Calidad microbiológica de jugos de uva concentrados

Mendoza, 25 de abril de 2013

Microbiol. María Cecilia Rojo (Becaria CONICET)Dra. Mariana Combina (Directora INTA-CONICET)Dra. Adriana Torres (Co-directora UNRC-CONICET)

Argentina es una de las regiones másimportantes en la producción yexportación de uvas y sus derivados.

Anualmente el INV regula el porcentaje de uvasque se destinará a la producción de mostos, elcual es dependiente de los volúmenes de uvatotales producidos.

Antecedentes

Product neither fermented no caramelised, obtained by thepartial dehydration of grape must or of preserved grape mustaccording to procedures accepted by the OIV, such that itsdensity at 20°C is not less than 1.24 g/ml

Product neither fermented no caramelised, obtained by thepartial dehydration of grape must or of preserved grape mustaccording to procedures accepted by the OIV, such that itsdensity at 20°C is not less than 1.24 g/ml

International Code of Oenological Practices (OIV)

Artículo 775 bis - (Res 127, 20.02.89)"Con la denominación de Mosto Concentrado de Uva o Jarabe de Uva seentiende el producto obtenido del mosto de uva sin fermentar pordeshidratación parcial mediante procesos térmicos al vacío o a presión normal ocualquier otro proceso físico, sin haber sufrido una caramelización sensible.

Código Alimentario Argentino (CAA)

Definiciones

Etapas de elaboración de JUC

Recepción de la materia prima, lavado, molienda y prensado

Sulfitado

Clarificación y filtración

Intercambio iónico

Desulfitado (Tº 110°C a 120°C)

Concentrado 1º)100-110ºC, 2º) 90-95ºC, 3º)75ºC, 4º)40-45ºC

Envasado

Sustrato - Elevada concentración de azúcar baja aw- Bajo pH.- SO2.

- Almacenamiento sin oxígeno.

Características analíticas del producto

Exigencias en calidad e inocuidad del producto altamente estrictas.

Aplicaciones industriales

Jugo de Uva Concentrado

Por la presencia de espuma, gas y olor a fermentado.

Levaduras capaces de desarrollar en sustratos con alto contenido de azúcares (aw < 0,85).

Levaduras osmófilas

Alteración en la composición inicial del jugo de uva concentrado y en el aspecto del mismo, provocando el rechazo de las partidas cuando llegan a destino.

¿Qué consecuencias tienen sobre los jugos concentrados?

¿Cómo se reconoce la alteración a simple vista?

La estabilidad microbiológica de los jugos de uva concentrados

- Estimar la vida útil de los jugos concentrados con diferentes valores de pH y concentración de azúcar (ºBrix). De este modo, sabremos cuál es estabilidad intrínseca potencial que tienen los jugos en diferentes condiciones de almacenamiento y transporte.

- Disminuir o inhibir el desarrollo de levaduras osmófilas en el producto final aplicando métodos físicos y/o químicos permitidos en la elaboración de jugos de uva concentrados.

- Identificar cuáles son los puntos de contaminación microbiana con levaduras osmófilas durante la elaboración y el fraccionamiento de jugos concentrados.

Para ello:

Con este estudio nos proponemos…

Aumentar la estabilidad microbiológica de los jugos de uva concentrados producidos en Argentina y aportar una base científica-tecnológica para la implementación de normas de calidad en esta industria.

Sc pombe 6%P. anomala 2%

S. cerevisiae 14%

K. delphensis 2%

Se analizaron 21 muestras de jugos concentrados:

16 muestras sin alteración visible (listas para ser comercializadas).

5 muestras con alteración visible.

…en los jugos visiblemente alterados:

1. Identificación y caracterización de levaduras

aisladas de JUC

¿Qué levaduras osmófilas y osmotolerantes están presentes en los

jugos concentrados de Argentina?

…en los jugos a simple vista no alterados:

Z. rouxii100%

S. cerevisiae14% Z. rouxii

76%

S. pombe6%

P. anomala2% K. delphensis

2%

Combina y col. (2008)

1. Identificación y caracterización de levaduras aisladas de JUC

1. Identificación y caracterización de levaduras

aisladas de JUC

- Extracción de ADN Técnica modificada de Hoffman y Wiston (1987) que consiste en el mecanismo de ruptura celular mediante lisis química/mecánica de las células, seguido de una purificación con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y precipitación con etanol absoluto.

