ASPERGILOSIS SINUSAL NO INVASIVAPOR Aspergillus parasiticus

EN NIÑO INMUNOCOMPROMETIDO (Non invasive sinusal aspergillosis by Aspergillus parasiticus in an

immunecompromised child)

R. Salim1 & R. Runco1,2

1. Cátedra de Micología. Instituto de Microbiología Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán

Ayacucho 491. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina. 2. Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750.

(4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentinae-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar

Palabras claves: aspergilosis sinusal, niño, inmunocomprometidoKey words: sinusal aspergillosis, immunocompromised child.

RESUMEN

El presente trabajo tiene la finalidad de exponerun caso clinico de un niño inmmunosuprimido conantecedentes de hospitalización previa, a los 6 años deedad con múltiples síntomas y signos (poliadenopatías,desnutrición, sepsis en cavidad bucal y foco pulmonar,además de pancitopenia). Permaneció en terapiaintermedia durante 38 días, cumpliendo varios esquemasantibióticos sin buena respuesta a los mismos. Fuederivado al Hospital Ricardo Gutiérrez (Buenos Aires)desconociéndose la terapéutica seguida en esaoportunidad. Cinco años después (2007) es ingresadonuevamente a nuestro hospital por cuadro de epistaxiscefaléa, compromiso del estado general y neutropeniafebril, por lo que se inicia tratamiento antibiótico,además de estudio con mielograma confirmándose eldiagnóstico de leucemia linfocítica aguda. Cinco díasdespués de su ingreso expulsa espontaneamente, desdelas fosas nasales material granulomatoso el cual fuéenviado a estudio micológico (examen directo y cultivo),detectándose alta presencia de Aspergillus parasiticusen ambos examenes, lo cual fue ratificado porhistopatología como una aspergilosis sinusal noinvasiva. El paciente fue remitido a la Sala deInmunodeprimidos donde recibió tratamientointravenoso con 350 mg/día de anfotericina B-complejolipídico y terapia específica para LLA. Presentó unaevolución tórpida y al 12º día el paciente falleció por sumal estado general y progresión terminal de suenfermedad de base.

ABSTRACT

This present paper is meant to reveal the clinicalcase of an immunesuppressed boy having been previouslyin a hospital, when he was 6, showing multiple symptomsand signs (polyadenopaties, malnutrition, buccal sepsisand pulmonary focus, in addition to pancitopia). Hestayed under intermediate therapy for 38 day beingsubmitted to varied antibiotic schemes, though yieldingno satisfactory responses to them. Later on he was derivedto the Hospital Ricardo Gutiérrez (Buenos Aires), yettherapeutics used at that place being unknown. Fiveyears later (2007), he is admitted again in our hospitalbecause of cephalea epistaxis, a compromised healthcondition and fevered neutropenia, so he is given anantibiotic treatment in addition to a mielographic studyyet it is confirmed the diagnosis of an acute lymphociticleukemia. Five days after his admittance, he dischargesgranulomatous matter from his nasal cavities which wassent for a mycological study. Direct exam and culture,detecting high presence of Aspergillus parasiticus onboth exams which was ratified by histopathology as anon invasive sinusal aspergillosis. The patient was sentto the Immunedepressed Ward where he receivedintravenous treatment with 350mg/day anfotericina B-lipidic complex and a specific therapy for LLA. He had atorpid evolution and on the 12nd day the patient died asa result of his very bad health condition as well as theterminal progression of his base disease.

INTRODUCCION

La patología fúngica sinusal es poco frecuente, sinembargo, su diagnóstico ha aumentado desde hace

Recibido el 1 de Octubre 2008Aceptado 29 Noviembre 2008

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algunos años gracias al avance vertiginoso de la radiologíay el desarrollo de la cirugía endoscópica nasal (1,7). Com-prende una extensa variedad de entidades patológicas condiferente expresión clínica, cuyo denominador común esla presencia de hongos en los senos paranasales (10, 11).

Se define como Aspergilosis sinunasal, a un grupode afecciones relacionadas con varias especies deAspergillus, hongos saprotrofos comunes que crecencomo una masa de hifas anchas y tabicadas. Aspergillusspp. son las causas más comunes de todas las formas depatología micótica sinunasal (5, 12,17, 22, 23).

Los integrantes del géneroAspergillus, sonubicuos, abundan en el suelo, en la materia orgánica endescomposición y en granos almacenados. Estudiosambientales han indicado que los humanos pueden inhalar,diariamente, acorde al ambiente, varios cientos de susconidios (26). Sin embargo, su inhalación por individuosinmunocompetentes, raramente tiene efectos adversos,debido a que estos propágulos son eficientementeeliminados por la inmunidad celular (3, 34). Puede provocarcomplicaciones en individuos con alteración de la defensacelular, fundamentalmente en enfermos neutropénicos,especialmente en pacientes leucémicos o transplantadosde médula ósea, terapia corticoesteroide, quimioterapiacitotóxica y SIDA (16, 17, 19). El paciente típico esgranulocitopénico, que ha recibido un sobre tratamientocon antibióticos de amplio espectro por fiebresinexplicables (9, 14, 30, 33). Por su oportunismo puedecausar desde alergias hasta infecciones invasivasimplicando las vías aéreas superiores, pulmones, y otrosórganos (4, 15, 23, 25, 29).

Los cambios de la mucosa y la obstrucción delorificio nasal, disminuyen la ventilación del seno, reducenel pH, y en consecuencia favorecen la colonización y laproliferación micótica (1, 31, 32).

Además de los factores del huésped, se han citadodiversos factores ambientales como causa del desarrollode sinusitis micótica (1,10). El tamaño del inóculo necesariopara desarrollar manifestaciones de aspergilosis esdesconocido, pero parece que tiene que ser bajo en lospacientes inmunocomprometidos. Respecto al tiempo deincubación entre la exposición a Aspergillus spp. y eldesarrollo de aspergilosis invasiva Chacón et al. (5),establecen que varía entre 36 horas y 3 meses. En lospacientes neutropénicos no se presentan sino hastadespués de 12 días de neutropenia severa, aun cuandolos pacientes pueden estar colonizados en pulmón ocavidad sinusal a su llegada al hospital (5,18).

Al parecer, el clima también es un factor que puedefavorecer la incidencia de esta patología, pues existenzonas donde la sinusitis micótica es endémica; entre ellasse encuentra Sudán, Norte de India y Arabia Saudita, todascon clima caliente y seco (3).

En los últimos años se han asociado otros factoresal aumento de las aspergilosis, entre ellos, las nuevas pautasde quimioterapia antineoplásica, el incremento exponencialde los trasplantes de órganos y la utilización de fármacosinmunosupresores cada vez más potentes frente aenfermedades auto-inmunes (9, 14, 25).

Si bien existe consenso que la incidencia de lasdiferentes formas de presentación de micosis nasosinusales variable y la diversidad de hongos involucrados estáaumentando, desafortunadamente, la verdadera incidenciade estas infecciones es desconocida (29). Según unarevisión efectuada en la Clínica Mayo su frecuencia, basadaen las muestras quirúrgicas codificadas como «sinusitisinflamatoria» fue 6,9%; de sinusitis fúngica alérgica, 3,7%;de bola fungosa 3,7%; y 0,003% de invasora (12).

De las más de 200 especies que comprende elgénero Aspergillus, unas 20 han sido reconocidas, hastala fecha, como patógenas en el hombre. De éstas, la especiemás frecuentemente aislada es Aspergillus fumigatuscomplex. le siguen : A. flavus, A. niger, A. terreus y A.nidulans, que también juegan un papel importante enpatología humana (4,18).

Los brotes de aspergilosis que implican la piel, lamucosa oral o los tejidos subcutáneos, se asocian más amenudo a A. flavus que a las otras especies (3, 4, 18, 27).Se cree que el tamaño mayor de las esporas de A. flavuscon respecto a las de A. fumigatus favorece su deposiciónen la zona respiratoria superior lo que podría explicar suincidencia como un agente etiológico común de la sinusitisfúngica y de las infecciones cutáneas. Posiblemente, lascaracterísticas de la superficie de las esporas también sondeterminantes importantes de la localización (24).

A. flavus es la segunda causa de aspergilosisinvasiva y es el agente más común de la infecciónsuperficial no invasiva (4, 10, 18, 19). Los síndromesclínicos comunes asociados a esta especie incluyen,particularmente, sinusitis granulomatosa crónica,queratitis, aspergilosis cutánea, infecciones de heridas yosteomielitis postraumaumáticas y/o de inoculación (18).

El presente trabajo tiene la finalidad de exponerel hallazgo casual de Aspergillus parasiticus en materialgranulomatoso sangrante de descarga nasal espontáneaen un paciente inmunocomprometido de 11 años de edad,con desenlace fatal, comentar aspectos clínicos y dediagnósticos de la aspergilosis sinusal.

CASO CLINICO

Paciente masculino de 11 años de edad, residenteen San Miguel de Tucumán (R. Argentina) ingresado por1ª vez en nuestro hospital a los 6 años de edad (Marzo de2002) por un síndrome febril prolongado (>30 días de

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evolución), pérdida de peso (aproximadamente 7 kilos enun mes) y diarrea. Fue internado, en estado crítico. Elexamen físico reveló adenopatías en cadena latero-cervical,preauricular y submaxilar de 1 a 1,5 cm, duras, móviles,indoloras, además en región inguinal. Desnutrido de primergrado con déficit del 15% (85% peso para edad). Sediagnosticó sepsis a foco en cavidad bucal y a focopulmonar, síndrome anémico, leucopenia severa sindiagnóstico etiológico confirmado, síndrome de colestasiscon hepatomegalia, insuficiencia hepática y enteropara-sitosis (huevos de Ascaris). Registraba, además, lesionespustulosas en región lateral de cuello y perianal. Lapunción-aspiración de médula ósea informó ausencia casitotal de la serie granulocítica (agranulocitosis). Al mismotiempo, se diagnosticó neumonía derecha, con clínica yradiología positiva. Permaneció en terapia intermediadurante 38 días, cumpliendo varios esquemas antibióticossin buena respuesta a los mismos, continuando febril, sinbacteriemia. Fue derivado al Hospital Ricardo Gutiérrez(Buenos Aires) desconociéndose la terapéutica seguidaen esa oportunidad.

El 10 de Diciembre de 2007, consulta por epistaxisde 3 h. de evolución, de difícil manejo a pesar de lacolocación de un tapón nasal anterior y administración deconcentrado plaquetario. Refiere padecer sensación detaponamiento nasal, sangrado nasal, cefalea, fatiga ymalestar general de más de 2 semanas de evolución. Sedecide su hospitalización. Al momento del ingresopresenta fiebre, neutropenia y plaquetopenia, por lo quese administra concentrado plaquetario y se iniciatratamiento con cefalotina y ceftazidima. Con diagnósticopresuntivo de leucemia linfocítica aguda (LLA) se efectúapunción-aspiración de médula ósea.

A los 5 días de su admisión, por una descarganasal espontánea (estornudo), elimina material granuloma-toso y sangrante que es transportado rápidamente allaboratorio. El tejido es procesado para diagnósticobacteriológico y micológico arrojando examen directopositivo, con abundantes hifas hialinas tabicadascompatibles con elementos fúngicos. Este resultado esinmediatamente comunicado al médico tratante, lo cualllevó a una orientación diagnóstica preliminar de sinusitisfúngica. Se decidió practicar biopsia por curetaje,obteniéndose un tejido granulomatoso, friable y sangrante,que fue enviado para estudios histopatológicos ymicrobiológicos (examen directo y cultivo micológico).

El resultado de la biopsia fue compatible conaspergilosis sinusal sin invasión tisular.Los resultados delos cultivos y examen histopatológico fueron positivospara hongos compatibles con Aspergillus parasiticus.Con el diagnóstico de leucemia linfocítica aguda el pacientefue remitido a la Sala de Inmunodeprimidos donde recibiótratamiento intravenoso con 350 mg/día de anfotericina B-

complejo lipídico y terapia específica para LLA. Presentóuna evolución tórpida y al 12º día el paciente falleció porsu mal estado general y progresión terminal de suenfermedad de base.

Estudios Microbiológicos

Se efectuaron exámenes microscópicos directosy cultivos del material de descarga nasal espontánea,previamente macerado en mortero estéril con SF estéril. Alexamen directo se observaron abundantes hifas hialinas,septadas, de 2 µm de diámetro con ramificaciones enángulos de 45º. Coincidentemente con este hallazgo, eldiagnóstico histológico de los materiales de biopsia nasalreveló abundantes hifas septadas, ramificadas, noinvasivas de la mucosa sinusal.

Los cultivos se realizaron en Sabouraudglucosado agar (SGA) e incubados a 37 ºC. A partir de las72 h se observó en todos los tubos abundante desarrollo,en cultivos puros, de numerosas colonias de aspectofúngico que fueron identificadas como Aspergillusparasiticus Link, de acuerdo a la descripción para laidentificación de especies de Aspergillus provista por elDepartamento Micología INEI ANLIS (R. Argentina) (28).La identificación se basó en el estudio de los caracteresmacro y micromorfológicos de las colonias aisladas. Suidentidad fue corroborada por comparación con ladescripción de esta especie en la literatura especializada(8,20) (Fig. 1 y 2).

El diagnóstico micológico se basó en laobservación macro y micromorfológica de la colonia aisladaen SGA y en Agar Czapeck extracto de levadura. En SGAse aísla un hongo de crecimiento rápido, color amarilloverdoso a marrón claro uniforme que se oscurece con eltiempo, borde difuso, dentado y superficie densamentetapizada de conidióforos, anverso color dorado a rojo-marrón. Al esporular, la colonia toma un color verde olivaclaro uniforme, que se oscurece con la edad. En AgarCzapeck extracto de levadura a 28 ºC la colonia, al principiode color amarillo, rápidamente pasa a color verde oscuro yel reverso amarillo-crema, al envejecer se torna amarillo-naranja. Márgenes microlobulados, textura algodonosa.La observación microscópica muestra conidióforos delongitud variable, pared hialina, gruesa, con ornamentaciónequinulada, vesículas esféricas, uni o biseriadas (24-25µm), las fiálides cubren completamente la vesícula. Conidiosglobosos o subglobosos verrugosos (2,5-3 µm) conparedes delgadas (20, 21).

DISCUSION

El aumento de las enfermedades infecciosas en elmundo, a expensas del creciente número de individuos

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido - R.Salim & R.Runco

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que tienen afectada su competencia inmunológica,significa un enorme reto para el equipo de salud entérminos de diagnóstico y tratamiento. Las infeccionesoportunistas se producen cuando fallan los mecanismosdefensivos del huésped para enfrentar los procesosinfecciosos, en el que las micosis alcanzan un lugar cadavez más importante, por su frecuencia, difícil diagnósticoy elevada mortalidad (35, 36, 37, 38, 39).

Por su baja frecuencia, alta complejidaddiagnóstica y terapéutica, estas enfermedades caengeneralmente en el campo del especialista, pero el clínicogeneral debe conocer su existencia y característicasgenerales, para pedir ayuda o derivarlas oportunamente.Por ello, es necesario insistir en que la eficiencia con laque es evaluado un paciente y la eficacia de su tratamientodepende de un equipo de salud multidisciplinario (35, 38,39). El laboratorio y la tecnología, no deben estar fuera,sino dentro del método clínico, jugando un papel muyimportante y muchas veces decisivo en el diagnóstico,porque son capaces de poner en evidencia situaciones,allí donde no llega la sensibilidad de la clínica (40, 41).Para ello se debe disponer de materiales específicos ytécnicas adecuadas, rápidas y confiables paraproporcionar la información, acertada y precoz, sea éstabacteriana, viral, fúngica o parasitaria (25,30). En nuestropaís, los resultados de una encuesta nacional sobremicosis diagnosticadas entre enero y diciembre de 2004,con datos provistos por 72 laboratorios, mostraron quetan sólo un 8% de las muestras microbiológicas fueronsometidas a estudios micológicos (6).

El caso que exponemos, es una muestra de loimportante que resulta ‘no olvidar’ la posibilidad de unapatología fúngica, que puede quedar ‘oculta’ por lossíntomas y signos propios de la enfermedad de base enpacientes inmunodeprimidos. De hecho, el estudiomicológico del material granulomatoso y sangrante de ladescarga nasal espontánea, fue un episodio fortuito, ya

que la muestra fue llevada directamente al laboratorio sinun pedido médico formal para su análisis micológico. Laevaluación de un paciente con fiebre y neutropenia es unhecho frecuente en la práctica clínica y puede obedecer auna gran cantidad de situaciones patológicas, entre ellasinfecciones invasivas por hongos filamentosos olevaduriformes (2, 9, 30).

Los pacientes cuya neutropenia es prolongaday profunda, sobre todo si es secundaria a las quimioterapiasmás agresivas, habitualmente las de rescate, son los quecon más frecuencia se infectan con integrantes del géneroAspergillus. Es sabido que la terapia esteroidal en altasdosis, aumenta la susceptibilidad a la infección por esteagente (19, 30).

El diagnóstico de micosis sinusal requiere un altogrado de sospecha. Como los síntomas de sinusitisbacteriana y micótica son generalmente similares y sudistinción clínica resulta prácticamente imposible esnecesario sospecharla para así efectuar un diagnósticocorrecto y plantearlo cuando existe recurrencia opersistencia de enfermedad en un mismo sitio (1, 4, 11, 29).

En nuestro laboratorio, nos encontramosabocados a un programa rutinario de rastreo diario demuestras clínicas, no derivadas al laboratorio micológico,al menos en algunos casos seleccionados de pacientescuyas historias clínicas nos llevan a la sospecha de unaposible micosis. Esto podría justificar, en parte, elincremento en la incidencia de infecciones fúngicas en laedad pediátrica que se registró en nuestro medio, en losúltimos años (35, 36, 37, 38, 39, 40, 41).

Asimismo, el diagnóstico casual de micosissuperficiales y profundas en nuestro hospital ha sido cadavez más frecuente en el transcurso de estudioscomplementarios por otras patologías o patologías norelacionadas. Esto explicaría el aumento progresivo en lassolicitudes médicas de diagnóstico micológico en losúltimos tiempos lo que pone en evidencia el reconocimientomédico de la importancia y frecuencia de las micosis en el

Fig. 1. Colonia de A. parasiticus .En SGA a 10 días deincubación a 28 ºC

Fig. 2. Micromorfología de A. parasiticus en agar malta,en el recuadro se aprecia la rugosidad de los conidios.D IC (1000X)

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Hospital de Niños de Tucumán, así como de la necesidadde la utilización racional de los recursos de laboratorio(37, 38, 39).

Los hongos del género Aspergillus se distinguenpor su capacidad de causar afecciones muy diferentessegún el terreno del paciente. Resulta significativo que ala luz del conocimiento actual, la aspergilosis siga teniendouna alta morbilidad y mortalidad en grupos de individuosinmunodeprimidos (con enfermedades malignas,trasplantados, con SIDA, etc.) lo cual determina sucondición actual de enfermedad reemergente. Se expresacon nuevas formas graves en el curso de neutropeniasseveras en trasplantados, enfermedades malignas bajotratamiento, trasplante de médula ósea, enfermos de SIDA,etc. (2, 15, 16, 21, 33).

En la actualidad, la aspergilosis es la micosis máscomún de senos paranasales. En infecciones de víasrespiratorias altas se encuentran síntomas nasales,retronasales, sinusales y orbitarios Los síntomas nasalesse relacionan con secreción mucoide o mucopurulenta,inflamación de la mucosa nasal, aumento de tamaño de loscornetes y en ocasiones pólipos o dolor facial. Lainflamación granulomatosa es el sello histológico distintivode esta condición. Se presenta más comúnmente enpacientes con leucemia aguda y que han recibidotransplantes de médula ósea, los cuales son sometidos aterapias con corticosteroides que interfieren de maneraimportante con la función de los macrófagos (33).

Los hospederos más frecuentes son los pacientesneutropénicos con enfermedades hematológicas malignas,los trasplantados y los que padecen de enfermedadesgranulomatosas. La evolución casi siempre es de cursofatal con series que reportan mortalidades entre 80-100 %.De ahí la importancia del diagnóstico precoz, la profilaxisy el tratamiento específico temprano. Hay que sospecharcuando el curso febril permanezca por más de 72 h en estetipo de paciente, pese a tratamiento antibacteriano deamplio espectro (14, 19, 33).

Aun cuando las características clínicas de lasaspergilosis son generalmente idénticas para todas lasespecies del Aspergillus, a menudo se describen algunasparticularidades referidas a las infecciones causadas porA. flavus. Esta especie es más probable de ser recuperadade la zona respiratoria superior que cualquier otra especiede Aspergillus (1, 2, 4, 10, 18). Las presentaciones clínicasdel r inosinusitis aspergilar incluyen síndromesgranulomatosos agudos y crónicos invasivos y síndromesgranulomatosos no invasivos (4, 11). Para un diagnósticocorrecto, se debe obtener muestras de tejido para estudioshistopatológicos, que son esenciales, con cultivos de losespecimenes quirúrgicos. Los cultivos de moco nasal noson confiables para el diagnóstico porque pueden reflejar

sólo la presencia del hongo en el aire, más que laenfermedad.

Es importante enfatizar que debido a su naturalezacosmopolita, un cultivo positivo de un sitio no estéril,necesita del respaldo del estudio de microscopia directade la muestra y el aislamiento del hongo en muestrasrepetidas para considerarlo significativo. Aspergillus escapaz de crecer fácilmente en los medios de cultivo de unlaboratorio, de tal forma que en ocasiones es difícildiferenciar si se trata de un contaminante de la muestra, deun colonizador o de un invasor del huésped (13). Por ello,si bien el cultivo de la muestra obtenida permite laidentificación del hongo, el diagnóstico se establecedefinitivamente mediante el estudio histopatológico (1).

En un estudio realizado en la India, de 119personas con molestias sinunasales (de los cuales sólodos, diabéticos, tenían afección inmunitaria), el 42% tuvocultivos positivos para hongos. En 80% de los casos,Aspergillus flavus fue el agente causal. Los demás hongoscultivados fueron A. fumigatus (6%), Aspergillus spp.(4%), Alternaria spp. (4%), Rhizopus arrhizus (4%) yCandida albicans (2%) (22).

Actualmente se carece de datos confiables sobrela frecuencia de las micosis en la República Argentina. Lainformación disponible sobre frecuencia de micosis ennuestro país ha sido fragmentaria y geográficamentelimitada. Por esta razón existe muy poca bibliografíanacional sobre la incidencia de esta patología (6l).

El tratamiento depende si la sinusitis micótica,es invasiva o no,requiriendo la primera tratamientoquirúrgico y antifúngicos sistémicos (9, 33). Actualmentela droga de elección es el Voriconazol, siendo laanfotericina una alternativa principalmente por su menorcosto . Debe considerarse la resistencia a Anfotericina Bde Aspergillus terreus.

A. fumigatus es el mayor causante de lacolonización e invasión de senos paranasales como rutaaérea de infección al tracto respiratorio (21, 22, 23),mientras A.parasiticus , se consiera una especiecosmopolita, común en suelos cultivados, granos,alimentos granulados, compost, vegetales, insectos,productos almacenados y otros ambientes diversos, enmuchas localizaciones geográficas, incluyendo Argentina(42, 43, 44, 46, 49). Sin embargo, a pesar de ser consideradauna especie alergénica no se han documentado en lalinteratura casos de micosis invasivas por esta especie(8), lo que demuestra su aparente escaso poder patógenoen los mamíferos, una situación que se corrobora en estecaso clínico al colonizar saprofíticamente una descargasinusal del enfermo sin la invasión de la mucosa nasal apesar de la neutropenia grave y terminal.

Su falta de poder patógeno no se compara con su

Aspergilosis sinusal no invasiva por Aspergillus parasiticus en niño inmunocomprometido - R.Salim & R.Runco

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actividad toxicogénica donde A.flavus y A.parasiticusson los más comunes e importantes productores deaflatoxinas en alimentos y piensos, sin dejar de mencionarque actualmente ambos taxa pueden contener más de unaespecie (47, 50). Esta especie no se considera un habitantecomún de ambientes internos como A.flavus yA.fumigatus (47), pero se ha descrito en muy baja cantidaden ambientes hospitalarios (45). En nuestro caso nopodemos precisar su orígen ambiental, sin embargo, esprobable su entrada desde una fuente exógena por laparticular biogeografía de la zona.

Debe destacarse el raro y casual hallazgo deA.parasiticus colonizando saprofíticamente los senosnasales

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),4)íakekem

CASO CLINICO: ASPERGILOSIS PULMONAR INVASIVATRATADA CON VORICONAZOL EN PACIENTE CONSINDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA

(Clinical case: invasive pulmonary aspergillosis treated with Voriconazolin an AIDS patient)

H. Arias(1), R. Cruz (2) , M.de la Prida (3W. Jensen (4), R. Ahumada (4), M. Huilcaman (

(1) Medicina Interna, Hospital Gustavo Fricke, (2) Cátedra de MicologU de Valparaíso, (3) Respiratorio, Hospital Gustavo Fric

(4) Infectología ,Hospital Gustavo Fricrcruzchoappa@gmail.co

Palabras clave: Aspergilosis invasiva, VIH, VoriconazolKey words: Invasive aspergillosis, VIH, Voriconazol

Recibido el 21 Octubre 2008Aceptado el 15 Diciembre 2008

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RESUMEN

Se reporta un caso clínico de aspergilosispulmonar invasiva en un paciente de 29 años VIH(+) enetapa SIDA, sin antecedentes mórbidos conocidos, condiagnóstico inicial de neumonía por Pneumocystisjirovecii. Fue tratado con exito, pero sin asistir acontroles posterior a su alta . Tres meses después ingresaal servicio de Urgencias del Hospital Gustavo Frickecon tos productiva mucopurulenta, disnea progresiva,fiebre intermitente y compromiso del estado general. Laradiografía de tórax sugirió neumonía atípica, detectán-dose en los exámenes Pneumocystis jirovecii y Entero-bacter aerógenes , por lo que se inicia tratamiento conCotrimoxazol y Ertapenem. En los cultivos en agarSabouraud se detectó abundante desarrollo deAspergillus fumigatus , por lo que se empieza tratamientocon anfotericina B en dosis crecientes hasta alcanzar50 mg/día, sin embargo, por reacciones adversas severasse decidió tratamiento con Voriconazol intravenoso yluego oral, con buena respuesta clínica, radiológica yde laboratorio. Es dado de alta con tratamiento conVoriconazol oral, además de profilaxis secundaria paraP. jirovecii y Mycobaterium avium .

INTRODUCCION

Las infecciones fúngicas invasivas han aumentadoen las últimas décadas debido al aumento de los pacientesinmunodeprimidos y a tratamientos médicos y quirúrgicos

agresivos (Bennet, 2005). Aproximadamente unas 20especies de Aspergillus se han relacionado con patologíashumanas. De éstas, las más importantes en frecuencia sonA. fumigatus (80% del total), A. flavus, A. niger, A.nidulans y A. terreus (Thompson et al., 1987; Walsh &Dixon, 1989; Herbrecht et al., 2002). La mayoría de estas

ABSTRACT

A clinical case of an invasive pulmonary asper-gillosis in a 29 aged VIH (+) patient, at an AIDS stage,lacking any known morbid data, and bearing an initialdiagnosis of pneumonia by Pneumocystis jirovecii isherein described. Was successfully treated even thoughhe failed to attend subsequent health controls. Threemonths later he is admitted in the Hospital GustavoFricke, showing productive mucupurulent cough, pro-gressive disnea, intermittent fever and his overall healthcondition resulting deeply compromised. Thorax X-rayrevealed an atypical pneumonia together with the presen-ce of P. jirovecii and Enterobacter aerogenes, and decidedto treat him with Cotrimoxazol and Ertapenem. Meanwhi-le in agar cultures a heavy development of Aspergillusfumigatus was detected, thus the patient was given Anfo-tericina B in increasing doses up to reach 50mg/day;however due to some severe adverse reactions, the treat-ment with intravenous and later oral Voriconazol, whichrendered satisfactory clinical, radiological and labora-tory responses was ultimately preferred. The patient isdischarged from the hospital and advised to continuewith oral Voriconazol besides undergoing secondaryprofilaxis for P. jirovecii and Mycobaterium avium.

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especies esporulan profusamente con una alta dispersiónanemófila de sus conidios, los cuales por su reducidotamaño, pueden ser inhalados causando multiplicación einvasión pulmonar o de otros órganos, en dependenciade la respuesta inmune del huésped (Bennet, 2005;Sanchez, 2000). Las aspergilosis invasivas presentan unaalta mortalidad, la cual varía desde un 50% hasta un 90%dependiendo de la localización de la infección, patologíade base del paciente y de la precocidad del diagnóstico einicio de tratamiento (Pontón, 2003). En la actualidad secuenta con exámenes como el test de galactomanano y latomografía axial computada (TAC), cuyo signo más precozen aspergilosis pulmonar invasiva es el signo del halo.Estas pruebas, además de cultivos, examen microscópicodirecto, biopsia y biología molecular (Guzmán, 2005),permiten un diagnóstico oportuno en pacientes confactores de riesgo para tales infecciones. El patrón dereferencia que permite establecer de forma probada,probable o posible la existencia de una infección fúngicapor un hongo filamentoso, corresponde a los criteriosconjuntos de la EORTC (European Organization forResearch and Treatment of Cancer) y el Mycoses StudyGroup del NIAID (National Institute of Allergy andInfectious Diseases) de EE.UU (Pontón, 2003; Ascioglu etal., 2002).

Los factores de riesgo, criterios microbiológicos yclínicos para aspergilosis invasiva son variados, entre losfactores de riesgo se destacan: (a) Menos de 500 neu-trófilos /mm3 por más de 10 días, (b) fiebre persistente(más de 96 hrs) refractaria a antibióticos de amplio espectroen pacientes de alto riesgo, (c) t emperatura mayor de 38ºCo menor de 36º C, (d) neutropénia por mas de 10 días en los60 días anteriores, (e) uso de inmunosupresores en los 30últimos días, (f) infección fúngica invasiva (probada oprobable) durante el episodio neutropénico previo, (g)coexistencia de SIDA sintomático, (h) signos y síntomasde enfermedad injerto contra huésped severa o enferme-dad extensa crónica, (j) uso prolongado (más de 3 semanas)de corticoides en los 60 días previos.

Dentro de los criter ios microbiológicos enaspergilosis pulmonar se debe considerar: (a) cultivopositivo para Aspergillus spp. a partir de esputo o lavadobroncoalveolar, (b) cultivo positivo o citología omicroscopia directa positiva para Aspergillus spp. deesputo o lavado broncoalveolar, (c) antígenos de Asper-gillus spp. positivo en muestras de lavado broncoalveolar,(d) citología o microscopia directa positiva para Asper-gillus spp. en muestras habitualmente estériles.

Dentro de los criterios clínicos de infecciónpulmonar por Aspergillus se deben considerar: (a)criterios mayores: cualquiera de los siguientes hallazgosde la tomografía axial computarizada: signo del halo, signo

del crecente aéreo (o signo de la media luna) o cavitaciónsin área de consolidación (excluyendo Mycobacterium,Legionella o Nocardia spp.) y (b) criterios menores:síntomas (tos, dolor torácico, hemoptisis, disnea), rocepleural, nueva opacidad radiológica, derrame pleural.

CASO CLINICO

Paciente de 29 años, soltero, homosexual, sinantecedentes mórbidos conocidos.

El 15 de Enero del 2008 tras cuadro de tos seca,baja de peso y disnea progresiva, es derivado desde elHospital de Quintero con diagnóstico presuntivo deneumonía por Pneumocystis jirovecii. En esa oportunidadse detecta una LDH de 1046 UI/l, elevación de PCR y uninfiltrado radiológico intersticial de ambos campospulmonares, por lo que se inició tratamiento con Ceftriaxonay Cotrimoxazol E.V, el mismo que se mantuvo por 14 díashasta el alta, continuando con tratamiento oral. Durante lahospitalización se realizó un test de Elisa para VIH el cualresultó positivo y un recuento de CD4 de 14 células. Elexamen del lavado broncoalveolar no detectó presenciade Pneumocystis y el cultivo de Koch fue negativo.

El paciente no asistió a controles en policlínico deinfectología hasta el 15 de abril del 2008, fecha en la que esderivado por médico particular al servicio de Urgenciasdel Hospital Gustavo Fricke con historia de cuadro de tosproductiva mucopurulenta, disnea progresiva, fiebreintermitente y compromiso del estado general asociado aradiografía de tórax que sugirió neumonía atípica sin quese pudiera descartar un proceso tuberculoso (Fig. 1).

Ingresó al Hospital Gustavo Fricke el día 17 de Abrilde 2008. Dentro del examen físico destacó leucoplasiavellosa, sin adenopatías cervicales, axilares ni inguinales,murmullo pulmonar disminuido globalmente y crepitantesbilaterales pero con predominio izquierdo y condilomasacuminados en región anal.

De los exámenes de laboratorio destacó unaelevación significativa de PCR, no se solicitó LDH a suingreso, leucocitos de 4.600 x mm3, hematocrito de 29%,sin falla respiratoria hipoxémica y baciloscopías negativas.El día 18 de Abril se observó en muestra de expectoracióny mediante tinción de azul de toluidina presencia demoderada cantidad de Pneumocystis jirovecii por lo quese inicia tratamiento con Cotrimoxazol ev.

Se solicitó fibrobroncoscopía la cual mostró unaarquitectura conservada del árbol bronquial y abundantesecreción mucopurulenta. El cultivo del LBA mostródesarrollo de Enterobacter aerógenes con un recuentode colonias significativo por lo que se inició tratamientosegún antibiograma con Ertapenem a dosis de 1 g al día.Al mismo tiempo, los 6 cultivos en agar Sabouraud a 37ºmostraron abundante desarrollo de Aspergillus fumigatus

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Caso clínico: Asperguilosis pulmonar invasiva tratada con Voriconazol en paciente con VIH - Arias et al.

complex (Fig. 2), por lo que se inició tratamiento conAnfotericina B (AMB) en dosis crecientes hasta alcanzarlos 50 mg/día , tratamiento que se mantuvo por 10 días,tiempo en el cual presentó deterioro moderado de su

Fig. 3. TAC inicial con compromiso parenquimatosobilateral, predominantemente en pulmon izquierdo

Fig. 1. Radiografía de tórax que sugirió neumoníaatípica

Fig. 5 . TAC control de tratamiento

Fig 4. TAC de tórax que muestra signo del halo,característico de la aspergilosis pulmonar invasiva.

Fig. 2. Aspergillus Fumigatus

función renal, hipokalemia y datos que apoyaron unacolestasia, por lo que se suspendió la Anfotericina y seinició terapia con Voriconazol en dosis de 6mg/kg cada 12horas el primer día y posteriormente 4 mg/kg cada 12 horasinicialmente por vía endovenosa.

El scanner de tórax inicial mostró lesionespulmonares bilaterales, con compromiso predominante-mente del parénquima pulmonar izquierdo (Fig.3) y lesióncavitada con signo del halo característico de aspergilosispulmonar invasiva (Fig.4) y mínimo derrame pericárdico.

