UNIVERSIDAD AUTÓNOMA

DE

GUADALAJARA.

BIOLOGIA MOLECULAR.M.C. MARCELA DE LA MORA AMUTIO.

CYNTHIA STEPHANIA DOMÍNGUEZ PEÑA.

6TO. ING. EN BIOTECNOLOGÍA.

FECHA DE REALIZACIÓN:

MARTES 28 DE JULIO DE 2015

ZAPOPAN JALISCO. A LUNES 03 DE AGOSTO DE 2015.

PRÁCTICA NO. 3: ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

PRÁCTICA NO. 3: ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.

OBJETIVO.

Analizar la integridad y movilidad electroforética del ADN en geles de agarosa. Aprender a visualizar el extracto de ADN. Aprender a cuantificar ADN por comparación con un marcador de tamaño

molecular.

La electroforesis en gel es una herramienta que se utiliza de manera rutinaria en la investigación científica.

PRELABORATORIO.

En términos generales cuando se unen dos monómeros para la formación de un enlace y se desprende una molécula de agua, se habla de una reacción  de condensación. Si la reacción ocurre al contrario, esto es, que se rompe el enlace con la adición de una molécula de agua y se regeneran los monómeros originales se habla de reacciones de hidrólisis. Los organismos vivos juegan con reacciones de hidrolisis (digestión) y condensación (síntesis) para la construcción de sus macromoléculas. Los tipos principales de macromoléculas son las proteínas, formadas por cadenas lineales de aminoácidos; los ácidos nucleicos, DNA y RNA, formados por bases nucleotídicas (purinas y pirimidinas), los polisacáridos, formados por subunidades de azúcares y los lípidos formados por glicerol, ácidos grasos o colesterol. Los aminoácidos de las proteínas están unidos por enlaces peptídicos, los carbohidratos de los polisacáridos por enlaces glucosídicos o peptídicos y los lípidos y ácidos nucleicos por enlaces éster.

El ADN es un largo polímero formado por unidades repetitivas, los nucleótidos. Una doble cadena de ADN mide de 22 a 26 angstroms (2,2 a 2,6 nanómetros) de ancho, y una unidad (un nucleótido) mide 3,3 Å (0,33 nm) de largo. Aunque cada unidad individual que se repite es muy pequeña, los polímeros de ADN pueden ser moléculas enormes que contienen millones de nucleótidos. Por ejemplo, el cromosoma humano más largo, el cromosoma número 1, tiene aproximadamente 220 millones de pares de bases. En los organismos vivos, el ADN no suele existir como una molécula individual, sino como una pareja de moléculas estrechamente asociadas. Las dos cadenas de ADN se enroscan sobre sí mismas formando una especie de escalera de caracol, denominada doble hélice. Cada unidad que se repite, el nucleótido, contiene un segmento de la estructura de soporte (azúcar + fosfato), que mantiene la cadena unida, y una base, que interacciona con la otra cadena de ADN en la hélice. En general, una base ligada a un azúcar se denomina nucleósido y una base ligada a un azúcar y a uno o más grupos fosfatos reciben el nombre de nucleótido. Cuando muchos nucleótidos se encuentran unidos, como ocurre en el ADN, el polímero resultante se denomina poli nucleótido

Los polinucleótidos de DNA y RNA son hidrófilos debido a que se pueden formar puentes de hidrógeno entre el agua y los fosfatos, o el agua y los OH de la pentosa. Por

tanto, son más solubles que las bases que los forman. A pH fisiológico, los grupos fosfato presentan dos cargas negativas (el pK más alto es 6), por lo que los polinucleótidos son de naturaleza ácida. Debido a que los polinucleótidos son moléculas muy largas en relación a su diámetro, proporcionan soluciones viscosas. Químicamente son muy estables, especialmente en el caso del DNA por carecer del 2’-OH. Es precisamente este radical el que proporciona las principales diferencias entre ambos ácidos nucleicos, además de ser el principal responsable de la actividad catalítica de las ribozimas.

Una base nitrogenada, que se une al C1 del azúcar, puede ser: Purinas: adenina o guanina. Pirimidinas: timina, citosina o uracilo.

Un azúcar, que puede ser: Ribosa: en el ARN. Desoxirribosa: en el ADN.

Grupo fosfato que se une al C5 de su azúcar y al C3 del siguiente, pueden ser uno dos o tres grupos.