- PCR del dominio D1/D2 del gen ribosomal 26S

- Secuenciación

- Alineamiento de las secuencias mediante Contig-Express y comparadaspor BLAST con las bases de datos disponibles en la página del CentroNacional de Información de Biotecnología (NCBI) del Instituto nacionalde Salud (NIH) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Conclusión:

La mayoría de las cepas aisladas en jugos de uva concentrados con alteración visible y sin alteración, pertenecen a la especie

Zygosaccharomyces rouxii.

1. Identificación y caracterización de levaduras aisladas de JUC

¿Qué levaduras osmófilas y osmotolerantes están presentes en los

jugos concentrados de Argentina?

2. Selección de las cepas de Z. rouxii capaces de crecer en condiciones de elevada presión osmótica (38 ºBrix)

MYGF (extracto de malta, 20 g/L; extracto de levadura, 5 g/L; glucosa, 193 g/L; fructosa 193 g/L)

Siembra en TGY (triptona, 5 g/L; glucosa, 100 g/L; extracto de levadura, 5 g/L; agar, 20 g/L) (Combina y col., 2008)

Medición de densidad óptica por espectrofotometría a 600 nm

CURVAS DE CRECIMIENTO

2. Selección de la cepa de Z. rouxii capaces de crecer en condiciones de elevada presión osmótica (38 ºBrix)

Cepa Densidad óptica (promedio ± DS) Viabilidad celular (promedio ± DS)

µmax λ

(horas)

R2 µmax λ

(horas)

R2

MR4 0,11±0,00a 7,96±0,51b 0,997 0,07±0,01a 2,26±1,60ab 0,992

MC8 0,15±0,00a 7,01±0,17b 0,999 0,16±0,09a 2,65±2,68ab 1

MT6 0,37±0,01d 5,43±0,01a 0,999 0,09±0,00a 0,00±0,00a 1

MC9 0,15±0,00ab 4,77±0,09a 1 0,13±0,02a 4,45±0,15b 0,959

MC10 0,22±0,00b 5,01±0,51a 0,983 0,11±0,08a 2,85±1,58ab 0,909

Parámetros de crecimiento y coeficiente de regresión de ajuste al modelo paravalores experimentales obtenidos por densidad óptica y por recuento de célulasviables

Letras distintas significan diferencia significativa dentro de la misma columna (Test de Fisher p≤0,05)

2. Selección de la cepa de Z. rouxii capaces de crecer en condiciones de elevada presión osmótica (38 ºBrix)

Conclusión: Cepas de una misma especie muestran diferentes parámetros cinéticos de crecimiento desarrollando en un mismo

sustrato específico. Se seleccionaron las cepas MR4, MT6 y MC9 que presentaron diferencias en la cinética de crecimiento.

1 6 11 16 21 26Tiempo (Horas)

1

3

5

7

Rec

uen

to v

iab

les

(lo

g u

fc/m

l)

Poblaciones de diferentes cepas de Z. rouxii en jugos a 68° Brix pH 3,7

MC9

MR4

MT6

2. Selección de la cepa de Z. rouxii que presenta mayor potencial alterador

Siembra en TGY (triptona, 5 g/L; glucosa, 100 g/L; extracto de

levadura, 5 g/L; agar, 20 g/L) (Combina y col., 2008)

2. Selección de la cepa de Z. rouxii que presenta mayor potencial alterador

Conclusión:

La cepa Z. rouxii MC9 mostró mayor potencial alterador en jugo concentrado de uva, lo que permitió seleccionarla para futuros ensayos de estimación de

vida útil.