Finalmente el recuento de CD4 fue de 9 células porlo que se inició profilaxis para Mycobacterium avium conAzitromicina 500 mg semanal.

El paciente evolucionó favorablemente mantenien-do parámetros sépticos apagados y clínicamente estableuna vez iniciado el tratamiento. Se realiza TAC de tórax decontrol dos semanas posteriores a inicio de tratamiento, elcual muestró una resolución del patrón inflamatorioparenquimatoso y cavitaciones secuelares (neumatoceles)(Fig. 5).

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Boletín Micológico Vol. 23 : 9-14 2008

Es dado de alta con indicación de tratamiento víaoral con Voriconazol en dosis de 200 mg cada 12 horas,además de profilaxis secundaria para Pneumocytisjirovecii (Cotrimoxazol forte un comprimido diario) yMycobaterium avium (Azitromicina 500 mg semanal).

Estudio micológico. Los cultivos de expectoración fueron enviados a

la Cátedra de Micología de la Universidad de Valparaíso.En agar Sabouraud a 37º crecieron colonias que tanto a lamacro como a la microscopia eran sugerentes deAspergillus fumigatus, las cuales se traspasaron a agarCzapec extracto de levadura (CYA) y agar Malta (MEA) a25 y 37ºCº. A 25ºC en CYA durante 7 días, crecieron coloniasentre 45 y 65 mm de diámetro, mientras en MEA a la mismatemperatura 40-60 mm. En CYA a 37ºC (60-66 mm) mientrasen MEA (62-64 mm). Máximo crecimiento 52ºC (± 1º).Conidios verde oscuros a verde turquesa, micelio blanco,con exudado y sin pigmentos, reverso amarillento en CYA.A la microscopía, las cabezas conidiales fueronpredominantemente columnares, con conidióforo incoloro,de pared lisa, grises cerca del ápice, vesículas piriformes aespatuladas, entre 18-25µm; fiálides uniseriadas entre 5-9por 2-3 µm cubriendo la mitad superior de las vesícula;conidios, globosos a elipsoidales, lisos a finamenterugosos 2-3 µm.

Con estas características morfofisiológicas seconfirmó el aislado como Aspergillus fumigatus

DISCUSION

Distintas especies del género Aspergillus puedencolonizar las vías respiratorias y posteriormente produciruna invasión en aquellos pacientes con algún grado deinmunodepresión celular, en especial los neutropénicos.A. fumigatus es la especie más aislada en todas las formasclínicas de aspergilosis, tanto en la no invasiva como en lainvasiva (Henderson & Chapman, 2004; Cruz et al., 2005 ).Esta última destaca por su mayor gravedad y por su altamortalidad dependiendo de la condición inmune delpaciente, el diagnóstico precoz y el oportuno tratamientocon antifúngico de última generación. El cuadro clínico deuna aspergilosis pulmonar es inespecífico y puedeconfundirse con una neumonía bacteriana o viral (Arteaga& Grande Argudo, 1999). Las imágenes en la radiografíason variables y difíciles de diferenciar en su etiología, razónpor la cual es urgente en estos pacientes, poder contarcon TAC y test de galactomanano, el cual ha demostradosu mayor utilidad diagnóstica en pacientes neutropénicosque cursan precozmente una aspergilosis invasiva, ademásde su utilidad pronostica en el control de la respuesta altratamiento antifúngico (Pereira et al., 2005; Pontón, 2003).

Con respecto al tratamiento, en los últimos años

han aparecido nuevos medicamentos que han demostradouna mejor respuesta clínica y con menos reaccionesadversas que la Anfotericina B deoxicolato, entre elloslos azoles de ultima generación como el Voriconazol, lasEquinocandinas como la Caspofungina y las formulacioneslipídicas de Anfotericina B como la liposomal (Saballs etal., 2000; Wieland et al., 2005). El Voriconazol esconsiderado como la droga de elección en la aspergilosisinvasiva; es un Triazol de segunda generación, derivadosintético del Fluconazol que actúa inhibiendo la 14-alfademetilasa y la 24 dihidrolanosterol demetilasa,disminuyendo la síntesis de ergosterol, componentefundamental de la membrana celular fúngica(Wieland etal., 2005). La casuística nacional referente a aspergilosispulmonar se inicia en la mitad del siglo pasado,evolucionando desde aportes del diagnóstico basadossolo en hallazgos microbiológicos e histológicos (estosúltimos principalmente post mortem) a los primeros intentosde anticuerpos anti Aspergillus en el suero de los enfermos(Yarzabal et al., 1974). Posteriormente se han publicadovarios casos de aspergilosis principalmente invasivas(Thompson et al., 1985; Mendoza et al., 1985; Pillaux, etal., 2000; Zambrano et al., 2007 ), además de los aspectosanatomopatológicos, clínicos y técnicas modernas comoPCR, que apoyan al diagnóstico convencional (Oddo &Thompson, 1990).

El caso expuesto evidencia lo importante de lasospecha precoz de aspergilosis en los pacientes conSIDA, su diagnóstico oportuno con cultivos eimagenología, además de la buena respuesta al tratamientocon Voriconazol y las reacciones adversas severas de laAnfotericina B deoxicolato (falla renal, colestasia ehipokalemia).

Los métodos más empleados en los laboratoriosen la identificación de las especies de Aspergillus deorigen clínico, se basan mayoritariamente en el análisis desus características de cultivo, propiedades fisiológicas yla morfología de sus estructuras asexuales o sexuales.Sin embargo, los esquemas morfológicos pueden presen-tar ciertas dificultadas cuando las cepas clínicas impor-tantes y comunes, muestran grados de variabilidad en suscaracteres fenotípicos, situación que dificulta la determina-ción a nivel de especie (Samson et al., 2006).

Los miembros de la sección Fumigati en particular,son unos de los ejemplos actuales a considerar por poseercaracterísticas morfológicas que se superponen al incluirdistintas especies genéticas dentro de una única morfo-especie (Balajee et al.,2005a; 2005b; 2007; Katz et al., 2005).A. fumigatus sigue siendo el más común agente de asper-gilosis, sin olvidar que sus aislamientos clinicos no sonsiempre morfológicamente característicos y se hancometido errores en el pasado en su identificación aplican-do solo características morfológicas (Balajee et al., 2006).

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Caso clínico: Asperguilosis pulmonar invasiva tratada con Voriconazol en paciente con VIH - Arias et al.

Estudios actuales, con métodos polifásicos(morfológicos, fisiológicos y moléculares), han reevaluadola sección Fumigati (así como otras) (Hong et al., 2005;Yaguchi et al., 2007) y sus resultados determinaron quelas especies anamórficas de esta sección pueden serdivididas en 5 clades: la clade I incluye A. fumigatus y susotras 7 especies consideradas como sinónimos, la cladeII: A.lentulus y A.fumisynnematus; la clade III: A. fumi-gatiaffinis y A. novofumigatus; la clade IV: especiesatípicas de A. fumigatus incluyendo A. viridinutans y laclade V: A. brevipes, A. duricaulis y A. unilateralis. Lamayoría de las cepas clínicas obtenidas en Japón seagrupan juntas en la clade I, otras en la clade II y IV, yninguna en las clades III y V.

Se han analizado también las correlaciones entremorfología, máximo crecimiento a diversas temperaturasy la filogenia de los aislados dentro de la sección (Balajeeet al. 2005a, 2007; Katz et al., 2005). El máximo desarrolloa diversas temperaturas de las clades I, II, III, IV y V fueroncalculadas sobre los 50 °C, 45 °C, 45 °C, 42 °C y 42 °C,respectivamente; estos datos fisiológicos son muy útilesen la separación de especies dentro de la sección Fumigati,mostrando buena correlación entre las característicasfilogenéticas y fenotípìcas (Balajee et al., 2007; Samson etal., 2007).

Nuestra cepa clínica, se clasificó morfofisio-lógicamente como A. fumigatus mediante cultivos enmedios estandarizados, creciendo a una temperaturamáxima de unos 52ºC. A 25ºC en MEA, presentó unamorfología característica de sus vesículas, fiálides yconidios, por lo cual se separó de una especie similar capazde crecer a la misma temperatura máxima, pero con unavesícula diferente como se observa en la nueva especieAspergillus turcosus Hong, Frisvad & Samson, aislada enKorea del Sur (en Samson et al., 2007).

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Boletín Micológico Vol. 23 : 15 - 20 2008

ACTIVIDAD LIPASA DE ESPECIES DE MalasseziaAISLADAS EN PACIENTES SANOS Y CON

LESIONES DERMICAS

(Lipase activity of Malassezia species isolated from healthy patientsand having dermic lesions)

Maria de los Angeles Sosa, Florencia Rojas, Sergio Toma VanacoreMagdalena Mangiaterra, Gustavo Giusiano

Departamento Micología. Instituto de Medicina Regional.Universidad Nacional del Nordeste. Av. Las Heras 727,

3500 Resistencia, ArgentinaE-mail: gusgiusi@medreg.unne.edu.ar

Palabras Claves: Malassezia, activididad lipasaKey words: Malassezia, lipase activity

Recibido el 23 Abril 2008Aceptado el 2 Julio 2008

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RESUMEN

Las levaduras del género Malassezia forman partede la microbiota normal de piel humana y animal.Excepto M. pachydermatis, todas las especies de estegénero son lipodependientes. Bajo ciertos factores,Malassezia se asocia como agente etiológico en diversasafecciones dérmicas. Uno de los principales factores devirulencia de estas levaduras es su actividad de lipasa(AL). El objetivo de este trabajo fue introducir modifica-ciones a las técnicas de determinación de la actividadlipasa (AL) para su aplicación en levaduras lipodepen-dientes y estudiar la AL en cepas de Malassezia aisladasde personas con piel sana y de pacientes con pitiriasisversicolor (PV), dermatitis seborreica (DS) y psoriasis(PS). Se estudiaron 94 cepas aisladas de 34 pacientescon lesiones de PV, 20 con DS, 7 con PS y 33 cepas depersonas con piel sana. Las modificaciones planteadasa la técnica, que incluyeron variación del medio decultivo y tiempos de incubación, permitieron ladeterminación semicuantitativa de la AL con resultadosclaros y definidos. El 88,23% de las cepas presentó AL.No se obtuvieron diferencias estadísticamente significa-tivas al comparar la AL entre las cepas de pacientes conafecciones de piel y las cepas aisladas de personas sanas.La producción de lipasas de las especies de Malasseziaen orden decreciente fue: M. sympodialis, M. slooffiae,M. furfur, M. globosa, M. restricta. M. globosa y M.furfur fueron las especies en que se observaron mayorcantidad de cepas no productoras de AL y cepas congran variabilidad en la medida de AL.

ABSTRACT

Yeasts of the genus Malassezia are part of theregular microbiota in human and animal skin. Exceptfor M. pachydermatis, all the species of this genus arelipodependent. Malassezia, under certain factors, isassociated as an etiological agent in diverse dermicaffections. One of the main virulence factors of these yeastsis their lipase activity (LA).

The objective of this research was to introducesome changes in the techniques adopted to determinethe lipase activity (LA) in order to apply them tolipodependent yeasts and to study likewise the LA inMalassezia strains isolated from healthy skin people andpatients diagnosed with pitiriasis versicolor (VP),greasy dermatitis (GD) and psoriasis ( PS). Ninety fourstrains isolated from 34 patients having VP lesions, 20with GD, 7 with PS and 33 strains from healthy skinpeople. Changes suggested to the technique involved avariation in the medium of culture as well as in the timeof incubation what resulted in the semiquantitativedetermination of the LA together with clear and preciseresults.

The presence of LA was observed in of 88.23%strains. The comparison of the LA among strains ofpatients bearing injured skin and those isolated fromhealthy skin did not show any significant statisticaldifference. The production of lipasae from Malasseziaspecies were in decreasing order: M.sympodialis, M.slooffiae, M.furfur,M.globosa and M.restricta. M. glo-bosa and M. furfur were the species that revealed thehighest number of non producting LA strains as well asstrains with the highest variability in the degree of LA

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INTRODUCCION

En contraste con las bacterias, pocos son loshongos que se pueden definir como patógenos primariosy sus mecanismos de patogénesis son mucho menoscomprendidos. La mayoría de estos organismos vivencomo saprófitos ambientales o como simbiontes,coexistiendo con el hospedador sin consecuenciasnegativas. Sin embargo, algunos son capaces de parasitarhospedadores sanos y generar desde infeccionessuperficiales hasta las diseminadas o invasoras (1).

Actualmente el género Malassezia está confor-mado por las siguientes especies: M. furfur, M.sympodialis, M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M.slooffiae, M. dermatis, M. yamatoensis, M. japonica, M.pachydermatis, M.nana y M. equii. Las 9 primeras formanparte de la microbiota normal de la piel del hombre y las 3últimas están adaptadas al estrato córneo de los animales(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8). Desde el punto de vista fisiológico estaslevaduras se distinguen por su lipodependencia, debido aque tienen un defecto en la síntesis de ácidos grasos quese manifiesta en su requerimiento exógeno; excepto M.pachydermatis, la cual es lipofílica pero no lipodendiente(9, 10, 11, 12).

Bajo la influencia de ciertos factores, las especiesde Malassezia pueden volverse patógenas y participaren diversas enfermedades dermatológicas superficiales einfecciones sistémicas (2, 9, 13, 14, 15). Está demostradoque este género es el agente etiológico de la pitiriasisversicolor y la foliculitis y que se asocia a dermatitisseborreica, exacerba la dermatitis atópica y se lo consideracomo patógeno secundario a otras afecciones de piel. (2,3, 16, 17).

La virulencia es una compleja interrelación entre elorganismo infeccioso y el hospedador. La patogénesisfúngica involucra una interacción y a veces unamodificación de factores para ambos (1, 12) y uno de losprincipales en la virulencia de estas levaduras es suactividad de lipasa (17).

El conocimiento sobre los patrones bioquímicosdel género Malassezia es exiguo y los escasos informesexistentes sobre la producción de lipasa y lipoxigenasa,tanto in vivo como in vitro, fueron realizados antes de larevisión del género cuando se consideraban sólo dosespecies, M. furfur y M. pachydermatis (17, 18, 19, 20).

El objetivo de este trabajo fue introducir modi-ficaciones a las técnicas de determinación de la actividadlipasa (AL) para su aplicación en levaduras lipo-dependientes y estudiar la AL en cepas de Malasseziaaisladas de personas con piel sana y de pacientes conpitiriasis versicolor (PV), dermatitis seborreica (DS) ypsoriasis (PS).

MATERIALES Y METODOS

Entre los meses de octubre del 2005 y diciembre de2007, se estudiaron cepas de Malassezia aisladas depersonas que asistieron al Instituto de Medicina Regional(UNNE) y agrupadas de la siguiente manera:Criterio de inclusión:

Grupo I: Cepas aisladas de todos los pacientescon PV, DS y PS que demandaron atención.

Grupo II: Cepas aisladas de personas clínicamentesanas, sin lesiones de piel.Criterios de exclusión:

Grupo I: Cepas aisladas de pacientes condiagnóstico de PV, DS y PS que no hubieran suspendidoel tratamiento tópico u oral 7 días previos a la toma demuestra.

Grupo II:Cepas aisladas de personas clínicamente sanas

que presentaran algún antecedente de afección de piel decualquier índole en los 5 meses precedentes a la toma de lamuestra.

Cepas aisladas de personas con tratamientoantibiótico y/o corticoide durante los 15 días precedentesa la toma de la muestra.

En el caso del Grupo I se tomaron muestras de laslesiones y del Grupo II desde la espalda y el cuerocabelludo. Las muestras fueron recolectadas por raspadocon bisturí estéril y sembradas en medio de Agar Dixonmodificado e incubadas a 32ºC hasta 7 días, con observa-ciones diarias (21).

IdentificaciónTodas las cepas de Malassezia aisladas se

tipificaron en base a sus características macro y micro-morfológicas y a sus propiedades bioquímicas yfisiológicas, según la metodología propuesta por Guillotet al. (21). Para confirmar la identificación se realizaronestudios moleculares, aplicando la metodología de PCR-RFLP basada en la técnica de Mirhendi et al. (22).

Como cepas control se incluyeron cepas dereferencia CBS 7886 M. globosa, CBS 7019 M. furfur,CBS 7222 M. sympodialis, CBS 9169 M. dermatis, CBS9432 M. japonica, CBS 10533 M. pachydermatis, CBS7991 M. restricta, CBS 9725 M. yamatoensis y CBS 7956M. slooffiae.

Actividad lipasaLa determinación de la AL se realizó tomando

como base la técnica de Riciputo et al. (20), con modifi-caciones para el estudio de levaduras lipodependientes,introducidas por este grupo de investigación. Al mediobase de acuerdo a Riciputo et al. que incluye yema dehuevo como fuente de lípidos, se le agregó taurocolato

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Actividad lipasa en especies de Malassezia - Sosa et al.

de sodio como activador de la producción de lipasas. Lasplacas con medio yema de huevo-taurocolato una vezinoculadas se incubaron a 32ºC. Se hicieron lecturas losdías 3, 5, 7 y 10. La formación de zonas de lipólisis oaclaración alrededor de la colonia se consideró indicativade la producción enzimática. La medida y el cálculo de la zona de AL se realizóde acuerdo al método descripto por Price et al. (23). La ALse calculó como la relación entre el diámetro de la coloniay el diámetro de la zona de lipólisis (23, 24). Estoscoeficientes posteriormente se agrupan en 3 clases, lo quepermite hacer una medición semicuantitativa de la actividadenzimática:

AL = Diámetro de la colonia Diámetro de la zona de producción enzimática

AL 0.69: actividad lipasa alta (+++) 0.69 >AL < 0.89: actividad lipasa media (++) 0.9 > AL < 1: actividad lipasa baja o no detectable (+)

Aquellas cepas en las que no se detectó producciónde la enzima, es decir, que se obtuvo una AL=1, secategorizaron como no productoras de lipasa. Para obtenerun promedio de AL se midió la AL de 3 colonias de cadacepa estudiada. Todas las determinaciones se realizaronpor triplicado.

Se incluyeron cepas de referencia: CBS 7886 M.globosa, CBS 7019 M. furfur, CBS 7222 M. sympodialis,CBS 7991 M. restricta y CBS 7956 M. slooffiae.

RESULTADOS

Se estudiaron 94 cepas aisladas de 34 pacientescon lesiones de PV, 20 con DS, 7 con PS y 33 cepas depersonas con piel sana. En la Tabla 1 se presenta ladistribución de las especies aisladas según el origen de lacepa.

De los 94 aislados de Malassezia spp., 83 (88,23%)presentaron AL. En la Tabla 2 se muestra el índice de ALpor grupo y afección dérmica.

La distribución por especie de los valores de AL delos 94 aislamientos estudiados se muestra en la Tabla 3. Elvalor mínimo de AL obtenido se ubicó en 0,198 y el máximoen 1.

La producción de lipasas de las especies deMalassezia en orden decreciente fue: M. sympodialis, M.slooffiae, M. furfur, M. globosa, M. restricta.

Respecto a los tiempos de lectura, al 3er día no seobservó desarrollo de M. globosa ni de M. restrica. Apartir del día 5, todas habían desarrollado e iniciado suactividad. Entre el día 7 y el 10 se observó una disminuciónen la relación diámetro de la colonia/diámetro de la zonade producción enzimática. Por esta razón se tomó el

Tabla 1: Distribución de especies aisladas según grupo y afección de procedencia

Actividad Lipasa N cepas con AL (AL ± SD) %

Pitiriasis versicolor 34 30 0,382 ± 0,246 88.24 Dermatitis seborreica 20 18 0,379 ± 0,235 85.71 Grupo I

Psoriasis 7 7 0,292 ± 0,096 100 Grupo II Piel sana 33 28 0,437± 0,270 84.85

Total 94 83 88.23 AL: Índice de actividad lipasa. SD: Desviación estándar

Tabla 2: Actividad lipasa de Malassezia spp. según grupo y cuadro clínico de procedencia.

Grupo I Grupo II Especie Pitiriasis

Versicolor Dermatitis Seborreica Psoriasis Piel sana

Total

M. furfur 11 5 2 11 29 M. sympodialis 9 3 1 6 19 M. globosa 14 10 3 14 41 M. restricta 0 1 1 1 3 M. slooffiae 0 1 0 1 2 Total 34 20 7 33 94

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Boletín Micológico Vol. 23 : 15 - 20 2008

Tabla 3: Distribución de los valores de AL obtenidos según la especie.

septimo día como punto de corte para la lectura de AL,cuando las relaciones fueron más altas.

Todos los valores de las Tablas 2 y 3 correspondena la medida obtenida el día 7. Utilizando la prueba de análisisde la varianza ANOVA para comparar la AL entre las cepasde pacientes con afecciones de piel (Grupo I) y las cepasde personas sanas (Grupo II), no se obtuvieron diferenciasestadísticamente significativas.

DISCUSION

La asociación de las especies de Malassezia adiversas patologías ha impulsado el estudio de sucapacidad patogénica. Se considera que la producción deproteinasas y lipasas juega un papel importante en lapatogenicidad de estos hongos oportunistas (17). Existeun gran número de publicaciones en las cuales se examinala producción de estas enzimas hidrolíticas en aislados deC. albicans y su papel en la patogénesis de la candidosisinvasiva, ya que están relacionadas con su virulencia,pero, existen escasos estudios que investiguen suexistencia y su relación con la virulencia de las levadurasdel género Malassezia (25-28).

Los pocos trabajos publicados sobre la actividadenzimática de Malassezia fueron realizados antes de larevisión del género, cuando se conocían sólo dos especies,M. furfur y M. pachydermatis (18, 19, 20). Probablementeesos resultados deben ser reevaluados, ya sea, porque nocorrespondan a alguna de las especies nombradas, o bien,por la posibilidad de la existencia de mezclas en loscultivos. El amplio espectro de especies de Malasseziareconocido en la actualidad hace interesante el estudio delos patrones bioquímicos y del comportamiento de cadauna de ellas.

En este estudio se planteó la utilización de un mediosólido que permite la determinación semicuantitativa de laAL. El agregado de taurocolato dio buenos resultados, yaque los halos de producción enzimática obtenidos siemprefueron claros y definidos, por lo tanto, de fácil lectura yapreciación.

Debido a que el género Malassezia se desarrollamás lentamente en cultivo que otras levaduras, comoCandida, el tiempo de incubación fue más prolongadoque el de la técnica original que fue ideada para levadurasno lipodependientes (20). Malassezia se desarrolla entre5 y 7 días, por lo que su mayor actividad se observó al 7modía.

En nuestro trabajo encontramos AL en el 88,23%de los 94 aislamientos estudiados. Neves et al. (29), en unestudio similar al nuestro, hallaron 100% de AL en 11aislamientos de Malassezia. Probablemente la discrepanciaen el porcentaje de positividad se relacione con el númerode cepas estudiado ya que aquellos autores sólo encon-traron M. furfur y M. sympodialis.

En nuestro trabajo M. sympodialis fue la especieque mostró mayor AL. Por otro lado, las 2 cepas de M.slooffiae presentaron alta AL. Dado el bajo número deaislamientos obtenidos, es difícil obtener una conclusiónde valor sobre esta especie.

M. globosa y M. furfur fueron las especies en quese observaron, por un lado mayor cantidad de cepas noproductoras de actividad, y por otro, cepas con granvariabilidad en cuanto a la medida de AL, como así también,en cuanto a su distribución en relación a las patologías enque se asocian y su presencia en piel sana.

Si bien esta claro que la actividad lipolítica esesencial para el crecimiento de Malassezia, al parecer noes su única función. Los lípidos asociados a la pared celular

Especie M. furfur M. globosa M. sympodialis M. restricta M. slooffiae AL Clase n % n % n % n % n %

1,00 + 2 6.89 8 19.51 0 0 1 33.33 0 0 0,90 – 0,99 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,80 – 0,89 ++ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,70 – 0,79 ++ 0 0 1 2.44 0 0 0 0 0 0 0,60 – 0,69 ++ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,50 – 0,59 +++ 1 3.44 2 4.88 0 0 0 0 0 0 0,40 – 0,49 +++ 4 13.80 4 9.75 3 15.79 2 66.67 0 0 0,30 – 0,39 +++ 11 37.93 15 36.6 2 10.53 0 0 2 100 0,20 – 0,29 +++ 11 37.93 10 24.39 9 47.37 0 0 0 0 0,00 – 0,19 +++ 0 0 1 2.44 5 26.31 0 0 0 0 29 100 41 100 19 100 3 100 2 100

* Clase +: 0.9 ≤ AL ≤ 1; clase ++: 0.69 ≤ Lz ≤ 0.89; clase +++: Lz 0.69

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Actividad lipasa en especies de Malassezia - Sosa et al.

han demostrado estar involucrados en una forma deevasión de la respuesta, ya que inhiben la respuestaproinflamatoria normal y esto provee la explicación de suestado de biota comensal en la piel. Además se cree queestos lípidos tienen importancia en la actividad fagocítica,dificultando su internalización y posterior acciónmicrobicida (30).

Se ha postulado que la AL está directamenterelacionada a la virulencia, por lo tanto, a mayor AL mayorvirulencia (18). En este trabajo no se encontrarondiferencias significativas entre los niveles de AL de cepasde afecciones y los de piel sana. Tampoco el índice ANOVAdetectó diferencias significativas entre los resultados delas AL comparando los aislamientos de las diferentesafecciones dérmicas estudiadas. La AL debe serconsiderada como uno de los factores de virulencia deestas levaduras, pero no el único factor que influye sobrela patogenicidad.

Esta es una contribución al avance en el estudio dela ecología y del rol patogénico de las especies hoyconocidas del género Malassezia.

AGRADECIMIENTOSAgradecemos la asistencia técnica de la Sra. Liliana

Alegre en el desarrollo del presente trabajo.

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Recibido el 30 Octubre 2008Aceptado el 5 Diciembre 2008

Boletín Micológico Vol. 23 : 21 - 25 2008

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ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA Y SUSCEPTIBILIDAD INVITRO A FLUCONAZOL EN AISLAMIENTOS CLINICOS

Y AVIARIOS DE Cryptococcus neoformans

(Phospholipase activity and «in vitro» susceptibility to fluconazolin clinical and aviars isolates of Cryptococcus neoformans)

Gabriel Pérez C. (1), Gisela González H. (2),M. Cristina Díaz J. (3)

(1). Facultad de Medicina, Universidad de Chile(2). Programa Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias, Universidad de Chile

(3).- Programa de Microbiologia y Micología, ICBM,Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

mcdiaz@med.uchile.cl

Palabras clave: Fosfolipasa, Cryptococcus neoformans, susceptibilidad FluconazolKey words:Phospholipase, Cryptococcus neoformans, susceptibility Fluconazol

RESUMEN

Se detectó la actividad de fosfolipasa en 19 cepasclínicas y 17 aviarias de C. neoformans var. neoformans,usando Agar Sabouraud con yema de huevo,incubándose a 37ºC por 5 dias. Se determinó el índicePz estableciéndose los siguientes rangos: Pz muy alto(0.9-1), alto (0.89-0.80), bajo (0.79-0.70) y muy bajo (<0.69). El 84% de las cepas clínicas presentaron índicePz muy bajo, el 5% bajo y 11% muy alto. Mientras en lascepas aviarias el 82% presentaron índice muy bajo y un18% muy alto. Los valores de Pz promedio fueron muybajos en todos los aislamientos, sin existir diferenciassignificativas (p > 0,05) entre las cepas clínicas yaviarias, lo que implica una alta actividad enzimática.La susceptibilidad in vitro a Fluconazol se realizó por elmétodo de difusión con discos y el 89,5 % de las cepasclínicas fueron sensibles y el 10,5% resistentes, mientrasen las cepas aviarias, el 59% fueron sensibles, 29%sensible dosis dependiente y un12% resistentes.

INTRODUCCION

Cryptococcus neoformans es una levaduracapsulada que pertenece a los Basidiomycota (Garau,2002) y que posee diversos factores de virulencia, entrelos cuales se encuentra la fosfolipasa y por ende la produc-

ción de esta enzima extracelular se relaciona eventualmentecon patogenicidad (Ghannoum, 2000) .

Paralelamente al aumento de la población en estadode inmunodepresión, la infección por C. neoformans haemergido como una causa importante de morbilidad ymortalidad, afectando especialmente a pacientes con SIDAen etapa avanzada. Actualmente, representa la causa máscomún de meningitis fúngica en el mundo, y es una de laslevaduras más frecuentemente asociadas a infección fún-

ABSTRACT

Phospholipase activity was determined to 19clinical and 17 aviars trains of C. neoformans var.neoformans, incubating the yeast for 5 days at 37º C onSabouraud Agar supplemented with egg yolk. Pz valueswere determined and the following ranges wereestablished:very high (0.9-1), high (0.89-0.80), low(0.79-0.70) and very low (<0.69). The 84% of the clinicalisolates showed Pz values very low ( 5% ) and 11%very high. On the other hand, the 82% of the aviars strainspresented Pz values very low and 18% very high.Average Pz values were very low in all isolates , therewere no statiscally significant differences (p>0.05)impliying a high enzymatic activity. Susceptibility invitro testing to Fluconazole was performed by a diskdiffusion method (M44-A).The 89.5% of the clinicalisolates were susceptible and 10.5% resistant, while inavian strains, 59% were susceptible, 29% susceptibledose dependent and 12% resistant.

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gica invasora (García-Ruiz et al., 2004; Warnock, 2007).La virulencia de esta levadura es un tema amplia-

mente estudiado, diversas investigaciones han descritofactores de virulencia para C. neoformans, entre los quese encuentran la actividad fosfolipasa extracelular, laproducción extracelular de melanina y de prostaglandinas,la producción de cápsula de polisacáridos y la habilidadde crecer a 37ºC (Vartivarian et al.,1993; Vidotto et al.,1996; Chen, 1997; Casadevall et al., 2000; Cox et al.,2001; Noverr et al., 2001; Perfect , 2006; Bovers et al.,2008).

La fosfolipasa puede dañar las membranas celularesdel hospedador generando disfunción y/o disrupción físicade las membranas (Ghannoum, 2000) y jugar un rolimportante en la patogénesis de este hongo oportunista(Vidotto et al., 1998). Más aún, la posible asociación deproducción de fosfolipasa por cepas de Cryptococcusvirulentas ya fue reportada por Chen et al. (1998).

Con respecto a la actividad enzimática extracelularde fosfolipasa, Ganendren et al. (2006), observaron queesta es necesaria para la iniciación de la infección pulmonar,debido a que aumenta considerablemente la adhesión dela levadura al epitelio pulmonar. Santangelo et al. (2004),demostraron que la actividad fosfolipasa promueve lasobrevida y replicación de C. neoformans en macrófagos,lo que permite la iniciación de la infección pulmonarintersticial y que la fagocitosis mononuclear es el vehículopara la diseminación sistémica de esta levadura. Shea etal. (2006), observaron que la actividad fosfolipasa protegea C. neoformans de la acción lítica de las enzimas delfagolisosoma del macrófago activado, y que esto aumentala diseminación de la levadura al sistema nervioso.

La actividad fosfolipasa extracelular puededetectarse en Candida albicans y C. neoformans median-te diversas metodologías, tales como agar malta más yemade huevo, agar Sabouraud glucosado más yema de huevo(SEA) ( Price et al., 1982; Chen et al., 1997; Echeverría etal., 2002) y pruebas específicas colorimétricas yradiométricas (Banno et al.,1985; Ghannoum et al., 2000).El medio de cultivo SEA constituye un método semicuan-titativo, de amplia utilización y de mayor sensibilidad parala detección de esta enzima en C. neoformans que otrossimilares (Chen et al., 1997 y Echeverría et al., 2002) .

La sensibilidad de C. neoformans a antifúngicosutilizados en clínica para su tratamiento puede ser evaluadain vitro mediante técnicas estandarizadas tales comométodos de dilución en caldo, Etest y métodos de difusiónen agar , siendo este último el de mayor uso en la actualidaddebido a su elevada precisión y exactitud (Barry et al.2002; Pfaller et al., 2004), y su mejor relación costo-efectividad en comparación con otros métodos.

Actualmente, no existe evidencia de que esta infor-

mación pueda correlacionarse con la respuesta terapéuticaobtenida in vivo; sin embargo, un valor in vitro elevadode CIM puede predecir el fallo terapéutico de un antifúngico(Dannaoui et al., 2006 ).

El objetivo de este estudio es detectar la actividadfosfolipasa en aislamientos clínicos y aviarios de C.neoformans y evaluar su susceptibilidad in vitro aFluconazol

MATERIALES Y METODOS

Aislados de C. neoformans (Cn). Se utilizaron 19cepas clínicas de Cn, aisladas de muestras de sangre yLCR de pacientes con criptococosis, obtenidas endiversos centros hospitalarios del país y 17 cepas de Cnobtenidas de deyecciones secas expuestas al medioambiente de aves exóticas de 3 colecciones privadas y depsitácidas de un centro de rehabilitación de fauna nativade la Región Metropolitana.

Detección de la actividad fosfolipasa. La deteccióny cuantificación de la actividad fosfolipasa extracelular serealizó de acuerdo al método de Price (1982), con algunasmodificaciones. Las cepas aisladas previamente fueronsembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico eincubadas a 37°C durante 48 hrs, posteriormente seinocularon en placas con medio de cultivo SEA (agarsabouraud glucosado con yema de huevo estéril) eincubadas a 37 °C durante 5 días. Se midieron losdiámetros de las colonias y el diámetro total de la coloniamás la zona de hidrólisis producida por la actividadenzimática y se calculó la relación entre ambos valores(índice Pz de Price). A mayor valor de Pz, menor producciónde fosfolipasa por la colonia. La lectura se realizó en todaslas muestras a los 5 días. Cada aislado de C. neoformansse clasificó de acuerdo al valor de su coeficiente Pz comosigue: Pz muy alto (0.9-1); Pz alto (0.89-0.80); Pz bajo (0.79-0.70); Pz muy bajo (< 0.69).

Susceptibilidad in vitro a Fluconazol : se evaluómediante el método de difusión con discos de 25 µg deFluconazol (Becton Dickinson), de acuerdo a lasrecomendaciones del documento M44-A de CLSI,utilizando medio Mueller­Hinton con glucosa al 2% y azulde metileno (MHGAM). Las 36 cepas aisladas previamentefueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sinantibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, el inóculose preparó en solución salina y se ajustó a 0.5 en la escalaMc Farland por medida espectrofotométrica. Se incluyóCandida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosisATCC22019 como cepas de control de calidad.

La interpretación de los resultados se llevó a

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Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios. - Perez et al..

cabo de acuerdo a la tabla Nº 1 de documento M44-A.Según el diámetro del halo de inhibición del

crecimiento de la colonia; cada aislado frente al disco de25 µg de Fluconazol se clasificó como sensible (>19mm),sensible dosis dependiente (15-18mm), o resistente(<14mm).

