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Revisin de Mtodos Espectroscpicosy elaboracin de curva estndar de protena

Hernndez Pando Daniel Alejandro; Lagar Quinto Frida; Lpez Eric; Casas Mara Fernanda!io"u#ica E$peri#ental %rupo& ' Fec(a& )* de +e,rero de -.)*

Resumen

Se realiz una curva estndar empleando el

mtodo de Lowry para la cuantificacin de

Albmina Srica Bovina (BSA) utilizando una

lon!itud de onda de "#$nm% &ara ello se

prepararon oc'o soluciones con diferentes

concentraciones de BSA y se aadieron los

reactivos A y B del mtodo de Lowry%

&osteriormente se re!istraron los valores de

absorbancia y se procedi a !raficarlos%

As mismo se midi la absorbancia de dos

muestras problema% *stos valores se

interpolaron en la curva estndar con el fin de

conocer su concentracin de BSA%

Palabras clave: +todo de Lowry BSAconcentracin espectrofotometra

Introduccin

La albmina es una protena presente en la

san!re ,ue es producida en el '!ado% Su

cuantificacin puede resultar til para al!unos

aspectos relacionados con la salud% *n este

traba-o se utilizar Albmina Srica Bovina

(BSA por sus si!las en in!ls) para la

determinacin de la cantidad de dic'a protena

en dos muestras problemas%

*.isten diversas metodolo!as para determinar

la presencia de protenas en una solucin% *l

mtodo de Lowry (/0#/) es un mtodo

colorimtrico de valoracin cuantitativa de las

protenas% A la muestra se aade un reactivo

,ue forma un comple-o coloreado con las

protenas siendo la intensidad de color

proporcional a la concentracin de protenas

se!n la ley de Lambert1Beer A2 3%l%c%

*ste mtodo consta de dos etapas4 /) Los

iones 5u67 en medio alcalino de la solucin

cabonato1tartrato1cobre (reactivo A) se unen a

las protenas formando comple-os con los

tomos de nitr!eno de los enlaces peptdicos%

*stos comple-os 5u671protena tienen un color

azul claro% Adems provocan el

desdoblamiento de la estructura tridimensional

de la protena e.ponindose los residuos

fenlicos de tirosina ,ue van a participar en la

se!unda etapa de la reaccin% *l 5u67 se

mantiene en solucin alcalina en forma de su

comple-o con tartrato% 6) La reduccin tambin

en medio bsico del reactivo de 8olin1

5iocalteau (reactivo B) por los !rupos fenlicos

de los residuos de tirosina y el triptofano

presentes en la mayora de las protenas

actuando el cobre como catalizador% *l principal

constituyente del reactivo de 8olin15iocalteau

es el cido fosfomolibdotn!stico de color

amarillo ,ue al ser reducido por los !rupos

fenlicos da lu!ar a un comple-o de color azul

intenso% (/6)

9ado ,ue el mtodo a emplear es un mtodo

,ue mide la absorbancia de una sustanciacolorida se utiliza un espectrofotmetro como

instrumento de medicin% 9e acuerdo con la ley

de Lambert1Beer las mediciones realizadas

!uardan una correlacion con la concentracin

de las soluciones por lo ,ue se debe realizar

una cuerva estndar% :na curva estndar ,ue

es una !rfica de referencia construida a partir

de concentraciones conocidas de una

sustancia ,ue se utiliza para determinar la

cantidad de esta sustancia presente en una

muestra inc!nita (;)%

5onociendo las bases de este mtodo

buscaremos comprobar la relacin proporcional

,ue e.iste entre las concentraciones y la

absorbancia para posteriormente poder usar

esa curva como referencia a una absorbancia

pero sin conocer la concentracin% tubos a

distintas concentraciones siendo el tubo / con

concentracin $ de BSA y se fueron aadiendo

# ?L ms a cada tubo de manera ascendente

siendo el tubo > con ;#?L de BSA% *l volumen

de a!ua inicial fue de @#$ ?L y se fue

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disminuyendo en #?L por tubo para asi tener el