Fuerzas que mantienen la estructura.

1. Primero tenemos los puentes de H que son muy numerosos, debido a que se dan entre los pares de bases de los distintos nucleótidos que se van uniendo; son fuerzas débiles, que ayudan a mantener la estructura de doble hélice de la molécula, pero interaccionan de forma distinta dependiendo de las bases que se unan; mientras entre la unión A-T, se dan dos puentes de H2, entre C-G se dan tres uniones por puente de H2, por lo tanto las regiones ricas en C-G, están más fuertemente unidas.2. Como segunda fuerza de unión se encuentran las fuerzas de Van der Waals, que se dan entre cada peldaño de la hélice, gracias a que los P están cargados negativamente.3. También ayuda a la estabilidad de la estructura, que las bases sean hidrófobas, lo cual favorece la cohesión, ya que excluye a las moléculas de agua de su interior. Además los P- se estabilizan con iones + de la solución acuosa que impiden la repulsión entre estos P-.

Propiedades fisicoquímicas.

Desnaturalización: capacidad que posee la molécula de separar sus dos cadenas. Para seguir esta desnaturalización los anillos de las bases son capaces de absorber una longitud de onda de 260nm, absorbiéndose menos si las bases están hacia fuera, no unidas; se mide con la absorbancia, obteniéndose la curva de desnaturalización. La Tª de fusión indica la Tª a la que la mitad de las moléculas están desnaturalizadas. El proceso: se aplica calor a la molécula y se mide la absorbancia a 260nm, progresivamente se va aumentando la Tª hasta llegar al punto medio, que será en el que se da la Tª de fusión. Si la Tª de fusión es alta significa que hay más enlaces del tipo C-G y si es baja que existe menos enlaces de este tipo; por lo que conseguiremos saber él % del enlace C-G.

Reabsorción: emparejamiento de las cadenas tras quitar el calor al que son sometidas para la desnaturalización.

Hibridación: emparejamiento entre cadenas complementarias de origen diferente.

Luego de la extracción del ADN, son necesarias la cuantificación y el análisis de la calidad de las moléculas obtenidas.

Uno de los métodos más utilizados para la cuantificación del ADN es el análisis de la absorción UV, ya que los nucleótidos poseen máximos de absorción alrededor de 260 nm (por ejemplo, dATP: 259 nm; dCTP: 272 nm; dTTP: 247 nm). Este método proporciona una estimación simple y precisa de la concentración de una muestra, pero sólo si ésta se encuentra pura, sin contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a longitudes de onda cercanas. Para evaluar la pureza de la muestra debe determinarse la proporción OD 260nm/OD 280nm. Si la relación es mayor a 1,6 puede estimarse que la muestra es lo bastante pura para confiar en la cuantificación espectrofotométrica.

La calidad de las moléculas extraídas se analiza por electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polisacárido altamente purificado derivado del agar. Se utiliza para separar macromoléculas tales como ácidos nucleicos y grandes complejos proteicos. Tienen un menor poder de resolución que la poliacrilamida pero una gran rango de separación, tal que pueden ser separadas moléculas de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50.000 pb (variando las concentraciones de agarosa). El tamaño del poro del gel puede ser predeterminado ajustando su concentración en el gel; entonces a mayor concentración menor tamaño de poro. El rango de trabajo es aproximadamente entre 0,7% y 2% p/v. Con un gel 0,7% se obtiene una buena separación (resolución) de grandes fragmentos de ADN (5–10kb) y con uno 2% se resuelven mejor los fragmentos pequeños (0.2–1kb). Hay que tener en cuenta que los geles de bajo porcentaje son muy frágiles y se pueden romper al intentar levantarlas, y los de alto porcentaje suelen opacarse mucho, disminuyendo la visibilidad de las bandas. En líneas generales, 1% es una concentración estándar.

El ADN esta homogéneamente cargada de forma negativa a pH neutro, por lo que la relación carga: masa es constante. Su velocidad de migración del ADN en la matriz de agarosa está determinada por una serie de parámetros:

» Tamaño del ADN

» Concentración de agarosa

» Conformación del ADN. Las distintas conformaciones de las moléculas de ADN circular del mismo peso molecular migran a distinta velocidad: de mayor a menor velocidad, superenrollado circular, lineal y circular relajado.

» Voltaje aplicado. A bajo voltaje la velocidad de migración de un fragmento lineal de ADN es proporcional al voltaje aplicado, así el rango efectivo de separación decrece a medida que el voltaje se incrementa.