Análisis Estadístico. Con el objeto de compararel valor Pz del día 5 de incubación de las cepas de Cn deorigen humano y aviar, se utilizó la prueba estadística deMann-Whitney con cálculo de U para dos muestrasindependientes.

RESULTADOS

Detección actividad fosfolipasa. En las 19 cepasclínicas analizadas, los valores Pz al día 5 de incubaciónvariaron en un rango de 0,26 a 1 (Promedio Pz= 0,44± 0,21y coeficiente de variación (CV) de 48%). Cerca del 90%presentó un índice Pz bajo o muy bajo (1 y 16respectivamente) y 2 muestras presentaron índice Pz muyalto (0.915 y 1). Sólo en una de las cepas, no se detectóactividad fosfolipasa (Pz=1)

En las 17 cepas aisladas de deyecciones de aves,los valores Pz al día 5, variaron entre 0,28 y 1 (promedioPz= 0,49 ± 0,264 y CV de 54%). Catorce cepas presentaronun Pz muy bajo (82%) y 3, muy alto (18%). En estas trescepas no se detectó actividad fosfolipasa.

No hubo diferencias significativas entre los aisladosclínicos y los aviarios mediante la prueba de Mann Whitney(p > 0,05), U=144.

Susceptibilidad in vitro a Fluconazol . En 19 cepasclínicas, 17 (89,47%) fueron sensibles mientras que 2(10,53%) resultaron resistentes. En 17 aislamientosaviarios, 10 fueron sensibles (58,8%), 5 (29,4 %) sensiblesdosis dependiente y 2 (11,8%) resistentes (Tabla 2).

DISCUSION

La actividad fosfolipasa extracelular ha sidoimplicada en la patogénesis de infecciones bacterianas yfúngicas Ghannoum et al.( 2000), existen numerosaspublicaciones en que se ha detectado esta actividad enlevaduras, principalmente en Candida albicans y C.neoformans usando diferentes métodos para medirla (Priceet al.,1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002).Entre éstos, el método desarrollado por Price resultaconveniente y sencillo de utilizar en un gran número deaislados (Vidotto et al., 1998). Además la correlación entreel valor Pz y la actividad fosfolipasa ya fue demostrada(Price et al., 1982).

En el presente estudio, no hubo diferenciassignificativas en los valores Pz entre las cepas de ambosgrupos, lo que concuerda con lo comunicado por Chen etal. (1997), y difiere de lo reportado por Vidotto et al. (1998),quienes si encontraron diferencias significativas.

En nuestro estudio, las cepas aviarias presentaron,con respecto a los aislados clínicos un Pz promedio mayor(0,49 vs 0,44); y un mayor número de aislados sin detecciónde fosfolipasa (15,8% vs 5,3%). Esta tendencia se mantuvoigual al estudio de Vidotto et al. (1998), donde las cepas

Cepas de C neoformans Valor Pz

Actividad fosfolipasa (Índice Pz)a

Clínicas n (%)

Aviarias n (%)

< 0.69 0.70 - 0.79 0.80 - 0.89 0.90 -1.0

++++ +++ ++ +

16 84,21 1 5,26 - 2 10,53

14 82,35 - - - - 3 17,65

a Pz muy alto (+); alto (++); bajo (+++); muy bajo (++++)

Tabla 1: Actividad de fosfolipasa en cepas clínicas y aviarias de C. neoformans

Susceptibilidad in vitro a Fluconazolª Cepas de

C. neoformans N %S %SDD %R

Clínicas Aviarias

19 17

89,47 58,82

- 29,41

10,53 11,77

ª Sensible (S, ≥19mm), sensible dosis dependiente (SDD,15-18mm), o resistente (R, ≤14mm)

Tabla 2: Susceptibilidad in vitro a Fluconazol enaislamientos clínicos y ambientales de C. neoformans

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aviarias también presentaron, con respecto a las cepasclínicas, un valor Pz promedio mayor (0,941 y 0,652respectivamente) y un mayor número de cepas sindetección de fosfolipasa (74% y 4,76%, respectivamente).

La mayoría de las cepas estudiadas fueronsensibles a Fluconazol (89,5% clínicas, 59% aviarias), peroen las cepas aviarias se detectó un mayor número de cepassensibles dosis dependiente (29%). Estos resultados sonsimilares a los obtenidos por Pfaller et al. ( 2007), en cepasclínicas, que reportan una sensibilidad de 78% a Fluco-nazol. Referente a las cepas aviares, un estudio identificólos aislados obtenidos a partir de un brote de Cryptoco-cosis en psitácidas en Brasil como resistentes a Fluconazol(Raso et al., 2004), mientras que en Malasia, todos los C.neoformans aislados de deyecciones aviares fueronsensibles al antifúngico (Tay et al., 2005).

En base a lo expuesto podemos concluir que losvalores de Pz promedio fueron muy bajos en aislamientosclínicos y aviarios de Cn, lo que se traduce en un nivel deactividad fosfolipasa alta y sugiere un rol de la enzima enla invasión al hospedero. En muy pocas cepas no sedetectó la producción de fosfolipasa.

REFERENCIAS

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Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios. - Perez et al..

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Boletín Micológico Vol. 23 : 21 - 25 2008

ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA Y SUSCEPTIBILIDAD INVITRO A FLUCONAZOL EN AISLAMIENTOS CLINICOS

Y AVIARIOS DE Cryptococcus neoformans

(Phospholipase activity and «in vitro» susceptibility to fluconazolin clinical and aviars isolates of Cryptococcus neoformans)

Gabriel Pérez C. (1), Gisela González H. (2),M. Cristina Díaz J. (3)

(1). Facultad de Medicina, Universidad de Chile(2). Programa Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias, Universidad de Chile

(3).- Programa de Microbiologia y Micología, ICBM,Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

mcdiaz@med.uchile.cl

Palabras clave: Fosfolipasa, Cryptococcus neoformans, susceptibilidad FluconazolKey words:Phospholipase, Cryptococcus neoformans, susceptibility Fluconazol

Recibido el 30 Octubre 2008Aceptado el 5 Diciembre 2008

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RESUMEN

Se detectó la actividad de fosfolipasa en 19 cepasclínicas y 17 aviarias de C. neoformans var. neoformans,usando Agar Sabouraud con yema de huevo,incubándose a 37ºC por 5 dias. Se determinó el índicePz estableciéndose los siguientes rangos: Pz muy alto(0.9-1), alto (0.89-0.80), bajo (0.79-0.70) y muy bajo (<0.69). El 84% de las cepas clínicas presentaron índicePz muy bajo, el 5% bajo y 11% muy alto. Mientras en lascepas aviarias el 82% presentaron índice muy bajo y un18% muy alto. Los valores de Pz promedio fueron muybajos en todos los aislamientos, sin existir diferenciassignificativas (p > 0,05) entre las cepas clínicas yaviarias, lo que implica una alta actividad enzimática.La susceptibilidad in vitro a Fluconazol se realizó por elmétodo de difusión con discos y el 89,5 % de las cepasclínicas fueron sensibles y el 10,5% resistentes, mientrasen las cepas aviarias, el 59% fueron sensibles, 29%sensible dosis dependiente y un12% resistentes.

INTRODUCCION

Cryptococcus neoformans es una levaduracapsulada que pertenece a los Basidiomycota (Garau,2002) y que posee diversos factores de virulencia, entrelos cuales se encuentra la fosfolipasa y por ende la produc-

ción de esta enzima extracelular se relaciona eventualmentecon patogenicidad (Ghannoum, 2000) .

Paralelamente al aumento de la población en estadode inmunodepresión, la infección por C. neoformans haemergido como una causa importante de morbilidad ymortalidad, afectando especialmente a pacientes con SIDAen etapa avanzada. Actualmente, representa la causa máscomún de meningitis fúngica en el mundo, y es una de laslevaduras más frecuentemente asociadas a infección fún-

ABSTRACT

Phospholipase activity was determined to 19clinical and 17 aviars trains of C. neoformans var.neoformans, incubating the yeast for 5 days at 37º C onSabouraud Agar supplemented with egg yolk. Pz valueswere determined and the following ranges wereestablished:very high (0.9-1), high (0.89-0.80), low(0.79-0.70) and very low (<0.69). The 84% of the clinicalisolates showed Pz values very low ( 5% ) and 11%very high. On the other hand, the 82% of the aviars strainspresented Pz values very low and 18% very high.Average Pz values were very low in all isolates , therewere no statiscally significant differences (p>0.05)impliying a high enzymatic activity. Susceptibility invitro testing to Fluconazole was performed by a diskdiffusion method (M44-A).The 89.5% of the clinicalisolates were susceptible and 10.5% resistant, while inavian strains, 59% were susceptible, 29% susceptibledose dependent and 12% resistant.

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gica invasora (García-Ruiz et al., 2004; Warnock, 2007).La virulencia de esta levadura es un tema amplia-

mente estudiado, diversas investigaciones han descritofactores de virulencia para C. neoformans, entre los quese encuentran la actividad fosfolipasa extracelular, laproducción extracelular de melanina y de prostaglandinas,la producción de cápsula de polisacáridos y la habilidadde crecer a 37ºC (Vartivarian et al.,1993; Vidotto et al.,1996; Chen, 1997; Casadevall et al., 2000; Cox et al.,2001; Noverr et al., 2001; Perfect , 2006; Bovers et al.,2008).

La fosfolipasa puede dañar las membranas celularesdel hospedador generando disfunción y/o disrupción físicade las membranas (Ghannoum, 2000) y jugar un rolimportante en la patogénesis de este hongo oportunista(Vidotto et al., 1998). Más aún, la posible asociación deproducción de fosfolipasa por cepas de Cryptococcusvirulentas ya fue reportada por Chen et al. (1998).

Con respecto a la actividad enzimática extracelularde fosfolipasa, Ganendren et al. (2006), observaron queesta es necesaria para la iniciación de la infección pulmonar,debido a que aumenta considerablemente la adhesión dela levadura al epitelio pulmonar. Santangelo et al. (2004),demostraron que la actividad fosfolipasa promueve lasobrevida y replicación de C. neoformans en macrófagos,lo que permite la iniciación de la infección pulmonarintersticial y que la fagocitosis mononuclear es el vehículopara la diseminación sistémica de esta levadura. Shea etal. (2006), observaron que la actividad fosfolipasa protegea C. neoformans de la acción lítica de las enzimas delfagolisosoma del macrófago activado, y que esto aumentala diseminación de la levadura al sistema nervioso.

La actividad fosfolipasa extracelular puededetectarse en Candida albicans y C. neoformans median-te diversas metodologías, tales como agar malta más yemade huevo, agar Sabouraud glucosado más yema de huevo(SEA) ( Price et al., 1982; Chen et al., 1997; Echeverría etal., 2002) y pruebas específicas colorimétricas yradiométricas (Banno et al.,1985; Ghannoum et al., 2000).El medio de cultivo SEA constituye un método semicuan-titativo, de amplia utilización y de mayor sensibilidad parala detección de esta enzima en C. neoformans que otrossimilares (Chen et al., 1997 y Echeverría et al., 2002) .

La sensibilidad de C. neoformans a antifúngicosutilizados en clínica para su tratamiento puede ser evaluadain vitro mediante técnicas estandarizadas tales comométodos de dilución en caldo, Etest y métodos de difusiónen agar , siendo este último el de mayor uso en la actualidaddebido a su elevada precisión y exactitud (Barry et al.2002; Pfaller et al., 2004), y su mejor relación costo-efectividad en comparación con otros métodos.

Actualmente, no existe evidencia de que esta infor-

mación pueda correlacionarse con la respuesta terapéuticaobtenida in vivo; sin embargo, un valor in vitro elevadode CIM puede predecir el fallo terapéutico de un antifúngico(Dannaoui et al., 2006 ).

El objetivo de este estudio es detectar la actividadfosfolipasa en aislamientos clínicos y aviarios de C.neoformans y evaluar su susceptibilidad in vitro aFluconazol

MATERIALES Y METODOS

Aislados de C. neoformans (Cn). Se utilizaron 19cepas clínicas de Cn, aisladas de muestras de sangre yLCR de pacientes con criptococosis, obtenidas endiversos centros hospitalarios del país y 17 cepas de Cnobtenidas de deyecciones secas expuestas al medioambiente de aves exóticas de 3 colecciones privadas y depsitácidas de un centro de rehabilitación de fauna nativade la Región Metropolitana.

Detección de la actividad fosfolipasa. La deteccióny cuantificación de la actividad fosfolipasa extracelular serealizó de acuerdo al método de Price (1982), con algunasmodificaciones. Las cepas aisladas previamente fueronsembradas en placas de Agar Sabouraud sin antibiótico eincubadas a 37°C durante 48 hrs, posteriormente seinocularon en placas con medio de cultivo SEA (agarsabouraud glucosado con yema de huevo estéril) eincubadas a 37 °C durante 5 días. Se midieron losdiámetros de las colonias y el diámetro total de la coloniamás la zona de hidrólisis producida por la actividadenzimática y se calculó la relación entre ambos valores(índice Pz de Price). A mayor valor de Pz, menor producciónde fosfolipasa por la colonia. La lectura se realizó en todaslas muestras a los 5 días. Cada aislado de C. neoformansse clasificó de acuerdo al valor de su coeficiente Pz comosigue: Pz muy alto (0.9-1); Pz alto (0.89-0.80); Pz bajo (0.79-0.70); Pz muy bajo (< 0.69).

Susceptibilidad in vitro a Fluconazol : se evaluómediante el método de difusión con discos de 25 µg deFluconazol (Becton Dickinson), de acuerdo a lasrecomendaciones del documento M44-A de CLSI,utilizando medio Mueller­Hinton con glucosa al 2% y azulde metileno (MHGAM). Las 36 cepas aisladas previamentefueron sembradas en placas de Agar Sabouraud sinantibiótico e incubadas a 37°C durante 48 hrs, el inóculose preparó en solución salina y se ajustó a 0.5 en la escalaMc Farland por medida espectrofotométrica. Se incluyóCandida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosisATCC22019 como cepas de control de calidad.

La interpretación de los resultados se llevó a

23

Actividad de Fosfolipasa y susceptibilidad in vitro a Fluconazol en aislamientos clínicos y aviarios. - Perez et al..

cabo de acuerdo a la tabla Nº 1 de documento M44-A.Según el diámetro del halo de inhibición del

crecimiento de la colonia; cada aislado frente al disco de25 µg de Fluconazol se clasificó como sensible (>19mm),sensible dosis dependiente (15-18mm), o resistente(<14mm).

Análisis Estadístico. Con el objeto de compararel valor Pz del día 5 de incubación de las cepas de Cn deorigen humano y aviar, se utilizó la prueba estadística deMann-Whitney con cálculo de U para dos muestrasindependientes.

RESULTADOS

Detección actividad fosfolipasa. En las 19 cepasclínicas analizadas, los valores Pz al día 5 de incubaciónvariaron en un rango de 0,26 a 1 (Promedio Pz= 0,44± 0,21y coeficiente de variación (CV) de 48%). Cerca del 90%presentó un índice Pz bajo o muy bajo (1 y 16respectivamente) y 2 muestras presentaron índice Pz muyalto (0.915 y 1). Sólo en una de las cepas, no se detectóactividad fosfolipasa (Pz=1)

En las 17 cepas aisladas de deyecciones de aves,los valores Pz al día 5, variaron entre 0,28 y 1 (promedioPz= 0,49 ± 0,264 y CV de 54%). Catorce cepas presentaronun Pz muy bajo (82%) y 3, muy alto (18%). En estas trescepas no se detectó actividad fosfolipasa.

No hubo diferencias significativas entre los aisladosclínicos y los aviarios mediante la prueba de Mann Whitney(p > 0,05), U=144.

Susceptibilidad in vitro a Fluconazol . En 19 cepasclínicas, 17 (89,47%) fueron sensibles mientras que 2(10,53%) resultaron resistentes. En 17 aislamientosaviarios, 10 fueron sensibles (58,8%), 5 (29,4 %) sensiblesdosis dependiente y 2 (11,8%) resistentes (Tabla 2).

DISCUSION

La actividad fosfolipasa extracelular ha sidoimplicada en la patogénesis de infecciones bacterianas yfúngicas Ghannoum et al.( 2000), existen numerosaspublicaciones en que se ha detectado esta actividad enlevaduras, principalmente en Candida albicans y C.neoformans usando diferentes métodos para medirla (Priceet al.,1982; Chen et al., 1997; Echeverría et al., 2002).Entre éstos, el método desarrollado por Price resultaconveniente y sencillo de utilizar en un gran número deaislados (Vidotto et al., 1998). Además la correlación entreel valor Pz y la actividad fosfolipasa ya fue demostrada(Price et al., 1982).

En el presente estudio, no hubo diferenciassignificativas en los valores Pz entre las cepas de ambosgrupos, lo que concuerda con lo comunicado por Chen etal. (1997), y difiere de lo reportado por Vidotto et al. (1998),quienes si encontraron diferencias significativas.

En nuestro estudio, las cepas aviarias presentaron,con respecto a los aislados clínicos un Pz promedio mayor(0,49 vs 0,44); y un mayor número de aislados sin detecciónde fosfolipasa (15,8% vs 5,3%). Esta tendencia se mantuvoigual al estudio de Vidotto et al. (1998), donde las cepas

Cepas de C neoformans Valor Pz

Actividad fosfolipasa (Índice Pz)a

Clínicas n (%)

Aviarias n (%)

< 0.69 0.70 - 0.79 0.80 - 0.89 0.90 -1.0

++++ +++ ++ +

16 84,21 1 5,26 - 2 10,53

14 82,35 - - - - 3 17,65

a Pz muy alto (+); alto (++); bajo (+++); muy bajo (++++)

Tabla 1: Actividad de fosfolipasa en cepas clínicas y aviarias de C. neoformans

Susceptibilidad in vitro a Fluconazolª Cepas de

C. neoformans N %S %SDD %R

Clínicas Aviarias

19 17

89,47 58,82

- 29,41

10,53 11,77

ª Sensible (S, ≥19mm), sensible dosis dependiente (SDD,15-18mm), o resistente (R, ≤14mm)

Tabla 2: Susceptibilidad in vitro a Fluconazol enaislamientos clínicos y ambientales de C. neoformans

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Boletín Micológico Vol. 23 : 21 - 25 2008

aviarias también presentaron, con respecto a las cepasclínicas, un valor Pz promedio mayor (0,941 y 0,652respectivamente) y un mayor número de cepas sindetección de fosfolipasa (74% y 4,76%, respectivamente).

La mayoría de las cepas estudiadas fueronsensibles a Fluconazol (89,5% clínicas, 59% aviarias), peroen las cepas aviarias se detectó un mayor número de cepassensibles dosis dependiente (29%). Estos resultados sonsimilares a los obtenidos por Pfaller et al. ( 2007), en cepasclínicas, que reportan una sensibilidad de 78% a Fluco-nazol. Referente a las cepas aviares, un estudio identificólos aislados obtenidos a partir de un brote de Cryptoco-cosis en psitácidas en Brasil como resistentes a Fluconazol(Raso et al., 2004), mientras que en Malasia, todos los C.neoformans aislados de deyecciones aviares fueronsensibles al antifúngico (Tay et al., 2005).

En base a lo expuesto podemos concluir que losvalores de Pz promedio fueron muy bajos en aislamientosclínicos y aviarios de Cn, lo que se traduce en un nivel deactividad fosfolipasa alta y sugiere un rol de la enzima enla invasión al hospedero. En muy pocas cepas no sedetectó la producción de fosfolipasa.

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Boletín Micológico Vol. 23 : 27 - 33 2008

ESPECIES DE Fusarium COMO AGENTES DEQUERATITIS MICOTICAS EN ADULTOS

EN TUCUMAN, ARGENTINA(Fusarium species as agents of mycotic keratitis in adults,

in Tucumán, Argentina)

R. Salim (1) & R. Runco (1, 2)(1). Cátedra de Micología. Instituto de Microbiología

Fac. de Bioquímica, Química y FarmaciaUniversidad Nacional de Tucumán

Ayacucho 491. (4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina.(2). Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750.

(4000) San Miguel de Tucumán. R. Argentina.e-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar

Palabras clave: Queratitis, Fusarium spp, diagnóstico micológico.Key words: Mycotic keratitis, Fusarium spp, Laboratory diagnoses

Recibido el 23 Abril 2008Aceptado el 2 Julio 2008

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RESUMEN

Las queratomicosis por hongos filamentososson una de las causas de daño en la córnea en los paísesde climas tropicales y subtropicales y se considerandentro de las micosis de difícil tratamiento. El presenteestudio evalúa la etiología de las queratitis micóticasen Tucumán (R. Argentina) para determinar su incidenciae importancia clínica regional. En un lapso de 5 años seestudiaron 48 muestras (biopsias, raspados corneales y/o aspirados oculares) recogidas por el oftalmólogo yenviadas al laboratorio para análisis micológico.Mediante examen directo, cultivos y estudios macro ymicromorfológicos se confirmó etiología micótica en 13pacientes (27%). De ellos, se identificaron 7 cultivoscomo Fusarium solani complex, 4 F. oxysporum y 2 F.verticillioides. Estos hallazgos permiten profundizar elconocimiento de los agentes etiológicos locales involu-crados y los factores de riesgo, dos aspectos importantesen la prevención y la terapéutica de estas micosis.

INTRODUCCION

Las queratomicosis representan una de las formasde queratitis más difíciles en su diagnóstico y tratamiento,constituyendo un problema oftalmológico importante quepuede llevar rápidamente a la destrucción de la córnea y ala pérdida de la visión (3, 4, 38, 39). Las tasas de fracasosterapéuticos son muy altas y estarían relacionadas a varios

factores: diagnóstico tardío, tipo de enfermedad primariao de base, reducida penetración ocular del medicamento ybaja susceptibilidad antifúngica de ciertos agentesetiológicos (9, 10, 19, 31, 37, 39).

Los hongos son agentes oportunistas queraramente infectan las córneas saludables de los individuosinmunocompetentes (26, 28, 29). Estos microorganismosno pueden penetrar en el epitelio corneal intacto por loque, obviamente, es necesario un traumatismo o unamicrolesión previa para iniciar su acción oportunista. Elagente traumatizante origina abrasiones en la córnea y al

ABSTRACT

Keratomycosis caused by filamentous fungi is oneof the agents of damage to the cornea in subtropicaland tropical climate countries and belongs to thosemycoses identified as of difficult treatment. This studyevaluates the etiology of mycotic keratitis in Tucumán(R.Argentina) with the purpose of assessing its incidenceand regional and clinical significance. In a 5-year period,48 samples (biopsy, corneal scrapes and/or ocularaspiration) collected by the oculist were examined andsent to the laboratory for a mycological analysis. Bymeans of direct exam, macro and micromorphologicalcultures and studies of the presence of mycotic etiologyin 13 patients (27%) was confirmed. Among them 7 cultu-res such as a Fusarium solani complex, 4 F. oxysporumand 2 F. verticillioides were identified. These findingsallow to enlarge the knowledge of the local etiologicalagents involved as well as the risk factors, two elementsthat are significant in the prevention and therapeutics ofthese mycoses.

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Boletín Micológico Vol. 23 : 27 - 33 2008

estar contaminado con propágulos fúngicos, éstos seimplantan en el tejido corneal. Una vez que se localizan enel estroma, se reproducen, provocan necrosis y reaccióninflamatoria en la membrana Descemet para llegar a lacámara anterior o al segmento posterior, pudiendoocasionar endoftalmitis (1, 7, 39).

Una amplia variedad de hongos, filamentosos ylevaduras, han sido citados en la literatura mundialespecializada, como agentes etiológicos de queratomi-cosis, de los cuales las especies integrantes de losgéneros Candida, Aspergillus, y Fusarium son los máscomunes (24,31). Las queratitis debidas a hongosfilamentosos ocurren con más frecuencia en hombresjóvenes sanos, especialmente agricultores y trabajadoresdel campo o jardinería, que sufren un traumatismo oerosión del epitelio ocular por fragmentos de madera, restosvegetales, polvo o materiales provenientes del suelo o losanimales (2, 20, 31, 32, 33).

Se han descrito numerosos factores predispo-nentes a la queratomicosis, tales como el uso tópico decorticoides, solos o combinados con antibióticos de amplioespectro, el uso frecuente y prolongado de lentes decontacto, enfermedades oculares preexistentes, cirugíasde córnea, infecciones postquirúrgicas, enfermedadsistémica, cuerpo extraño, edad, sexo, clima y estación (3,4, 5, 29, 32).

Ciertos factores ambientales como la humedad,pluviometría elevada, altas temperaturas y viento intenso,explican las variaciones en el aislamiento de los diversoshongos fitopatógenos ambientales, así como la apariciónestacional de las queratomicosis (9, 17, 19, 28).

La mayoría de los hongos filamentosos asociadoscon ulceraciones de la córnea en las zonas tropicales ysubtropicales son saprotrofos y termotolerantes que seencuentran ampliamente distribuidos en el suelo y lavegetación, en especial las especies de Fusarium queson fitopatógenos comunes particularmente en los cereales(20). Su incidencia se correlaciona con la época de lascosechas y las estaciones con alta temperatura y humedad(4 ,9). Durante las últimas cuatro décadas se ha informado,de manera creciente, el aumento de esta micosis endiferentes partes del mundo, debido a un mejor diagnóstico(2, 5). El presente estudio evalúa la etiología de las queratitismicóticas en Tucumán (R. Argentina) para determinar suincidencia e importancia clínica regional.

MATERIALES Y METODOS

En un lapso de 5 años se procesaron 48 muestrasobtenidas por biopsia, raspado de cornea y/o aspiradosoculares de pacientes con diagnóstico presuntivo dequeratitis micótica. Las muestras, obtenidas asépticamentepor el oftalmólogo fueron enviadas de inmediato al labora-

torio para su procesamiento.Con una porción de las muestras se realizaron

preparaciones microscópicas para examen con KOH 10%entre porta y cubre y tinciones con Gram y Giemsa. Elmaterial restante fue sembrado según el tamaño de lamuestra en un máximo de 4 tubos con Agar-Sabouraud-glucosado (SGA) adicionado de Penicilina (50 U.I./mL) yEstreptomicina (80 µg/mL). Los cultivos fueron incubados2 a 27 ºC y 2 a 37ºC durante 3 a 20 días y fueron examinadosdiariamente. Las muestras fueron consideradas positivascuando los hallazgos de la microscopía directa fueronconfirmados con el aislamiento de Fusarium a ambastemperaturas en 2 ó más tubos.

A partir de todas las colonias obtenidas en SGA,en cada caso se procedió con la metodología siguiente(23): se tomaron pequeños inóculos desde los esporo-doquios o de los conidios presentes en el micelio aéreo,diluyéndose la muestra en un tubo con 5 mL de aguadestilada estéril. Previa agitación se dispersaron 0,2 mLsobre una placa de PDA para obtener inicios de crecimientoa partir de conidios aislados en el lapso de 2 días a 25ºC.Posteriormente, con un asa de platino se transfirió en elcentro de 2 placas de PDA un trozo de una de las coloniasen desarrollo. El mismo procedimiento se efectuó en agaragua con hojas de clavel (CLA), esterilizadas con hipo-clorito de sodio durante 5 minutos y lavadas 3 veces enagua destilada estéril (Modificación de la técnica de Nelsonet al. (25)). Dos a tres hojas de unos 2-3 cm se distribuyeronen forma equidistante cerca de los bordes de las placas,sembrándose trozos de las colonias en desarrollo en susorillas. Ambos medios de cultivo se incubaron en oscuridaddurante 7 a 14 días a 25ºC (12).

La identificación de las especies se realizó segúnDe Hoog & Guarro (8) y Nelson et al.(24), que incluyenestudios macro y micromorfológicos de los cultivos(aspecto, textura, color de las colonias, velocidad decrecimiento, forma y tamaño de los macroconidios, forma,cantidad y modo de formación de microconidios, presenciade mono o polifialides y clamidosporas).

RESULTADOS

De las 48 muestras procesadas, se confirmóetiología micótica en 13 pacientes (27%). El examenmicroscópico directo fue positivo en el 84.6% de los casos(11:13). La concordancia entre los examenes directos(elementos hifales, hialinos, finos, ramificados) y loscultivos fue del 100%. De ellos, 7 (53,8%) cultivos fueronidentificados como Fusarium solani complex ; 4 (30,8%)F. oxysporum y el resto (15,4%) F. verticillioides.

La Tabla 1 muestra la población afectada por edady por sexo y los agentes etiológicos encontrados. Del totalde 13 pacientes evaluados, 9 fueron de sexo de masculino,

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Especies de Fusarium como agentes de queratitis micóticas en adultos en Tucumán, Argentina - R.Salim & R. Runco

con un rango de edad entre 22 y 64 años y 4 de sexofemenino con un rango de edad entre 24 y 66 años. Lamayor incidencia fue encontrada en el grupo de 33-50 años(8:13) con predominio en el sexo masculino (9:4) dedicadosa la agricultura (6:9). De los 9 hombres estudiados, 6poseían antecedentes de traumatismos durante eldesempeño de su actividad laboral. Del total de mujeresestudiadas, 2 eran portadoras de lentes de contactosblandas, una de ellas sufrió un traumatismo con las mismas,mientras el otro caso sufrió un traumatismo con partículasde un vegetal.

No se hallaron factores predisponentes diferentesa los ya descritos. Los encontrados incluyeron: trauma-tismo (54%), uso de antibióticos tópicos (38%), uso delentes de contacto (15,4%) inmunosupresión sistémica(7,7%), y cirugía ocular previa (23%). La mayoría de lospacientes (7:13) presentaron lesión corneal causada portraumatismo con partículas vegetales. El uso prolongadode corticoides como factor predisponente fue observadoen 1 paciente, y la queratitis fúngica con enfermedadsistémica en 2 pacientes (Tabla 1).

De los 4 F. oxysporum aislados, 3 provinieronde muestras de pacientes con cirugía ocular previa.

Descripción de las especiesFusarium solani (Mart.) Appel & Wollenw. Emend.

Snyd. & Hans. complex. En APD es de crecimiento rápido:>50 mm en una semana. La colonia presenta un aspectoliso y algodonoso de color blanco grisáceo, crema a ante.Generalmente el reverso no es coloreado o es de colorcrema pálido a tonos café. En CLA, los microconidios sonabundantes, en falsas cabezas, ovoides a oblongos 0-1septo. Su tamaño oscila entre 8-16 x 2-4,5 µm y sonproducidas en monofiálides alargadas y finas que suelenmedir 40-80 x 2,5-3 µm. Las monofiálides nacen lateralmentede la hifa y a veces son ramificadas. Hacia la punta seadelgazan y presentan collaretes poco definidos. Losmacroconidios, cuyo tamaño aproximado es de 28-65 x 4-6µm, se observan en menor cantidad que los microconidiosy nacen de conidióforos cortos y ramificados quefrecuentemente forman esporodoquios en la superficie delagar, generalmente de color crema. Presentan entre 3 y 5

Tabla 1. Factores predisponentes, ocupación, edad, sexo y agentes etiológicos aislados

Edad Sexo Ocupación / F. predisponente Aislamiento

1 22 M Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño F. solani

2 24 F Absceso corneal Antibióticos y corticoides tópicos F. verticillioides

3 33 F Lentes de contacto / úlcera corneal F. oxysporum

4 36 M Agricultor , Traumatismo por cuerpo extraño/ Antibióticos tópicos F. solani

5 37 M Transportista de soja/ Diabetes/ Traumatismo por cuerpo extraño F. solani

6 40 M Cirugía ocular Antibióticos y corticoides tópicos F. oxysporum

7 48 F Lentes de contacto / úlcera corneal F. verticillioides

8 48 M Traumatismo por cuerpo extraño Leucemia /terapia antiblástica F. solani

9 50 M Cirugía ocular Antibióticos y corticoides tópicos F. oxysporum

10 50 M Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño F. solani

11 58 M Agricultor Traumatismo por cuerpo extraño F. solani

12 64 M Agricultor

Corticoterapia prolongada Traumatismo por cuerpo extraño

F. solani

13 66 F Cirugía ocular Antibióticos tópicos F. oxysporum

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Boletín Micológico Vol. 23 : 27 - 33 2008

tabiques y tienen forma de media luna, con las superficiesventrales y dorsales paralelas en la mayor parte de sulongitud. La célula apical es corta y redondeada y la célulabasal redondeada o claramente con forma de pie. Lasclamidosporas son frecuentes, con una pared lisa o rugosa.Se observan aisladas o en parejas, terminales o intercalaresy tienen un tamaño de 6-10 µm de diámetro.

Fusarium oxysporum Schlecht.:Fr. complex. EnAPD a 25ºC presenta un crecimiento rápido: > 50 mm enuna semana. Al principio la colonia es lisa y algodonosa.Con el tiempo se torna de color blanco a salmón pálido,tiñéndose de violeta pálido en su zona central. El reversoes generalmente de color púrpura. Produce un pigmentopúrpura-violeta que difunde al medio. Los esporodoquios,presentes en algunas cepas, dan una coloración cremaanaranjada al cultivo. En CLA, los microconidios siempreen falsas cabezas, son ovoides o en forma de riñón, conun tamaño de 5-12 x 2,3-3,5 µm y, ocasionalmente, con 0, 1o 2 tabiques. Nacen de monofiálides laterales, cortas yanchas, afiladas hacia la punta, con collaretes pocodefinidos, solitarias o ramificadas. Los macroconidiostienen de 3 a 5 septos. Su tamaño es de 25- 42 x 3-4,5 µm.Tienen forma de media luna, ligeramente curvadas, conpared fina y delicada. Su célula apical es afilada y la célulabasal con forma de pie, pero pueden presentar ambosextremos aguzados. En la mayoría de los cultivos lasclamidosporas son abundantes. Son grandes, hialinas, depared lisa o rugosa y pueden observarse aisladas, enparejas o en cadenas ya sea intercalares o terminales.

Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg. EnAPD a 25ºC es de crecimiento rápido, >60 mm en unasemana con abundante micelio aéreo algodonoso, de colorblanco, rosa salmón que se tiñe de color azulado o púrpuraen pocos días. El color del reverso varía de crema a violeta.En CLA los microconidios son ovoides o en forma de mazacon base truncada, generalmente sin septos o 1 o 2tabiques. Se disponen en largas cadenas y en falsascabezas y su tamaño es de 7-10 x 2,5-3,2 µm. La presenciade abundantes microconidios condiciona el aspectopulverulento de la colonia. Los conidióforos nacenlateralmente de la hifa y son escasamente ramificados. Lascélulas conidiógenas son monofiálides, habitualmentedelgadas y largas, pero menores que la de F. solani (20-30x 2,3 µm). Los macroconidios a veces son escasos enalgunas cepas. Cuando existen son ligeramente fusiformes,casi rectos, con superficies dorsales y ventrales levementeparalelas, de pared fina y delicada. Las células basal yapical son alargadas y ligeramente curvadas. Pueden tenerentre 3 y 7 tabiques y su tamaño es de 31-58 x 2,7-3-6 µm.No forma clamidosporas. Los esporodoquios se formaronraramente en algunos aislamientos, presentando un colornaranja pálido.