mismo volumen en todos los tubos%

&osteriormente se aadi reactivo A de Lowry

(#$$?L) y se mezclo para despus aadir

6#$?L de reactivo B% Se incub por ;$ minutos

y se procedi a leer en el espectrofotmetro

usando el tubo / como blanco y a una lon!itud

de onda de "#$nm%

&ara finalizar se midi la muestra problema a

dos volmenes distintos (6# y #$ ?L) para

despus analizar los datos%

Resultados

Los resultados obtenidos de manera

e.perimental al !raficar la concentracin de

BSA contra la absorbancia re!istrada con el

espectrofotmetro a "#$nm se muestran en la

!rfica si!uiente (8i!%/)% *n ella podemos

observar con claridad ,ue no se si!ue una

relacin lineal entre la concentracin y la

absorbancia% ncluso es posible ver al!unos

puntos ,ue ,uedan fuera de la tendencia de la!rfica%

0 5 10 15 20 250

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Concentracion (mg/m

Absorbancia

Sin embar!o se detect una variacin en los

reactivos ,ue podra 'aber causado las

fluctuaciones obtenidas en la !rfica ori!inal%

9ado ,ue las soluciones con /$ y ;# m!=ml

BSA fueron a,uellas en las ,ue vari el reactivo

se procedi a !raficar estas absorbancias en

una curva independiente de las otras seis

soluciones de BSA (8i!%6)%

0 5 10 15 20 25 30 35

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

f(x) = 0.02xR = 1

Concentracin (mg/mL)

Absorbancia

&or otra parte se !raficaron las soluciones conlos reactivos iniciales (8i!%;) para observar sutendencia y poder discriminar entre las doscurvas obtenidas%

Fig. 1. Relacin entre la concentracin de BSA y laabsorbancia. La grca muestra toos !os "u#tos o$te#%osex"er%me#ta!me#te e# co#&u#to.Las co#ce#trac%o#es e 10 '35 mgmL uea# fuera e !a grca* !e&os e !os ems

Fig. 2. Relacin entre la concentracin de BSA y laabsorbancia con reactivo A distinto. Los "u#tos ue sa!,a#e !a te#e#c%a e# !a -%g.1 se gracaro# "or se"arao* 'a uefuero# o$te#%as $a&o co#%c%o#es ex"er%me#ta!es %st%#tas. eo$ser+a ue e#tre estos "u#tos se guara u#a $ue#acorre!ac%/# ' muestra# u#a te#e#c%a omog#ea ' co#sta#te.

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0 5 10 15 20 20

0.02

0.04

0.06

0.080.1

0.12

0.14

f(x) = 0x

R = 1

Concentracin (mg/m

Absorbancia

*n las !rficas de las fi!uras ; y @ podemos

observar un comportamiento bastante

aceptable y constante% &ero como referencia se

muestra una !rfica terica obtenida a partir

de los datos proporcionados por la profesora

(8i!% @)%

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.20.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8f(x) = 0.02xR = 0.

Concentracin (g/

Absorbancia

Las absorbancias obtenidas en las muestras

problema se muestran a continuacin (8i!%#)%

&ara la muestra A la absorbancia fue de $%66

mientras ,ue para la muestra B fue de $%@;%

&ara obtener la concentracin de BSA

contenida en dic'as muestras se interpol en la

!rfica de la 8i!%6 a partirde la !rfica obtenidamediante la re!resin lineal a-ustada a cero%

0 5 10 15 20 25 30 35 400

0.1

0.2

0.3

0.4

0.50.6

0.7

0.8

0.43

0.22

f(x) = 0.02x

R = 1

Concentracin (mg/mL)