RUN ºBrix pH

1 64 1.72 64 1.73 64 1.74 64 2.55 64 2.56 64 2.57 64 3.28 64 3.29 64 3.210 66 1.711 66 1.712 66 1.713 66 2.514 66 2.515 66 2.516 66 3.217 66 3.218 66 3.219 68 1.720 68 1.721 68 1.722 68 1.923 68 1.924 68 1.925 68 2.126 68 2.127 68 2.128 68 2.529 68 2.530 68 2.531 68 3.232 68 3.233 68 3.2

3. Efecto del pH y la concentración de azúcares sobre el desarrollo de Z. rouxii MC9y estimación de la estabilidad intrínseca potencial del jugo

Different treatments (combinations of pH and ºBrix) contemplated in theexperimental design at isothermal and non-ishotermal conditions.

Note: All experiments were carried out in concentrated grape juice and followed for a

maximum of 60 days.

3. Efecto del pH y la concentración de azúcares sobre el desarrollo de Z. rouxii MC9y estimación de la estabilidad intrínseca potencial del jugo

Figure 4. Response surface graph for lag phase duration (λ) ofZygosaccharomyces rouxii MC9 as a function of pH and sugarconcentration (ºBrix) at isothermal conditions (23ºC) in concentratedgrape juice.

Figure 3. Response surface graph for maximum specificgrowth rate (µmax) of Zygosaccharomyces rouxii MC9 as afunction of pH and sugar concentration (ºBrix) at isothermalconditions (23ºC) in concentrated grape juice.

3. Efecto del pH y la concentración de azúcares sobre el desarrollo de Z. rouxii MC9y estimación de la estabilidad intrínseca potencial del jugo

De los gráficos se puede deducir que:

- Cuándo el pH disminuye, la velocidad máxima también (correlación positiva)

- Cuando el pH disminuye, la fase de latencia aumenta (correlación negativa)

ConclusionesExiste un claro efecto inhibidor del pH en el retraso del crecimiento de la

levadura.

A pH 1,7 no se observó desarrollo de la cepa en ninguna de las concentraciones evaluadas y bajo ninguna condición de temperatura.

Probablemente, el menor efecto de la concentración de azúcares en comparación con el pH, se debe al carácter osmofílico de la levadura.

4.Días para observar alteración en JCU con diferentes pH y Brix, mantenidos a temperatura constante y temperatura variable

ºBrix pH TFS-IC ± SD (days) TFS-NIC ± SD (days)

64 1.7 >60 >60

64 2.5 14.66±0.58a 17.66±0.58b

64 3.2 13.66±0.58ac 12.66±0.58c

66 1.7 >60 >60

66 2.5 26.33±0.58d 21.33±0.58e

66 3.2 14.33±0.58a 14.33±0.58a

68 1.7 >60 >60

68 1.9 >60 >60

68 2.1 48.33±0.58f 41.66±0.58g

68 2.5 35.66±0.58h 24.66±0.58i

68 3.2 26.33±0.58d 24.66±0.58i

Table 3. Time for spoilage (TFS) produced by Zyogaccharomyces rouxii MC9 in concentrated grapejuice at isothermal (IC, 23ºC) and non-isothermal (NIC, variable temperatures) conditions for thedifferent treatments (combinations of pH and ºBrix) contemplated in the experimental design.

Values are means of triplicate ± standard deviations. Numbers with different superscript letters are different according to the Fisher Test p≤ 0.05

ConclusiónEn general, los ensayos realizados a temperatura variable mostraron una

estabilidad microbiana inferior a los ensayos realizados a temperatura constante.

Modificando el pH de 3.2 a 2.1 duplicamos el tiempo de estabilidad microbiana en ambas condiciones de temperatura.

Modificando el pH de los JCU se prolonga significativamente la vida útil del producto.

De

4.Días para observar alteración en JCU con diferentes pH y Brix, mantenidos a temperatura constante y temperatura variable

De la tabla se puede deducir:

- TFS-IC (23ºC) osciló entre 13.66 días (pH 3.2 y 64 ºBrix) a más de 60 días (pH 1.9 y 1.7).

-TFS-NIC osciló entre 12.66 (pH 3.2 y 64 ºBrix) a más de 60 días en las mismas condiciones de pH.

Perfil de temperatura interna y externa aplicado en el ensayo a temperatura variable

Leinberger, D. (2006)Hartley, A. (2008)

Conclusiónes

-Si bien a pH 1,7 se limita totalmente el desarrollo de esta especie, resulta difícilde alcanzar en condiciones industriales.