DISCUSIONA nivel mundial, la incidencia de los diferentes

hongos causales de queratomicosis varía según el áreageográfica, y zonas climáticas. Los climas tropicales osubtropicales, calurosos y húmedos, favorecen laproliferación ambiental de los hongos filamentosos de hifastabicadas, generalmente Fusarium y Aspergillus, mientrasque se da una mayor presencia de Candida en los climasmás fríos (6, 31, 39). Dependiendo de las variacionesclimáticas en un mismo país, se observa que lapresentación de estas infecciones varía de acuerdo a lasregiones, al grado de exposición de la población, a losfactores de riesgo y al origen, urbano o rural, de lapoblación estudiada. Tucumán, su ubica en el noroesteargentino, región cálida subtropical, con 1000 -1200 mmde lluvias anuales, de vegetación abundante, con economíaagrícola. En este contexto, las úlceras corneales, al parecerresultan más frecuente en economías agrícolas (20, 22, 28).

La cornea humana puede ser infectada por másde 70 especies pertenecientes a cuarenta géneros dehongos de los cuales Candida, Aspergillus, y Fusariumson los más comunes (24, 31). En concordancia con losresultados de otras investigaciones realizadas en paísesLatinoamericanos (2, 6, 21, 22), en el presente estudioFusarium ha sido el agente más frecuente de querato-micosis en nuestro medio, resultando Fusarium solani laespecie más aislada. En todos los casos en que se aisló F.solani, los pacientes, dedicados a la agricultura, refirieronhaber sufrido un traumatismo reciente de córnea. Estosdatos son coincidentes con los observados en otrosestudios (2, 21).

En la mayoría de los casos, las especies deFusarium son las predominantes. Por ejemplo, en unarevisión de 156 casos de queratomicosis realizada en laIndia el 32.3% fueron causadas por Fusarium, 29% porAspergillus, 12.9% Alternaria, y 6.4% por Candida (35).Sin embargo, cada vez se van incluyendo nuevas especiesa la larga lista de agentes fúngicos capaces de causar quera-titis, especialmente en climas tropicales, tales como Curvu-laria senegalensis (12), Phaeoisaria clematidis (13),Sarcopodium oculorum (14), Beauveria bassiana (16) yespecies de Fusarium que no habían sido diagnosticadascomo agentes de queratomicosis humana (15).

Los integrantes del género Fusarium(Ascomycota, Pezizomycotina, Hypocreales, Hypocrea-ceae) son hongos filamentosos, hialinos y septados. Sufrecuencia como agente causal de queratomicosis, en otrasinvestigaciones, es de hasta un 37% para F. oxysporum, y24% para F. solani (7).

La queratitis causada por especies de Fusariumes clínicamente similar a la producida por otros hongospero su pronóstico es peor (21, 33, 38). La presencia de

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Especies de Fusarium como agentes de queratitis micóticas en adultos en Tucumán, Argentina - R.Salim & R. Runco

glaucoma maligno es una complicación severa de laqueratitis producida por Fusarium (18). La especie máscomún que causa infecciones oculares es F. solanicomplex (8, 30, 32, 40). Los miembros de este complex hanaumentado su importancia como agentes causantes demicosis humanas, particularmente en pacientesinmunocomprometidos. Son conocidos como saprofitosy fitopatógenos. El complejo incluye muchas especiesfilogenéticos distintas, distribuidas en 4 mayores linajes,en todos ellos se encontraron especies aisladas desdeinfecciones oculares (40). F solani complex, ha sidodescrita en casos de queratitis relacionadas con el uso delentes de contacto (3, 18). Le sigue en frecuencia F.oxysporum (3, 9, 36, 38). F. verticillioides, F. dimerum yF. sacchari, están más raramente implicadas en infeccionesoculares (11, 15, 26, 36, 38). Guarro et al. (2003), hareportado un caso de queratitis producido por F.polyphialidicum (15).

Nuestros resultados son concordantes con losde diversos estudios, realizados en diferentes países,asícomo en Argentina (42, 43, 44, 45) a pesar que no todoslos agentes corresponden a integrantes del géneroFusarium, por lo que se puede afirmar que el traumatismoes el factor predisponente más frecuente (44-55%) a lasinfecciones fúngicas de los ojos, seguido por laenfermedad sistémica (11,2%) y la cirugía previa (9,8%).Los traumatismos con elemento vegetal son responsablesdel 60-70% de las lesiones que son consideradaspredictoras de una queratitis fúngica (21, 27, 28, 30).

Como las lesiones no son patognomónicas deinfección micótica del ojo, es el oftalmólogo quien debeconsiderar, además, otras causas microbianas (bacterianas,virales y/o parasitarias). Si bien el diagnóstico comienzacon la sospecha clínica, éste se establece, principalmente,mediante los cultivos o la biopsia de córnea. Como uno delos diagnósticos diferenciales de queratomicosis es laqueratitis bacteriana, la terapia inicial con antibióticostópicos sólo se justifica cuando no se cuenta con elsoporte del laboratorio. Es por ello que, en el 38% de loscasos que hemos analizado existe el antecedente demedicación previa con corticoides y/o antibióticos tópicosentre el momento en que aparecieron las manifestacionesy el diagnóstico de queratomicosis.

Al respecto, Torres Rodríguez (34) señala que, ensu gran mayoría (a veces más del 50%), los enfermosreciben tratamiento tópico con corticoides y/o antibióticosy que, por lo general, el diagnóstico definitivo sobrevienetarde, tanto si se trata de una queratitis micótica comobacteriana. A menudo, y desafortunadamente, muchosoftalmólogos piensan en una queratomicosis después queuna presunta queratitis bacteriana se empeora duranteterapia antibiótica.

Nos parece importante señalar que el diagnóstico

de las infecciones fúngicas requiere que el especialistapueda establecer la presencia de patología oftálmica (loque requiere de instrumental especial) y pueda obtenertejido en el que el microorganismo causal sea visualizado(17). Frente a cualquier úlcera corneal es imprescindibledescartar que el agente causal sea un hongo, y si lo es, esnecesario identificar de qué hongo se trata, ya que estosdatos son fundamentales en el enfoque terapéutico delpaciente (17).

El traumatismo de córnea es la primera causa delas queratitis microbianas y siempre existe riesgo deinfección micótica cuando el paciente tiene antecedentede trauma corneal. En nuestro estudio, hemos corroboradola alta frecuencia de queratitis micótica en pacientes contraumatismo de córnea por cuerpo extraño (54%), que sedescribe en la literatura mundial.

Las infecciones fúngicas del ojo han sidocomunicadas en forma progresiva durante las últimasdécadas a nivel mundial. Si bien no se trata de lasafecciones más frecuentes entre las infecciones de lacórnea, la dificultad para su tratamiento, los problemaspara la identificación etiológica, la diversidad depresentaciones clínicas observadas en cada caso, ytambién los nuevos casos que emergen cada año, hacende esta micosis un importante objeto de estudio. Por ello,coincidimos con Lek et al.(20), en que es fundamentalconocer la etiología ‘local’ de queratitis en una regiónparticular ya que guarda relación con el tratamiento, debidoa que no siempre existen laboratorios especializados yentonces el diagnóstico depende del conocimiento clínicoy el tratamiento instituido, será, en el mejor de los casos,empírico.

La incidencia de esta micosis en Tucumán no hasido establecida anteriormente. Si bien el diagnóstico debebasarse en un alto nivel de sospecha, sobre todoatendiendo a los factores de riesgo mencionados y laevolución del cuadro clínico, el laboratorio demicrobiología es el que establece el diagnóstico específico.

CONCLUSIONES

El bajo número de pacientes con diagnósticomicológico confirmado, revela la poca sospecha de estainfección en nuestro medio.

La comprensión de los aspectos epidemiológicosregionales, factores de riesgo y agentes etiológicos(hongos levaduriformes o filamentosos) son importantesen la sospecha clínica, prevención y terapéutica apropiadade estas micosis. En nuestro estudio el principal factor deriesgo correspondió a traumatismo relacionado conpartículas vegetales.

Si bien varias especies de hongos capaces de crecer

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a 37ºC pueden causar queratomicosis, los hongos quehemos diagnosticado en Tucumán, pertenecen a tresespecies del género Fusarium: F. solani complex, F.oxysporum y F. verticillioides.

La rápida intervención del laboratorio esimportante para establecer el diagnóstico y tratamientoadecuado.

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ZIGOMICOSIS CUTANEA PRIMARIA PORRhyzopus oryzae EN UNA NIÑA CON LEUCEMIA

LINFOBLASTICA AGUDA TIPO B

(Primary Cutaneous Zygomycosis by Rhyzopus oryzae in a girl diagnosedwith an Acute Lymphoblastic Leukemia B Type)

R. Salim (1), R. Runco (1, 2), C. Alvarez (2), S. Romano (3) & M. Charre (2)1. Cátedra de Micología-Fac. de Bioquímica, Química y Farmacia

Universidad Nacional de Tucumán Ayacucho 491. (4000) Tucumán. R. Argentina. 2. Lab. Micología del Hospital del Niño Jesús. Pasaje Hungría 750.(4000) Tucumán. R. Argentina.

3. Cátedra de Dermatología- Fac. de Medicina. U. N. T.Ayacucho 491. (4000). R. Argentina.e-mail: rqsalim@rectorado.unt.edu.ar

Palabras claves: zigomicosis cutánea primaria, leucemia, Rhizopus oryzaeKey words:Primary cutaneous zygomycosis, leukemia, Rhizopus oryzae

Boletín Micológico Vol. 23 : 35 - 41 2008

RESUMEN

La Zigomicosis es una infección infrecuentecausada por hongos oportunistas integrantes del ordenMucorales, que se presenta en pacientes de alto riegocomo en: leucemia, linfomas con neutropenia prolon-gada, cetoacidosis diabética, malnutrición severa,ruptura de la integridad de la barrera cutánea y terapiainmunosupresora. Se presenta un caso de Zigomicosiscutánea en una paciente pediátrica con leucemia linfo-blástica aguda de tipo B, con severa neutropenia ytratamiento con corticoides. A los cinco días de su hospi-talización desarrolló en el antebrazo (zona de punciónvenosa), una lesión indurada, eritematosa, que progresóy ulceró. A partir de exudados y biopsias del tejido subcu--táneo se realizaron exámenes microscópicos directoscon KOH, cultivos en agar Sabouraud y estudio histoló-gico a través de técnicas convencionales de hematoxi-lina-eosina y PAS. Los análisis de los materiales clínicosrevelaron la presencia de hifas hialinas, no tabicadas,gruesas, compatibles con un Zygomycete. En todos lostubos se obtuvo abundante desarrollo de un hongo fila-mentoso, identificado como Rhizopus oryzae. Posterior-mente a la escisión quirúrgica y tratamiento conanfotericina B se obtuvo una evolución favorable delpaciente hasta el presente.

ABSTRACT

Zygomycosis is an infrequent infection caused byopportunistic fungi which belong to the order Mucoralesand which is present in high risk patients diagnosedwith : leukemia, lymphomas with prolonged neutropenia,diabetic cetoacidosis, severe malnutrition, rupture of theentire cutaneous barrier and immunesuppressingtherapy. This paper deals with a case of cutaneousZygomycosis in a pediatric patient diagnosed with acutelymphoblastic leukemia B type, suffering a severeneutropenia and corticosteroid treatment. On the fifthday of hospitalization, her forearm (venous puncturezone) showed an indured, erimatose lesion whichprogressed and ulcerated. Collection of exudates andbiopsies of subcutaneous tissue served to carry out directmicrosco-pic examinations with KOH, cultures inSabouraud Agar and a histologic study throughconventional hematoxilin-eosin and PAS techniques.Analyses of the clinical materials revealed the presenceof hyaline, not septated and broad hyphae suitable to aZygomycete. In all the tubes there was an abundantdevelopment of filamentous fungus identified as Rhizopusoryzae. After the surgical scission and treatment withanfotericine B, the patient showed a favorable evolutionup to now.

INTRODUCCION

Los hongos del orden Mucorales son los agentescausantes de lo que clásicamente llamamos mucormicosis

Recibido el 12 de Abril 2008Aceptado el 8 de Octubre 2008

o zigomicosis. Los géneros y especies de la familia Mucora-ceae, son los que causan más frecuentemente zigomicosisy de ellos los más comunes son Rhizopus oryzae y R .microsporus var. rhizopodiformis. Otros agentesetiológicos descritos en el hombre son: Rhizomucorpusi l lus, Absidia corymbifera, Cunninghamella

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bertholletiae y con menor frecuencia se diagnosticancasos originados ocasionados por Saksenaea vasiformis,Mucor circinelloides, M. ramosissimus, Apophysomyceselegans, Cokeromyces recurvatus y Syncephalastrumracemosum (20, 21, 23, 29, 32). En pacientes pediátricos,los agentes etiológicos identificados han sido fundamen-talmente Rhizopus spp. y esporádicamente Absidia spp.(1, 20, 23, 28, 37).

Los Mucorales no forman parte de la microbiotaresidente del hombre. Ocasionalmente es posibleencontrarlos como agentes saprobios de la piel y mucosasde individuos sanos o de pacientes hospitalizados (14, 21,22, 35). Esta cualidad, junto con su facilidad para creceren los medios habituales para hongos, hace que los cultivospositivos constituyan, en sí mismos, tan sólo unasospecha de infección, y que ésta deba ser confirmadapor la demostración de los hongos en los tejidos afectados(8, 28).

La característica epidemiológica más relevante delos Zygomycetes es su ubicuidad. Han sido identificadosen el medio ambiente hospitalario e incluso en los sistemasde aire acondicionado, lo que representa, al igual queAspergillus spp., una amenaza para la población depacientes inmunocomprometidos (35, 36). Las esporan-giosporas pueden ser vehiculizadas en el ámbitohospitalario por corrientes de aire o por objetos en contactodirecto con los pacientes (gasas, vendas, una variedad deproductos adhesivos usados en su ajuste y bajalenguasde madera contaminados), que pueden originar infeccionesnosocomiales (7, 9, 12, 22, 25, 32).

La infección se adquiere principalmente porinhalación de esporas, las que colonizan los senosparanasales y nasofaringe; ocasionalmente se puedeadquirir por inoculación cutánea de esporas o ingestióninadvertida de productos contaminados. No se hadocumentado transmisión de persona a persona (14).

Los factores que predisponen la infección porestos hongos son múltiples. Entre ellos: acidosismetabólica, cetoacidosis diabética, el uso de Desferoxami-na, leucemia en fase de neutropenia prolongada, linfoma ysíndrome mielodisplásico, trasplante de órganos sólidosy de precursores hematopoyéticos, desnutrición severa,ruptura de la integridad de la barrera cutánea (cirugía,traumatismos, quemaduras graves, punciones con agujascontaminadas, mordeduras o picaduras de insectos,vendajes contaminados, inserción de catéter, pinchazos yotros tipos de lesiones cutáneas, etc.) (12, 13, 17, 23, 25,26, 29 ,31, 37). También pueden afectar a enfermos bajoterapéuticas inmunosupresoras, niños prematuros y ainfectados por VIH (1, 8, 13, 17, 18, 19, 32, 34, 38).

Después del contacto con los tejidos, estoshongos raramente producen infecciones e invasión, y enuna alta proporción de los casos se comportan como meros

colonizadores (32). La integridad de las barreras cutáneo-mucosas y un sistema inmunitario competente son lasprimeras líneas de defensa con que se encuentran lasesporas.

La enfermedad se caracteriza por la rápidainvasión de tejidos y estructuras vasculares con lasconsiguientes vasculitis y trombosis que conducen ainfartos y necrosis tisular (2, 3, 5, 7, 12, 14, 15, 22, 24, 25, 27,28, 31, 32, 38). Típicamente, la infección implica el árearhino-facial-craneal, los pulmones, el tracto gastrointes-tinal, la piel, y menos comúnmente otros sistemas deórganos (21, 22).

Se describen seis formas clínicas de mucormicosis:cutánea, gastrointestinal, pulmonar, rinocerebral,diseminada y una forma miscelánea, que englobalocalizaciones como endocarditis, miocarditis, meningitis,absceso cerebral, endoftalmitis, cistitis, peritonitis,osteomielitis, artritis, miositis y pielonefritis (14, 20, 29,32). En niños se han descrito principalmente las formascutánea e intestinal en neonatos y las formas pulmonaresy rinocerebral en pacientes diabéticos e inmunocompro-metidos (1, 17, 37, 38).

La zigomicosis cutánea primaria se clasifica en:superficial, nodular, y gangrenosa. En cualquier caso, seinicia como vesículas o pústulas que pronto se transfor-man en úlceras o escaras.

El tipo superficial es poco sintomático y tiene elaspecto de una úlcera que no sana. El tipo gangrenosomuestra una progresión fulminante con extensión hacialos tejidos profundos. Otras formas incluyen púrpura,induración y ulceración con formación de escara. En laperiferia de las lesiones cutáneas, generalmente existenáreas de celulitis que pueden ser intensamente dolorosasa la palpación, aunque algunas zonas pueden serinsensibles debido a la necrosis (19). Pueden ser rápida-mente agresivas, incluso frente al desbridamiento apro-piado y al tratamiento médico (32).

En el huésped immunocompetente, se manifiestacon vesículas o pústulas que eventualmente progresanformando costras (12). Por el contrario, en el pacienteinmunocomprometido las lesiones, rojas e induradas,progresan formando costras negras que, al desprenderse,dejan úlceras grandes. La preferencia angioinvasiva delos zygomycetes, con la consecuente diseminación pordebajo de las estructuras cutáneas, culmina con la necrosisrápida y progresiva no sólo de los tejidos cutáneos ysubcutáneos, sino también de la grasa, músculos,tendones, el hueso adyacente y seguir un curso fulminante(3, 12, 15, 23, 26, 30, 31).

Frente a este tipo de lesiones cutáneas, se deberealizar diagnóstico diferencial con infecciones bacterianasnecrotizantes, aspergilosis, tuberculosis, sífilis y otrosprocesos granulomatosos. El diagnóstico de zigomicosis

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se establece por la demostración de las hifas en el materialde biopsia.

En este trabajo describimos los aspectoshistológicos y clínicos de una zigomicosis cutánea primariacausada por Rhizopus oryzae en el antebrazo de unapaciente pediátrica con leucemia linfoblástica aguda detipo B, con severa neutropenia y tratamiento coninmunosupresores.

CASO CLINICO

Paciente femenina, de 2 años de edad, residenteen Alto Verde, Concepción, (Tucumán – R. Argentina)consulta por cuadro clínico de 15 días de evolución, conlesión ampollar en la región submaxilar izquierda, tos yfiebre persistente. Es medicada con Cefalexina (140/mg/kg/día) durante 9 días. Debido a la mala evolución de lalesión, fiebre persistente y disminución de peso, se decidesu internación en el Hospital de Concepción. El día 20 defebrero de 2008 ingresa febril, con palidez mucocutánea,poliadenopatía latero-cervical, supraclavicular izquierda,axilar e inguinal y hepatoesplenomegalia. Es tratada conClindamicina y Dipirona. Después de recibir los resultadosde laboratorio se diagnostica pancitopenia febril. Esderivada con urgencia al Hospital del Niño Jesús el 22/2/2008. A su ingreso impresiona como una paciente en estadogeneral grave, hemodinámicamente compensada, consíndrome linfoproliferativo y absceso submaxilar izquierdode etiología desconocida.

Con diagnóstico presuntivo de leucemia, esderivada a la Sala de Inmunodeprimidos. Presentapoliadenopatias móviles y dolorosas a la palpación,petequias en los miembros inferiores y tumefaccióneritematosa en región submaxilar izquierda. Es medicadacon Ceftazidima, Amikacina y Clindamicina. Sus exámenes

de laboratorio iniciales mostraron: leucocitos 25.000 cel;células blásticas 97%, linfocitos 2%, monocitos 1%,hemoglobina 6,20 g/dl, hematocrito 19,6% y plaquetas18000. Se observa marcada hipocromía y anisocromía.glicemia normal; proteínas totales 8.6 g/dl, urea 0.42 g/L;Fig. 1. Zigomicosis cutánea primaria con necrosis

Fig. 2. Hifas cenocíticas en el examen directo (KOH10%) de muestra de exudado seropurulento

Fig. 3. Hifas anchas no tabicadas, Coloración HE (100X)

Fig. 4. Aspecto micromofológico (Gueguén 40X)

Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

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GPT 45 U/L. El laboratorio de Microbiología informóhemocultivo negativo, E. coli en urocultivo y Staphy-lococcus aureus en el exudado del absceso submaxilar. Alexamen micológico directo del exudado no se observaronelementos fúngicos ni se aislaron hongos en los mediosde cultivo específicos.

A los cinco días de su hospitalización (27/2/08),desarrolló en el antebrazo derecho, correspondiendo a lazona de punción venosa, una lesión indurada, eritematosa,que progresó y en cinco días se ulceró (3/3/08). La lesión,de 7 por 5 cm, dolorosa, tórpida, irregular, de bordespolicíclicos e hipertróficos, centralmente necrótica,rodeada de piel eritematosa que presentaba un fondoirregular con exudado seropurulento (Fig. 1). Se realizótoma de muestra por punción aspiración de la lesión ysangre que se enviaron para examen bacteriológico ymicológico (directo y cultivos). Los hemocultivos fueronnegativos. Los cultivos bacterianos fueron positivos paraS. aureus meticilino resistente. Al examen micológicodirecto (KOH, Giemsa y Gram) se observaron hifas hialinascenocíticas semejantes a Zygomycetes (Mucorales)resultado que fue inmediatamente informado al médicotratante (Fig.2). Se inició tratamiento con antibióticosparenterales (Ceftazidima y Amikacina), sin presentarmejoría. A las 72 h de incubación a 37 ºC en los cultivos enAgar Sabouraud Glucosa (SGA), se obtuvo el desarrollode colonias lanosas y blanquecinas de un hongofilamentoso, hialino, con hifas cenocíticas, compatible conRhizopus sp. Respecto a este resultado se mantuvoconducta expectante.

Dos días después (5/3/08), se recibió muestra deuna escarectomía de la lesión necrótica para análisismicrobiológico. Al examen micológico directo nuevamentese observaron hifas hialinas cenocíticas. En los cultivosen SGA a las 72 h de incubación a 37 ºC se obtuvo, otravez, el desarrollo de colonias lanosas y blanquecinas deun hongo filamentoso, hialino, con hifas cenocíticas,posteriormente identificado como Rhizopus oryzae (Fig. 3y 4). Se informaron los cultivos de hongos como positivosy ante el diagnóstico presuntivo de zigomicosis, el día 6/3/08 se realizó exéresis quirúrgica amplia y se iniciómedicación con Anfotericina B liposomal (1,5mg/Kg/dia)por vías intravenosa y tópica, más limpiezas quirúrgicascada 3-4 días manteniendo terapia antibacteriana. El día13/03/08 se recibió nuevo material de tejido subcutáneonecrótico y músculo para estudios micológicos e histopa-tológicos. El examen directo y cultivos de la muestra demúsculo fueron negativos mientras que el análisismicroscópico del tejido subcutáneo volvió a revelar hifasidénticas a las muestras anteriores. Nuevamente se obtuvocultivo puro de R . oryzae, en todos los cultivos del tejidosubcutáneo.

El estudio histopatológico, a través de técnicas

convencionales de hematoxilina-eosina y PAS, reveló ex-tensas áreas de necrosis en dermis e hipodermis conpresencia de abundantes hifas no septadas y anchaspenetrando la dermis y los vasos sanguíneos, confirmandoel diagnóstico micológico (Fig. 2).

Como complemento de la terapia antifúngica, lazona fue lavada en reiteradas oportunidades con soluciónsalina fisiológica estéril y tratamiento topico con elantifúngico, repitiéndose los aseos quirúrgicos. Seprocedió a la ampliación quirúrgica y repetición de laslimpiezas curativas cuando se consideró necesario.

Con diagnóstico final de Leucemia LinfoblásticaAguda Tipo BII y zigomicosis cutánea primaria, a la fecha,la paciente presenta una evolución ligeramente favorabley continúa con quimioterapia específica para LLA,tratamiento antifúngico con Anfotericina B y aseosquirúrgicos periódicos. Por su pronóstico reservado, seevalúa la posibilidad de su traslado a Buenos Aires.

Estudio MicológicoAl examen microscópico directo de las muestras

con KOH al 10%, coloración de Gram y Giemsa, seobservaron abundantes hifas hialinas, no septadas, anchascomo cintas, de 10-20 m de diámetro, con ramificacionesen ángulo recto.

Las muestras fueron sembradas en AgarSabouraud Glucosa (SGA) adicionado de Penicilina (50U.I./ml) y Estreptomicina (80 g/ml), e incubadas a 37 ºC.El diagnóstico microbiológico se basó en la observaciónmacro y micromorfológica de las colonias en SGA. A partirde las 72 h se observó en todos los tubos abundantedesarrollo de un hongo de crecimiento rápido. Las coloniascubrieron prácticamente toda la superficie del medio decultivo, con micelio aéreo denso, algodonosas, de aspectoconsistente, al principio blancas, después gris oscurasque se fueron ennegreciendo con el transcurso de los días,anverso claro, típicas de los integrantes del géneroRhizopus (Fig.3).

Para la observación macro y micromorfológica seresembró la cepa en Agar Malta siguiendo la metodologíade Schipper (27). Colonias café grisáceas, esporangióforoscafé-grisaceos, rizoides cafesosos, esporangioforos yestolones hasta 1200 µm de largo y de 9-15 µm de ancho,solitar ios o agregados en grupo, frecuentementeramificados. Esporangios cafesosos a negros, globososa subglobosos, lisos a finamente espinosos, 55-130 µm;columelas elipsoidales a ovoides de base trunca, 40-100µm de alto, de color gris; esporangiosporas esféricas,ovoides o irregulares, estriadas, pálidas, 4-8 µm de largo.Clamidosporas escasas, globosas a elipsoidales.Zigosporas ausentes. Crecimiento óptimo a 37ºC, máximo42-43ºC . No crece a 45ºC. Determinación final: Rhizopusoryzae (Fig. 4).

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DISCUSION

La presentación clínica de la zigomicosis cutáneaes variable, sin embargo, los signos clave que debenadvertir al clínico son la necrosis y la rapidez del cursoevolutivo (25). Una herida en cuyo margen aparece unanecrosis progresiva en un paciente con factores de riesgo,debe orientar hacia zigomicosis. La triada constituida pornecrosis cutánea, progresión veloz del cuadro, junto conlos factores de riesgo del paciente, debe alertar al médicosobre un cuadro grave. La sospecha clínica de esta entidad,su estudio mediante examen directo de la escara, y elprocesamiento rápido del material de biopsia para estudioconvencional y cultivo, son determinantes para instaurarel tratamiento con la mayor celeridad posible, lo queredundará en un mejor pronóstico de esta grave enferme-dad (8).

Los Zygomycetes esporádicamente forman partede la microbiota saprofita normal de la piel y mucosas ycrecen fácil y rápidamente en los medios de cultivo (22).Por esto, se explica que su diagnóstico no se puedeestablecer sólo por la positividad de los cultivos, sino queresulta indispensable demostrar la invasión fúngica en lostejidos, para lo que se requieren procedimientos agresivoscomo la obtención de biopsia de tejidos (5, 22). La invasióndel tejido por hongos no tabicados mostrando áreas denecrosis e infartos con vasculitis, trombosis y hemorragiascaracterísticas de esta enfermedad constituye la pruebadeterminante de esta micosis (25, 28, 29), y su cultivo esdefinitivo para la identificación final del agente (8).

A pesar de que el diagnóstico de la zigomicosisse basa en exámenes histopatológicos, es necesario teneren cuenta que éstos no suelen estar disponibles en formarápida. Esta limitación justifica que, en algunas series,hasta el 50% de los casos sólo fueron diagnosticados postmortem (16,18). Por ello, el examen micológico directo dela escara es de gran rendimiento diagnóstico y en sólounos minutos orientará hacia esta posibilidad.

En un estudio que reunió datos de 50 hospitalesde España, el aislamiento de Zygomycetes fue muy bajo,demostrando que menos del 8% de los pacientes concultivo positivo estaban realmente infectados, mientrasque la gran mayoría presentaban colonización o contami-nación de laboratorio (33). Aún así, consideramos que, sibien la trascendencia del cultivo puede ser baja, elaislamiento de estos hongos tiene importancia si seconsidera el tipo de lesión y procedencia de la muestraclínica. La observación de abundantes hifas hialinas notabicadas junto al aislamiento de un zygomycete debe serla voz de alarma para el seguimiento de los pacientes deriesgo, aun cuando su carácter ambiental les permitecolonizar pacientes sin causar enfermedad, o contaminarlos cultivos en el propio laboratorio.

La literatura médica nacional es escasísima acercade esta patología. Al presente carecemos de datos confia-bles sobre la frecuencia de esta micosis en la RepúblicaArgentina. De un estudio que integra los datos de pato-logía fúngica generados por un número importante delaboratorios distribuidos a lo largo de todo el país, surgeque el porcentaje de muestras derivadas para diagnósticomicológico es bajo. Entre enero y diciembre de 2004, tansólo 0,78% de los casos correspondieron a zigomicosis loque probablemente no refleja la incidencia de esta patologíaen la Argentina (4).

Por otra parte, el diagnóstico de especiehasta ahora no parecía tener mayor trascendencia clínica;sin embargo, existen diferencias significativas desusceptibilidad in vitro de los distintos géneros y especiesde la familia Mucoraceae a los azoles, lo que podríatraducirse dentro de los próximos años en importantesdecisiones terapéuticas (6, 30).

Como todas las especies de Mucoralespresentan hifas anchas no septadas que se ramifican enángulo recto, y además causan invasión vascular, para suidentificación es necesario realizar un diagnósticomorfológico en cultivos.

El diagnóstico serológico no es útil para detectarinfecciones por Zygomycetes. Éstos comparten variosdeterminantes antigénicos, lo que dificulta la distinciónentre especies e incluso entre géneros (32).

Las técnicas moleculares para la detección dezigomicosis invasora son escasas y se emplean fundamen-talmente para determinar asignaciones taxonómicas.Aunque estas herramientas pueden ser útiles en losestudios epidemiológicos de brotes de zigomicosis, seconoce mal su rendimiento en el diagnóstico primario (10,11).

En el caso clínico que presentamos concurrieronvarios factores de riesgo para el desarrollo de zigomicosiscutánea: leucemia, neutropenia severa, infección bacterianamixta y tratamiento inmunosupresor. Consideramos, juntoa Chandra (3), del Palacio (5) y Runco (25) que en estoscasos los pacientes presentan una evolución rapidísima ygeneralmente fulminante.

Habitualmente, la imposibilidad de llegar a undiagnóstico que permita el tratamiento oportuno de estapatología, induce a la medicación empírica del paciente loque aumenta, innecesariamente, su situación de riesgo.En estos últimos años se ha descrito un incrementoimportante en la incidencia de esta enfermedad eninstituciones aisladas o unidades específicas alcanzandoun 8% en pacientes con leucemia. Este aumento del númerode casos se produce generalmente en pacientes y unidadesdonde se administra con exceso profilaxis antibacterianade amplio espectro, sin la sospecha de una micosis (33).

Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

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CONCLUSIONES

La triada constituida por necrosis cutánea, granagresividad y rápida evolución, principalmente enpacientes inmunocomprometidos, debe poner al médicoen alerta sobre una posible patología fúngica. La sospechaclínica y los criterios de infección fúngica probable oposible son determinantes para establecer el diagnósticoapropiado, aún frente a la negatividad del examen directoy los cultivos. La observación de abundantes hifas hialinasno tabicadas y el aislamiento de un zygomycete deben seruna voz de alarma cuando se trata de enfermos inmuno-comprometidos. La demora en el diagnóstico produce unimpacto desfavorable en la toma de decisiones terapéuticasacertadas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. Eduardo Piontelli porhaber realizado la identificación de R.oryzae y por sussugerencias en la elaboración de este manuscrito.

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Zigomicosis cutánea primaria por Rhyzopus oryzae - R. Salim et al.

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ASPERGILOSIS CEREBRAL: REPORTE DE CASO

(Brain aspergillosis: a case report)

Eduardo Contreras Zúñiga (1)Gloria Elena Posadan (2)

Sandra Ximena Zuluaga Martínez (3)(1) Medicina Interna Universidad del Valle.

Cali. Colombia. Correspondencia: edo11@hotmail.com.Dirección: Calle 4 No, 65 – 14. Cali. Colombia.

(2) Medicina Interna. Clínica de Occidente S.A. Cali. Colombia. (3) Cirujano general. Angiografía se Occidente SA.

Cali. Colombia.Palabras claves: Aspergilosis cerebral, aspergilosis invasiva.Keywords: Brain aspergillosis, invasive aspergillosis.

Boletín Micológico Vol. 23 : 43 - 47 2008

RESUMEN

En los últimos años la incidencia por infeccionesde hongos del genero Aspergillus han aumentado deforma significativa como consecuencia del incrementode pacientes con estados de inmunodepresión,fundamentalmente por la alta incidencia de SIDA y porel mayor empleo de tratamientos inmunosupresores. Lasaspergilosis son infecciones infrecuentes en el sistemanervioso central, constituyendo el 4% de las enferme-dades invasoras, tratandose de una entidad grave, conun pobre pronóstico (mortalidad mayor del 95%). Sepresenta un caso clínico de un paciente masculino de 48años, con miocardiopatia dilatada terminal que fue some-tido a transplante cardiaco, tratamiento inmunosupresory profilaxis antimicrobiana. Después de su alta ( 23 díaspost cirugia), regresa con compromiso del sensorio yfocalidad neurológica, por lo que se practica RNM queevidenció lesión microangiopatica, con edema y realceperiférico anular. Cultivos microbiológicos negativos yLCR dentro de lo normal. Posteriormente (10 díasdespués del ingreso) empeora su condición neurológicae imagenológica, por lo que se realizó biopsia estereo-taxica obteniéndose exámenes directos negativos ehistología sin evidencia de microorganismos, sinembargo, en los cultivos se obtuvo Aspergillus fumigatus.Se inició tratamiento con Voriconazol con buena respues-ta inicial, pero posteriormente empeora su condiciónneurológica y general, con signos y síntomas de rechazodel transplante cardiaco, falleciendo a los 62 díaspostransplante.

SUMMARY

In recent years the incidence of fungal infectionsof the genera Aspergillus have increased significantlyas a result of the increase in patients with immuno-compromised states, primarily by the high incidence ofAIDS and the increased use of immunosuppressivetreatments. The aspergillosis infections are rare in thecentral nervous system, constituting 4% of invasivedisease, in the case of a serious entity with a poorprognosis (mortality greater than 95%). We report a caseof a 48-year-old male patient with terminal dilatedcardiomyopathy underwent heart transplantation,immunosuppressive therapy and antimicrobialprophylaxis. After his high (23 days post-surgery), isback with commitment and focal neurologicconsciousness, so that is practiced MRI showedmicroangiopathic injury, edema and peripheralenhancement cancel. Microbiological cultures andnegative CSF within normal. Later (10 days afteradmission) her neurological condition worsened andimagery, so stereotactic biopsy was obtained andhistology tests negative without direct evidence ofmicroorganisms, however the culture was positive toAspergillus fumigatus. Voriconazole treatment startedwith good initial response, but later his conditionworsened neurological and general signs and symptomsof heart transplant rejection, died 62 dayspostranplantation.