» Presencia de colorante intercalante. El Bromuro de Etidio o Sybr green reduce la movilidad electroforética del ADN lineal ya que el intercalante se introduce entre las bases, extendiendo la longitud del ADN lineal o nicked haciéndolo más rígido.

Para preparar un gel de agarosa, se pesa el polvo de agarosa y se disuelve en el buffer (TBE 0,5X) en un recipiente de vidrio. Para fundir la agarosa se necesita calentar la mezcla, lo que generalmente se realiza con unos segundos en el microondas. Es importante dejar enfriar un poco la preparación (hasta que podamos mantener el recipiente en la mano sin quemarnos) antes de verterla en la cuba ya que ésta es de plástico, y si el líquido está muy caliente puede romperla. Finalmente se coloca el peine para generar las calles, y se deja enfriar completamente.

INTRODUCCIÓN.

Prácticamente todos los protocolos en biología molecular requieren, en algún momento, el fraccionamiento de los ácidos nucleicos. Existen técnicas cromatográficas que son apropiadas para algunas aplicaciones, por ejemplo la separación entre ácidos nucleicos de cadena doble y de cadena sencilla, o bien para la separación de plásmidos del ADN cromosomal o en la separación de ADN cromosomal de restos celulares. Sin embargo, la electroforesis en gel es una técnica con mayor resolución que cualquier método alternativo y es el método de fraccionamiento utilizado rutinariamente en el laboratorio de biología molecular. Las separaciones electroforéticas pueden ser analíticas o preparativas y permiten la resolución de fragmentos en un rango de <1,000 Daltones a >108 Daltones.

En general, el uso de electroforesis para separar ácidos nucleicos es una técnica muy sencilla. Los ácidos nucleicos están cargados de manera uniforme negativamente, además de que el ADN de doble cadena se encuentra razonablemente libre de complicaciones estructurales que puedan afectar su movilidad. Sin embargo, existen ciertas variables que afectan la migración de los ácidos nucleicos en un gel. Éstas incluyen la conformación y el tamaño de los ácidos nucleicos, el tamaño de poro del gel, el gradiente de voltaje aplicado y la concentración de sales en el buffer que se utiliza. La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de ADN que se quiera visualizar. Para fragmentos de gran tamaño, como el del ADN genómico, deben trabajarse con concentraciones del 0.8%. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles al 2% o 2.5%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados más rápido corren las muestras.

Buffer de electroforesis. La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE) o tris-borato (TBE) El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente, en la actualidad prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se practican utilizando esta concentración.

El empleo del TBE como buffer de electroforesis es particularmente útil para discriminar a pequeños fragmentos de DNA (<500 bp) en geles de agarosa (en comparación al TAE). En términos generales los fragmentos grandes (>20 kbp) de DNA tienden a migrar más rápido en el TAE que en el TBE, mientras que los fragmentos pequeños (<300 bp) migran más rápido en el TBE que en el TAE. Esta capacidad discriminatoria ha llevado a establecer parámetros optimizados para la discriminación de fragmentos en base a su tamaño. Así pues, la mejor discriminación de fragmentos de entre 100 y 500 bp de DNA se logra con geles de agarosa al 2% empleando TBE como buffer, mientras que los fragmentos de entre 900 y 2000 bp son mejor separados con geles de agarosa al 0.8% empleando TAE como buffer de electroforesis.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

REACTIVOS MATERIALES.Agua. Microtubos de 1.5 ml y 0.5 ml

Buffer TBE 10 X Vasos de precipitado para diluir.Solución de carga de geles (6X LD) Guantes.

Marcador de peso molecular. Parafilm.

Muestras de ADN. Juego de micropipetas.Solución colorante de ADN (Gel

Red).Puntas.

Agarosa.

EQUIPOS.Horno de microondas.

Cámara de electroforesis.Fuente de poder.

Soporte para geles.Peine para pozos.Transiluminador.

Lentes de seguridad contra luz UV.Balanza analítica.

PROCEDIMIENTO.

Preparación de buffer TBE 1X.

1. Tomar como base un buffer TBE 10X preparado previamente como se indica en el apéndice.

2. Tomar 35 ml de TBE 10X y diluirlo con 350 ml de agua destilada.

Preparación de gel de agarosa para ADN genómico 1% (p/v).