-TFS fue mayor a 60 días cuándo el pH es inferior a 2.1, independientemente dela concentración de azúcares y la condición de temperatura. Por lo tanto, un pHmenor a 2.1 resulta una opción viable para que los JCU lleguen a destino sinalteración y de esta manera evitar rechazos y pérdidas económicas para laindustria.

- Una extensión de la vida útil en más de 30 días, representa una enormeventaja comercial ya que en ese término de tiempo el producto ya llegó adestino.

Conclusiones generales

1.Métodos físicos para reducción de población en jugos concentrados

a. Ensayos de termoresistencia y pasteurización. Calculo de valores D y Z

¿Cómo continuamos el plan de trabajo?

La pasteurización es un tratamiento de calor suave usado para reducir el número de microorganismos vivos en el alimento de manera que se pueda extender su vida útil. La eficiencia de este proceso dependerá de la carga microbiana inicial, de la termoresistencia del microorganismo y de las características del sustrato.

i.-Selección de la cepa Z. rouxii termotolerante y ensayos de pasteurización para controlar y/o disminuir el desarrollo de Z.rouxii

Se construyeron las curvas de muerte térmica para cinco cepas (60 ºC, T:2 – 15 minutos)

Se construyeron las curvas de supervivencia de la cepa Z.rouxii MC8 en jugo de uva concentrado a 68 ºBrix y pH 3.2 para las temperaturas 70, 72.5, 80 y 85 ºC.(T:5 – 90 segundos)

¿Cómo continuamos el plan de trabajo?

Resultados parciales-Se seleccionó la cepa MC8 que mostró mayor termoresistencia.

Curvas de muerte térmica de distintas cepas de Z. rouxii obtenidas por el software GInaFit 1.4.2

- El protocolo de pasteurización para jugos de uva concentrados a 68 ºBrix, pH 3.2, sería 75 ºC con un tiempo de retención de 60 segundos.

¿Cómo continuamos el plan de trabajo?

1. Métodos químicos para reducción de población en JUC

a. Adición de conservantes químicos. Cálculo MIC y NIC

a. Sales de quitosano (0,01 a 0,3 g/L)

b. Sorbato de potasio (0,05 a 1,5 g/L)

c. Benzoato de sodio (0,05 a 1,5 g/L)

d. Vainillina (2 a 30 mM)

e. Dimetildicarbonato (DMDC) (0,1 a 0,65 mL/L)

f. Ácido ferúlico-cumárico-cafeico (2 a 22 mM)

g. Extracto de jarilla (0,23 a 2,63%)

Instituto de la Grasa (CSIC) Sevilla, España

Resultados Parciales

Bioscreem C, Finlandia

Que se deduce…i) No se ha introducido el quitosano ya que no presentó ningún efecto inhibidor incluso en la máxima concentración ensayada.

ii) El ácido cumárico y cafeico presentaron los menores efectos inhibidores, obteniéndose solo alrededor del 15% de la inhibición.

iii) El ácido ferúlico presentó alrededor del 30% de reducción del crecimiento formando un grupo estadísticamente diferente.

iv) Estadísticamente, el benzoato de sodio, sorbato de potasio, DMDC y vainillina formaron un grupo homogéneo con un 40% de reducción del crecimiento.

¿Cómo continuamos el plan de trabajo?

Conclusión

Ninguno de los conservantes evaluados fue incapaz de impedir el desarrollo de la levadura en las dosis ensayadas.

3. Identificación de puntos de contaminación.

Puntos de muestreo Se determinarán “in situ” dependiendo de la planta elaboradora. Incluye la extracción de muestras de jugo simple antes y después del sulfitado; de jugo en las diferentes fases de la concentración, antes y después de los tratamientos de clarificación y filtrado y antes del fraccionamiento; y de jugo concentrado almacenado en los tanques donde se homogeniza previo a su envasado.

4. Aislamiento e identificación a nivel de especie y cepa de las levaduras aisladas de los distintos puntos de muestreo.

Puesta a punto de metodología molecular a nivel de cepa y PCR RealTime.

¿Cómo continuamos el plan de trabajo?

Muchas gracias!!