INTRODUCCION

En la última década se ha producido un incrementosustancial de los casos de aspergilosis invasiva comoconsecuencia de la generalización de tratamientos

Recibido el 18 de Diciembre 2008Aceptado el 30 de Diciembre 2008

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inmunosupresores cada vez más potentes. Este incrementoen la frecuencia de esta enfermedad no se ha vistoacompañado de una reducción en la mortalidad, que siguesiendo elevada (1, 2).

La aspergilosis pulmonar es, sin duda, la formaclínica más frecuente de presentación de esta entidad,seguida por la sinusitis, la infección del árbol traqueo-bronquial y la del sistema nervioso central (2, 10).

La aspergilosis cerebral puede verse en un 4% hastaun 20% de las formas invasivas. El diagnóstico precoz dela infección por Aspergillus del Sistema Nervioso Central(SNC) es un gran desafío, donde la sospecha clínicafundamentada es clave por la alta letalidad de la entidadaún con tratamiento oportuno. La importante dificultaddiagnóstica es favorecida por algunas características dela entidad: baja incidencia, compromiso de individuosinmunocomprometidos que presentan múltiples infec-ciones, manifestaciones neurológicas clínicas e image-nológicas inespecíficas y métodos diagnósticosetiológicos de resultados tardíos (1, 3, 4).

CASO CLINICOPaciente masculino, de 48 años de edad, con

antecedentes de miocardiopatía dilatada idiopática, por laque fue sometido a transplante cardíaco, recibiendo dentrodel protocolo de manejo perioperatorio profilaxis antibió-tica con Ceftriaxona y Vancomicina, además de bolos deMetilprednisolona. Se adicionó Micofenolato Mofetil yCiclosporina. También se inicio profilaxis con Trimetropin-sulfametoxazol (TMS), Aciclovir, Nistatina y Pirimetamina(seronegativo para anticuerpos contra Toxoplasma gondii).

Se realizaron ecocardiogramas transtorácicos queevidenciaban adecuado funcionamiento del injerto. Serealizaron 2 biopsias endomiocárdicas (Semana 1 y 2)negativas para rechazo celular del injerto. El paciente esdado de alta a los 18 días después del transplante paraseguir con Ciclosporina, Prednisolona, MicofenolatoMofetil, Aciclovir, Nistatina, ASA, Omeprazol, Calcio,Calcitriol, Enalapril, Metoprolol, TMS.

El paciente reingresa a los 23 días postransplantepor 72 horas de evolución de malestar general, disneasubjetiva e irritabilidad. Al examen físico se encontró enregular estado general, TA 126/72 mmHg, Fc:100 l.p.m.,Fr:18, sin hallazgos anormales al examen físico. Paraclínicosevidencian sodio: 118mEq/lt, potasio: 5.2mEq/lt. Resto delos estudios dentro de límites normales. Ecocardiogramaevidencia hipertrofia marcada del ventrículo izquierdo confracción de eyección del 65% 24 horas después del ingreso:

A pesar de la corrección de las alteracioneshidroelectrolíticas, se observa mayor deterioro neuroló-gico, confusión y desorientación.

A los 25 días postrasplante: Se observa mutista, no obe-

dece ordenes, hay respuesta plantar flexora bilateral ymarcado temblor distal en miembros superiores. Se realizauna resonancia magnética cerebral (RMN) (Fig. 1, 2, 3)observándose múltiples lesiones secundarias amicroangiopatía con edema perilesional y realce periféricoanular. Se solicita una tomografía de tórax sin lesionesespecíficas. Los hemocultivos fueron negativos yGalactomannano fue negativo en dos oportunidades. ELfisicoquímico y citológico del LCR estaba dentro de losparámetros normales, con cultivo negativo.

El paciente evoluciona en forma favorable durantelos siguientes 7 días.

A los 32 días postrasplante: Control escanográfico (Fig. 4y 5) evidencia mejoría parcial de las lesiones. El pacientepermaneció con temblor distal pero con mejoría neurológicaimportante.

A los 37 días postrasplante: Presenta episodio convulsivo,relajación de esfínteres, sialorrea y desviación de la mirada.Se realiza nueva resonancia magnética cerebral que muestraaumento del edema perilesional, aparición de nuevaslesiones con efecto de masa y realce periférico (Fig.6 y 7).

A los 40 días postrasplante: Se realiza biopsia cerebralestereotáxica obteniendo abundante material purulento.El examen directo del material coloreado con Gram fuenegativo; en el estudio histológico se observo necrosissin evidencia de microorganismos.

A los 44 días postrasplante: El paciente se deterioraneurológicamente, presenta hemiparesia. El reportepreliminar del cultivo es informado como positivo para unhongo filamentoso el cual, posteriormente fue tipificadocomo un Aspergillus fumigatus. Se inicia tratamiento conVoriconazol 4 mg/kg cada 12 horas.

A los 50 días postrasplante: El paciente mejoraneurológicamente, queda secuela de hemiparesiaizquierda. Se realiza control escanográfico que evidenciamejoría de todas las lesiones previas excepto una a nivelde de hemisferio cerebral izquierdo.

A los 55 días postrasplante: El paciente presenta disneaprogresiva, cifras tensionales bajas y disminución defracción de eyección (30%) mediante ecocardiograma.Teniendo en cuenta la mejoría neurológica y radiológicadel paciente, se reajusta dosis de esteroide para manejodel rechazo celular con compromiso Hemodinámico.

A los 60 días postrasplante: Empeoramiento de hemiparesiaizquierda y disartria. Se realiza nuevo estudio image-nólogico (Fig. 8 y 9) que evidencia sangrado intraparen-

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Figuras 1 - 9 Estudio imagenólogico. Fig.1, 2, 3. Múltiples lesiones secundarias a microangiopatía con edemaperilesional y realce periférico anular a los 25 días post transplante Fig. 4, 5. Control escanográfico a los 32 días .

Fig. 6, 7. Control escanográfico a los 37 días. Fig. 8, 9. Control escanográfico a los 60 días.

quimatoso con sangre en el sistema ventricular ydesviación leve de línea interhemisférica.Se le realizo a drenaje neuroquirúrgico urgente delhematoma cerebral. El paciente fallece 2 días después (37días postransplante cardiaco).

DISCUSION

El primer caso de Aspergilosis en seres humanos fuedescrito en 1842 por Bennet en Edimburgo. Sin embargolos casos descritos correspondían a personas inmuno-

Aspergilosis cerebral: reporte de caso - E. Contreras et al.

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competentes donde se presentaba como una enfermedadgranulomatosa. No fue sino hasta 1950, cuando el uso delos esteroides y medicamentos citotóxicos se introdujo enla práctica diaria que se reconoció su papel comoenfermedad oportunista y en 1953 se describe el primercaso de Aspergillosis Invasora (AI) en un pacienteinmunocomprometido (1, 2).

En pacientes trasplantados de corazón la incidenciade esta infección parece ser menor que en pacientestrasplantados de otros órganos como hígado y pulmón.Sin embargo la mortalidad es igual de alta en estospacientes y las dificultades existentes en cuanto aldiagnóstico y manejo antimicótico son también similares(1, 3).

Se han identificado algunos factores de riesgo paradesarrollar esta infección, tanto en pacientestransplantados de corazón como de otros órganos. Dentrode estos factores se destacan el uso de esteroides a altasdosis, el uso de antibióticos pretransplante, la colonizaciónprevia por Aspergillus, complicaciones quirúrgicas, elexceso de inmunosupresión, el rechazo crónico, laenfermedad por CMV, la ocurrencia en la institución de unepisodio de Aspergillosis invasora en los dos mesesprevios o posteriores al trasplante y la necesidad deretrasplante (2, 4, 5).

La especie aislada con mayor frecuencia es A.fumigatus y la importancia de otras especies es menosdramática aunque se han diagnosticado infecciones porA. niger, A. flavus y A .terreus (3).

La incidencia de Aspergillosis invasiva en trasplan-tados cardiacos oscila entre 1 y 15%, con una frecuenciaen promedio de 5.2%, representando el 69.8% de lasinfecciones micóticas, siendo la infección mas frecuenteen su grupo (4, 6).

La Aspergillosis cerebral ocurre en el 10 a 40% delas infecciones invasivas, sin embargo, es raro elcompromiso aislado cerebral y es generalmente el resultadode diseminación desde otro órgano, generalmente lospulmones (2).

La mortalidad en trasplante cardiaco es del 53-78%con aspergillosis invasora y cercana al 100% si comprometeel sistema nervioso central (4).

La infección se presenta con mayor frecuenciadurante los primeros meses postransplante. El riesgodisminuye en forma importante después del primer año detransplante. Se ha observado una frecuencia de infecciónen los primeros 3 meses postransplante de 0.15 episodios/paciente/mes y disminuye hasta 0.05 episodios/paciente/mes despues de los tres meses (5, 7).

El SNC puede afectarse de distintas maneras enesta infección, incluyendo la formación de abscesos ogranulomas en el parénquima cerebral, aracnoiditis difusa,infartos cerebrales o medulares, aneurismas micóticos o

abscesos epidurales espinales (4, 7, 8).La aparición de abscesos cerebrales es un signo

ominoso. Generalmente el paciente presenta síntomasfocales. Cuando Aspergillus invade el sistema nerviosocentral por vía hematógena las hifas producen oclusiónvascular o pueden atravesar las paredes capilaresproduciendo infarto hemorrágico que puede evolucionara un infarto séptico con cerebritis y formación de abscesos.La distribución más común suele ser las regiones irrigadaspor la arteria cerebral media y por la arteria cerebral anterior(1, 2, 6).

Los síntomas son inespecíficos, y a pesar de supropensión a realizar invasión vascular los hemocultivossuelen ser negativos.

El diagnostico suele ser un reto y hasta el 18% delos pacientes se diagnostican post mortem. La dificultaden el diagnóstico tiene varias razones:1. En primer lugar la aspergillosis tiene presentacionesatípicas e inespecíficas que hacen primero pensar en otrasinfecciones que son además más frecuentes (2, 9).2. Se presenta en un amplio y variado grupo de personasalgunos de los cuales están expuestos por mucho tiempoal patógeno y otros que solo se exponen un tiempo corto(3, 8).3. No hay un solo método diagnóstico. Se requieren variosexámenes y descartar otras infecciones antes de confirmaresta infección, cuyo patrón de oro para diagnosticarla eshistopatológico y/o por cultivos y de cuya rapidez en eldiagnóstico y tratamiento, dependerá la vida del paciente(7, 9).

El tratamiento de elección de la enfermedadinvasora es el Voriconazol a una dosis de 8 mg/kg/día.Algunos expertos recomiendan como alternativa laadministración de Anfotericina liposomal en dosis elevadas(10 mg/kg/día) basándose en estudios que demuestranuna mayor eficacia sin mayor toxicidad. También es posiblela utilización de Caspofungina (la única Equinocandinacomercializada en nuestro país hasta el momento) que hademostrado su utilidad en tratamientos de rescate (8, 9).

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APORTES MORFOTAXONOMICOS EN EL GENEROAspergillus Link: CLAVES PARA LAS ESPECIESAMBIENTALES Y CLINICAS MAS COMUNES

(Morphotaxonomic contributions in the genus Aspergillus Link:keys for the most common environmental and clinical species)

Eduardo Piontelli L.Universidad de Valparaíso, Escuela de Medicina,

Cátedra de Micología, Casilla 92 V, Valparaíso Chileeduardo.piontelli@uv.cl

Palabras clave: Aspergillus, claves especies comunes.Key words: Aspergillus, key common species.

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RESUMEN

Se condensan los principales alcances en elgénero Aspergillus y las metodologías de diagnósticomorfo-taxonómico de las especies más comunes deutilidad para el micólogo en áreas clínicas y ambien-tales. Se aporta información bibliográfica actualizadapara las determinaciones polifásicas de las especies yalgunas claves morfofisiológicas tentativas en ciertostaxa de importancia médica, con énfasis en la SecciónFumigati.

INTRODUCCION

Las especies de Aspergillus Link , seconsideran entre los organismos de más ampliadistribución cosmopolita, capaces de colonizar una granvariedad de substratos en los diferentes nichosecológicos del suelo; en general, son frecuentes en climastropicales y subtropicales pero disminuyen en los climasfríos, mientras algunas epecies son restringidas a hábitatespecíficos. Se consideran contaminantes comunes devarios substratos, en especial alimentos, granos, suelos(salinos, cultivados, desérticos y de pastoreo), bosquessubtropicales deciduos y ambientes internos, entre otros.

Un buen número de sus integrantes tieneimportancia ecológica, genética, biotecnológica, sinolvidar sus aspectos patogénicos y micotoxicogénicosrelacionados con el hombre y otros mamíferos (Powellet al., 1994).

Se reconoce a Link (1809) como al autor quevalidó al género (CINB), a pesar que Micheli (1729) fueel primero que lo describió. En el siglo XX se publicaronvarias monografías del género (Thom & Church, 1926;

Thom & Raper, 1945), pero la más completa en su épocay aún consultada fue la escrita por Raper & Fennel en elaño 1965, que incluyó varias nuevas especies; sinembargo, a pesar de incluir la diagnosis latina de lasnuevas especies, no designaron las especies tipo,describiendo además los teleomorfos bajo el mismonombre de los anamorfos (Aspergillus). Los aportesposteriores fueron agregando nuevas especies yreordenaron el género hacia una línea más acorde alCódigo Internacional de Nomenclatura Botánica (CINB)dilucidando sus relaciones con los teleomorfos deAspergillus. Las nuevas especies descritas desde 1965fueron publicadas en la literatura por Samson (1979, 1992,1993, 2000) y otros autores (Al Musallan, 1980;Christensen, 1981-1982, entre otros), aportándose almimo tiempo varios métodos de identificación.

La taxonomía tradicional del género se basaprincipalmente en sus caracteres fenotípicos y fisioló-gicos, los cuales han aportado satisfactorias delimita-ciones de las especies, sin embargo, existen variacionesmorfológicas en varias secciones que han llevado acontroversias en sus esquemas taxonómicos. En elnuevo siglo 21, Aspergillus y sus teleomorfos han sidorecientemente investigados con métodos polifásicos(morfológicos, fisiológicos y moleculares) para examinar

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Recibido el 1 de Septiembre 2008Aceptado el 28 de Noviembre 2008

ABSTRACT

The main information about the Aspergillusgenus together with methodologies for the morphotaxo-nomic diagnosis of the most common species useful forthe mycologist in clinical and environmental areas arehere condensed. An updated bibliography is forwardedin order to carry out polyphasic identification of thespecies as well as tentative morphophysiological keysin some taxa having medical significance with emphasisin Section Fumigati.

la variabilidad entre sus especies (Samson & Pitt, 2000;Samson et al, 2006; Samson & Vargas, 2007).

Las especies de Aspergillus se estudianmediante sus características macro y micromor-fológicas, junto a caracteres de crecimiento en diferentesmedios de cultivo, perfiles de extrolitos (micotoxinas) ytécnicas moleculares, tales como; secuencias del gende la b-tubulina, calmodulina y actina, mientras otrastécnicas de análisis como, amplificación de DNA poli-mórfico al azar (RAPD) entre otras, han sido utilizadas(Geiser et al., 2000-2004 -2007; Balajee et al., 2005; Prin-gle et al., 2005; Samson et al., 2007; Varga et al., 2007)

En clínica, los análisis moleculares e inmuno-lógicos han sido un avance prometedor en eldiagnóstico rápido, sin embargo, la microscopía y loscultivos (con un adecuado entrenamiento profesional),siguen siendo las herramientas esenciales no solo eneste campo, sino en muchos otros (McClenny, 2005).

Las secciones de Aspergillus Fumigati, Circum-dati, Flavi y Nigri, contienen los más importantes pató-genos humanos, sin embargo, A. fumigatus fue conside-rado como el único y más importante Aspergilluspatogénico conocido dentro de la Sección Fumigati,una situación que ha cambiado recientemente conreportes clínicos que incluyen, Neosartorya pseudofis-

cheri, A. lentulus (resistente a múltiples antifúngicos)y A. undagawe (Neosartorya) como patógenas relacio-nadas con A. fumigatus (Balajee et al.,2005). Losestudios moleculares han revelado frecuentes erroresen la identificación de A. fumigatus cuando se usasolamente la morfología, sin otros datos fisiológicos deapoyo, especialmente en cepas de baja esporulación(Balajee et al., 2006).

b) Características macroscópicas. Estas son importantes en la clasificación

subgenérica, tales como el color de los conidios, que seobserva en placas de Petri en los diferentes medios decultivo (debido a su utilidad en la clasificaciónsubgenérica); el color puede variar desde el negro,blanco, amarillo, ocre, azul verde, o una mezcla de ellos,por lo que es recomendable emplear a veces una tablade colores determinada. Las colonias pueden producirgotas de líquidos en su superficie, ya sea incoloras ocon diferentes tonalidades, así como pigmentos devarios colores en el reverso de la colonia, si éstos sonsolubles difunden al agar. El diámetro de las colonias(en mm), es otra característica fisiológica útil, debido aque las especies del género pueden variar en suhabilidad de crecer a diferentes potenciales de agua, y a

ConidióforoEstipe

Conidios

MétulasFiálides

Vesícula

Cabeza radiada biseriada Cabeza columnar monoseriada

Célula piéCélulas Hülle

Tipos de vesículas

Globosa PiriformeEspatulada Clavada

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Figura 1. Estructuras morfológicas en el género Aspergillus: cabezas radiadas y colomnares, tipos devesículas, célula pie, células Hülle

diferentes temperaturas en medios estandarizados.

Algunas especie pueden producir en los culti-vos estructuras de variado tamaño, pero observables asimple vista o bajo la lupa estereoscópica, de aspectogeneralmente redondo, de diversos colores y consis-tencia firme, llamadas esclerocios (Sección: Candidi,Circumdati, Flavi, Nigri), pero también puedenpresentarse cleistotecios (ascomata), principalmente delos géneros Eurotium, Neosartorya y Emericella).

c) Características microscópicasAspergillus es un género anamórfico que

produce esporas asexuales (conidios, mitosporas)sobre estructuras especializadas características que secomponen de un: conidióforo (estipe) que se dilata en elápice, formando una vesícula de diferentes formas (Fig.1). Las vesículas pueden variar en tamaño y forma, desdeesféricas (globosas), clavadas, piriformes y espatula-das. La vesícula nace sobre un corto o largo pie,usualmente aseptado, liso o rugoso y que se une a lahifa portadora generalmente en ángulo recto mediante

una estructura en forma de T invertida llamada célulapie (Fig.1), que forma parte integral del estipe. La célulapie y el estipe son comúnmente llamados conidióforos,que apicalmente terminan siempre en una vesículadilatada, la cual puede dar origen en su superficie a 1 o2 tipos de estructuras ya sea en una sola alineación defiálides (monoseriados o uniseriados), que son las célulaconidiógenas, que originan siempre conidios secos opresentar una segunda estructura bajo las fiálidesllamadas métulas (biseriadas) que pueden sostener 1a 10 fiálides c/u (Fig.1). Algunos taxa pueden sermonoseriados y biseriados a la vez, mientras otros sonestrictamente monoseriados o biseriados. Ambasestructuras (fiálides y métulas) se forman sincrónica-mente en la superficie de la vesícula pudiéndola cubrirparcial o totalmente. Las vesículas, fíalides y métulas (siestas últimas están presentes), junto con los conidios,forman lo que llamamos cabeza conidial, la cual por ladisposición de los conidios puede ser de aspectocolumnar o radiado (redonda). Pueden presentarsesituaciones intermedias, como columnar laxa, que formavarias columnas divergentes o radiada laxa, con cortascolumnas que abren la cabeza radiada, pero mantienenel aspecto redondo. Algunos miembros del géneropueden producir células de gruesa pared y de variadotamaño (siempre mayores que los conidios o mitospo-ras), llamadas células de Hülle, generalmenteentremezcladas con el micelio o asociadas a las formassexuales del género (ej.Cleistotecios de Emericella). Sibien es cierto que su función parece ser protectiva,pueden actuar también como propágalos de dispersión.

d) Presencia de teleomorfo.Algunos miembros del género son capaces de

reproducirse sexualmente en cultivos mediante laformación de cleistotecios (Ascomycota, Pezizomyco-tina, Eurotiomycetes, Trichocomaceae), que contienenascosporas formadas en ascos más o menos redondos,evanescentes, dispuestos desordenadamente en elcentrum. El tipo de ascoma, tamaño, forma, estructura,superficie y color de las ascosporas, son importantesen la determinación de los taxa. Actualmente se con-sideran 11 géneros teleomórficos dentro del género ana-mórfico Aspergillus y sus subgéneros (Tabla 1). Chaetosartoria (Sección Cremei) Dichlaena y Eurotium (Sección Aspergillus, Fig. 2a) Emericella (Sección Nidulantes, Fig. 2b) Fennellia (Sección Flavipedes), Hemicarpenteles, Sclerocleista y Warcupiella

(Sección Ornati), Neopetromyces (Seccion Circumdati), Neosartorya (Sección Fumigati, Fig. 2c), Petromyces (Sección Flavi).

e) Producción de MicotoxinasLos Aspergillus no se han considerado como

causa de enfermedades en las plantas, sin embargo,algunas especies son responsables de algunos proble-

Ascos y ascosporas

Ascos y ascos-poras

Células Hülle

a

b

cAscos y ascosporas

Figura 2. Principales tipos de ascomata enteleomorfos de Aspergillus.

a) Eurotium, b) Emericella, c) Neosartorya.

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

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Subgénero Secciones*Aspergillus Aspergillus (A. glaucus grupo).Teleomorfo Eurotium, cleistoteciosUniseriados, xerofílicos, amarillosconidios gris-verdosos Restricti (A. restrictus grupo). Crecimiento lento en los medios

Fumigati Fumigati (A. fumigatus grupo).Conidios gris verde a azul verdososUniseriados,vesículas pre- Cervini (A. cervinus grupo). Conidios naranja claros a gris naranjadominantemente piriformes,conidios gris-verdes, azul-verde a naranja

Ornati Ornati (A. ornatus grupo)Uniseriados, conidios gris verdosos, amarillo-verdosos u oliva-café

Clavati Clavati (A. clavatus grupo) (Incluida en Fumigati por Peterson, 2008)Uniseriados, vesículas clavadas,conidios gris-verdosos

Nidulantes Nidulantes ( A. nidulans grupo). Estipe corto cafesoso, células Hülle aBiseriados, conidios de menudo presentes. Teleomorfo Emericella, ascosporas rojo púrpura.colores variables Versicolor (A. versicolor grupo). Estipe hialino a café, conidios verdes,

verde grises o azul verdosos. (Incluida en Nidulantes por Peterson 2008).Usti (A. ustus grupo). Estipe café, conidios café a oliva, rugosos.Terrei (A. terreus grupo). Estipe hialino, conidios naranja café a ante.Flavipedes (A. flavipes grupo). Estipe hialino a café claro, conidiosblancos a crema.

Circumdati Wentii (A. Wentii grupo).Conidios color ante, amarillo-café o oliva-café.Uni o biseriado, vesículas Flavi (A. Flavus grupo). Estipe rugoso, conidios amarillo verde a oliva-cafè .esféricas o piriformes Nigri (A. niger grupo). Estipe liso, conidios oscuros cercanos al negro.

Circumdati (A. ochraceus grupo).Predominantemente biseriados, conidiosamarillos, ante u ocráceos.Candidi (A. candidus grupo). Conidios blancos o cercanos al blanco.Cremei (A. cremeus grupo). Conidios café, amarillos o azul verdosos.Sparsi (A. sparsus grupo).Conidios gris pálido a oliva-ante.

Ochracxeoroseus Ochraceoreosei (A.ochraceoroseus y A.rambelli).Biseriados, vesícula redonda, conidios gris-amarillentos (Frisvald et al., 2005) incluyen ambas especies bajo elsubgénero Circumdati, por su incapacidad de crecer a 37ºC y sus extrolitos)(*La resoloción filogenética limitada de algunas especies y secciones aconseja el uso de más genes adicionalespara determinar sus relaciones).

Tabla 1. Nomenclatura de los taxa infragenéricos del género Aspergillus y sus Secciones(Modificada de Gams et al., 1985 y Klich, 2002).

mas de contaminación en productos vegetales ya seaen precosecha, cosecha, post cosecha y almacena-miento (A. niger, A. flavus, A. parasiticus, A. ochra-ceus, A. carbonarius, A. alliaceus, entre otros)( Perroneet al., 2007).

El mayor problema reside en la presencia demicotoxinas contaminantes en alimentos y piensos.donde varias de estas se han identificado y la másimportante son las aflatoxinas y la ocratoxina A (Vargaset al., 2004). Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2, por supoder carcinogénico son consideradas las máshepatotóxicas (Bennet & Klich, 2003), por el riesgo en

salud humana y animal, debido a la contaminación deproductos en precosecha: maíz, algodón, soja, maní,nueces y por ciertos residuos que aparecen en la lechedebido al consumo por los animales de piensoscontaminados. La ocratoxina A es una potentenefrotoxina que además posee propiedades carcino-génicas, teratogénicas e inmunotóxicas en ratas yposiblemente en humanos. Puede contaminar alimentos,tales como granos, legumbres, café, frutas secas,cerveza, vino y carnes: las especies más productoraspertenecen a la sección Circumdati y Nigri (Ver Frisvaldet al., 2007).

Stilbothamnium (especies que forman sinnemata)

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f) Presencia de extrolitos. La detección de la presencia de extrolitos

(compuestos químicos), ha sido otro buen aporte en ladeterminación de las especies, demostrándose que cadaaislamiento de Aspergillus presenta un específico perfilque agrega una importante información para la presenciade micotoxinas (Tabla 2). Los extrolitos se analizanmediante el método de HPLC (diode array detection)(Frisvald & Thrane,1993) modificado por Smedsgaard(1997), retenciones de índices de alquilfenona ydetección de una matriz de diodo UV-VIS.

g) Subgéneros y Secciones de Aspergillus.Enla Tabla 1, los nombres de los grupos según

la antigua clasificación de Raper & Fennell (1965), estánentre paréntesis. Como los grupos no tienen un estatusbajo el Código Internacional de Nomenclatura Botánica(ICBN), se han reemplazado por los nombres de subgéne-ros y Secciones (Gams et al., 1985).

La posición de algunas especies y la existenciade otros subgéneros y secciones ha sido cuestionada ymodificada por ciertos autores (Kozakievicz, 1989).

Peterson (2000), propone eliminar 3 de lossubgéneros establecidos por Gams et al. (1985), y retener12 de las 18 secciones, modificar 3 y eliminar 3; Petersonet al. (2008), con nuevos datos moleculares proponen 8

subgéneros y 22 secciones. Posteriormente Peterson(2008), agrega nuevos cambios en un análisis desecuencias de DNA desde 4 locus. La Tabla 1, mantienela estructura clásica con algunas modificaciones.*

h) Medios de cultivo para la identificación de lasespecies de Aspergillus.

Se emplean por lo general 3 a 5 medios de cultivo1.- CYA25, Agar Czapek extracto de levadura a

25ºC por 7 días.2.- CYA37. Agar Czapek extracto de levadura a

37ºC por 7 días3.-CY20S. Agar Czapek extracto de levadura más

20% de sacarosa a 25ºC por 7 días (para las especiesxerofílicas (sección Aspergillus (Eurotium) y secciónRestricti).

4. MEA. Agar extracto de malta a 25ºC por 7 días.5. CZ. Agar Czapek a 25ºC por 7 días. Es un medio

considerado viejo estandar que aún se emplea en muchoslaboratorios y textos y al cual se le agregan trazas demetales como el Zn y Cu, cuando el medio no los poseeen su fórmula.

Para cada cultivo, se emplean por lo general 4placas de Petri de 100 mm a las cuales se le agregan 25mlde cada medio de cultivo CYA25, CYA37 (o a mástemperatura si es necesario), CYA20S y MEA25. Esimportante la profundidad del medio, debido a que lamenor o mayor profundidad puede llevar a ciertoscambios morfológicos (Okuda et al., 2000).

Las placas con sus diferentes medios debeninocularse en 3 puntos equidistantes del centro medianteuna solución de conidios disueltos en un medio con0,2% de agar y 0,05 % de Twen 80 (Pitt & Hockin, 1997).Los conidios del cultivo a analizar, se mezclan en 1 o 2cc del medio y mediante una micropipeta se depositan2µL en 3 puntos equidistantes de las placas.

I) Identificación rápida de las especies aflatoxigénicasde Aspergillus.

Un medio especial para la identificación rápidade potenciales Aspergillus aflatoxigénicos (A. flavus yA.parasiticus) en 3 días, es el agar AFPA (AspergillusFlavus y Parasiticus Agar) (Pitt et al.,1983). Existen otrosmedios para distinguir algunas especies de la secciónFlavi (Ver Samson et al., 2004), pero la identificación enmedios estandar es suficiente para el micólogo conexperiencia.

J) Medios de cultivo y fórmulas

1.- Concentrado de Czapek (con trazas de metales)NaNO3 30 gKCl 5 gMgSO4.7H2O 5 gFeSO4. TH2O 0, 1 gZnSO4. TH2O 0, 1 gCuSO4. 5H2O 0, 1 gAgua destilada 100 ml

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

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Especies Aflatoxi-

nas

Acido Cyclopia-

zónico

Acido Kojico

Acido Asper- gílico

B1 G1

Aspergillus sección Flavi (Petromyces)

A. bombycis + + − + −

A. flavus + − + + +

A. nomius + + − + +

A. parasiticus + + − + +

A. parvisclerotigenus + ± + + +

A. pseudotamarii + − + + —

A. toxicarius + + − + +

Aspergillus subgénero Nidulantes (Emericella)

E. astellata + − − − −

E. sp. IBT 21903 + − − − −

E. venezuelensis + − − — —

Aspergillus sección Ochraceorosei

A. ochraceoroseus + − − − −

A. rambellii + − − − −

Tabla 2. Aspergillus productores de Aflatoxinas y susextrolitos quelantes ( Frisvald et al., 2005)

2.- Agar Czapek Levadura con 20% de Sucrosa (CY20S)K2HPO4 1 gConcentrado de Czapek 10 mlExtracto de levadura 5 gSucrosa 200 gAgar 15 gAgua destilada 1 L

3.- Agar Czapek Levadura (CYA25, CYA37)K2HPO4 1 gConcentrado de Czapek 10 ml

Extracto de levadura 5 gSucrosa 30 gAgar 15 gAgua destilada 1 L

4.- Agar Czapec Dox (CZ)K2HPO4 1 gConcentrado de Czapek 10 mlSucrosa 30 gAgar 17, 5 gAgua destilada 1 L

5.- Agar extracto de Malta (MEA)Extracto de malta en polvo 20 gPeptona 1 gGlucosa 20 gAgar 20 gAgua destilada 1 L

K) Claves anexas y su manejo.Las claves que se detallan a continuación,

pueden emplearse para determinar los más comunesaislamientos clínicos o ambientales; no sonestrictamente dicotómicas y se han completado con lainformación más significativa y descriptiva de cadaespecie, para facilitar en cierta medida una mejoridentificación para las personas que no poseen literaturataxonómica de las especies más comunes de Aspergillus,una situación que hemos observado en algunoslaboratorios de nuestro país. La lectura de estas clavespor su mayor información anexa, pueden alargar eltiempo de búsqueda de una especie, en especial si unaislamiento no corresponde plenamente con lasdescripciones, sin embargo, si ciertos aspectos soncoincidentes, se recomienda buscar en las referenciaslas descripciones completas en la sección quecorresponde. Las claves son siempre orientativas y esnecesario hacer coincidir la descripción final con lasmonografías en la literatura.

Antes de usar las claves, observe bien las colo-nias y haga preparaciones desde 2 medios diferentesporque pueden presentarse algunas característicasdiferentes (ej. el color del conidióforo, tamaño de lasvesículas, rugosidad de los conidios, etc.). El Lactofenolpuede alterar los diámetros de los conidios y a veces espreferible medir las estructuras en agua. Si un aislamientose presenta como biseriado y monoseriado, considerecomo válidas las estructuras dominantes. Si elaislamiento esporula pobremente expóngalo a la luz porvarios días (Aspergillus es sensitivo a la luz) o cultíveloen medios pobres (papa zanahoria (PZ), o Agar avena(OA).

L) Algunos textos a consultar : Raper & Fennel, 1965;Klich, 2002; Samson & Pitt, 2000; Samson et al., 2004;Samson & Vargas 2007 u otros trabajos citados en lasreferencias.

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Clave general de las especies más comunes de Aspergillus en diferentes ambientes

(Modificada de Samson et al., 2004 y Klich, 2002) Dibujos no a escala.