3. Pesar 0.5g de agarosa y agregar 50 ml de buffer TBE 1X 4. Calentar en microondas por lapsos de 15 segundos (agitando) hasta que la agarosa se disuelva evitando que hierva. 5. Enfriar hasta aproximadamente 50°C.6. Vaciar la agarosa sobre su molde bien nivelado evitando la formación de burbujas y colocar el peine para hacer los pozos. 7. Dejar solidificando aproximadamente 30 minutos. Corrida de las muestras.

8. Una vez que ha solidificado el gel, retirar el peine y transferir el gel de la base a la cámara, la cual debe tener suficiente buffer TBE 1X como para cubrir el gel ~ 1 mm. 9. En un cuadrito de parafilm agregar 4 µl de muestra de ADN, 4 µl de azul 6X LD (preparado según se indica en el apéndice) y 1 µl de GelRed. Mezclar bien con la pipeta.

10. Colocar los 9 µl de mezcla en un pozo del gel cuidando de no perforar el pozo con la punta de la pipeta. 11. Conectar la cámara de electroforesis, el cable y la fuente de poder. Unir los electrodos positivos (rojos) y por separado los negativos (negros). 10. Encender la fuente de poder y seleccionar un voltaje de 100 volts. Cuando el equipo funciona correctamente se producen burbujas que son visibles (electrólisis). Las muestras de ADN deben dirigirse hacia el electrodo positivo. El ADN migra del cátodo (polo negativo, cable negro) al ánodo (polo positivo, cable rojo). 12. Correr la electroforesis 45 min.13. Apagar la cámara y visualizar el gel en el fotodocumentador.

OBSERVACIONES.

No fue colocado un marcador (estándar para comparar pesos moleculares). La concentración de agarosa en el gel es inversamente proporcional al tamaño del

ADN. El voltaje es inversamente proporcional al tiempo de corrida. Para saber que las muestras está corriendo correctamente (hay corriente y carga), se

tienen que notar en la cámara burbujas que indiquen electrólisis. La carga depende de: tamaño del gel, distancia de un polo a otro, marcadores de

peso molecular. Se recomiendan 5-8 voltios por cm de gel. El gel que se fabricó tenía 10 pozos. Las concentraciones de buffer y gel deben estar en equilibrio. Las utilizadas en esta

práctica estaban al 1%. Debe tenerse cuidado de no enfriar de más el gel antes de vaciar, porque en ese caso

al vaciar su forma física seria irregular. Los geles se pueden reciclar: pozos sin usar, discriminar los usados; partirlo en

pedazos y derretirlo; al prepararlo cortarlo en pedazos. Siempre cuidar de no revolver diferentes concentraciones de gel en el caso del derretimiento.

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CORRIMIENTO DE LAS BANDAS.

Concentración de buffer en el gel y en el buffer de corrida. Debe haber concordancia.

Sales. Es importante mantener la cámara limpia y enjuagar con agua des ionizada para evitar interferencias por sales.

Exceso de voltaje. ADN corre – a + por cargas. Rojo (+), Negro (-)

Corrida del gel.Muestra/ pozo. Observación

1 ADN bacteriano. Brillite. Hay una sobreexpresión. La cantidad de ADN extraído es significativamente alta. Se cargó demasiada cantidad de DNA.

2 ADN humano. Brillite. Se observó un barrido de bandas. La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel eran insuficientes. La calidad del mismo no es buena puede que se haya degradado ligeramente.

3 ADN bacteriano. Oscar. La banda está perfectamente definida. La cantidad de ADN es ideal para una identificación. Muestra buena para análisis posteriores.

4 ADN humano. Oscar. Se observó un barrido de bandas. La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel eran insuficientes. La calidad del mismo no es buena puede que se haya degradado ligeramente.

5 ADN humano. Cynthia. Se observó un barrido de bandas. La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel eran insuficientes. La calidad del mismo no es buena puede que se haya degradado ligeramente.

6 ADN humano. Israel. Se observó un barrido de bandas. La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel eran insuficientes. La calidad del mismo no es buena puede que se haya degradado ligeramente.

7 ADN bacteriano. Israel. La banda está perfectamente definida. La cantidad de ADN es ideal para una identificación. Muestra buena para análisis posteriores.

8 ADN humano. Luttmann. No se realizó una correcta extracción, sin rastro de muestra. Puede también que el ADN se haya desnaturalizado.