Absorbancia

Discusin

*n base a los datos obtenidos de manera

e.perimental se realiz la primera !rfica ,ue

se observa en la fi!ura /% *n ella se aprecia

bastante inconsistencia en la tendencia de los

datos% *sto fue debido al uso de reactivos A

preparados en distintos momentos y ba-o

distintas condiciones los cuales muy

se!uramente se encontraban a una

concentracin distinta% ecordemos pues ,ue

el reactivo A es la Solucin de carbonato1

tartrato1cobre la cual le da la coloracin inicial

a la solucin con BSA debido a los comple-os

,ue el in 5u67 forma con las protenas% Si el

Fig. !. Relacin entre la concentracin de BSA y laabsorbancia con reactivo A original. Las so!uc%o#estrataas co# !os react%+os or%g%#a!es se gracaro# tam$%#.$ser+amos u#a $ue#a corre!ac%/# e#tre !os +a!oreso$te#%os ' u#a te#e#c%a #o ta# omog#ea ' co#sta#te. !

Fig. ". Relacin entre la concentracin de BSA y laabsorbancia con datos tericos. La grca muestra !ate#e#c%a e !os +a!ores te/r%cos "ro"orc%o#aos "or !a"rofesora. e o$ser+a u#a te#e#c%a s%m%!ar a !a ue a' e# !as

Fig. #. $nter%olacin de las m&estras %roblemmuestras "ro$!ema ' * cu'as a$sor$a#c%as fuero# 0.43 res"ect%+ame#te* se %#ter"o!aro# e# !a grca cu'est escr%ta "or !a ecuac%/# '= 0.0208 x.co#ce#trac%o#es o$te#%as me%a#te este tratam%e#to10.5762308 ' 20.6730762 mgmL.

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reactivo estuviera menos concentrado 'abra

menos iones 5u disponibles y se vera una

coloracin an ms tenue de lo 'abitual y aun

a!re!ando el reactivo B no se alcanzara a

observar la intensidad de azul

correspondiente% *n la !rfica de la fi!ura ;

observamos este comportamiento ya ,ue las

absorbancias re!istradas van entre $ a $%/@ es

decir son valores muy pe,ueos% Las muestras

problema A y B arro-aron valores de

absorbancia superiores a este ran!o por lo ,ue

no pueden ser interpoladas en la !rfica ;%

+ientras ,ue la !rfica de la fi!ura 6 muestra

mayor con!ruencia con las lecturas de

absorbancia de las muestras problema% *sta

!rfica fue elaborada a partir de datos ,ue se

obtuvieron con una se!unda versin del

reactivo A% Las absorbancias re!istradas para

esta !rafica fueron superiores a las de la

!rfica ; e incluso se poda notar visualmente

,ue la intensidad del color azul las solucionespreparadas con este reactivo era superior con

respecto a las soluciones preparadas con el

reactivo ori!inal% *n el caso particular del

e,uipo por errores de pipeteado el tubo cuya

concentracin deba ser de /$ m!=mL tena un

volumen distinto a todos los dems por lo ,ue

se tuvo ,ue repetir% +ientras tanto el reactivo A

se termin y no fue suficiente para la ltima

solucin% *s por ello ,ue las soluciones con /$

y ;# m!=mL fueron preparadas con el se!undo

reactivo A y fueron utilizadas para realizar la

curva patrn dentro de la cual si es posible

interpolar las absorbancias de las muestras A y

B% Si se comparan las !rficas de las fi!uras 6

y @ se observa ,ue ambas tienen un intervalo

de absorbancias similares por lo ,ue la curva

realizada con datos tericos respalda la curva

utilizada para calcular las concentraciones de

las muestras problema%

Bibliora!a

/%C%D% Lowry E%F% osebrou!' A%L% 8arr y

%F% andall% F% Biol% 5'em% /0;4 6G#16"#

(/0#/)6%Snc'ez S% Material de apo/o para los

alu#nos de !io"u#ica E$peri#ental%

(6$/;) 8acultad de Humica :EA+%&a!s%/$ y//

3.5urva de calibracin de protenas totales%

ecuperado de

'ttp4==traba-osmedicos%blo!spot%m.=6$//=

$>=curva1de1calibracion1de1proteinas%'tml

5onsultado el4 /@ de febrero de 6$/G