1 - Colonias blancas, negras, amarillas, café o de colores grises..........................2 - Colonias en algún tono de verde, verde amarillo o azul verdoso......……10

2. - Cabezas conidiales de color blanco a amarillo pálido a menudo húmedas;predominantemente biseriadas, cabezas reducidas a veces presentes;diámetro de las colonias en CYA25 13-20 mm, MEA25 8-15 mm, CYA37 sincrecimiento; vesículas predominantemente más grandes que 15 µm (10-40); métulas que cubren toda la superficie de la vesícula; conidiosglobosos a ovoides lisos 2,5-4 µm. Esclerocios púrpura a negros a vecespresentes…………………………………..............…...…. A.candidus Link

(Una especie similar como A. tritici Mehrotra & Basu, presenta colonias más amarillas, es capaz de crecer en CYA37, 7-21 mm; vesículas 5-11mm y conidios levemente rugosos. Seguramente por su capacidad de crecer a 37ºC se ha con- fundido con A.candidus en algunos tipos de micosis: ver Vargas et al., 2007c ) - Cabezas conidiales de color blanco a amarillo pálido o crema; diámetro de

las colonias en CYA25 20-38 mm, MEA25 20 (o menos)-38, CYA37 yCYA20S menores de 55mm; predominantemente biseriadas; vesículasmayoritariamente menores de 15 µm; métulas que cubren uno o dos terciosde la superficie de la vesícula; conidios globosos, lisos a finamente rugosos2,5-3,5µm. Células Hülle a veces presentes; cleistotecios amarillos raramentepresentes (Fennellia nivea)..................................…....A.niveus Blochwitz

- Cabezas conidiales amarillas, con algún tono de café o negro ..…....…… 3

3. - Cabezas conidiales café oscuras a negras; biseriadas (uniseriadas), diáme-tro de las colonias en CYA37 50-70 mm; conidios globosos, irregularmenterugosos a finamente rugosos, con crestas y surcos 3,5-5 µm………………........................A. niger complex van Tieghem (ver Tabla.3 para ladiferencia con otras especies de la sección Nigri, Samson et al., 2007b)

- Cabezas conidiales no café oscuras a negras pero de colores oliva, amarillo-café, u otros tonos más pálidos del café ........…….……....….…….…….. 4

4 - Cabezas conidiales columnares, a menudo de color canela-café a caférosado; biseriados; diámetro de las colonias en CYA37 y CYA20S 60-70mm; métulas angostas compactadas (2-2,5 µm) que cubren las 3/4 de lavesícula; conidios globosos a elipsóides, lisos 2 -2,5µm. Células globosashialinas (aleuroconidios) adheridos lateralmente en las hifas sumergidasusualmente presentes…................................. A. terreus Thom aggregates

(Es un taxa con alta variabilidad genética con varias especies crípticas incluidas en los aislamientos considerados como A.terreus, Vargas et al., 2005; Lass- Flörl

et al.2007 y otros estudios en preparación). - Cabezas conidiales no columnares, de color amarillo o café...............…..…5

5. - Cabezas conidiales oliva a café claro; diámetro de las colonias en CYA 25 36-43 mm, MEA25 35-46 mm, CYA37 sin crecimiento; biseriadas; estipe

café; células Hülle a menudo presentes en forma de salchicha; conidiosesféricos, de paredes muy rugosas 3,2-4,5 µm. Reacción de Ehrlich (-).Buen crecimiento en CREA, con micelio amarillo tenue sin producción deácido………..…………........................... A.ustus (Bainier) Thom & Church

(A . calidoustus Vargas et al., 2005, es una especie similar que se aisla en clínica yse ha confundido con A.ustus, crece bien en CYA37 entre 20-35mm; reacción deEhrlich de color violeta, débil a moderado crecimiento en CREA con miceliohialino y sin producción de ácido. Ver la descripción de los 7 integrantes de la

Aleuroconidio

C é lulasH ül le

Conidios y conidióforos

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

sección Usti en Houbraken et al., 2007).

- Cabezas conidiales no de color oliva, estipe hialino, amarillo o cafépálido células de Hülle ausentes……….......... ........………………….6

6. - Cabezas conidiales en tonos amarillo, biseriadas; estipe rugoso;conidios lisos a finamente rugosos ….......….………….....…….....….7

- Cabezas conidiales en tonos ocráceos, crema o ante; biseriadas;estipe rugoso; conidios lisos a finamente rugosos …………………8

- Cabezas conidiales en tonos amarillo-café o color cobre oliváceo uni y biseriadas; estipe rugoso o liso; conidios rugosos o con tubér-

culos, pared interna y externa visible o no……......….…...….....…….9

7. - Cabezas conidiales en amarillo intenso; radiadas que se abren encolumnas; colonias en CYA25 30-50 mm, MEA 25 40-60 mm, CYA370-25 mm, biseriados, estipe rugoso, abundantes esclerocios amarillosa naranja, conidios globosos a elipsóides, lisos a finamente rugosos2,5-3(-4) µm …...............….…….......…..A. auricomus (Guegen) Saito

- Cabezas conidiales en amarillo pastel intenso, radiadas, que se abrenen columnas; colonias en CYA25 45-60 mm, MEA 25 45-56 mm, CYA3720-30 mm, biseriados, estipe rugoso, abundantes esclerocios blancosa color ante; conidios esféricos, lisos a finamente rugosos 2,5-3(3,5)µm…….................................................... A. sclerotiorum Huber.

8. - Estipes largos generalmente sobre los 1000 µm en MEA, rugosos,incoloros a amarillentos a café hacia el ápice; colonias en CYA25 39-59 mm, MEA 44-55 mm, CYA37 0-35 mm; biseriados, métulas quecubren la vesícula entera; conidios globosos a ampliamente elip-sóides lisos a finamente rugosos 2,5-3 (-4,5)µm. Esclerocios cuandoestán presentes, rosados a púrpura........................ A.ochraceus K.Wil.

- Estipes más cortos, generalmente menores de 800 µm en MEA, rugosos,incoloros a amarillentos a café hacia el ápice; colonias en CYA25 30-50 mm, MEA 33-60 mm, CYA37 20-37mm; biseriados, métulas quecubren casi la vesícula entera; conidios globosos a ampliamenteelipsóides lisos a finamente rugosos 3-3,5 (4) µm. Esclerociosesféricos a elongados, de color amarillo, ante a colorescafé.......................................................................…. A.melleus Yukawa

9. - Cabezas conidiales radiadas que se separan en columnas, de colorbronce a café con la edad; colonias en CYA25 55-70 mm, MEA 65-70mm, CYA37 40-70 mm; uni o biseriadas; estipe largo 600-1500 o másx 12- 20µm, incoloro, rugoso; métulas o fiálides que cubren la vesículaentera; conidios en cadenas largas que se mantienen unidas,globosos, conspicuamente ornamentados y rugosos con paredexterna e interna visible, 5,5- 8 µm..................……... A tamarii Kita

(A.caelatus Horn,1977, tiene un color amarillo más intenso en el reversoen CYA25 que A.tamarii y estipes más cortos en MEA (menores de1000 µm). A.pseudotamarii Ito, produce aflatoxinas y en CZ 37ºC eldiámetro de las colonias son menores de 33 mm, ver Ito et al., 2001).

- Cabezas conidiales radiadas que se separan en columnas, de coloramarillo grisáceo a oliva café, biseriadas; diámetro de las coloniasen CYA25 25-35 mm, MEA 25-35(40) mm, no crece en CYA37 ; estipelargo generalmente sobre los 1000 µm (hasta 3000) x 12- 25µm, incolo-ro, de pared lisa o a veces ligeramente rugosa hacia el ápice. Conidios

Conidios y conidióforos

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globosos, subglobosos a elipsóides, lisos a rugosos, con crestas, 4-5 (-6) µm, sin una doble pared visible.................... A.wentii Wehmer

10. - Colonias verde oscuro,crecimiento en CYA25 40-60 mm, MEA 53-65mm,CYA37, de 50 mm o más; conidióforos cortos, café, biseriadoscon métulas que cubren la mitad superior de la vesícula; conidiosesféricos, lisos a finamente rugosos 3-4 µm. Cleistotecios de Eme-ricella a menudo presentes, globosos, de paredes de color rojooscuras al madurar, recubiertas de células de Hülle de color amarilloa ante. Ascosporas (maduran a las 2 semanas), redondas a lenticularesen vista lateral, rojo púrpura, lisas, 4-6 x 3-4 µm con 2 rebordes finoslongitudinales de cerca de 1 µm en vista lateral Emericella nidulans (Eidam) Vuill., anamorfo A. nidulans (Eidam) G.Winter

(La especie relacionada Emericella quadrilineata se diferencia sólo portener ascosporas lisas con 4 rebordes longitudinales, mientras E. rugulosa,presenta ascosporas ampliamete lenticulares 5-6,5 x 3-4,5 µm, de paredesgeneralmente rugosas, pero a veces lisas en algunos aislamientos, con 2rebordes finos longitudinales y crece más lentamente en CYA25 10-17 (-33)mm y MEA25 12-20 (-42) mm,que las 2 anteriores.Ver Klich, 2002).

- Colonias verde oscuro a gris verdoso amarillento, cleistotecios ausenteso presentes (excluyendo Emericella) ......................….........……… 11

11. - Colonias restringidas en CYA y MEA25 entre 15-25 mm, CYA20S 14-30 y CYA37 0-17mm, cleistotecios presentes o ausentes.................…12

- Colonias muy restringidas en CYA y MEA25 (<15mm o < de 10 mm en7 días), que crecen más rápido en CYA20S a los 7- 14 días, no crecena 37ºC ; cleistotecios ausentes .......................................... ..…….…13

- Colonias no restringidas, mayores de 30 mm en CYA y MEA,cleistotecios ausentes ...................................................................... 15

12 - Colonias de color verde oscuro con tonos amarillentos variables,cabezas biseriadas, radiadas, estipe incoloro, amarillento a café claro;métulas que cubren la mitad superior hasta los 2/3 de la vesícula;conidios globosos a subglobosos, finamente a conspicuamenterugosos 2-3,5 (4,5) µm, células Hülle raramente presentes, cleisto-tecios ausentes............................. .A. versicolor (Vuill.) Tiraboschi

- Colonias de color gris verdoso a verde oscuro, de crecimiento másrápido, generalmente > de 15mm en CYA y MEA25, gris verdosas averde oscuro, cabezas conidiales uniseriadas estrictas, cleistoteciosamarillos presentes, con ascos evanescentes de 8 ascosporas;células de Hülle ausentes ...................................................................14

13. - Colonias en colores pálidos, gris verdosas, cabezas radiadas al inicio,después variables; crecimiento en CYA y MEA25 raramente excedenlos 8 mm, estipe incoloro, liso, vesículas uniseriadas subglobosas aespatuladas 9-25 µm; conidios semiesféricos a elipsoides, finamentea francamente rugosos, los conidios elipsoides miden 3-5,5(6) x 3-4µm, los esféricos 3-5 µm.................................. A. penicillioides Speg.

- Colonias grises a verde oscuro; cabezas conidiales columnares;crecimiento en CYA y MEA 25, raramente exceden los 13mm; estipeliso o finamente rugoso, incoloro con vesículas uniseriadas; fiálidesque cubren solo la parte superior de la vesícula, conidios cilíndricoscuando nacen, posteriormente elipsoidales a piriformes, generalmenterugosos 4-7 x 3-4 (-5,5) µm. …........................….. A . restrictus G..Smith(A. penicillioides y A. restrictus se aislan y cultivan mejor en medios de

baja actividad de agua (DG18 , CYA20S, MA20-40G), permitiendo una mejor identificación).

Células Hülle

Asco y ascosporas

Células Hülle

Conidios y conidióforos

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

14. - Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de célulasangulares parenquimatosas, rodeados de hifas,especialmente encultivos viejos y en CYA20S con diámetros de 30-45 (60) mm (comomínimo el doble que en CYA y MEA25), no crece a 37ºC; ascosporasque maduran en 14 días, lenticulares, lisas, a menudo con un surcocentral, 5-6,5 x 3-5 µm. Cabezas conidiales radiadas, estipe incoloro,de pared lisa o rugosa, fiálides que cubren las 3/4 partes de la vesícula;conidios espinosos, variables en tamaño, esféricos, elipsoides, oapiculados, finamente rugosos a espinosos, 5-8 (11) x 5-7µm..............…Eurotium herbariorum Link,(anamorfo A.glaucus Link)(E. repens y E. rubrum son 2 especies estrechamente relacionadas con E.herbariorum. La primera difiere por la formación de ascosporas sin surcosdistintivos, mientras E. rubrum tiene surcos más notorios y sus hifasadquieren colores ladrillo a rojo con la edad. Domsch et al.,1980, considerana estas 2 especies como sinónimos de E. herbariorum).

- Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de célulasangulares parenquimatosas, rodeados de hifas, especialmente encultivos viejos en CYA20S, con diámetros de 34-60 mm (como mínimoel doble que en CYA y MEA25); ascosporas incoloras, de paredesrugosas que maduran en 14 y 21 días, lenticulares, con un surcocentral y 2 rebordes longitudinales, 4,5-6, x 3,5-4 µm. Cabezas conidialesradiadas a columnares, estipe incoloro a levemente café, liso, fiálidesque cubren los 2/3 de la vesícula; conidios, esféricos a subglobosos,finamente rugosos a espinosos 4-5 (-7) µm ….Eurotium amstelodami

Mangin (anamorfo A. vitis Novobr.) - Cleistotecios amarillos de Eurotium con una sola capa de células

angulares parenquimatosas, rodeados de hifas, especialmente encultivos viejos en CYA20S, con diámetros de 45-68 mm (como mínimoel doble que en CYA y MEA25); ascosporas incoloras, lisas, quemaduran en 7-14 días, lenticulares, con 2 rebordes longitudinalessalientes en forma de polea, 4,5-5,5 (7) x 3,5-4 µm. Cabezas conidialesradiadas, estipe incoloro a cafesoso, liso; fiálides que cubren los 2/3de la vesícula; conidios, variables en tamaño, desde globosos, ovoidesa piriformes, finamente rugosos a espinosos, 4-5 (-7) x 3-4µm................... ..........Eurotium chevalieri L.Mangin (anamorfo: A.chevalieri Ibid.)

15. - Cabezas conidiales amarillo-verde a amarillo o verde oscuro.....…. 16 - Cabezas conidiales azules a azul verdoso oscuro a grisáceo............ 20

16. - Cabezas conidiales uni o biseradas, conidios lisos a finamente rugosos ...........................................................................................……17 - Cabeza conidiales predominantemente uniseriadas, conidios conspi-

cuamente rugosos ……...................………….........………………….18

17. - Cabezas conidiales radiadas a columnares; que permanecen de coloroliva verde a verde amarillento en el tiempo en CYA25; diámetro delas colonias en todos los medios y temperaturas mayores de 50 mm;

estipe rugoso, incoloro, a veces en tonos café pálidos; vesículas bi- seriadas generalmente en un 20%, pero variable; en MEA a veces, enteramente uniseriadas; métulas/fiálides que cubren los ¾ de la vesícula; conidios globosos a elipsoides 3- 6 (-8) µm. Esclerocios generalmente presentes, redondos de colores café, violeta a negros

….........................................................................................A. flavus Link(Las poblaciones de A flavus, presentan a menudo aislamientos con 2 tiposde tamaño de esclerocios, unas llamadas cepas L superiores a 400µm yotras llamadas cepas S inferiores a los 400 µm, estas últimas producen

Pared del ascoma

Asco yascosporas

Ascos yascosporas

Pared delAscoma

Asco yascosporas

Conidios y conidióforos

Boletín Micológico Vol. 23 : 49 - 66 2008

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gran cantidad de aflatoxinas B. Las especies relacionadas como A.nomius,se distingue de A.flavus por producir aflatoxinas B, G y producir esclerociosalargados, mientras la rara especie A.bombycis crece lentamente en CYA37(0-37 mm en 7 días) y presenta un estipe liso).

- Cabezas conidiales radiadas a laxamente columnares, de color grisamarillento que se tornan oliva café con el tiempo en CYA25;carac-terísticas de crecimiento similares a A.flavus, estipe rugoso, incolo-ro, vesículas predominantemente uniseriadas, pero a veces lo con-trario (biseriadas); métulas/fiálides que cubren la mitad o más de

la vesícula; conidios globosos a elipsoides 4-8,5 (-10) µm .......................................................................................A.oryzae (Ahlburg) Cohn.

(Se considera actualmente a A. oryzae no como una especie diferente, sino un ecotipo diferente de A.flavus).

18. - Conidios globosos, usualmente entre 3,5-6 µm en diámetro (rugosos); colonias que mantienen un color amarillo verdoso oscuro o tonali- dades verdes en el tiempo en CIA25; cabezas conidiales usualmen- te radiadas; estipe incoloro, finamente a muy rugoso………............. …….................................................................…A.parasiticus Speare

- Conidios globosos, usualmente 5-8 µm en diámetro, colonias usualmente de color bronce a café en el tiempo en CYA 25......…. 19

19. - Cabezas conidiales radiadas a laxamente columnares, de color oliva acafé en CYA25, predominantemente uniseriadas; estipe incoloro lisoa rugoso; fiálides/métulas que cubren la mitad de la vesícula; conidiosde paredes finas, rugosas pero sin tubérculos sobresalientes, de colo-res oscuros 5,5-7 µm ......... A. sojae Sakaguchi & Yamada ex Murak (Esta especie se aísla prácticamente sólo de las fermentaciones del koji).

- Cabezas conidiales radiadas que se abren en cortas columnas de colorcafé verdoso intenso o amarillo café en CYA25, uni y biseriadas, conestipe rugoso incoloro; fiálides/métulas que cubren usualmente lavesícula entera; conidios rugosos, de paredes gruesas, con las 2paredes visibles, ornamentados con tubérculos de colores oscuros,5,5-8 µm …....…...................…….................................… A.tamarii Kita

20. - Colonias de crecimiento reducido en CYA37 (2-10) mm; cabezas coni- diales radiadas predominantemente biseriadas, de un color azul verdoso, a turquesa; en CYA25 semejante a colonias de Penicillium; colonias menores de 35 mm en CYA25 y CYA20S; estipe incoloro a café pálido (menores de 500 µm de largo); en el micelio aéreo se pre- sentan cabezas conidiales pequeñas, semejando penicillios; conidios esféricos rugosos a espinosos, 3-4 (4,5) µm…..................................….. ............................................A. sydowii (Bain. & Sart.) Tom & Church

- Colonias de regular crecimiento en CYA37, menores de 30 mm; cabezasconidiales radiadas a clavadas, que se abren en columnas con laedad; estrictamente monoseriadas; colonias en CYA25 y CYA20Smayores de 35mm; estipes largos y anchos (con promedios mayoresde 1000 x 10-30µm), de paredes lisas, incoloros a levemente café cercadel ápice; vesículas típicamente espatuladas con áreas fértiles dehasta 250 µm de largo; conidios lisos, mayoritariamente elipsoidales,a veces apiculados a cilíndricos, 3-6 x 2,5-4 µm .….. A.clavatus Desm. (A.giganteus Wemer, tiene mayor crecimiento en MEA25 (43-65 mm),

estipe de 2 tipos, 2-3 (-4) mm o varios cent. Vesículas más anchas, de 2tipos; en conidióforos cortos 30-50µm y en largos de 120-180 µm. Para unarevisión taxonómica de la sección Clavati ver Vargas et al, 2007b)

- Colonias de gran crecimiento en CYA37, mayores de 55 mm dediámetro….............................................................................................. 21

Conidios yconidióforos

Sin dibujo

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Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

21. - Cleistotecios presentes, tomentosos, hialinos a crema, con ascosporashialinas, lenticulares a esféricas con borde sobresaliente 5-8 x 4-5µm. Anamorfo semejante a A.fumigatus presente, con cabezascolumnares, vesículas piriformes, monoseriadas; conidios esféricosa elipsoidales, lisos a finamente rugosos, 2,5-3,5 x 2-3 µm ….……............................. Neosartorya fischeri* (Wehmer) Malloch & Cain

(anamorfo A . fischerianus Samson & W.Gams)(Ver diferencias con otras especies del género en Clave Nº2)

- Cleistotecios ausentes; cabezas conidiales columnares, con vesículasampliamente clavadas, estipe incoloro a gris cerca del ápice; vesículasuniseriadas con fiálides que cubren la mitad o la tercera parte de lavesícula, dispuestas en forma paralela con el eje del estipe; conidiosglobosos a ampliamente elipsoides, lisos a finamente rugosos oespinosos 2-3 µm en diámetro ........................ A. fumigatus Fresen.

(Es una de las especies de gran distribución en una amplia variedad desubstratos y ambientes; es el más común oportunista patógeno en humanosy otros mamíferos, ver clave Nº2 para diferenciarla de otras especiessemejantes del subgénero Fumigati).

Clave Nº2 morfofisiológica (tentativa) para la determinación de las especies del subgé-nero Fumigati con y sin producción de cleistotecios en cultivos (7 días de incubación).

(Para una descripción completa (polifásica) de las especies de importancia ya sea ecológica comoclínica, debe consultarse Hong et al., 2005; Balajee et al., 2007 y Samson et al., 2007)

1. - Ausencia de cleistotecios en cultivos ……....................….……………2 - Presencia de cleistotecios en cultivos ........ ............................…...…. 12

2. - Conidios en MEA verde grises a azul verdosos, dispuestos en columnas…................................................................................................ 3 - Conidios en MEA rosados a púrpura rojo en masa, dispuestos en co- lumnas cortas, crecimiento en CYA37 16-19 µm (máximo 42ºC); vesículas pequeñas en forma de pera y dispuestas en ángulo recto (al igual que A.viridinutans y A.duricaulis) 10-18 µm de ancho, conidios globosos, espinulosos 2,8-3,5µm ........................... Aspergillus brevipes Smith

(Se ha aislado en Australia y se asemeja a A. duricaulis)

3. - Cabezas conidiales predominantemente clavadas, colonias en CYA37ºC menores que 30 mm….. Vea Aspergillus clavatus Desm.(clave anterior) - Cabezas conidiales predominantemente piriformes, espatuladas, subglo- bosas a globosas; colonias en CYA 37ºC mayores o menores de 55 mm ......................................................................……………….………..….. 4

4. - Colonias que crecen a 50ºC …............................…….…..………….… 5 - Colonias que no crecen a 50ºC………….... ..............……..………………6

5. - Colonias en CYA37 60-75 mm; crecimiento a 50ºC pero no a 10ºC; ca- beza conidial columnar, estipe 50-350 x 3,5-10 µm (generalmente entre

6-10 µm de ancho); vesícula piriforme a subclavada 10-26µm; conidios 2-3,5µm, globosos a elipsoides, lisos a finamente rugosos (Es la espe- cie más patogénica en humanos) .....Aspergillus fumigatus Fresenius

(Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumisinnematus, A. lentulus, A. novofumigatus, A. viridinutans). Conidios y conidióforos

Asco yascosporas

Ascospora al SEM

Conidióforo y conidios

Ascomata

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- Colonias en CYA37 50-70 µm o más; crecimiento a 50ºC y a 10ºC; cabeza conidial columnar corta, estipe 80-100 x 4-7 µm, vesícula globosa o en

forma de matraz, 15-25 µm de ancho; fiálides que cubren los ¾ de la vesí-cula, conidios 2,5-3µm subglobosos, lisos (aislado en Corea del Sur)

.…….....………….....…… Aspergillus turcosus Hong, Frisvald & Samson

6. - Colonias que crecen hasta 45ºC, crecimiento a 10ºC negativo o positivo………….…........................................................................................................ 7

- Colonias que crecen hasta los 42ºC ……........….…. .......................….….. 10

7. - Crecimiento negativo a 10ºC; presencia de sinnema en el tiempo e hifas funiculosas aéreas; crecimiento en CYA 37 57-61 mm; estipe hasta 210 x 6- 8,5 (-10) µm; vesícula hemiesférica 16-20 (-25) µm; conidios ampliamente elipsoidales, verruculosos, 2,8-2,3 x 2,4-2,8 µm (patogénico en humanos)..............................................………Aspergillus fumisynnematus Horie et al. (Distribución: Brasil, Venezuela, España. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumigatus, A. lentulus, A. novofumigatus)

- Crecimiento positivo a 10ºC, ausencia de sinnema e hifas funiculosas en el tiempo ......................... .............................................................................….8

8. - Crecimiento lento en CREA (ver Tabla 3*), sin producción de ácido ......... 9

- Crecimiento lento en CREA con producción de ácido (las demás especies integrantes de la clave no producen ácido en CREA, salvo A.fumigatus, que a veces puede presentar una débil producción); crecimiento positivo a 10ºC; crecimiento en CYA37 65-70 mm; estipe, 6-8 µm diam.; vesículas globosas a subglobosas 18-24 µm; conidios 2-3µm globosos a subglo-bosos, lisos .…....... Aspergillus fumigatiaffinis Hong, Frisval & Samson (Distribución: USA, España. Especies similares: A. fumigatus, A. lentulus,

A. novofumigatus).

9. - Crecimiento positivo a 10ºC; conidiación pobre pero abundante en algunos aislamientos; crecimiento en CYA37 54-70 mm, estipe 20-500 x 4-6 (-7) µm, a veces sinuoso y constreñido; vesícula 10-25 µm, globosa a piriforme,

usualmente subglobosa; conidios globosos a ampliamente elipsoidales, lisos a finamente rugosos 2-3,2 µm (patogénico en humanos).....................………………………………..……. Aspergillus lentulus Balajee & Marr (Distribución cosmopolita. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A.fumigatus,

A. fumisinnematus, A. novofumigatus, A. viridinutans).

- Crecimiento positivo a 10ºC; crecimiento en CYA37 49-52 mm; estipe 50- 500 x 4-7 mm, vesícula subglobosa a forma de matraz, relativamente ancha (13) 15-30 µm, Conidios 2,5-3 µm, elipsoidales, lisos………............................... ............................. Aspergillus novofumigatus Hong, Frisvald & Samson (Se ha aislado solamente en las islas Galápagos y en Ecuador. Especies similares: A. fumigatiaffinis, A. fumigatus, A. fumisinnematus, A. lentulus )

10. - Crecimiento en MEA 25, menor de 30 mm en 7 días ............................……11

- Crecimiento en MEA25 mayor que 30 mm en 14 días (60-70 mm); estipecorto 50-30 x 1,2-2,2 µm; vesículas pequeñas 4-8,5 µm; irregularmente glo-bosas; conidios globosos, finamente rugosos 2,5-3,5 µm (Característicasdistintivas: crecimiento lento, reverso negruzco en CYA y fiálides en racimoen un lado de la vesícula)…..…….…… Aspergillus unilateralis Thrower

(Distribución: Australia) Conidios y conidióforos

61

Aportes morfotaxonómicos en el género Aspergillus Link: claves para las especies más comunes - E. Piontelli

11. - Crecimiento en MEA25 11-14 mm; estipe 20-35x 3,3-4,4 µm; vesícula subglo- bosa a forma de matraz, 7,5-12, que se desvía en ángulo recto; conidios globosos, finamente rugosos, 2-2,6µm....Aspergillus viridinutans Ducker & Thrower (patógeno en humanos).

(Distribución: Australia, Sri Lanka, Zambia, Rusia, Chile)

- Crecimiento en MEA25 20-22 mm; estipe 5-50 x 3,5-5,5 µm ; vesículas en forma de matraz 7-14 µm; conidios (2,8)3-3,2 (-3,3) µm, globosos, equinulados.........……..………. Aspergillus duricaulis Raper & Fennel

(Distribución: Argentina. Especie similar: A.brevipes)

12. - Colonias en CYA25 mayores de 40 mm …… ..................................……….13

- Colonias en CYA25 menores de 40 mm …………………........…..…......…..15

13. - Ascosporas lenticulares, con un patrón reticulado de crestas irregulares 7-8 x 3-4 µm; conidios subglobosos a elipsoides, finamente rugosos, 2- 2,5 o hasta 3µm, cuando globosos. Colonias en CYA25 45-68 mm ...........

...……...….. Neosartorya fischeri (Wehmer) Malloch & Cain (anamorfo:Aspergillus fischeranus Samson & W.Gams)

(Especie cosmopolita, patógena en el hombre y otros mamíferos. Especie similar:N.tatenoi)

(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vistas al SEM,c.Ascomata en cultivo, d. Conidióforo y conidios)

- Ascosporas lenticulares espinosas, verrucosas o tuberculadas …..… 14

14. - Colonias en CYA25 60-70 mm.Ascosporas sin un patrón reticulado decrestas irregulares, la ornamentación superficial corresponde a colgajostriangulares de tejido; conidios globosos a subglobosos lisos, 3-4 µm ......... ….........…Neosartorya pseudofischeri Peterson (anamorfo Aspergillus

thermomutatus (Paden) Peterson. (Especie aparentemente cosmopo-lita, patógena en humanos)

(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM,c. Conidióforo y conidios)

- Colonias en CYA25 41-70 mm. Ascosporas lenticulares, 4,5 µm, espinosas, con espinas de varios tamaños (<0,5 hasta 7 µm) o con proyecciones en la parte convexa, con 2 crestas ecuatoriales separadas y anchas; conidios globosos, finamente rugosos, 2-2,5 µm ……Neosartorya spinosa (Raper & Fennell) Kozakiewicz (anamorfo: Aspergillus spinosus Kozakiewicz) (Aparentemente cosmopolita. Leyenda: a. Asco y ascosporas, b.Ascos-

pora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

15. - Colonias en CYA25 12-14 mm, en CYA37 27-30 mm. Ascosporas lenticulares, finamente reticuladas 4,5-5 µm, con 2 crestas ecuatoriales poco separadas; conidios pequeños, globosos a subglobosos 2-2,5 µm, lisos a finamente rugosos ….......... Neosartorya hiratsukae Tsubouchi & Horié (anamorfo:A. hiratsukae Tsubouchi & Horié).(Distribución, Japón, Brasil,Corea delSur. Especies similares: N. fischeri, N. tatenoi )

(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM,c. Conidióforo y conidios)

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Tabla 3. Algunas características morfofisiológicas de utilidad para las diferentes especies de Aspergillus dela sección Nigri. Modificado de Samson et al., 2007. (Los datos de secuencias del gene calmodulina permiten

distinguir todas las especies de la sección)

Especies Conidios Superficie Vesícula Temp. CREA* Reacción deUniseriadas µm µm maxºC prod.ac. Ehrlich

crecimiento*

A. aculeatinus 2,5-4,5 finam.rugosa 45-80 36 3 - 3 -A. aculeatus 3,5-5 finam.rugosa 60-80 36 2 - 3 -A. japonicus 3,5-5 finam. rugosa 20-35 36 3 - 1 -A. uvarum 3-4 espinosos 20-30 36 1 - 1 -

EspeciesBiseriadas

A. brasiliensis 3,5-4,5 espinosos 30-45 40 4 - 4 ++ amarilloA. carbonarius 7-9 espinosos 40-80 36 3 - 3 -A. costaricarensis 3,1-4,5 finam. rugosa 40-90 40 5 - 5 ++++ azulA. ellipticus 3,5-5-5 lisos-finam.rug. 75-100 30 2 - 2 -A. foetidus 3,5-4,5 lisos-finam.rug. 50-80 40 4 - 4 ++ amarilloA. heteromorphus 3,5-5 espinosos 15-30 33 2 - 2 ++++ amarillo

con halo púrpuraA. homomorphus 5-7 espinosos 50-65 36 2 -2 idem anteriorA. ibericus 5-7 finam.espinosa 50-60 40 3 - 3 ++ amarilloA. lacticoffeatus 3,4-4,1 lisos 40-65 40 3 - 1 -A. niger 3,5-5 finam.rugosa 45-80 40 5 - 5 ++ amarilloA. piperis 2,8-3,6 finam.rugosa 40-55 40 5 - 5 -A.sclerotiicarbonarius 4,8-9,5 finam.espinosa 45-90 33 0 - 0 -A. sclerotioniger 4,5-6-4 finam.rugosa 30-50 36 4 - 2 + violeta,esclerociosA. tubingensis 3-5 finam.espinosa 40-80 40 1 - 1 -A. vadensis 3-4 lisos 25-35 40 5 - 5 -

* El médio de cultivo agar creatina sucrosa (CREA) permite ver el crecimiento y la producción de ácido (es de colorvioleta púrpura y cambia al amarillo con la producción de ácido). Los números del 1 al 5 en forma gradual, indicanel tamaño del halo o de la colonia, siendo el 1 el más pequeño; el cero indica que no hay crecimiento.

La composición del medio es: Creatina (1H2O) 3 g; Sucrosa 30 g; KCL 0,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; FeSO4.7H2O0,01g; K2HPO4.3H2O 1,3 hasta 1,6 g; Púrpura de bromocresol 0,05 g; agar 15 g; Agua destilada 1000 mL. pH.final8 ± 0,2, ajustarlo después de autoclavarlo.

- Colonias en CYA25 33-36 mm, en CYA37 61-65 mm. Ascosporas lenticulares de superficie tuberculada, con 2 crestas ecuatoriales a menudo irregulares 5-5,5 x 4-5 µm; conidios subglobosos a ampliamente elipsoides, lisos 2,6- 3,2 x 2,4-2,6 µm…. …….Neosartorya udagawae Horie, Miyaji & Nishim.

(anamorfo: Aspergillus udagawae Horie, Miyaji & Nishim.)

(Distribución: Brasil USA, España, Japón.Especies similares: N. aureolata,A. viridinutans)(Las especies de Neosartorya son más de 20, sólo se presentan en las claves las más comunes en distribución y las 5 encontradas como pató- genas oportunistas en el hombre. Para la descripción de todas las especies ver Samson et al., 2007)

(Leyenda: a. Asco y ascosporas, b. Ascospora vista al SEM, c. Conidióforo y conidios)

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Boletín Micológico Vol. 23 : 49 - 66 2008

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AEROMICOTA DE AMBIENTES INTERNOS: COMPARACION DE METODOS DE MUESTREO

(Aeromycota in indoor environment:sampling methods comparison)

Rojas, T.I.(1), Martínez, E.(2), Aira, M.J. (3)& Almaguer, M.(1)(1) Departamento de Microbiología y Virología. Facultad

de Biología. Universidad de La Habana (Cuba)(2)Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal

Centro Nacional de Sanidad Vegetal, La Habana (Cuba)(3)Departamento de Botánica, Facultad de Farmacia,

Universidad de Santiago (España)

Palabras clave: Hongos, atmósfera, interiores, muestreoKey words: Fungi, atmosphere, indoor, sampling

Boletín Micológico Vol. 23 : 67 - 73 2008

RESUMEN

El procedimiento de muestreo utilizado paradeterminar el grado de contaminación fúngica enambientes internos, difiere según los autores. Por ello,con el fin de conocer si el método utilizado por nuestrogrupo de investigación, es comparable con otrasmetodologías, se ha realizado un estudio comparativocon varios sistemas de captación de esporas del aire,incluyendo equipos volumétricos (Aeroscope Chirana,System Air Sampler, Burkard Personal Culture) así comoel método tradicional por sedimentación. Los resultadosobtenidos muestran que apenas existen diferenciascuando se utilizan los sistemas volumétricos, sinembargo, el método por sedimentación ha sido menoseficaz, tanto desde el punto de vista cuantitativo comocualitativo. Mientras, el método directo por hisopado,resulta un buen complemento para determinar la fuentede contaminación. También se ha determinado la horadel día con mayor carga fúngica, que se localiza almediodía y tras el análisis de varios medios de cultivo,se concluye que el Agar Glucosa de Sabouraud resultaadecuado para este tipo de investigaciones.

ABSTRACT

The sampling method used to determine the degreeof fungal contamination in indoor environment differs,according to some authors. Therefore, with the purposeof knowing if the method used by our research team iscomparable to other methodologies, a comparative studywith various systems used to capture air spores has beencarried out which include volumetric equipment(Aeroscope Chirana, System Air Sampler, BurkardPersonal Culture) as well as the traditional method bysedimentation. Results have revealed that there is fairlysome difference when volumetric systems are used; as tothe sedimentation method, it has proved to be less effectiveboth in the quantitative and qualitative point of view.On the other hand, direct method through sprinklingbecomes a suitable tool to establish the source ofcontamination. Moreover it has been recorded the timeof day when the greatest fungal load occurs, this beingat noon so after the analysis of several culture media ithas been concluded that Sabouraud Agar Glucose issuitable for this kind of research

INTRODUCCION

Uno de los aspectos de interés para losinvestigadores que realizan estudios de aeromicologíaambiental, y en concreto en el interior de edificios, esconocer si el procedimiento de trabajo se asemeja a los

estándares, con el fin de poder relacionar los resultadospropios con los obtenidos por otros autores. En aquellospaíses en los que esta línea de investigación y en general,la aerobiología, está organizada en Redes de trabajo onetwork, son éstas las encargadas de la publicación deprotocolos (Aira et al., 2005; Galán et al., 2007), lo quefacilita el desarrollo de una metodología común. Sinembargo, este no siempre es el caso y los investigadoresdesarrollan su trabajo adaptándose a los mediosdisponibles, desconociendo si finalmente sus resultados

Recibido el 20 Octubre 2008Aceptado el 27 Noviembre 2008

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son comparables a otros, aunque hayan sido realizadosen el mismo territorio.