9 ADN bacteriano. Cynthia. Hay una sobreexpresión. La cantidad de ADN extraído es significativamente alta. Se cargó demasiada cantidad de DNA.

10 ADN humano. Luttmann. La banda está perfectamente definida. La cantidad de ADN es ideal para una identificación. Muestra buena para análisis posteriores.

CUESTIONARIO.

¿Cuáles son los buffers más utilizados en electroforesis de ácidos nucleicos?

Buffer Tris, Ácido acético, EDTA (TAE) y Tris, Ácido bórico, EDTA (TBE).

El TAE es el buffer más comúnmente empleado para la separación de fragmentos de DNA por electroforesis. Sus aplicaciones electroforéticas incluyen al análisis de productos de PCR, protocolos de purificación de DNA y experimentos de clonación de DNA. Este buffer posee una fuerza iónica baja al igual que una pobre capacidad de amortiguación de pH.

¿Por qué se utilizan buffers y no se usa agua?

El ADN tiene una carga eléctrica negativa que proviene específicamente de los fosfatos en la parte de azúcar-fosfato de la cadena de ADN. Un ácido tiende  a donar un catión hidrógeno (H+) a otro compuesto (denominado base). En el buffer, específicamente el TRIS funciona cómo tamponante que mantiene el PH de la solución estable, algo muy importante porque si el nivel de acidez aumenta se puede desnaturalizar el ADN. Además que el ADN es soluble en ácido y el RNA en base.

El agua no es reguladora de pH por tanto si está en solución con el ADN esta tiende a acidificarse.

¿Qué función tiene cada ingrediente de los buffers TAE y TBE?

BUFFER TAEINGREDIENTE. FUNCIÓN.TRIS. Agente tamponante que mantiene el pH. Ácido acético. Contribuye a ajustar el pH deseado e

igualmente a mantenerlo.Na2EDTA ∙2H 2O Dado que el Mg2+ es un cofactor

requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

d H2O Solubilizar y diluir los componentes para formar la solución.

BUFFER TBEINGREDIENTE. FUNCIÓN.TRIS. Agente tamponante que mantiene el pH. Ácido bórico. Contribuye a ajustar el pH deseado e

igualmente a mantenerlo.0.5 M. EDTA, PH 8. Dado que el Mg2+ es un cofactor

requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

d H2O Solubilizas y diluir los componentes para formar la solución.

Ventajas y desventajas de cada buffer.

– Migración: los fragmentos grandes (>20 kbp) de DNA tienden a migrar más rápido en el TAE que en el TBE, mientras que los fragmentos pequeños (<300 bp) migran más rápido en el TBE que en el TAE. Así pues, la mejor discriminación de fragmentos de entre 100 y 500 bp de DNA se logra con geles de agarosa al 2% empleando TBE como buffer, mientras que los fragmentos de entre 900 y 2000 bp son mejor separados con geles de agarosa al 0.8% empleando TAE como buffer de electroforesis.

– Capacidad tamponante: el TBE es más estable y tiene una capacidad tampón más alta que el TAE.

– Reciclaje: el TAE no aguanta más de 3 corridas de electroforesis seguidas sin alterar sus propiedades, mientras que el TBE dura 3 o 4 días independientemente de las corridas de electroforesis realizadas.

– Recuperación del ADN: el TBE tiene una interacción pegajosa con la agarosa, lo que provoca una recuperación baja del ADN.

CONCLUSIÓN.

La electroforesis en geles de agarosa es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ácidos nucleicos en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción (GelRed), y de esta forma determinar el contenido de ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración e integridad.

En esta ocasión analizamos muestras de ADN humano y bacteriano, obteniendo los mejores resultados con el segundo, al utilizar kit el método es bastante sencillo pero se debe tener mucha precaución en el manejo de reactivos y la muestra ya que son muy sensibles, y al tratarse de un análisis de ADN que posteriormente puede servir para una identificación los resultados deben ser muy confiables y verídicos.

Es muy claro que se deben conocer las características físicas de las moléculas para producir métodos y materiales que nos ayuden a su estudio.

Aprendí los pasos y el fundamento necesarios para llevar a cabo una electroforesis de ADN en geles de agarosa.

APÉNDICE.