Los estudios sobre contaminación fúngicarealizados en Cuba, en este tipo de ambientes, son cadavez más numerosos y abarcan una amplia variedad delocales (museos, oficinas, viviendas, etc.), según el objetivoparticular de cada estudio (García, 1997; Fernández et al.,1998 ; Aira et al., 2002; Rojas et al., 1993, 2002; Acosta etal., 2003; Borrego et al., 2008). Por el contrario, no sonmuchos los trabajos que abordan el procedimientometodológico (Rojas, 1998), por lo que en el presenteestudio se incluye un análisis comparativo con diferentesmétodos y equipos de muestreo, a diferentes horas del díay con varios medios de cultivo.

Para colectar las esporas del ambiente, tradicio-nalmente se ha usado un método gravimétrico o desedimentación, exponiendo al aire durante un cierto tiempouna placa de Petri con medio de cultivo, pero hoy en día seprefieren los equipos de captación volumétrica que hayen el mercado, ya que a su sencillo funcionamiento, seune la ventaja de su autonomía y fácil transporte. Así mismoresulta recomendable completar este tipo de estudios conel muestreo directo (por hisopado) ya que permite iden-tificar, con mayor precisión, la fuente de contaminaciónmás próxima.

También la hora en que se realiza el muestreo,normalmente se acomoda a las condiciones específicas decada estudio, sin embargo, consideramos importantedeterminar cuál es la más adecuada en cada caso, lo cuálestará relacionado con las condiciones climáticas (ymicroclimáticas) del lugar. En cuanto al medio de cultivousado en el muestreo no hay un acuerdo unánime entrelos distintos autores, por lo que se ha realizado tambiénun estudio comparativo con los más recomendados paraeste tipo de investigación.

MATERIALES Y METODOS

El estudio se llevó a cabo en varios locales(museos, bibliotecas, almacenes) de la ciudad de La Habana(Cuba), sin embargo, ya que no se trata de ofrecer losresultados específicos de los mismos, sino profundizar enlos aspectos metodológicos, omitiéndose su descripciónpor resultar irrelevante para este trabajo.

Los equipos de captación volumétrica que se hanevaluado, han sido: un Aeroscope Chirana (AERO), unSystem Air Sampler (SAS) y un Burkard Personal Culture(BPC). Todos ellos permiten la incorporación de una placade Petri con medio de cultivo y cada fabricante facilitainstrucciones precisas, tanto en relación a su correctomanejo, como en la forma de recuento de las colonias y sutransformación a unidades formadoras de colonias (ufc/m3), que ha sido la expresión utilizada para cuantificar la

contaminación fúngica. Por su parte, para el métodogravimétrico se han seguido las recomendaciones deOmeliansky (OME) calculando el número de ufc/m3 segúnel método descrito en NRP-201 (1987).

El diseño experimental para validar el método demuestreo, se enfocó para averiguar preferentemente laeficacia del equipo AERO, por ser el de uso más habitualen nuestro laboratorio. Para ello, se realizaron dosmuestreos en dos locales diferentes, combinando el usode dicho equipo con los demás. En todos los muestreosse siguió un diseño diagonal tomando 3 ó 5 puntos deacuerdo a la superficie de los mismos, según NormaFEDECAI-01 (2007), tal como se señala en la Figura 1, yrealizando tres réplicas en cada punto.

Además del muestreo ambiental realizado porcaptación de esporas del ambiente, se han tomado muestraspor el método de hisopado (NRP-201, 1987) a los sustratosy/o objetos presentes en el interior de los locales. Enambos casos, y con el fin de valorar las posiblesvariaciones entre ambos métodos, se procedió al estudiode las colonias, identificando a nivel de género de acuerdoa Barnett & Hunter (1998). Para los géneros másabundantes se siguieron los criterios de identificación deEllis (1971, 1976), Klich & Pitt (1994), Ho et al. (1999) y Pitt(2000).

En cuanto a los medios de cultivo, se han valoradolos cuatro siguientes, M1 (Agar Extracto de Maltasuplementado con peptona y glucosa (ACGIH, 1989); M2(Agar Extracto de Malta+7,5% NaCl); M3 (Agar PapaDextrosa +7,5% NaCl) y M4 (Agar Glucosa de Sabouraud)y el estudio en el tiempo se realizó muestreando cada horaentre las 7 a.m. y las 4 p.m.

Los resultados obtenidos se han valoradoestadísticamente, aplicando el test de Students, la Pruebade Kruskall-Wallis y/o la prueba de Scheffé del paqueteinformático StatSoft, Inc. (2001).

RESULTADOS Y DISCUSION

El sistema AERO se probó frente a los dos sistemasvolumétricos (SAS y BPC) y el método gravimétrico (OME)en dos locales diferentes (L1 y L2). Los resultados

Figura 1. Esquema del diseño utilizado en losmuestreos

68

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Muestreo en tres Muestreo en cinco

3 2

1

1 2

3 4 5

muestran que no existen diferencias significativas encuanto a los niveles de contaminación fúngica, en el primercaso, mientras que al comparar AERO con OME, el sistemavolumétrico se muestra mucho más eficaz, ya que recogeprácticamente el doble de unidades formadoras de colonias(Figura 2).

Estos resultados coinciden con otros autores queseñalan que el método por sedimentación en placas nopermite comparar de forma favorable los resultadosobtenidos por otros métodos de muestreo (Buttner &Stetzenbach, 1993; Caneva et al., 2004).

Los equipos volumétricos SAS y BPC, sonutilizados con frecuencia en estudios aerobiológicos (Bellin& Schillinger, 2001; Aira et al., 2007) debido, entre otrasventajas, a su poco peso en comparación con el equipoAERO. Pese a ello, dicho equipo es utilizado de manerafrecuente, tanto en ambientes de interior (Blomquist et al.,1984; Klanova, 2000) como de exterior (Medrela- Kuder,

2003) y algunos autores le reconocen ciertas ventajas conrespecto a otros modelos; a señalar la homogénea distri-bución de las esporas en la placa (debido a la rotación deésta bajo la hendidura) y la posibilidad de poder usardiferente volumen de aire dependiendo de la anchura de larejilla utilizada, lo cual facilita seleccionar la misma deacuerdo a los niveles esperados (Portnoy et al., 2004).

Mas recientemente se han desarrollado nuevosmodelos, basados en el mismo principio que el equipoAERO (STA-100, 203 y 204, entre otros), los cuales sonutilizados con frecuencia en estudios ambientales deedificios, industria farmacéutica, hospitales, laboratoriosde cosméticos y de alimentos (Horn, 2005).

Para evaluar la eficacia del equipo AERO, esta vezdesde el punto de vista cualitativo, se realizó un nuevomuestreo para compararlo con SAS y OME, identificandolos aislamientos a nivel de género. Los resultadosobtenidos (Figura 3) muestran que los géneros Asper-gillus, Cladosporium y Penicillium fueron los másabundantes en cuanto a unidades formadoras de colonias,no presentándose tampoco diferencias significativas entreambos sistemas volumétricos, pero sí entre el equipo AEROy el método OME, tanto para Aspergillus como paraPenicillium.

El hecho de que dichas diferencias no afecten algénero Cladosporium, lo atribuimos a la dimensión de losconidios que son más grandes que los de Aspergillus yPenicillium y por tanto, tienen un mayor tamañoaerodinámico, ya que de acuerdo con Caneva et al. (2004),la micobiota del aire colectada dependerá, entre otrosfactores, del tamaño y forma de las partículas, delmovimiento del aire circundante, mientras la sedimentaciónno favorece la representación de hongos con esporaspequeñas.

En el mismo sentido, Pasanen et al. (1991), señalanque en la depositación de las esporas hay que tener encuenta el tamaño aerodinámico, que aumentará con elincremento de la humedad relativa del aire, el que favorecerála rápida caída de las partículas de mayor tamaño. Por lotanto, teniendo en cuenta los resultados obtenidos con elAeroscope Chirana, coincidimos con lo señalado porBurge & Solomon (1987) en que este método es eficienteen la colecta de microorganismos ambientales.

Al representar las especies más abundantes en loslocales muestreados, a partir de las esporas del ambiente(con el equipo AERO) o de las recogidas por hisopado(Tabla 1), se observan diferencias considerables, tanto enel número de especies identificadas (28 ambiente vs. 22por hisopado) como en su frecuencia relativa. Así especiescomo Aspergillus flavus, A.niger, Cladosporium clados-porioides, C. sphaerospermum y Penicillium citrinum,son ubicuas en todos los locales muestreados mientrasen las muestras de hisopado su frecuencia relativa oscila

Leyenda.- AERO (Aeroscopio Chirana),SAS (Sistem Air Sampler),BPC (Burkard Personal Culture),OME (Omeliansky), L1 y L2 (locales de muestreo)

Figura 2. Valores promedios de ufc/m3 obtenidos en lacomparación de diferentes métodos de muestreo (letrasno comunes indican diferencias significativas de p<0,05,según test de Students)

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Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

a

a

a

a0

500100015002000

L1 L2

ufc/m3 AERO SAS

b ba a0

500100015002000

L1 L2

uf/cm3 AERO OME

a

a

a

a

0500

100015002000

L1 L2

ufc/m3 AERO BPC

entre un 17-50%. Por su parte, Aspergillus tamarii yCladosporium herbarum tienen una mayor presencia enlos sustratos muestreados que en el aire. Estos resultadospueden ser útiles para localizar la fuente de contaminacióndel local y valorar la influencia del aporte del aire exterioren aquellos que tengan comunicación con el exterior.

La evaluación del medio de cultivo también serealizó desde un doble punto de vista, cuantitativo ycualitativo. En el primer aspecto, se observa que el medioM2 logró la mayor eficiencia aunque no muestra diferenciasignificativa desde el punto de vista estadístico con M3,pero sí con M1 y M4. El medio M3 no difiere con ningunode los medios evaluados (Figura 4).

Se debe señalar que M1 es el medio recomendadopara este tipo de estudios según la ACGIH (1989), el cualpresentó los valores más bajos de recuperación y ningunadiferencia significativa desde el punto de vista estadísticocon M4.

Para evaluar los resultados desde el punto devista cualitativo, se identificaron los aislamientosrealizados a nivel de género. En la Figura 5 se observa que

los géneros Aspergillus, Penicillium y Cladosporiumfueron los más abundantes, independientemente del medio

Figura 3. Valores promedios de ufc/m3 de los géneros identificados con diferentes métodos de muestreo (letras nocomunes indican diferencias significativas de p<0,05, según Prueba de Kruskall-Wallis para Cladosporium yprueba de Scheffé para Aspergillus y Penicillium

Tabla 1. Comparación de la frecuencia relativa (F.R.%)de las especies identificadas en el ambiente y en los

sustratos

M1 (agar extracto de malta suplementado con peptona yglucosa), M2 (agar extracto de malta+7.5% NaCl), M3 (agarpapa dextrosa+7.5% NaCl), M4 (agar glucosa de Sabou-raud)

Figura 4. Valores promedios de ufc/m3 obtenidas conAeroscope Chirana en diferentes medios de cultivos(letras no comunes indican diferencias significativas,según Prueba de Scheffé para p<0,05)

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baba

b

0

110

220

330

440

M1 M2 M3 M4

ufc/m3

AERO

(F.R. %) Hisopado (F.R%)

Aspergillus caespitosus 11 8 Aspergillus candidus 33 16 Aspergillus clavatus 33 16 Aspergillus flavus 100 50 Aspergillus fumigatus 55 25 Aspergillus niger 100 42 Aspergillus ochraceus 11 -- Aspergillus oryzae 44 25 Aspergillus parasiticus 11 -- Aspergillus puniceus 11 -- Aspergillus scleriotorum 22 -- Aspergillus sydowii 33 25 Aspergillus tamarii 22 42 Aspergillus terreus 67 33 Aspergillus ustus 22 -- Aspergillus wentii 22 -- Aspergillus versicolor 55 25 Cladosporium cladosporioides 100 42 Cladosporium herbarum 14 17 Cladosporium oxysporum 71 33 Cladosporium sphaerospermum 100 17 Penicillium chrysogenum 86 50 Penicillium citrinum 100 17 Penicillium corylophylum 29 17 Penicillium glabrum 71 33 Penicillium janthinellum 14 8 Penicillium purpurogenum 71 8 Penicillium simplicissimun 71 8

de cultivo, resultando más eficaz M2 para Aspergillus yPenicillium y M3 para Cladosporium.

Ambos medios no presentaron diferencias encuanto a la significación estadística para la colecta de lostres géneros evaluados. El resto de los medios (M1 y M4)no presentan diferencias entre sí y difieren de M2. Sinembargo, atendiendo a la diversidad que es capaz derecuperar cada uno de los medios, M1 y M4 son los másadecuados ya que en M2 no se representaron laslevaduras ni los géneros Paecilomyces ni Nigrospora, yen M3 no se obtuvo Paecilomyces y se recuperan bajosniveles de Fusarium.

Teniendo en cuenta los aspectos anteriores, podríarecomendarse el uso de M4 (agar glucosa de Sabouraud),ya que aunque no es el medio donde se obtiene losmayores niveles, los valores obtenidos están en el mismoorden (102) que los de M2 y M3 y es el medio queconjuntamente con M1 detecta la mayor variabilidadfúngica del ambiente. Además su eficiencia en larecuperación y variabilidad obtenida no difieren de las deM1 (medio recomendado por la ACGIH, 1989).

Al revisar la bibliografía relativa a este tema, seconcluye que no hay un acuerdo, ya que para algunosautores el Agar Extracto de Malta +7,5% NaCl (M2), no esadecuado para promover la esporulación (Morring et al.,1983; Verhoeff et al., 1990), recomendándose suplementarlocon peptona y glucosa (Hunter et al., 1988; ACGIH, 1989)o usar Agar glucosa de Sabouraud (Medina et al., 1999;Pepeljnjak & Segvic, 2003).

Finalmente para averiguar si pueden ocurrirvariaciones significativas según el momento en que serecogen las muestras, se realizó un muestreo cada horaentre las 7a.m. y las 4 p.m. en los dos locales (L1 y L2). Losresultados obtenidos (Figura 6) señalan que las horas enlas que se alcanza un mayor nivel de contaminación sonlas 7, las 12 y las 11h. (L1) y las 11, 12 y 14h (L2), aunqueno se encontraron diferencias significativas entre ellas(Tabla 2).

Muchos hongos liberan sus esporas durante lanoche y primeras horas de la mañana favoreciendo a este

proceso la elevada humedad un aspecto que justifica queencontremos picos de máxima concentración a las 7 de lamañana ya que las ventanas del Local (L1) permanecenabiertas durante la noche.

De todas formas, al calcular los valores promediode contaminación en ambos muestreos, la hora de mayorconcentración fúngica resultó las 12h, con 3327 ufc/m3,con valores muy próximos a los obtenidos a las 11h (3086ufc/m3), por lo que esta franja horaria podría ser la másconveniente. Este comportamiento coincide con losresultados obtenidos por Shadzi et al. (1993), al estudiarzonas urbanas de Irán durante un año, en las cualesencontraron que la mayor concentración de hongos sepresentó en el mediodía y al final de la mañana y con elpatrón de periodicidad diurna descrito para Cladospo-rium, por Shenoi & Ramalingam (1975) quienes señalanque durante las horas del mediodía sus niveles sonmayores.

Figura 5. Niveles promedios de ufc/m3 de hongos y levaduras en diferentes medios de cultivo (letras no comunesindican diferencias significativas, según Prueba de Scheffe para p<0,05)

Figura 6.- Niveles promedios de ufc/m3 (L1 y L2, localesde muestreo)

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Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

ufc/m3

bbb

a

ab

a

abaabbbb

050

100150200

Aspergillus Cladosporium Fusarium Levadura Nigrospora Paecilomyces Penicillium

M1 M2 M3 M4

L1

0

16003200

4800

6400

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

ufc/m 3

L2

0

16003200

4800

6400

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

ufc/m3

Ricci et al. (1996), señalaron que las concentra-ciones de esporas fúngicas en ambientes de interior soninfluenciadas por parámetros ambientales (temperatura,humedad, corrientes de aire, etc), características del local(sustratos, ventilación, limpieza, etc.) siendo también unavariable importante la micobiota predominante en el aireexterior (Shelton et al., 2002).

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Tabla 2. Comparación de ufc.m-3 en ambos locales (L1 yL2) a diferentes horas (letras no comunes indican

diferencias significativas, según Prueba de Scheffépara p < 0,05)

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L 1 Hora ufc/m3 Significación

7 6053 a 12 4428 ab 11 3904 abc 8 3445 abcd 9 2882 bcd

10 2538 bcd 13 2027 bcd 15 1314 cd 14 1213 cd 16 1102 d

L 2 Hora ufc/m3 Significación

11 2268 a 14 2250 a 12 2226 a 10 2115 a 9 2065 a

15 1679 ab 13 1646 ab 8 1531 ab 7 1357 ab

16 607 b

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Aeromicota de ambientes internos: Comparación de métodos de muestreo - Rojas et al.

MICROHONGOS OPORTUNISTASASOCIADOS AL «MUSGO POMPON» DESECADO

(Sphagnum magellanicum BRID.) EN CHILE

(Opportunistic microfungi associated to the desiccated «pompon moss» (Sphagnum magellanicum Brid.) in Chile)

Eduardo Piontelli, Rodrigo Cruz & Valia VivarUniversidad de Valparaíso, Escuela de Medicina,

Cátedra de Micología Casilla 92 VC, Valparaíso , Chileemail <eduardo piontelli@uv.cl>

Palabras claves: Sphagnum magellanicum, microhongos,Asperguillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatumKey words: Sphagnum magellanicum, microfungi , Asperguillus fumigatus, Trichoderma longibrachiatum

Boletín Micológico Vol. 23 : 75 - 85 2008

RESUMEN

Se analizó la presencia de propágulos fúngicosen muestras secas del musgo Sphangnum magellanicumprovenientes de 2 localidades de la zona Sur del país(39 y 41ºS), mediante cultivos en agar agua y agarSabouraud a temperaturas de 25 y 35ºC con muestrasrecién colectadas (2007) y almacenadas un año atemperatura ambiente (2008). Nuestro objetivo fuedeterminar previo a la comercialización de este vegetaldesecado, la presencia/ausencia del complejo Sporothrixschenckii u otras especies oportunistas consideradascomo un riesgo en salud pública en la comunidad demicrohongos filamentosos viables en el tiempo en estemusgo. En la primera muestra (41ºS, 2007), a 25ºC, enambos medios, se observó un total de 31 géneros y 36especies. Los géneros con mayor frecuencia en ordendecreciente y en ambos medios fueron: Penicillium,Cladosporium, Trichoderma y Mucor representandoaproximadamente el 70% del total de presencia, mientrasen las muestras sembradas un año después, fueron enorden decreciente: Aspergillus, Trichoderma, Peni-cillium y Gelasinospora, con un total de presencia del75,4%. A 35ºC en ambas muestras la presencia de taxase redujo a 4-5 géneros donde las principales especiesfueron A. fumigatus complex y T. longibrachiatum conaltos porcentajes, Penicillium spp. y Gelasinosporacaulospora. Se destaca un raro aislamiento deNeosartorya quadricincta.

Ningún integrante del complejo Ophiostomastenoceras-Sporothrix schenckii se detectó en las

muestras a 25º y 35º C, pero a pesar de su ausenciadeben tomarse precauciones en el manejo y distribucióncomercial de este musgo en Chile, debido a la sobrevi-vencia en el tiempo de ciertos hongos oportunistas, comolos integrantes del complejo A. fumigatus y T.longibrachiatum.

ABSTRACT

The presence of fungal propagules in desiccatedsamples of Sphangnum magellanicum moss collectedfrom two southern zones of the country (39 and 41ºS)was analyzed by means of water agar and Sabouraudagar, at 25 and 35ºC temperatures using freshly gatheredsamples (2007) and stored for a year at room temperature(2008). Our aim was to determine, prior to the marketingof this desiccated vegetable, the presence/absence of theSporothix schenckii complex or other opportunisticspecies which are considered to be a risk in public health,in the community of filamentous microfungi that areviable with time in this moss. The first sample (41ºS,2007),at 25ºC, in both media revealed 31 genera and 36species as a total. Genera most frequently found, in decre-asing order, were: Penicillium, Cladosporium ,Trichoderma and Mucor, which represented about 70%of the overall occurrence, whereas samples cultured oneyear later showed, in decreasing order, the presence of :Aspergillus, Trichoderma, Penicillium and Gela-sinospora, meaning a 75.4% occurrence. At 35ºC, thepresence of taxa became reduced in both samples to 4-5genera, main species being A. fumigatus complex and T.longibrachiatum in high percentages, Penicillium spp.and Gelasinospora caulospora. Besides, it is remarkablea rare isolation of Neosartorya quadricincta.

Recibido el 17 de Julio 2008Aceptado el 23 de Septiembre 2008

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None component of the Ophiostoma stenoceras-Sporothrix schenkii complex was detected in samplesat 25º and 35º C yet although its absence, caution mustbe made in handling and commercial distribution of thismoss in Chile due to the survival in time of certainopportunistic fungi such as those found in the A.fumigatus complex and T.longibrachiatum.

INTRODUCCION

Las briófitas son consideradas como el segundogran grupo de plantas terrestres y las únicas con fasegametofitica haploide dominante, presentan granpotencialidad de dispersión mediante esporas opropagación vegetativa. Son presumiblemente polifiléticasy por ende consideradas como un grupo no natural queincluye los musgos (Briophyta), hepáticas (Marchan-tiophyta) y las antocerotas (Anthocerotophyta). A pesarde ser muy diferentes entre ellas en estructura, son muysimilares en sus ciclos de vida (Frahm, 2008). El géneroSphagnum contiene una gran cantidad de especies demusgos de amplia distribución cosmopolita que ocupan1/3 de la superficie de los suelos en el planeta (Turetskyet al.,2002). Las especies de Sphagnum, incluyendo S.magellanicum Brid. (Sphagnopsida, Sphangnales,Sphangaceae), se denominan comúnmente en la zona surdel país como: musgo pompón, musgo de turberas, musgode pantano o esfagno, mientras en los países anglosajonesgeneralmente como «Sphagnum moss». En la zona sur deChile, sus poblaciones son integrantes de las turberasreferidas también como «pomponales o ñadis», las cualesse forman después de la tala, raza o quema de bosques, ensitios anegados que rápidamente son colonizados por estevegetal, cubriendo un área geográfica aproximada de unas500.000 hectáreas. Su distribución silvestre se presentaen extensas formaciones edáficas en franjas territorialesdesde la novena a la duodécima región (Ramírez, 1990;Figueroa et al., 1999; Villaroel et al., 2002; Teneb & Dollenz,2004). Las turberas, son ambientes naturales inundadoscaracterísticos de regiones climáticas templadas y frías,las que se desarrollan sobre terrenos con restricción dedrenaje, donde este musgo forma un sustrato esponjosocontinuo, impregnado de agua, asociado a numerosasespecies vasculares arbóreas y herbáceas adaptadas a esteambiente (Teneb & Dollenz, 2004).

El empleo comercial de Sphagnum deshidratadoes bastante amplio: en vendajes quirúrgicos, apósitos,empacado de plantas, así como también en forma de turbacomo combustible, como absorbente de aceites, derivadosdel petróleo y como descontaminante de metales pesadosy pesticidas entre otros usos (Villaroel et al., 2002).

El conjunto de microhongos filamentososfrecuentes que intervienen en la senescencia y descompo-

sición de las turberas en las poblaciones de Sphagnum,han sido estudiados solamente en algunas zonasgeográficas (Thorman et al., 2001- 2003- 2004; Tsuneda etal., 2001; Hambleton et al., 2003; Markus et al., 2002 -2004; Rice et al., 2006), sin embargo, la importanciaambiental de estos musgos tiene relevancia en la literaturamicológica médica internacional y en especial en USA,por ser considerado uno de los hábitat comunes de unhongo dimórfico saprofítico y geofílico que integra elcomplex Sporothrix schenckii, causante de varios brotesendémicos de una micosis crónica subcutánea granulo-matosa denominada esporotricosis (Powell et al., 1978;Dixon et al., 1991). Esta micosis se presenta generalmenteen una forma linfocutánea limitada, que puede diseminarsea otros sistemas orgánicos en pacientes con gravesdeficiencias inmunes (Jaffar et al., 1998).

En Chile, la esporotricosis es aparentemente unamicosis rara, debido a que solo se ha detectado en la zonacentral del país en 2 casos clínicos autóctonos en 1950 y1984 (en Piontelli, 1995), recientemente en lesiones nasalesen un perro (Muñoz et al., 2006) y como saprófito en uñasde gato (Thomson & Cerda, 2008), pero no existenreferencias sobre la distribución de su agente en unambiente determinado. Frente a la ausencia de unainformación geográfica y epidemiológica de este patógenoprimario y debido a que la gran cobertura del musgo S.magellanicum en la zona sur podría reunir condicionesfavorables para su permanencia y distribución, nuestroobjetivo fue: determinar previo a la comercialización deeste vegetal desecado y en una localización geográficaparticular, la presencia/ausencia del complejo S. schenckiiu otras especies consideradas como un riesgo en saludpública en la comunidad de microhongos filamentosos quepermanecen viables en el tiempo en este musgo.

MATERIALES Y METODOS

a) Localización geográfica de las muestras. La mayorparte de las muestras del musgo se obtuvieron el mes defebrero 2007, desde un distribuidor comercial (1ª. muestra)en el pueblo de Tegualda (Comuna de Fresia) en la Regiónde los lagos (app. 41º S) y en la zona de Valdivia (2ª muestramenor, app. 30ºS). Las muestras se refrigeraron a 4-6 gradoshasta su procesamiento los primeros días de Marzo.

La primera muestra correspondió a más de medio sacodel substrato (aproximadamente unos 6 kilos) obtenidodel lugar de secado de este musgo, representando unconjunto de diversas muestras provenientes de zonasprecordilleranas y en un radio de 60 Km alrededor delpueblo de Tegualda. Mientras la segunda (250 g) obtenidaen Marzo 2007, provino de una localidad cercana a Valdivia,procesándose ambas a fines del mes de Marzo, previa refri-geración por 5 días a 4º- 6º C.

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b) Metodología de siembra de la 1ª muestra. Con pinzasque se esterilizaban a la llama, se tomaron trozos del musgoal azar desde la muestra principal, los cuales se depositaronen bolsas de plástico estériles hasta confeccionar 19muestras de aproximadamente 100g c/u, luego con tijeraesterilizada a la llama se trozó el substrato en cada muestraen partes de no más de 2-3 cm de largo, para permitir unabuena siembra directa en la superficie de 2 medios decultivo en placas de Petri de 10 cm (en duplicado): unocon agar agua y otro en agar Sabouraud, ambos conCloramfenicol 250 mg /L. Para detectar la viabilidad de lasesporas o micelios presentes en el substrato, los trozosdel musgo seco (8-10 trozos), se distribuyeron de maneraequidistante directamente sobre la superficie de las placasen ambos medios y se incubaron a 25ºC durante 10 díasen oscuridad, manteniéndose los cultivos hasta 30 días atemperatura ambiente (17-22ºC) con el régimen alterno deluz y oscuridad diaria, esto último para detectar el posiblecrecimiento de hongos de lento desarrollo, en especial enagar agua. Paralelamente se sembró solo en agar Sabourad conCloramfenicol con la misma técnica descrita un set enduplicado de otras 19 placas que se incubaron por 10días a una temperatura de 35ºC ( ±1ºC), para observar laposible presencia de hongos mesófilos, termotolerantes otermófilos, capaces de crecer a esa temperatura. El sobrante de la primera muestra se mantuvoprotegido en su contenedor a temperatura ambientedurante 1 año, para luego separar (nuevamente en el mesde Marzo) 9 muestras de unos 100 g tomadas al azar (conel mismo procedimiento descrito anteriormente) las cualesse sembraron en duplicado en placas de agar Sabouraudcon Cloramfenicol, incubándose a 25 ºC durante 10 díasen oscuridad, y manteniéndose los cultivos hasta 30 díasa temperatura ambiente (17-22ºC) con el régimen alternode luz y oscuridad diaria.

c) Métodos de siembra de la segunda muestra. Debido a lapoca cantidad de muestra obtenida desde la zona deValdivia, ésta no pudo subdividirse en submuestras,sembrándose con la misma técnica anterior solo en 9 placasde agar Sabouraud con Caf. a temperatura de 35ºC ( ±1ºC),durante 7-10 días en oscuridad, para detectar la presenciade hongos mesófilos, termotolerantes o termófilos.

d) Observación de los cultivos y análisis de presenciafúngica. Los hongos que se desarrollaron en las diferentesmuestras, medios de cultivo, temperaturas y tiempos,fueron enumerados bajo la lupa estereoscópica mediantesu frecuencia de aparición, asignándole un «Puntaje depresencia de género o especie (PP)»: 3 puntos =Dominante (mas de 7 colonias dentro de una placa; 2puntos = Frecuente (de 3 a 6 colonias dentro de una placa)

y 1 punto = Esporádico (1 a 2 colonias en la misma placa).Para las placas duplicadas que proporcionaron valoresdiferentes, se consideró como valor de PP a la quepresentaba mayor frecuencia. Estas categorías pretendenproporcionar un valor estimativo que represente en el totalla frecuencia de cada taxa.

Las observaciones macroscópicas de los cultivosa temperaturas de 25º y 35ºC se efectuaron bajo lupaestereoscópica a los 7-10-20 y 30 días mientras los atemperaturas de 35ºC a los 5 y 15 días. Las observacionesmicroscópicas se hicieron con preparaciones en lactofenolen un microscopio ZEISS con óptica DIC. Cuando fuenecesario el empleo de cultivos adicionales, se efectúaronlos especificados en las monografías de cada género, enespecial Aspergillus (subgénero Fumigati), Trichodermay algunos Penicillium (Domsh et al., 1980; Klich, 2002;Samson et al., 2007; Gams & Bisset, 1998; Samuels et al.,1998; Pitt, 2000). No todos los integrantes de algunosgéneros se determinaron al nivel de especie, principalmentese clasificaron los considerados como oportunistas y losmás frecuentes.

RESULTADOS

a) Muestra 1, a 25ºC - año 2007. En las 19 muestrasanalizadas en los 2 medios de cultivo la micota presenteen agar agua, fue mayor que en agar Sabouraud con untotal de 21 géneros y 28 especies y 18 y 20 respecti-vamente, obteniéndose un total de 31 géneros y 36 especiesen ambos medios (Tabla 1). Ocho taxa que no se detectaronen agar agua se presentaron en agar Sabouraud, mientras13 que se presentaron en agar agua no lo hicieron en agarSabouraud y 18 taxa estuvieron presentes en ambosmedios. Los integrantes de los géneros con una frecuenciamayor del 10% fueron en agar agua: Penicillium (36,8%),Cladosporium (14,7%) Trichoderma (13%) y Mucor(12,3%). Estos, representaron el 76,8% del total depresencia. Los mismos géneros se obtuvieron en agarSabouraud con porcentajes semejantes, salvo enCladosporium con un porcentaje menor (10,9%) (Figura1, Tabla 1) representando sus integrantes un 69,1% deltotal de presencia (Tabla 1).

Las especies con mayor número de frecuencia depresencia (sobre el 5%) en agar agua fueron: Penicilliumglabrum (14,4%), Cladosporium cladosporioides (12%),Trichoderma harzianum complex (10%), Penicilliumbrevicompactum (7%), Mucor racemosus (6%) y Absidiaglauca (5,4%). En agar Sabouraud, hubo semejanzas en lapresencia de Penicillium glabrum, Trichoderma harzia-num complex y Mucor racemosus, mientras C.clados-porioides y P. brevicompactum disminuyeron. Aumen-taron su presencia A.glauca (9,3%) y Mortierella rama-nniana (6,1%) (Tabla 1).

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Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile - E. Piontelli et al.

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

4 0%

A g a r a g u a 2 0 0 7 A g a r S a b . 2 0 0 7 A g a r S a b . 2 0 0 8

P en ic illiu m s p p .

C la d o sp o r iu m s p p .

T r ich o d er m a s p p .

M u co r s p p .

A s p er g illu s sp p .

G ela sin o s p o ra sp .

Figura 1. Frecuencia de integrantes de géneros comunes aislados en dos medios de cultivo a 25ºCen los años 2007 y 2008 desde Sphagnum magellanicum desecado.

1

2

3

45 6 7

89

10

11

2

4

6

8 9

10

11

0

5

10

15

20

25%

2007 2008

1 Abs. glauca2 A. fumigatus comp.3 C. cladosporioides4 G. caulospora5 Mort. ramanniana6 Mucor racemosus7 P. brevicompactum8 P. glabrum9 Penicillium spp.10 T. harzianum11 T. longibrachiatum

No se observó la presencia de Sporothrix schen-ckii ni otro representante de las Ophiostomataceae en elseguimiento de las muestras en el tiempo (30 días).

b) Muestra 1, a 25ºC sembrada un año después (2008)sólo en agar Sabouraud. En las 9 muestras en duplicadoel número de géneros (13) y especies (16) disminuyó enreferencia a las del año 2007 y los integrantes de losgéneros con una frecuencia mayor del 10% fueron:Aspergillus (23,6%), Trichoderma (20%), Penicillium,18,2%) y Gelasinospora (13,6%), con un total de presenciadel 75,4%. Se observaron diferencias en la presencia detodos los géneros más frecuentes con respecto al año2007, destacándose la ausencia de los integrantes deCladosporium (Figura 1, Tabla 1). Las especies con mayornúmero de frecuencia de presencia (sobre el 5%) fueron:A . fumigatus complex (21,8%), T. harzianum complex

(16,4%), G.caulospora (13,6%), P. glabrum (9,1%)Penicillium spp. (8,2%)(mayoritariamente integrantes delsubgénero Penicillium) y M. racemosus (5,7%) ( Figura2, Tabla 1).

La frecuencia de presencia de los integrantes delos géneros en las muestras sembradas en los 2 medios enel año 2007 comparadas con las sembradas en A.S. en el2008 (Tabla 1), permiten observar que A. fumigatuscomplex, G. caulospora y T. longibrachiatum aumentaronnotoriamente su presencia; disminuyeron M. racemosus,P. glabrum, Penicillium spp. y T harzianum y no sepresentaron A. glauca, P. brevicompactum y ningúnCladosporium (Tabla 1, Fig. 2).

No se detectó la presencia de Sporothrixschenckii ni otro representante de las Ophiostomataceaeen las muestras en el tiempo (30 días).

Figura 1. Frecuencia de especies comunes aisladas en dos medios de cultivo a 25ºCen los años 2007 y 2008 desde Sphagnum magellanicum desecado.