I. PREPARACIÓN DE BUFFER TAE Y TBE.

Procedimiento:

1. Preparar 100 mL de Ácido Clorhídrico 1M (1M HCl) agregando 8.62 mL de HCl concentrado a 91 mL de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. ¡No agregar el agua al ácido! Mezcle en una plancha agitadora magnética durante 5 minutos. Afore a 100 mL con dH20.

2. Preparar 100 mL de Hidróxido de Sodio 10M (10M NaOH) agregando 40 g de NaOH a 40 mL de dH20 previamente colocados en un vaso de precipitados de 250 mL. Mezcle con una barra magnética en una plancha agitadora hasta que el NaOH se haya disuelto por completo. Afore a 100 mL con dH20. ¡Precaución, esta reacción es exotérmica!

3. Para TBE, preparar 0.5 M EDTA pH 8.0 disolviendo 186.1 g de Na2EDTA-2H2O en 700 ml de dH20, ajustando el pH a 8.0 (de lo contrario no será posible disolver al EDTA) por medio de 10 M NaOH (~50 ml), afore a 1 L con dH20.

4. Añadir las sales a un vaso de precipitados adecuado para el volumen de la solución por preparar. De acuerdo a la Tabla de Preparación mostrada a continuación.

5. Añadir el 80% del volumen de dH20 requerido y mezcle encima del agitador magnético hasta diluir las sales.

6. En el caso de soluciones TAE 1X, ajuste el pH a 7.6 con 1M HCl o 10M NaOH (según sea necesario) empleando para ello una pipeta de transferencia de plástico limpia (ver nota #2). Monitoree continuamente el pH con el potenciómetro mientras se añaden las soluciones de HCl o NaOH gota a gota.

7. Aforar la solución con dH20 al volumen final requerido.

8. Almacene a temperatura ambiente.

9. Para preparar una solución 1X, mezclar 1 volumen de TBE/TAE 10X con 9 volúmenes de agua y agítese bien.

Notas:1. Limpiar perfectamente bien la balanza con la brocha para evitar el acarreo de contaminantes y la corrosión de la balanza o de las superficies de acero inoxidable.

2. El Tris (hidroximetil) aminometano también es conocido por los nombres de tris, TRIS, tris base, trizma, trisamina, THAM, trometamina, trometamol y trometano. Tris-HCl hace referencia a la solución de tris cuyo pH ha sido manipulado o modificado con HCl. El pH de las soluciones amortiguadoras a base de Tris cambia significativamente con la temperatura, disminuyendo aproximadamente 0.028 unidades de por cada °C por encima de 25°C. Por ello es necesario ajustar el pH ante fluctuaciones extremas de temperatura operacional. Como el pKa del Tris es de 8.08, este no debe usarse para soluciones amortiguadoras con rangos operacionales por debajo de pH 7.0 o por encima de pH 9.0.

3. Las soluciones 10X de TAE poseen un pH ~8.5 que se corrige automáticamente a pH 7.5 una vez llevadas a 1X. Por ello en el caso de las soluciones 10X, no es necesario ajustar el pH.

4. La vida media de anaquel para soluciones 1X o 10X de TAE y TBE oscila entre 6 y 24 meses a temperatura ambiente.

II. FORMULACIÓN DE BUFFER TBE Y GEL AMORTIGUADOR DE CARGA.

Buffer para electroforesis TBE

Solución stock 10X: Tris base 108 g Ácido bórico 55g EDTA 0.5M, pH 8.0 40 ml H2O aforar a 1000 mL

Solución de trabajo 1X: Tris base 89mM Ácido bórico 89 mM

EDTA 2mM

Gel-amortiguador de carga (Loading buffer gel) 10X

Tris-HCl (pH 7.6) 10 mM Azul de Bromophenol 0.03% Xylene cyanol FF 0.03% Glicerol 60% EDTA 60 mM

BIBLIOGRAFÍA.

1. Current Protocols in Molecular Biology, Appendix 2, A.2.5, Supplement 40, Frederick M. Ausubel et al. 2003.

2. TBE, or not TBE; that is the question: Beneficial usage of tris-borate for obtaining a higher resolution of small DNA fragments by agarose gel electrophoresis. Yutaka Miura et al, Nagoya Medical Journal 43(1) 1-6, 1999.

3. Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. Ediciones IVIC.

4. TP5: Cuantificación de ADN y electroforesis en gel de agarosa. Universidad Nacional de Quilmes. https://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp5.pdf.

5. Reactivos empleados en la electroforesis de ADN y proteinas. http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/reactivos/reactivos.htm