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Vald. 2007TAXA FUNGICOS

fr. % fr. % fr. % fr. % fr. %Absidia glauca Hagem 16 5,4 23 9,3Acremonium strictum W. Gams complex 1 0,3Acremonium sp. 2 0,7 1Alternaria alternata (Fr.) Keissler complex 2 0,7Amphobotrys ricini (N.F. Buchw.) Hennebert 2 0,8 2 1,8 3 2,7Aspergillus fumigatus Fr. complex 3 1,0 7 2,8 24 21,8 46 41,8 15 29,4Aspergillus sclerotiorum G.A. Huber 2 0,7 2 1,8Aureobasidium pullulans (De Bary) Arnaud var. pullulans 2 0,7A. pullulans (De Bary) Arnaud var. melanigenum 2 0,7Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. 1 0,3Bipolaris sp. 1 0,4Botrytis cinerea Pers. 3 1,0 2 0,8Chalara sp. 2 1,8Chaetomium sp. 1 0,9Cladosporium cladosporioides (Fr.) de Vries 36 12,0 20 8,1Cladosporium sphaerospermum Penzing 8 2,7 5 2,0Cladosporium sp. 2 0,8Clonostachys rosea f. rosea Schroers et al. 3 1,2Curvularia clavata B.L. Jain 2 0,7Curvularia sp. 1 0,3Epicoccum nigrum Link 2 0,7Fusarium oxysporum Schlech.:Fr. 2 1,8Gelasinospora calospora (Mouton) C. Moreau & Moreau 9 3,0 4 1,6 15 13,6 7 6,4Geomyces pannorum (Lin.) Sigler & Carmich. 3 1,0 7 2,8 3 2,7Malbranchea sp. 1 0,3Mortierella ramanniana (Möller) Linnem. 12 4,0 15 6,1Mucor hiemalis Wehmer 13 4,3 9 3,6 2 1,8Mucor racemosus Fres. 19 6,4 14 5,7 3 2,7Mucor plumbeus Bon. 5 1,7 5 2,0 3 2,7Neosartorya quadricincta (J.L. Yuill) Malloch & Cain 1 0,2Nodulisporum sp. 1 0,4Oidiodendrum griseum Robak 3 1,2Penicillium brevicompactum Dierckx 21 7,0 12 4,9Penicillium decumbens Thom 10 3,3 4 1,6 4 3,6Penicillium glabrum (Wehmer) Westling 43 14,4 39 15,8 10 9,1Penicillium purpurogenum Stoll 1 0,3 1 0,9Penicillium spp. 36 12,0 31 12,6 9 8,2 18 16,4 9 17,6Phoma sp. 2 0,8Piptocephalis sp. 1 0,3 1 0,4Rhizopus stolonifer (Ehrenb:) Lind. 2 1,8Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings 3 2,7Stemphylium botriosum Sacc. 1 0,3Thamnidium elegans Link 3 1,2Trichoderma harzianum Rifai complex 30 10,0 26 10,5 18 16,4Trichoderma longibrachiatum Rifai 3 1,0 2 0,8 2 1,8 22 20,0 21 41,2Trichoderma viride Pers. 2 0,7 1 0,9Trichoderma spp. 4 1,3 2 0,8 1 0,9 2 1,8Ulocladium consotiale (Thüm.) E.G. Simmons 2 1,8Micelio sin fructificar 2 2 1 0,9 8 7,3 5 9,8Total del Puntaje de presencia (PP) 299 247 110 110 51Taxa fúngicos aislados 33 27 22 9 4

A.S. 35ºCFresia 2007 Fresia 2008

A.A. 25ºC A.S. 25ºC A.S. 25ºC A.S. 35ºC

Tabla 1. Frecuencia de hongos aislados en S. magellanicum desecado, en dos medios de culti-vo; Agar Agua (A.A.) y Agar Sabouraud (A.S.) a 25 y 35ºC, en los años 2007 y 2008

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Microhongos oportunistas asociados al «musgo pompom» desecado Sphagunum magellanicus Brid. en Chile - E. Piontelli et al.

c) Muestra 1 a 35ºC en agar Sabouraud. En las 9 muestrasen duplicado, la presencia de géneros y especies se redujoa 5 y 5 respectivamente, siendo los taxa dominantes: A.fumigatus complex (41,8%), T. longibrachiatum (20%),Penicillium spp.(16,4%) (integrantes principalmente de 2subgéneros Penicillium y Aspergilloides ) y G. caulos-pora (6,4%) (Tabla 1). No se observó la presencia deSporothrix schenckii en las muestras en el tiempo (15días).

d) Muestra 2 a 35ºC en agar Sabouraud. En las 9 mues-tras, la presencia de géneros y especies se redujo a 4 y 3respectivamente, siendo los taxa dominantes: T.longibrachiatum (41,2%), A. fumigatus complex (29,4%),Penicillium spp. (integrantes principalmente de lossubgéneros Penicillium y Aspergilloides)(17,6%).Neosartorya quadricincta se presentó una sola vez enuna muestra (Tabla 1). No se observó la presencia de S.schenckii en las muestras en el tiempo (15 días).

La alta presencia de A.fumigatus complex en las 2muestras a 35ºC permitió un estudio morfofisiológicoadicional de 10 cepas seleccionadas al azar, las cuales secompararon entre si y con 2 cepas aisladas de pacientescon aspergilosis pulmonar. Las 12 cepas crecieron a 50-51ºC y solo 1(de la muestra 1) lo hizo a 9-10ºC. A pesar dela variación morfológica observada en algunas de las cepasambientales, en especial en la forma de sus vesículas (Fig.1A), la extensión de las fiálides sobre estas y el largo desus cabezas columnares (2 cepas con cabezas columnaresmuy cortas), estos datos no permitieron su inclusión enespecies diferentes y se prefirió determinarlas a todas comointegrantes de A. fumigatus complex.

Descripción de Neosarorya quadricincta:Diámetro de las colonias a los 7 días en CYA 33-40 mm,MEA25:55-61mm, OA (agar avena) 50-52 mm, CYA37 56-63 mm. Color en CYA ante claro, con leves tonos verdes,flocosas, reverso blanco a crema. En agar Malta y agaravena colonias flocosas, similares en colores, ante en elcentro con tonalidades verde oscuras en la periferia por elcrecimiento del anamorfo (más notorio en OA), reversocrema.

En OA,Cabezas columnares cortas y laxas.Anamorfo; estipe 350-450 x 3-8µm, diámetro de lasvesículas 13-24(promedio 19), conidios elípticos aglobosos, microtuberculados 2-3µm. Teleomorfo:Cleistotecios de color ante claro, 240-285µm, pseudopa-renqimatosos, de paredes delgadas de color café oscuro,ascos subglobosos a ovoides, 11-15 x 10-11,5 µm,ascosporas elípticas en visión lateral y redondas en visiónfrontal, con 4 crestas ecuatoriales, 2 prominentes en elcentro y 2 menos prominentes lateralmente, reticuladas,5,5 - 6,5 x 4 - 5 µm (Figura 2).

DISCUSION

La decomposición de las briófitas en la naturalezaes lenta, debido a los compuestos secundarios que ellasproducen (Asakawa,1990), especialmente compuestosfenólicos con funciones desconocidas, pero con capa-cidad de inhibir la herbivoría de micro y macrofauna, lagerminación de las esporas de los hongos y el crecimientobacteriano cuando la superficie de la hoja se humedece(Tadesse, 2002). Esta situación, no se debe exclusivamentea los compuestos secundarios sino en especial en elgénero Sphagnum, a las bajas concentraciones denutrientes en sus hojas, como nitrógeno y fósforo (Aert,et al., 1999; Turetsky, 2003).

La fuente de agua y nutrientes para los turbalesproviene sólo de las precipìtaciones, y el esfagno, queposee una alta capacidad para su retención (8 a 10 vecessu peso), contribuye a formar un sistema cerrado ombro-trófico (Damman, 1978). Si bien es cierto, que las condi-ciones climáticas de alta humedad y el agua son impor-tantes en la distribución de esta especie, sus rangos depH entre 4 y 6, considerados moderados con respecto alas demás especies del género (Andrus, 1986), resultanadecuados para la mayoría de una micota asociada alterreno, de gran importancia en sus procesos de senes-cencia y descomposición.

Una variedad de hongos parasíticos y saprofí-ticos se han registrado en las briófitas vivas y en descom-posición, incluyendo representantes del géneroSphagnum, en orden decreciente desde los Ascomycotay sus anamorfos a los Zygo y Basidiomycota (Frankland,1974; Redhead, 1981; Moreau, 2002; Thormann, 2003).Incluso trabajos recientes en las turberas empleando sólotécnicas moleculares con aislamientos directos de micelioso esporas capaces de germinar, siguen demostrando unadominancia de ascomicetos (Artz et al., 2007) y general-mente con presencia de taxa de rápido crecimiento y granproducción de esporas, como las especies de Penicillium,Cladosporium, Verticillium, Mortierella y Mucor,reportadas en cultivos estandar; prevalencia que se explicapor su fácil desarrollo en estos medios (Thormann, 2006).El caso contrario sucede con los basidiomicetos, los cualesno se detectan prácticamente en los estudios basadosen cultivos, a pesar de la ocurrencia de sus fructificacionesen los ecosistemas de turberas (Felix, 1988; Thorman, 2004).

Sin embargo, a pesar que los musgos son aúnun hábitat poco analizado en relación a los hongos, enalgunas especies de Sphagnum vivas y en descompo-sición (en especial en S. fuscum), se ha encontrado unaamplia comunidad fúngica mayoritariamente saprotrofacon escasos patógenos, probablemente debido a suhabilidad de utilizar un amplio rango de fuentes carbo-nadas, tales como la celulosa, los ácidos tánicos y la pectina

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(Thorman et al., 2001, 2003, 2004; Tsuneda et al., 2001;Hambleton et al., 2003; Markus et al., 2002 -2004; Rice etal., 2006).

El conjunto de hongos en S. fuscum, en gradientesde descomposición en el tiempo, ha sido estudiado enCanadá por Thorman et al. (2001), los cuales encontraronuna mayor frecuencia de hongos comunes del suelo(Penicillium tomii, Trichoderma viride, T. harzianum,Mortierella ramanniana y Mucor hiemalis), unasituación muy similar a la nuestra y la de otros estudiossobre turberas (referencias en Thorman et al., 2001). Perodebemos aclarar que a pesar de que geográficamentenuestras muestras fueron tomadas en latitudes hemisféri-cas con ciertas semilitudes, la metodología que empleamosno se refirió a las etapas de descomposición de S. magella-nicum, sino a la sobrevivencia y presencia en el tiempo delos diferentes propágulos de dispersión despues de susecado al sol sobre mallas levantadas del suelo, en unproceso previo a su comercialización.

Si a pesar de la metodología, comparamos losgéneros encontrados con los de Thormann et al., 2001observamos una buena coincidencia en la presencia dealgunos de ellos, pero con una mayor diversidad ennuestros aislamientos (31 géneros), con un buen porcen-taje de taxa que se han aislado consistentemente en tierrasde turberas en el mundo por su tolerancia a bajos pH ytemperaturas, condiciones de suelos inundados y capaci-dades enzimáticas (grupos funcionales) de utilizar fuentescarbonadas, pectinas, celulosa, gelatina y almidón perocon escasa capacidad de utilizar ácido tánico ( Thorman etal., 2001, 2003; Swift, 2005).

Las especies aisladas a temperaturas de incu-bación de 25ºC (año 2007), que representaron casi untercio de la comunidad especialmente en agar Sabouraud,fueron las integrantes de los Mucorales, siguiendole enimportancia las especies de Penicillium, Trichoderma yCladosporium, todos habitantes comunes del suelo omaterial vegetal senescente (Domsch et al., 1980). La pre-sencia esporádica de Geomyces pannorum (Onygenales),Gelasinospora caulospora (Sordariales), Aspergillusfumigatus (Eurotiales) y Botrytis cinerea (Leotiales),también se asocia a los diversos hábitat del suelo y los 3primeros no parecen ser comunes en Sphagnum(Thormann et al., 2001, 2003, 2004), así como otros quedeben su presencia posiblemente a cambios vegeta-cionales en la turbera (Artz et al., 2007) o al manejo deeste musgo para su traslado comercial a otras zonasecológicas.

En la micota obtenida un año después (2008), seobservó una disminución en el número de géneros yespecies, pero con notables aumentos del porcentaje deA. fumigatus complex, G. caulospora y T. harzianum

complex (Tabla.1). Esta situación, puede asociarse a losefectos inhibitorios sobre la esporulación fúngica de loscomponentes de este musgo en el tiempo en parte de lamicota presente (Tadesse, 2002) y a la mayor capacidad desobrevivencia de sus mito y meiosporas durante elalmacenaje, lo que podría ser una desventaja para lasespecies de Mucorales y Penicillium que disminuyeronsu presencia y la ausencia de Cladosporium. Sin embargo,Rhizopus stolonifer y R.oryzae, sólo se presentarondespués del almacenaje en el tiempo.

La clara disminución de taxa en el substrato cul-tivado a 35ºC, en las 2 muestras (año 2007), favoreciósolo el crecimiento de pocas especies mesófilas y termoto-lerantes, con notable aumento de A. fumigatus, T. longi-brachiatum y algunos integrantes del género Penicillium(mayoritariamente del subgénero Penicillium). A. fumi-gatus es un reconocido termotolerante que crece a unatemperatura optima de 45º con máxima de 53º y una mínima11ºC (Samson et al., 2007) y T. longibrachiatum (secciónLongibrachiatum), crece y produce la mayor cantidad deconidios entre los 30-40ºC (Samuels et al., 1998). De estas2 últimas especies oportunistas A. fumigatus princi-palmente, es el causante común de varias infecciones enel hombre y los animales y T .longibrachiatum se consi-dera entre los hongos emergentes que presentan mani-festaciones clínicas diversas, en especial peritonitis debidoa dialisis peritoneal (De Hoog et al., 2000; Kredics et al.,2003).

Los aislamientos de A. fumigatus fueron variablesen su macro y micromorfología, lo que dificulta sudiferenciación solamente en base a datos fenético de lasotras especies estrechamente relacionadas, situación quees comentada por Samsom et al. (2006, 2007). Sin embargo,A. fumigatus se caracteriza por sus vesículas subcla-vadas, mientras A. lentulus, A. fumigatiaffinis, A. novofu-migatus y A. turcosus tienen usualmente vesículasglobosas. A. fumigatus crece a 50ºC pero no a 10ºC. y A.turcosus lo hace a 10ºC y también a 50ºC. Al comparar lascepas aisladas, varias presentaron una mezcla de vesículasclavadas a esféricas (Fig. 1A) y los rangos de sus diámetrosjunto con los conidióforos (datos no incluidos) fueronvariables, pero no permitieron una clara diferenciación delos integrantes del complex A. fumigatus.

Geneticamente A. fumigatus parece ser una especiemuy homogénea claramente separada de otras relacio-nadas cuando se emplean secuencias de genes queincluyen b-tubulina, actina y calmodulina. Es por esto queel empleo de las secuencia de multigenes es una determi-nante crítica para la delineación del complex A. fumigatus(Samsom et al., 2006, 2007).

Se destaca la capacidad de sobrevivencia deAmphobotrys ricini, anamofo de Botryotinia ricini

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(Godfrey)Whetzel (Sclerotinaceae), el moho gris agentecausal del daño de inflorecencias y semillas de laoleaginosa llamada higuerilla (Ricinus communis L.) y lapresencia en la muestra 2 de un aislamiento de Neosarto-rya quadricincta (anamorfo A. quadricingens. Kozak.)Esta última especie no parece haberse aislado en el conosur de Sudamérica (Samson et al., 2007) y se describe sumorfología en resultados, destacando que este ecotipopresentó ascosporas levemente mayores a las señaladasen la bibliografía (Fig. 2).

La ausencia de miembros de las Ophiostomata-les, en especial de los integrantes del complex Ophiostomastenoceras-Sporothrix schenckii (de Meyer, 2008), es unasituación que debe considerarse con cautela debido a quese han analizado solo partes del área de crecimiento de S.magellanicum, por lo que no podemos aseverar su totalausencia. En Chile, sólo en la zona central, se han detectado2 casos autóctonos de esporotricosis en el hombre, entrelos años 1950 y1984 (en Piontelli, 1995), recientemente seha detectado un caso en un agricultor en Santiago (M.CDíaz, comunicación personal) y otro caso desde lesionesnasales en un canino (Muñoz et al. 2006), asi como suaislamiento como agente saprófito en uñas de gato(Thomson & Cerda, 2008). Sin embargo, en todos ellos sedesconocen las fuentes de infección. Otra posible eviden-cia de la presencia de este complejo en esta última zona,fué detectada en especies de Eucalyptus y asociada a uncoleóptero (Ectinogoniua buquetti Spin.), sin poder obte-nerse la cepa pura por estar mezclada con O. stenoceras.Sin embargo, por el tamaño y la abundante producción desus conidios sésiles oscuros (Fig 1B), puede ser sugerente

de S.brasiliensis (Piontelli et al.,2006 ; Marimón et al.,2007).

En la actualidad la esporotricosis se ha detectadoen muchos países y algunas de sus regiones son conside-radas endémicas para este agente infeccioso, principal-mente en USA, Canadá, Japón, Sudáfrica, India, Australia,México, Uruguay, Brasil, Argentina, Colombia, Perú yGuatemala. La adquisición del agente causal según laliteratura, proviene desde varios ambientes naturales, talescomo: el suelo, restos de plantas, musgos (Sphagnum),plantas exóticas, espinas, tallos de rosas, madera, heno,aire, agua, insectos y otras fuentes. Incluso varios animalesdomésticos y roedores son portadores de este hongo,entre ellos gatos y perros, pero no se consideran comoreservorios naturales; por esta razón, la esporotricosis seasocian con actividades en ambientes externos relaciona-das con: floristas, agricultores, jardineros, trabajadoresde viveros de plantas, leñadores, etc., donde al parecer, elsustrato muerto de Sphagnum (Zhanf & Andrews, 1993),se considera entre los hábitat más comunes y por endeuna fuente de contagio humana y animal para este hongodimórfico (Powell et al., 1978; Travassos & LLoyd, 1980Dixon et al., 1991; Vismer & Hull, 1997; Jaffar et al., 1998;Lopes-Bezerra, 2006; Mehta et al., 2007)

Mediantes estudios moleculares se hademostrado que la estructura de la población de S. schen-ckii,está integrada filogenéticamente por un conjunto devarias especies (más de 5 especies putativas) prevalentesen distintas áreas geográficas, que pueden inclusoidentificarse sólo con tecnicas morfofisiológicas ( Marimonet al., 2006-2007; O’Reilly & Atman, 2006). De Meyer etal.(2008), mediante estudios taxonómicos y filogénicos,

Figura 1. A. -Forma de las vesículas de algunos de los integrantes del complejo Fumigatus aisladas en S. magella-nicum y recubrimiento por las fíalides de las 2/3 de éstas. B.- Conidios simpodiales hialinos y aleuroconidios

dematiáceos de S. schenckii complex, aislado en Eucalyptus.

A B

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Figura 2. Neosartorya quadricincta. 2,1-2, 2-2,3.- Holomorfo en cultivo en OA, CYA, MA. 2,4.- Conidióforos,vesículas, fiálides, conidios y un asco en OA. 2,5.- Ascoma, ascos y anamorfo en OA. 2,6 -2,7 -2,8 -2,9.- Ascoy ascosporas mostrando las 2 crestas prominentes y las 2 bandas laterales. En 2,8.- Se aprecia al mismotiempo la rugosidad de la ascospora en vista lateral. 2,10.- Conidióforos, vesículas, fiálides, conidios en MA.

Barra = 10 µm

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describieron 3 nuevas especies en el complex O.stenoceras-S.schenckii, desde la madera y el suelo, confirmando almismo tiempo que las cepas patógenas en humanos formanun conjunto de varias especies crípticas.

La ausencia de patógenos primarios en S. ma-gellanicus del complejo S.schenkii en las zonas mues-treadas, es una situación favorable desde el punto de vistade un substrato considerado una fuente de infección envarias partes del mundo. A pesar de lo limitado de nuestromuestreo, aporta nueva información sobre la riqueza desus propágulos como remanentes de posibles gruposfuncionales fúngicos asociados a este musgo. Conreferencia a su importancia en salud pública y debido a lasparticulares propiedades físicas que exhibe este substratodeben tomarse precauciones en su manejo y distribucióncomercial en Chile, debido a la sobrevivencia en el tiempode ciertos hongos oportunistas, en especial los integrantesdel complejo A. fumigatus.

Agradecimientos. Se agradece al Sr. Oscar Castro de laciudad de Tegualda (Comuna de Fresia) la gentileza dehaber proporcionado toda la muestra 1.

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NOTAS SOBRE EL GENERO Geastrum PERS. EN CHILECENTRAL

(Notes on the genus Geastrum Pers. in Central Chile)

Hugo Madrid L.Unitat de Microbiologia, Facultat de Medicina i Ciències de la Salut,

Universitat Rovira i Virgili, Sant Llorenç 21, 43201 Reus (Tarragona), España.Tel: 34-977759350, E-mail: hugo.madrid@urv.cat

Palabras clave: Geastrales, Geastrum, DistribuciónKey words: Geastrales, Geastrum, Distribution

Recibido el 12 Mayo 2008Aceptado el 23 Agosto 2008

RESUMEN

Se reporta el hallazgo de Geastrum campestre, G.fornicatum y G. pectinatum en la zona central de Chile.Junto a la descripción e ilustraciones de estas especies,se comentan aspectos de su ecología, taxonomía ydistribución. G. campestre es nuevo para el catálogomicológico chileno.

ABSTRACT

Geastrum campestre, G. fornicatum, and G.pectinatum are reported from Central Chile. Descriptionsand illustrations of these species are provided withcomments on their ecology, taxonomy and distribution. G.campestre is new to Chile.

INTRODUCCION

Geastrum Pers. (Geastrales) es un génerocosmopolita de basidiomicetos gasteroides que crecen ensuelo o madera, y que según Hawksworth et al. (1995)incluiría unas 50 especies. Las fructificaciones de estegénero son inicialmente globoides o con forma de bulbo,y su peridio consta de dos capas, denominadas exo- yendoperidio. En la madurez el exoperidio se rasga desde elápice en forma estrellada, dejando ver el endoperidio, quelibera los propágulos a través de un ostíolo apical rodeadode un peristoma (Calonge, 1996, 1998). Pese al llamativoaspecto de sus carpóforos, por el cual son conocidos enotros países como «estrellas de tierra» o «earthstars»(Gerhardt et al., 2000; Bates, 2004), y a ser hongosrelativamente frecuentes en el centro y sur de Chile, lasespecies de Geastrum han sido aún poco estudiadas en elpaís (Montagne, 1850; Espinosa, 1917; Lazo, 1972, 2001).

El estudio taxonómico de basidiocarposrecolectados en Chile Central permitió identificar tresespecies de Geastrum, Geastrum campestre Morgan,Geastrum fornicatum (Huds.) Hook y Geastrumpectinatum Pers. En el presente trabajo, junto a ladescripción e ilustraciones de estas especies, se comentanaspectos sobre su ecología, taxonomía y distribución.

MATERIAL Y METODOS

Los carpóforos fueron recolectados desde suelo,en las localidades de Santiago (Región Metropolitana) yGuacarhue (VI Región). Para la observación de estructurasmicroscópicas de las especies estudiadas, se realizaronpreparaciones de la gleba en KOH 3% y lactofenol. Lasmedidas de las esporas incluyen la ornamentación. Lascolecciones se conservan en el herbario de la SecciónBotánica del Museo Nacional de Historia Natural de Chiley en el herbario particular del autor.

RESULTADOS Y DISCUSION

Geastrum campestre Morgan, Amer. Naturalist 21:1027. 1887 (Figuras 1 A-B)

Material estudiado: En suelo de un cerro, bajoAcacia caven (Mol.) Mol. Guacarhue, VI Región, Provinciade Cachapoal, Chile. 26-junio-2006. SGO153511.

Macroscopía: Carpóforos de 34-41 mm de diámetrox 14-16 mm de altura. Exoperidio rasgado en 7-9 rayoshigroscópicos. La capa micelial adhiere abundantes restosvegetales y tierra. Capa carnosa de color café, persistente,agrietada. Capa fibrosa blanquecina. Endoperidio de colorblanco sucio, globoide, sobre un corto pedicelo, áspero altacto, de superficie verrugosa al examinarlo bajo la lupa.Peristoma fuertemente surcado.

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Microscopía: Esporas globosas de 6-8 m dediámetro, verrugosas. Capilicio liso de 5-6 m de diámetro,amarillento pálido.

Observaciones: G. campestre se diferenciafácilmente del resto de las especies de Geastrum citadasde Chile por su endoperidio fuertemente verrugoso(Calonge, 1998; Lazo, 2001). En el material estudiado, elendoperidio se mostraba muy áspero en estado fresco,cuando los basidiomas aún estaban bien hidratados porla humedad del suelo y por gotas de rocío. Sin embargo,tras secar los basidiomas esta cualidad se hacía menosevidente al tacto.

La literatura consultada menciona un hongo muyparecido a G. campestre, llamado G.. pouzarii V.J. Staněk,conocido de Europa y Asia. Esta especie también poseerayos higroscópicos, peristoma surcado, endoperidioverrugoso y esporas fuertemente ornamentadas (Moreno& Ladó, 1984; Calonge, 1996; Esqueda et al., 2003). Calonge(1998) señaló que, por su similitud con G. campestre, G.pouzarii debería considerarse como una variedad de dichaespecie, para la cual propuso el nombre G. campestre var.pouzarii (V.J. Staněk) Calonge, caracterizada por susesporas algo menores (5-7 m diam.) y por la presencia defisuras radiales en la cara externa de la capa fibrosa. Otrasespecies (aún no reportadas de Chile), con las cuales G.campestre podría confundirse son G. berkeleyi Massee yG. kotlabae V.J. Staněk. A nivel macroscópico, G. berkeleyies muy similar a G. campestre, con endoperidio verrugosoy peristoma surcado, pero posee rayos no higroscópicos.Además sus esporas no superan los 7 m de diámetro(Calonge 1996; Bates, 2004). G. kotlabae tiene rayoshigroscópicos y peristoma surcado, pero el endoperidioes farinoso y sus esporas tampoco exceden los 7 m dediámetro (Calonge, 1998).

G. campestre se ha reportado previamente deEstados Unidos, México, Australia, Europa, Sudáfrica yBolivia (Bates, 2004; Rocabado et al., 2007). Esta especiecrece en el suelo, en áreas despejadas, en pastizales oentre la hojarasca, bajo especies de Acacia Mill., JuniperusL., Pinus L., Prosopis L. y Quercus L. (Smith, 1951; Jeppson,1987; Calonge et al., 1992; Moyersoen & Demoulin, 1996;Calonge, 1998; Bates, 2004). El material estudiado,recolectado de suelo bajo Acacia caven («espino»), unárbol autóctono de la zona central de Chile, constituye unnuevo registro para el catálogo micológico nacional.

Geastrum fornicatum (Huds.) Hook., Fl. Londinensis4: 575. 1821 (Figura 1 C)

Material estudiado: En suelo, entre la hojarasca deplanifolio no determinado. Santiago, Cerro San Cristóbal,Región Metropolitana, 4-octubre-2005. SGO153512.

Macroscopía: Carpóforos inicialmente globoide-deprimidos. En la madurez, los carpóforos abiertos alcanzan

39-54 mm de diámetro x 45-65 mm de altura. Exoperidiorasgado en 4 rayos no higroscópicos. La capa micelialforma en el suelo una estructura gruesa y resistente, similara una copa, que adhiere restos vegetales, tierra y piedre-cillas, sobre la cual se apoyan las puntas de los rayos de lacapa fibrosa. Capa fibrosa de color café, con restos secosde la capa carnosa adheridos a su superficie. Endoperidiode 13-18 mm de diámetro x 9-12 mm de altura, globoide, decolor gris a café oscuro, sobre un pedicelo de hasta 3 mmde longitud. Peristoma fimbriado, no delimitado.

Microscopía: Esporas de 4,3-5,8 m de diámetro,globosas, verrugosas, de color café. Capilicio de 4-11 mde diámetro, de color café, con paredes gruesas.

Observaciones: G. fornicatum se caracteriza porposeer carpóforos abovedados, peristoma fimbriado, maldelimitado o sin delimitar, capa micelial ciatiforme hipogeay esporas verrugosas (Calonge, 1984; Ochoa, 1993; Bates,2004; Leite et al., 2007). Es un hongo frecuente en el CerroSan Cristóbal, Santiago, donde fue observado en variasoportunidades entre los años 2005 y 2006.

En Chile se han reportado 2 especies de Geastrumcon fructificaciones abovedadas, G. fornicatum y G. jureiLazo, muy similares entre sí. De acuerdo a Lazo (1972, 2001),estos hongos pueden diferenciarse si se observan elendoperidio y el peristoma, siendo ambas estructurasconcoloras en Geastrum fornicatum, mientras que en G.jurei el peristoma es de color café grisáceo pálido y elendoperidio es café oscuro con tintes violáceos. Calonge(1998), en su monografía de hongos gasteroides ibéricos,menciona 2 especies adicionales, hasta el momento noreportadas de Chile, con las que podría confundirse G.fornicatum, éstas son G. welwitschii Mont. y G.quadrifidum Pers.:Pers. A diferencia de G. fornicatum, G.welwitschii posee una capa micelial ciatiforme epigea, queno adhiere restos del sustrato y tiene un rizomorfo biéndesarrollado. Por otra parte, G. quadrifidum se distinguede G. fornicatum por poseer un peristoma bien delimitado.

G. fornicatum es un taxón humícola que fructificabajo planifolios, tales como Quercus, Acacia y Prosopis(Ochoa, 1993; Calonge, 1998; Bates, 2004). En Chile, estehongo se distribuye por las zonas central y austral (Lazo,2001). G. fornicatum también se ha reportado de EstadosUnidos, México, Europa, Sudáfrica, Australia, Brasil yArgentina (Ochoa, 1993; Calonge, 1998; Bates, 2004; Leiteet al., 2007).

Geastrum pectinatum Pers. ex Pers., Syn.Meth. Fung.: 132.1801 (Figura 1 D-E)

Material estudiado: En suelo. Santiago, Cerro SanCristóbal, Región Metropolitana, 11-junio-2006. SGO153513.

Macroscopía: Carpóforos de 28-38 mm de diámetrox 14-32 mm de altura. Exoperidio abierto en 10-12 rayos no

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Notas sobre el género Geastrum Pers. en Chile Central - H. Madrid.

higroscópicos, recurvados. La capa micelial adhiereabundantes restos vegetales y tierra. Capa fibrosa de colorcafé, con la superficie interna parcialmente cubierta porrestos secos de la capa carnosa. Endoperidio globoide, de

color gris a beige, algo farinoso, de 10-13 mm de diámetrox 7-12 mm de altura, sobre un pedicelo de 1-2 mm de altura.Peristoma cónico, surcado. Apófisis estriada.

Microscopía: Esporas de 7- 8 m de diámetro,

Figura 1. Basidiocarpos de: A, B. Geastrum campestre; C. G. fornicatum, en distintas etapas de maduración; D, E. G.pectinatum. La flecha en E señala las típicas estrías en la apófisis que caracterizan a esta especie.

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Boletín Micológico Vol. 23 : 87 - 91 2008

globosas, de color café, fuertemente verrugosas. Capiliciode 5–6 m de diámetro, de color café claro, con paredesgruesas.Observaciones: G. pectinatum es un hongo fácil dereconocer en el campo, caracterizado por sus rayos nohigroscópicos, peristoma surcado y apófisis estriada(Breitenbach & Kränzlin, 1986; Martín, 1988; Castro et al.,1993; Baseia et al., 2003; Calonge et al., 2005). La presenciade estrías radiales en la apófisis permite diferenciar a G.pectinatum de especies similares, tales como G. striatumDC. y G. nanum Pers. (no reportadas de Chile) (Calonge,1998). Las dimensiones de las esporas muestran granvariabilidad en G. pectinatum. A modo de ejemplo se puedemencionar que Baseia et al. (2003) encontraron, en materialcolectado en Brasil, medidas esporales de 4-4,5 m,incluyendo la ornamentación, mientras que Breitenbach& Kränzlin (1986), en su monografía de hongos de Suiza,describen esporas de 4-6 m de diámetro, sin considerar laornamentación, compuesta por verrugas de hasta 1 m delongitud. El material chileno estudiado se acerca más a ladescripción dada por estos últimos autores.

G. pectinatum crece en suelo. Según Baseia et al.(2003), la distribución de esta especie abarca EstadosUnidos, México, Argentina, Brasil, Bélgica, Francia,España, Inglaterra, Noruega, Suecia, Islas Aland, Australia,Sudáfrica, El Congo y China. En Chile, Espinosa (1917)cita esta especie como Geaster pectinatus, sin precisar lalocalidad.

AGRADECIMIENTOSA las señoras Elizabeth Barrera, Mélica Muñoz e

Inés Meza, de la Sección Botánica del Museo Nacional deHistoria Natural de Chile, por las facilidades otorgadaspara el trabajo de laboratorio. Al Dr. Eduardo Piontelli, dela Facultad de Medicina de la Universidad de Valparaíso,por facilitar información sobre la distribución de especiesestudiadas. A la señorita Laura Clavijo, por su colaboracióntécnica. A los expertos que han revisado el manuscritooriginal, por sus valiosos comentarios.

REFERENCIAS

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CURSO

HONGOS EN ALIMENTOS Y AMBIENTES INTERNOS

Universidad de Valparaíso, Escuela de Medicina, Cátedrade Micología. Valparaíso. Chile 3-7 Agosto 2009Curso intensivo teórico práctico (41 horas), orientado aprofesionales que se desempeñan en el area de la micro-biología, para capacitar a profesionales (Ingenieros enalimentos, tecnólogos, biológos, químicos farmaceúticosu otros) en el manejo básico de la taxonomía fúngica a nivelde géneros y especies en hongos filamentosos.Contenidos del curso:Generalidades de los hongos, morfología, fisiología yecología. Sistemas reproductivos, tipos de propágulos de

dispersión, nociones de sistemática. Grupos taxonómicosa incluir: representates de los Mucorales, Eurotiales,Hypocreales, Sordariales y sus anamorfos asociados. Pa-trones de conidiogénesis, sistemática actual de los géne-ros Aspergillus, Penicillium y Fusarium. Métodos de cul-tivo.Laboratorio: Manejo de lupa estereoscópica para la ob-servación de colonias fúngicas en diferentes medios decultivo y ambientes (aire, vegetación, alimentos, suelo,etc.). Preparaciones microscópicas para la identificación anivel de género y especie en los medios específicos co-rrespondientes. El laboratorio abarca el 80% de las horasdel curso. Cupo: 20 personas.Inscripciones e informaciones: Fono 32-2507370, Fax 32-2507375, @mail: anamaria.carreno@uv.cl

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